Name: Transformacja, edycja genomu i fenotypowanie tropikalnego drzewa Cannabaceae Parasponia andersonii wiążącego azot (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Poznaj protokół transformacji Agrobacterium i edycji genomu CRISPR/Cas9 w drzewie Parasponia andersonii. Metoda umożliwia generowanie stabilnych linii transgenicznych do badań symbiozy z rizobium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Markowi Youlesowi, Sophien Kamoun i Sylvestre Marillonnet za udostępnienie części do klonowania Golden Gate za pośrednictwem bazy danych Addgene. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować E. Jamesowi, P. Hadobasowi i T. J. Higgensowi za nasiona P. andersonii. Prace te były wspierane przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (grant NWO-VICI 865.13.001; Grant NWO-Open Competition 819.01.007) oraz Ministerstwo Badań, Technologii i Szkolnictwa Wyższego Republiki Indonezji (grant RISET-PRO 8245-ID).

<ol><li>Clason, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THE+VEGETATION+OF+THE+UPPER-BADAK+REGION+OF+MOUNT+KELUT+%28EAST+JAVA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+du+Jardin+Botanique+de+Buitenzorg%22%5BJournal%5D)">THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA).</a> Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).</li>
<li>Soepadmo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulmaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Flora+Malesiana-Series+1%2C+Spermatophyta%22%5BJournal%5D)">Ulmaceae.</a> Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).</li>
<li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rhizobium+symbiosis+of+the+nonlegume+Parasponia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Nitrogen+Fixation%22%5BJournal%5D)">The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia.</a> Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).</li>
<li>Oldroyd, G. E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speak%2C+friend%2C+and+enter%3A+signalling+systems+that+promote+beneficial+symbiotic+associations+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).</li>
<li>Gutjahr, C., Parniske, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+developmental+biology+of+arbuscular+mycorrhiza+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).</li>
<li>van Velzen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+nonlegume+Parasponia+reveals+insights+into+evolution+of+nitrogen-fixing+rhizobium+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).</li>
<li>van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Resurrected+Scenario%3A+Single+Gain+and+Massive+Loss+of+Nitrogen-Fixing+Nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation.</a> Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).</li>
<li>Griesmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+reveals+multiple+losses+of+the+nitrogen-fixing+root+nodule+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis.</a> Science. 1743, eaat1743(2018).</li>
<li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root-Nodule+Symbiosis+Between+Rhizobium+And+Parasponia+%28Ulmaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae).</a> Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).</li>
<li>van Zeijl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Mediated+Mutagenesis+of+Four+Putative+Symbiosis+Genes+of+the+Tropical+Tree+Parasponia+andersonii+Reveals+Novel+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 284(2018).</li>
<li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+Agrobacterium+rhizogenes%E2%80%93mediated+root+transformation+of+Parasponia+and+Trema+is+temperature+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Growth+Regulation%22%5BJournal%5D)">Efficiency of Agrobacterium rhizogenes–mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent.</a> Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).</li>
<li>Limpens, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+Agrobacterium+rhizogenes-transformed+roots+of+Arabidopsis+and+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula.</a> Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).</li>
<li>Boisson-Dernier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-Transformed+Roots+of+Medicago+truncatula+for+the+Study+of+Nitrogen-Fixing+and+Endomycorrhizal+Symbiotic+Associations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).</li>
<li>Kumagai, H., Kouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Silencing+by+Expression+of+Hairpin+RNA+in+Lotus+japonicus+Roots+and+Root+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).</li>
<li>Nilsson, O., Olsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+root%3A+The+role+of+the+Agrobacterium+rhizogenes+rol+genes+in+the+formation+of+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots.</a> Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).</li>
<li>Davey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+Nodulation+of+Micro-Propagated+Shoots+of+the+Non-Legume+Parasponia+andersonii+by+Bradyrhizobium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium.</a> Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).</li>
<li>Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nodulation+of+micro-propagated+plants+of+Parasponia+andersonii+by+tropical+legume+rhizobia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia.</a> Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).</li>
<li>Op den Camp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LysM-type+mycorrhizal+receptor+recruited+for+rhizobium+symbiosis+in+nonlegume+Parasponia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia.</a> Science. 331, 909-912 (2011).</li>
<li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Cloning+System+for+Standardized+Assembly+of+Multigene+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.</a> PLOS ONE. 6, e16765(2011).</li>
<li>Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana+using+Cas9+RNA-guided+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+On+Lysogenesis.+I.+The+Mode+Of+Phage+Liberation+By+Lysogenic+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli.</a> Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).</li>
<li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">A Golden Gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).</li>
<li>Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+CRISPR%2FCas-based+nucleases+and+nickases+can+be+used+efficiently+for+genome+engineering+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).</li>
<li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+Transformation-Competent+Arabidopsis+Genomic+Library+in+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium.</a> Biotechnology. 9, 963-967 (1991).</li>
<li>Op den Camp, R. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N+Nonlegume+Parasponia+andersonii+Deploys+A+Broad+Rhizobium+Host+Range+Strategy+Resulting+in+Largely+Variable+Symbiotic+Effectivenes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).</li>
<li>Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+acid+soil+tolerance+among+strains+of+Rhizobium+phaseoli%5BTitle%5D)+AND+%22Field+Crops+Research%22%5BJournal%5D)">Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli.</a> Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).</li>
<li>Martinez-Romero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+tropici%2C+A+Novel+Species+Nodulating+Phaseolus+vulgaris+L.+Beans+and+Leucaena+sp.+Trees%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).</li>
<li>Felten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ectomycorrhizal+Fungus+Laccaria+bicolor+Stimulates+Lateral+Root+Formation+in+Poplar+and+Arabidopsis+through+Auxin+Transport+and+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling.</a> Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).</li>
<li>Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesure+du+taux+de+mycorhization+VA+d%E2%80%99un+systeme+radiculaire.+Recherche+de+methods+d%E2%80%99estimation+ayant+une+signification+fonctionnelle%5BTitle%5D)+AND+%22Aspects+Physiologiques+et+Genetiques+des+Mycorhizes%22%5BJournal%5D)">Mesure du taux de mycorhization VA d’un systeme radiculaire. Recherche de methods d’estimation ayant une signification fonctionnelle.</a> Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).</li>
<li>Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+and+techniques+for+induction+and+growth+of+monocotyledonous+and+dicotyledonous+plant+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures.</a> Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).</li>
<li>Becking, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parasponia+parviflora+-+Rhizobium+symbiosis.+Host+specificity%2C+growth+and+nitrogen+fixation+under+various+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions.</a> Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Water-Culture+Method+for+Growing+Plants+without+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Circular+California+Agricultural+Experiment+Station%22%5BJournal%5D)">The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil.</a> Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).</li>
<li>Wang, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+K+%22Methods+in+Molecular+Biology%3A+Agrobacterium+Protocols%22">Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols</a>. 1, Humana Press. (2015).</li>
<li>Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+plant+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Growth+Regulation%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in plant tissue culture.</a> Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).</li>
<li>Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somaclonal+variation+%E2%80%94+a+novel+source+of+variability+from+cell+cultures+for+plant+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somaclonal variation — a novel source of variability from cell cultures for plant improvement.</a> Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).</li>
<li>Cannon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legume+genome+evolution+viewed+through+the+Medicago+truncatula+and+Lotus+japonicus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).</li>
<li>Tuskan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+of+Black+Cottonwood%2C+Populus+trichocarpa+%28Torr.+%26+Gray%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray).</a> Science. 313, 1596-1604 (2006).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520(2011).</li>
<li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Structure+of+the+Legume%2C+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus.</a> DNA Research. 15, 227-239 (2008).</li>
<li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biology. 14, 327(2014).</li>
<li>Lowder, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+Toolbox+for+Multiplexed+Plant+Genome+Editing+and+Transcriptional+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation.</a> Plant Physiology. 169, 971(2015).</li>
<li>van Zeijl, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Zeijl%2C+A+%22Dissecting+Hormonal+Pathways+in+Nitrogen-Fixing+Rhizobium+Symbioses%22">Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses</a>. , Wageningen University. (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rośliny strączkowe i daleko spokrewniony rodzaj Cannabaceae Parasponia reprezentują jedyne dwa klady gatunków roślin, które są w stanie ustanowić endosymbiotyczny związek z ryzobiami wiążącymi azot i tworzyć guzki korzeniowe. Badania porównawcze między gatunkami obu kladów są bardzo istotne, aby zapewnić wgląd w podstawowe sieci genetyczne umożliwiające tę symbiozę. Obecnie badania genetyczne wykonuje się głównie na roślinach strączkowych; zwłaszcza dwa gatunki modelowe M. truncatula i L. japonicus. Aby zapewnić dodatkową platformę doświadczalną i ułatwić badania porównawcze z guzkującym roślinem niestrączkowym, opisujemy tutaj szczegółowy protokół stabilnej transformacji i odwrotnych analiz genetycznych u P. andersonii. W przedstawionym protokole wykorzystano namnażanie in vitro transgenicznych linii T0 P. andersonii , co pozwala na rozpoczęcie analizy fenotypowej w ciągu 4 miesięcy od wspólnej hodowli A. tumefaciens . Jest to znacznie szybsze niż obecne protokoły, które zostały ustanowione w celu stabilnej transformacji roślin strączkowych33. To sprawia, że P. andersonii jest atrakcyjnym modelem badawczym.
Opisany tutaj protokół zawiera kilka krytycznych kroków. Pierwsza z nich dotyczy kiełkowania nasion. Aby przygotować nasiona P. andersonii do kiełkowania, nasiona należy odizolować od jagód. Odbywa się to poprzez pocieranie jagód o kawałek bibuły lub o wnętrze sitka do herbaty. Tę procedurę należy wykonać delikatnie, aby zapobiec uszkodzeniu okrywy nasiennej. Jeśli okrywa nasienna zostanie uszkodzona, wybielacz może dostać się do nasion podczas sterylizacji, co zmniejsza żywotność nasion. Aby przerwać spoczynek nasion, nasiona poddawane są 10-dniowemu cyklowi temperaturowemu. Jednak pomimo tego zabiegu kiełkowanie nie jest do końca zsynchronizowane. Ogólnie rzecz biorąc, pierwsze nasiona wykazują pojawienie się korzonków po 7 dniach, ale inne mogą potrzebować kilku dni dłużej, aby wykiełkować.
Punkty krytyczne w procedurze przekształcania dotyczą wyboru materiału wyjściowego i czasu trwania etapu wspólnej uprawy. Aby osiągnąć efektywną transformację, jako materiał wyjściowy najlepiej jest używać zdrowych i młodych łodyg lub ogonków liściowych niesterylnych roślin uprawianych w szklarniach. W celu pobudzenia wzrostu młodych gałęzi zaleca się przycinanie drzew Parasponia co 2-3 miesiące i odświeżanie drzew raz w roku. Dodatkowo etap wspólnej uprawy musi być wykonywany tylko przez 2 dni. Długotrwała kohodowla sprzyja nadmiernej kolonizacji eksplantatów tkankowych przez A. tumefaciens i ogólnie zmniejsza wydajność transformacji. Aby zapobiec nadmiernej kolonizacji przez A. tumefaciens , ważne jest również regularne odświeżanie talerzy, na których uprawiane są eksplantaty. W przypadku wystąpienia nadmiernej kolonizacji, eksplantaty tkanek można umyć (patrz sekcja 3.8) w celu usunięcia komórek A. tumefaciens . Zalecamy dodanie wybielacza do roztworu SH-10 używanego do prania (końcowe stężenie: ~2% podchlorynu). Ważne jest, aby pamiętać, że ten dodatkowy etap mycia może nie działać w przypadku silnie zainfekowanych eksplantatów (rysunek 2B). W przypadku, gdy transformacja za pomocą konstruktu CRISPR/Cas9 daje tylko ograniczoną liczbę przypuszczalnie przekształconych pędów lub jeśli oczekuje się, że mutageneza określonego genu spowoduje problemy z regeneracją, zaleca się włączenie pustego konstruktu kontrolnego wektora jako kontroli pozytywnej. Wreszcie, ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie wybrane linie transgeniczne są wynikiem niezależnych zdarzeń integracji T-DNA. Dlatego instruujemy, aby wziąć tylko jeden przypuszczalnie transgeniczny pęd z każdej strony eksplantatu. Zdajemy sobie jednak sprawę, że zmniejsza to potencjalną liczbę niezależnych linii. Jeśli potrzebnych jest wiele linii, naukowcy mogą zdecydować się na oddzielenie przypuszczalnie przekształconych kalii od oryginalnych eksplantatów, gdy te kaliby mają rozmiar ≥2 mm i hodować je niezależnie. W ten sposób można wyizolować wiele linii z każdego eksplantatu, co zwiększa liczbę potencjalnych linii transgenicznych.
W obecnym protokole linie transgeniczne P. andersonii są rozmnażane wegetatywnie poprzez rozmnażanie in vitro. Zaletą tego rozwiązania jest to, że wiele sadzonek transgenicznych może zostać wygenerowanych w stosunkowo krótkim czasie. Jednak ta metoda ma również kilka ograniczeń. Po pierwsze, utrzymanie linii transgenicznych T0 poprzez rozmnażanie in vitro jest pracochłonne i może skutkować niepożądanymi zmianami genetycznymi lub epigenetycznymi34,35. Po drugie, linie T0 nadal zawierają kopię T-DNA, w tym kasetę oporności na antybiotyki. Ogranicza to liczbę możliwych ponownych przekształceń, ponieważ dla każdej ponownej transformacji wymagane są różne znaczniki wyboru. Obecnie testowaliśmy tylko transformację przy użyciu selekcji kanamycyny lub higromycyny (dane nie pokazane). Co więcej, obecność sekwencji kodującej Cas9 i sgRNA w liniach transgenicznych T0 komplikuje badania komplementacji. Testy komplementacji są możliwe, ale wymagają mutacji miejsca docelowego (miejsc) docelowych sgRNA w taki sposób, aby zapobiec edycji genów konstruktu komplementacji. Po trzecie, wadą pracy z liniami T0 jest to, że mutanty CRISPR/Cas9 mogą być chimeryczne. Aby zapobiec analizie fenotypowej chimerycznych linii zmutowanych, zalecamy powtórzenie analizy genotypowania po rozmnażaniu in vitro na co najmniej 3 różnych pędach. Chociaż liczba chimerycznych mutantów uzyskanych przy użyciu opisanego tutaj protokołu jest ograniczona, czasami obserwuje się je10. Aby przezwyciężyć ograniczenia związane z pracą z liniami T0, linie mutantów P. andersonii mogą być rozmnażane generatywnie. Drzewa P. andersonii są dwupienne i zapylane przez wiatr2. Oznacza to, że każda linia transgeniczna musi być manipulowana w taki sposób, że kwiaty męskie i żeńskie są wytwarzane na jednym osobniku, a następnie uprawiane w taki sposób, aby nie doszło do zapylenia krzyżowego. Ponieważ P. andersonii jest szybko rosnącym drzewem, wymaga znacznej ilości miejsca w tropikalnej szklarni (28 °C, ~85% wilgotności względnej). Dlatego, choć technicznie możliwe, generatywne rozmnażanie linii transgenicznych P. andersonii jest logistycznie trudne.
W sekcji protokołu opisaliśmy 3 metody guzkowania P. andersonii. Zaletą systemów płytek i torebek jest to, że korzenie są łatwo dostępne, co może umożliwić punktowe zaszczepianie bakterii i śledzenie tworzenia się guzków w czasie. Jednak system płytek jest dość pracochłonny, co sprawia, że mniej nadaje się do eksperymentów z nodulacją na dużą skalę. Wadą systemu woreczków jest to, że trudno jest zapobiec zanieczyszczeniu grzybiczemu. Woreczki nie są sterylne, dlatego często obserwuje się wzrost grzybów w górnej połowie torebki. Nie wpływa to jednak na wzrost P. andersonii , a zatem nie zakłóca testów guzkowych. Dodatkowo system woreczków nadaje się tylko do sadzonek. Pomimo kilku prób nie udało nam się wyhodować sadzonek uzyskanych w wyniku rozmnażania in vitro w torebkach.
Opisana tutaj linia genetyki odwrotnej P. andersonii oferuje znaczną poprawę w porównaniu z istniejącą metodą transformacji korzeni opartą na A. rhizogenes 11. Korzystając z opisanych procedur, można efektywnie generować stabilne linie transgeniczne i utrzymywać je poprzez rozmnażanie in vitro. Natomiast transformacja A. rhizogenes jest przejściowa i prowadzi jedynie do powstania korzeni transgenicznych. Ponieważ każdy korzeń transgeniczny powstaje w wyniku niezależnej transformacji, testy oparte na transformacji A. rhizogenes cierpią ze względu na znaczną zmienność fenotypową. Zmienność ta jest znacznie mniejsza w przypadku stabilnych linii, chociaż rozmnażanie in vitro również tworzy pewien poziom zmienności. Ze względu na tę zmniejszoną zmienność i fakt, że wiele sadzonek może być fenotypowanych dla każdej stabilnej linii, stabilne linie są bardziej odpowiednie do testów ilościowych w porównaniu z korzeniami przekształconymi przez A. rhizogenes. Dodatkowo, stabilna przemiana nie zależy od wprowadzenia locus indukującego korzeń A. rhizogenes (rol), który wpływa na endogenną równowagę hormonalną15. Dlatego stabilne linie lepiej nadają się do odwrotnej analizy genetycznej genów zaangażowanych w homeostazę hormonalną w porównaniu z korzeniami przekształconymi przez A. rhizogenes. Bardziej ogólną zaletą P. andersonii jako modelu badawczego jest to, że nie doświadczył on niedawnej duplikacji całego genomu (WGD). Podrodzina roślin strączkowych Papilionoideae, która obejmuje modelowe rośliny strączkowe M. truncatula i L. japonicus, a także Salicaceae (rząd Malpighiales), która obejmuje drzewo modelowe Populus trichocarpa, doświadczyła WGD ~65 milionów lat temu36,37. Wiele paralogicznych kopii genów powstałych w wyniku tych WGD jest zatrzymywanych w genomach M. truncatula, L. japonicus i P. trichocarpa 37,38,39, co powoduje redundancję, która może komplikować odwrotne analizy genetyczne. Ponieważ P. andersonii nie doświadczył niedawnego WGD, odwrotne analizy genetyczne P. andersonii mogą być mniej dotknięte nadmiarowym funkcjonowaniem paralogicznych kopii genów.
Podsumowując, przedstawiamy szczegółowy protokół odwrotnej analizy genetycznej u P. andersonii. Korzystając z tego protokołu, pojedyncze linie mutantów mogą być efektywnie generowane w ramach czasowych 2-3 miesięcy10. Protokół ten można rozszerzyć w celu stworzenia mutantów wyższego rzędu poprzez multipleksowanie sgRNA ukierunkowanych na różne geny jednocześnie, jak pokazano dla innych gatunków roślin 40,41,42. Dodatkowo, opisana tutaj procedura stabilnej transformacji nie ogranicza się do celowania w geny CRISPR/Cas9, ale może być również wykorzystana do wprowadzenia innych typów konstruktów (np. do testów promotor-reporter, ekspresji ektopowej lub transkomplementacji). Ustaliliśmy P. andersonii jako model badań porównawczych do badania wzajemnych symbioz z ryzobiami wiążącymi azot lub grzybami endomikoryzowymi. Jednak opisane tutaj protokoły dostarczają również narzędzi do badania innych aspektów biologii tego tropikalnego drzewa, takich jak tworzenie drewna, rozwój biseksualnych kwiatów lub biosynteza metabolitów wtórnych specyficznych dla Cannabaceae.

Parasponia andersonii to tropikalne drzewo należące do rodziny konopiowatych (Cannabaceae) i pochodzi z Papui Nowej Gwinei oraz kilku wysp Pacyfiku1,2,3. Wraz z 4 dodatkowymi gatunkami Parasponia reprezentuje jedyną linię niezwiązaną z roślinami strączkowymi, która może ustanowić symbiozę guzków wiążących azot z rhizobią. Ta symbioza jest dobrze zbadana w modelach roślin strączkowych (Fabaceae) Medicago truncatula i Lotus japonicus, co zaowocowało zdobyciem szczegółowej wiedzy na temat molekularnej genetycznej natury powstawania i funkcjonowania guzków4. Dodatkowo wykazano, że symbioza guzków korzeniowych u roślin strączkowych opiera się na znacznie starszej i szeroko rozpowszechnionej symbiozie mikoryzowej arbuskularnej5. Porównania filogenomiczne sugerują, że symbiozy brodawek wiążących azot roślin strączkowych, Parasponia, a także tak zwanych gatunków roślin promieniowych, które są gospodarzami diazotroficznych bakterii Frankia, mają wspólne pochodzenie ewolucyjne6,7,8. Aby ustalić, czy geny zidentyfikowane jako zaangażowane w tworzenie guzków roślin strączkowych są częścią konserwatywnej podstawy genetycznej, niezbędne są badania na gatunkach innych niż rośliny strączkowe. W tym celu proponujemy wykorzystanie P. andersonii jako porównawczego modelu badawczego, obok roślin strączkowych, w celu zidentyfikowania podstawowych sieci genetycznych leżących u podstaw powstawania i funkcjonowania guzków korzeniowych.
P. andersonii to pionier, którego można znaleźć na zboczach wulkanicznych wzgórz. Może osiągnąć prędkość wzrostu 45 cm miesięcznie i długość do 10 metrów9. Drzewa P. andersonii są zapylane przez wiatr, co jest ułatwione przez tworzenie oddzielnych kwiatów męskich i żeńskich3,10. Niedawno zsekwencjonowaliśmy i oznaczyliśmy diploidalny genom (2n = 20; 560 Mb / 1C) P. andersonii i zebraliśmy szkice sekwencji genomu 2 dodatkowych gatunków Parasponia; P. rigida i P. rugosa6. Ujawniło to ~ 35 000 modeli genów P. andersonii, które można zgrupować w >20 000 ortogrup razem z genami M. truncatula, soi (Glycine max), Arabidopsis thaliana, truskawki leśnej (Fragaria vesca), Trema orientalis, czarnej topoli bawełnianej (Populus trichocarpa) i eukaliptusa (Eucalyptus grandis)6. Ponadto porównania transkryptomu między M. truncatula i P. andersonii zidentyfikowały zestaw 290 przypuszczalnych ortologów, które wykazują wzorzec ekspresji wzmocnionej guzkami w obu gatunkach6. Stanowi to doskonałe źródło do badań porównawczych.
Aby zbadać funkcję genu w korzeniach i guzkach P. andersonii, ustanowiono protokół transformacji korzeni za pośrednictwem Agrobacterium rhizogenes11. Korzystając z tego protokołu, rośliny złożone z korzeniami transgenicznymi mogą być generowane w stosunkowo krótkim czasie. Metoda ta jest również szeroko stosowana w badaniach nad symbiozą roślin strączkowych12,13,14. Jednak wadą tej metody jest to, że przekształcane są tylko korzenie, a każdy korzeń transgeniczny reprezentuje niezależne zdarzenie transformacji, co skutkuje znaczną zmiennością. Ponadto transformacja jest przejściowa i linie transgeniczne nie mogą być utrzymane. To sprawia, że transformacja korzeni oparta na A. rhizogenes jest mniej odpowiednia do edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Dodatkowo, A. rhizogenes przenosi swoje geny locus indukujące korzenie (rol) do genomu rośliny, które po wyrażeniu zakłócają homeostazę hormonów15. To sprawia, że badanie roli hormonów roślinnych w korzeniach przekształconych przez A. rhizogenes jest wyzwaniem. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, niedawno opracowaliśmy protokół transformacji opartej na Agrobacterium tumefaciens i mutagenezie za pośrednictwem CRISPR/Cas9 P. andersonii10.
Tutaj podajemy szczegółowy opis procedury transformacji opartej na A. tumefaciens i linii odwrotnej genetyki opracowanej dla P. andersonii. Ponadto zapewniamy protokoły dalszego postępowania z sadzonkami transgenicznymi, w tym testy do badania interakcji symbiotycznych. Korzystając z opisanego tutaj protokołu, w ciągu 2-3 miesięcy można wygenerować wiele linii transgenicznych. W połączeniu z mutagenezą, w której pośredniczy CRISPR/Cas9, pozwala to na wydajne generowanie linii mutantów nokautujących. Te zmutowane linie mogą być rozmnażane wegetatywnie in vitro10,16,17, co pozwala na wygenerowanie materiału wystarczającego do rozpoczęcia charakterystyki fenotypowej po 4 miesiącach od rozpoczęcia procedury transformacji10. Łącznie ten zestaw procedur powinien pozwolić każdemu laboratorium na przyjęcie P. andersonii jako modelu badawczego do badań mających na celu zrozumienie związków ryzobialnych i mikoryzowych, a także potencjalnie innych aspektów biologii tego tropikalnego drzewa.

<table><tbody><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>NAA</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503.0250</td><td>MES</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Acetosyringone</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>X1402.1000</td><td>X-Gal</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>101236</td><td>Do żelu</td><td></td> do elektroforezy kwasów nukleinowych</tr> <tr><td>-</td><td></td> <td>materiał pudełka na woreczki, wieszaki</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>101188</td><td>NH4NO3</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408-1G</td><td>BAP</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>100156</td><td>H3BO3</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>ER1011</td><td>Używany jako enzym restrykcyjny w zespole</td><td></td>klonowania Golden Gate</tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>15561020</td><td>Używany w zespole</td><td></td>klonowania Golden Gate</tr><tr><td>Merck</td><td>137101</td><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0111.0025</td><td>C16H16N5O7S2Na</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>K1231</td><td>Służy do klonowania tępo zakończonych amplikonów PCR w procedurze</td><td></td>genotypowania</tr><tr><td>Agronutrition</td><td>AP2011</td><td>Zawierający Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 zarodników/ml), używany do oznaczania</td><td></td>michorryzacji</tr><tr><td>Merck</td><td>102790</td><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>D1004.1000</td><td>Używany do hodowli tkanek roślinnych pożywka</td><td></td>na bazie agaru</tr><tr><td>Merck</td><td>105101</td><td>K2HPO4</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>20302.293</td><td>Na2&middot; EDTA</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0803.1000</td><td>C6H14O6</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>ER0291</td><td>Stosowany jako enzym restrykcyjny w zespole</td><td></td>do klonowania Golden Gate</tr><tr><td>Merck</td><td>100983</td><td>C2H5OH</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>BDH9232-500G</td><td>EDTA</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377600-1PAK</td> Membrana <td></td><td>celofanowa</td></tr><tr><td>Biomatters, Ltd.</td><td>R9 lub wyższy</td><td>Oprogramowanie bioinformatyczne do klonowania in silico i projektowania sgRNA</td><td></td></tr><tr><td>Mega</td> <td>International-Informacje</td> <td>techniczne w https://mega-international.com/tech-info/</td><td></td></tr> <tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>65882</td><td>Służy do mocowania tkanek</td><td></td>guzków</tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>24385.295-Vink</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>219341</td><td>Woreczki materiał pudełka, dno część</td><td></td></tr><tr><td>Leica Biosystems</td><td>14702218311</td><td>Używany jako szablon do osadzania</td><td></td>tworzyw sztucznych</tr><tr><td>Merck</td><td>100317</td><td>HCl</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5386-1G</td><td>IBA</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>103862</td><td>C6H5FeO7</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>103965</td><td>FeSO4O&middot; 7H2O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>I1401.0005</td><td>IPTG</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>K0126.0010</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2000</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105886</td><td>MgSO4O&middot; 7H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105934</td><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>102786</td><td>MnSO4O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1002.1000</td><td>Stosowany do hodowli bakteryjnych pożywki</td><td></td>na bazie agaru</tr><tr><td>Manutan</td><td>92007687</td><td>Materiał woreczków</td><td></td></tr><tr><td>Paraxisdienst</td><td>130774</td><td>Elastyczna folia</td><td></td>uszczelniająca</tr><tr><td>Pull Rhenen</td><td>Agra-Perlite No.3</td><td>Stosowany jako podłoże do uprawy w doniczkach do oznaczania</td><td></td>nodulacji</tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>391-0581</td><td>Używany jako pojemnik na membrany</td><td></td>celofanowe</tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>F130WH</td><td>Do genotypowania linii</td><td></td>transgenicznych</tr><tr><td>Addgene </td><td>50337</td><td>Terminator poziomu 0, 3' UTR, 35s (wirus mozaiki kalafiora)</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>48017</td><td>Łącznik końcowy 2 do montażu 2 części poziomu jednego w akceptor</td><td></td>poziomu 2</tr><tr><td>Addgene </td><td>48018</td><td>Łącznik końcowy 3 do montażu części poziomu 3 poziomu pierwszego w akceptor</td><td></td>poziomu 2</tr><tr><td>Addgene </td><td>48001</td><td>Akceptor poziomu 1. Pozycja 5. Orientacja</td><td></td>do przodu</tr><tr><td>Addgene </td><td>48007</td><td>Akceptor poziomu 1. Pozycja 1. Odwrotna orientacja</td><td></td></tr><tr><td>Promotor Addgene </td><td>50268</td><td>poziomu 0 (0,4 kb), 35s (wirus mozaiki kalafiora) + 5' UTR, &Omega; (wirus mozaiki tytoniu)</td><td></td></tr><tr><td>Addgene </td><td>46966</td><td>Używany do projektowania modułu</td><td></td>CRISPR/Cas9</tr><tr><td>Addgene </td><td>46968</td><td>Używany do projektowania modułu</td><td></td>CRISPR/Cas9</tr><tr><td>Addgene </td><td>50334</td><td>Poziom 0 Kaseta oporności na kanamycynę/neomycynę/paromomycynę</td> Topzeven-Używany jako filtry do płukania zawiesiny zarodników Sigma-Aldrich 8.17003 PEG400 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>E1674.0001</td><td>Doniczki do uprawy Parasponia sadzonki/sadzonki</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>104871</td><td>KH2PO4</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105033</td><td>KOH</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>105153</td><td>K2SO4O</td><td></td></tr><tr><td>Van Leusden b.v. </td><td>-</td><td>Stosowany jako podłoże do uprawy do testu</td><td></td>michorryzacji</tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0225.0050</td><td>SH-podłoże soli</td><td></td>bazalnej</tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0411.0250</td><td>Mieszanina</td><td></td>SH-witamin</tr><tr><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-02</td><td>Stosowany jako niejonowy środek powierzchniowo czynny w etapie płukania stabilnej przemiany</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>137017</td><td>NaCl</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>89230-072</td><td>C6H11NaO7</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td></td><td>106521 Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>106574</td><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>567549</td><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>Na2SO4O</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809.5000</td><td>C12H22O11</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fisher</td><td>B69</td><td>Używany w zespole</td><td></td>klonowania Golden</tr><tr><td>Gate Thermo-Fisher</td><td>EL0013</td><td>Używany w zespole</td><td></td>klonowania Golden Gate</tr><tr><td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td><td>64708806</td><td>Żywica na bazie metakrylanu metylu w proszku</td><td></td></tr><tr><td>Kulzer-Mitsui Chemicals Group</td><td>64709003</td><td>Roztwór żywicy na bazie HEMA (metakrylanu 2-hydroksyetylu)</td> Kulzer-Mitsui Chemicals Group 66022678 Roztwór żywicy na bazie metakrylanu metylu Merck 1159300025 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acros</td><td>189350250</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VWR Chemicals</td><td>663684B</td><td>Polysorbate 20</td><td></td></tr><tr>Stout Woreczki<td>z pleksiglasu</td><td></td>, <td>materiał pudełka, pokrywa</td><td></td></tr><tr><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Merck</td><td>108816</td><td>ZnCl2</td><td></td></tr><tr><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>ZnSO4O&middot; 7H2O</td><td></td></tr></tbody></table>

transformacja, edycja genomu i fenotypowanie tropikalnego drzewa cannabaceae parasponia andersonii wiążącego azot

Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii

Parasponia andersonii to szybko rosnące drzewo tropikalne, które należy do rodziny konopi (Cannabaceae). Wraz z 4 dodatkowymi gatunkami tworzy jedyną znaną linię niestrączkową, która jest w stanie ustanowić symbiozę guzków wiążących azot z ryzobium. Badania porównawcze między roślinami strączkowymi a P. andersonii mogą dostarczyć cennych informacji na temat sieci genetycznych leżących u podstaw powstawania guzków korzeniowych. Aby ułatwić badania porównawcze, niedawno zsekwencjonowaliśmy genom P. andersonii i ustaliliśmy stabilną transformację za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens oraz edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis procedur transformacji i edycji genomu opracowanych dla P. andersonii. Ponadto opisujemy procedury kiełkowania nasion i charakterystyki fenotypów symbiotycznych. Korzystając z tego protokołu, stabilne transgeniczne linie mutantów mogą zostać wygenerowane w okresie 2-3 miesięcy. Rozmnażanie wegetatywne in vitro linii transgenicznych T0 pozwala na rozpoczęcie eksperymentów fenotypowania po 4 miesiącach od wspólnej hodowli A. tumefaciens. W związku z tym protokół ten trwa tylko nieznacznie dłużej niż przejściowa metoda transformacji korzeni oparta na Agrobacterium rhizogenes dostępna dla P. andersonii, chociaż oferuje kilka wyraźnych korzyści. Opisane tutaj procedury pozwalają na wykorzystanie P. andersonii jako modelu badawczego do badań mających na celu zrozumienie związków symbiotycznych, a także potencjalnie innych aspektów biologii tego tropikalnego drzewa.

Parasponia andersonii to szybko rosnące drzewo tropikalne, które należy do rodziny konopi (Cannabaceae) i może tworzyć brodawki korzeniowe wiążące azot w połączeniu z rhizobium. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół odwrotnych analiz genetycznych u P. andersonii w oparciu o stabilną transformację za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens i edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9.

Transformacja, edycja genomu i fenotypowanie tropikalnego drzewa Cannabaceae Parasponia andersonii wiążącego azot

Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the ...

Parasponia to tropikalne drzewo z rodziny konopi, które jest w stanie ustanowić symbiozę wiążącą azot z rhizobium. Badania porównawcze między parasponią a roślinami strączkowymi mogą dostarczyć informacji na temat podstawowych sieci genetycznych leżących u podstaw symbiozy ryzobium. Dzięki temu protokołowi stabilne transgeniczne linie mutantów Parasponia andersonii mogą zostać wygenerowane w okresie od dwóch do trzech miesięcy.Linie te mogą być skutecznie rozmnażane poprzez rozmnażanie in vitro. Protokół ten stanowi eksperymentalną platformę do badania symbiozy ryzobialnej, a także innych aspektów biologii tego tropikalnego drzewa. Podstawowe umiejętności w zakresie hodowli tkankowej i klonowania molekularnego są wystarczające do wdrożenia tego protokołu.Dzięki temu każde laboratorium może zaadaptować Parasponię jako model badawczy. Procedurę zademonstrują doktoranci Titis Wardhani i Yuda Roswanjaya wraz z Marijke Hartog, technikiem w naszym laboratorium. Aby wyhodować drzewa Parasponia andersonii, zacznij od wykiełkowania nasion.Usuń nasiona z jagód Parasponia, pocierając je o wnętrze sitka do herbaty lub zgniatając je na kawałku bibuły. Zdezynfekuj nasiona za pomocą 4% wybielacza podchlorynowego przez 15 do 20 minut, a następnie umyj nasiona sześć razy wysterylizowaną wodą. Przenieś nasiona do sterylnych probówek PCR o pojemności 200 mikrolitrów i napełnij probówki wysterylizowaną wodą, aby zanurzyć nasiona.Inkubuj probówki przez 10 dni w termocyklerze zgodnie z instrukcjami manuskryptu. Po 10-dniowej inkubacji przenieś nasiona na płytki SH-0 i zamknij je dwiema warstwami elastycznej folii uszczelniającej, aby zapobiec wysuszeniu. Inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza z 16-godzinnym cyklem dnia i ośmiogodzinnej nocy przez trzy do czterech tygodni.Gdy sadzonki rozwiną pierwszy zestaw prawdziwych liści, przenieś je do doniczek wypełnionych komercyjną ziemią doniczkową i przykryj półprzezroczystym plastikowym kubkiem, aby zapobiec wysuszeniu. Umieść doniczki w pomieszczeniu o temperaturze 28 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 85% lub szklarni w reżimie 16 godzin dziennie i ośmiu godzin nocy. Po tygodniu wyjmij plastikowy kubek.Regularnie podlewaj doniczki i uzupełniaj nawozem, aby podtrzymać wzrost drzew. Przygotuj się do transformacji, zbierając młode pięcio- lub ośmiocentymetrowe gałęzie z drzew uprawianych w szklarni, upewniając się, że używasz tylko zdrowych, niezainfekowanych gałęzi. Odetnij liście, pozostawiając jeden centymetr kwadratowy tkanki liścia na końcu każdego ogonka.Dezynfekuj tkankę przez 15 minut 2% wybielaczem podchlorynowym zawierającym kilka kropli polisorbatu 20, a następnie spłucz ją osiem razy wodą z autoklawizem. Ponownie zawiesić komórki Agrobacterium w 25 mililitrach pożywki infiltracyjnej do gęstości optycznej około pięciu. Pokrój łodygę i tkankę ogonka liściowego na jednocentymetrowe kawałki wewnątrz zawiesiny komórkowej.Usuń tkanki liści i inkubuj kawałki łodygi i ogonków liściowych w zawiesinie komórkowej przez 10 do 30 minut. Wysuszyć kawałki tkanek na sterylnym kawałku bibuły filtracyjnej i umieścić je na podłożu ukorzeniającym przygotowanym zgodnie z instrukcjami rękopisu. Inkubuj płytki w ciemności w temperaturze 21 stopni Celsjusza przez dwa dni.Po dwóch dniach sprawdź płytki pod kątem zanieczyszczenia grzybiczego lub bakteryjnego i wyrzuć zanieczyszczone płytki. Przenieść kawałki tkanek do 10 mililitrów pożywki SH-10 przygotowanej zgodnie z instrukcjami rękopisu. Pozostaw chusteczkę w podłożu na co najmniej 10 minut i delikatnie mieszaj co dwie do trzech minut w celu umycia.Przygotować podłoże ukorzeniające z cefotaksymem i kanamycyną zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i wlać płytki. Wysuszyć chusteczki na sterylnych kawałkach bibuły filtracyjnej i przenieść je na płytki. Inkubuj płytki przez siedem dni w temperaturze 28 stopni Celsjusza w schemacie 16 godzin dziennie i ośmiu godzin nocy.Co dwa dni sprawdzaj tabliczki pod kątem zanieczyszczenia grzybiczego lub bakteryjnego. Jeśli dojdzie do zanieczyszczenia, niezakażone kawałki tkanki przenieść na nową płytkę. Po siedmiu dniach przenieść fragmenty tkanek na pożywkę do rozmnażania przygotowaną zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza w reżimie 16 godzin w dzień i osiem godzin w nocy.Odświeżaj płytki raz w tygodniu, aż rozwiną się pędy transgeniczne, upewniając się, że przenosisz tylko niezainfekowane fragmenty tkanek na nowe płytki. Gdy przypuszczalne pędy transgeniczne osiągną co najmniej jeden centymetr długości, odetnij pędy i hoduj je niezależnie w pożywce rozmnożeniowej z antybiotykami. Aby upewnić się, że pędy reprezentują niezależne transformanty, weź tylko jeden pęd z każdej strony eksplantu.Rozmnażać tkankę, umieszczając około 10 pędów na świeżej płytce pożywki rozmnożeniowej i zamykając płytkę dwiema warstwami elastycznej folii uszczelniającej. Inkubuj płytki w temperaturze 28 stopni Celsjusza w schemacie 16 godzin w dzień i osiem godzin w nocy i powtarzaj ten krok co cztery tygodnie. Gdy pędy osiągną jeden centymetr długości, odetnij je u podstawy i umieść na podłożu ukorzeniającym.Ustaw pędy pionowo, wkładając podstawową końcówkę pędu do podłoża. Na jednej płytce można umieścić około 10 pędów. Zacznij od przygotowania inokulum rhizobium.Zaszczepić 10 mililitrów płynnej pożywki YEM z pojedynczej kolonii Mesorhizobium plurifarium BOR2 i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa dni. Użyj tej kultury, aby zaszczepić większą objętość płynnej pożywki YEM. Po wyhodowaniu odwiruj kulturę bakteryjną przez 10 minut w temperaturze 3 500 g w celu zebrania komórek.Ponownie zawiesić osad bakteryjny w ciekłym podłożu EKM i określić gęstość optyczną. Przygotuj trzy litry pożywki EKM, która wystarcza na około 20 doniczek i zaszczep ją zawiesiną ryzobialną. Wymieszaj podłoże z 1,25 kilograma perlitu i dodaj 210 gramów tej mieszaniny do sterylnych półprzezroczystych garnków polipropylenowych.Posadź od jednej do trzech sadzonek Parasponia andersonii do każdej doniczki i przygotuj kilka doniczek z sadzonkami przekształconymi za pomocą konstruktu kontrolnego. Zważ kilka doniczek i przykryj dno każdej doniczki, aby chronić korzenie przed światłem. Inkubuj doniczki w klimatyzowanym pomieszczeniu do uprawy w temperaturze 28 stopni Celsjusza w reżimie 16 godzin dziennie i ośmiu godzin w nocy przez cztery do sześciu tygodni.Raz w tygodniu zważ kilka doniczek, aby określić utratę wody. Jeśli utrata wody przekracza 10 mililitrów, uzupełnij ją ultraczystą wodą, aby zrekompensować ubytek. Po inkubacji oczyść korzenie z perlitu i określ liczbę guzków za pomocą lornetki.Technika ta została wykorzystana do skutecznego przekształcenia ogonków liściowych i segmentów łodyg Parasponia andersonii za pomocą szczepu Agrobacterium AGL1. Najpierw eksplantaty tkankowe są współuprawiane z Agrobacterium przez dwa dni. Długotrwała kohodowla powoduje nadmierną kolonizację bakterii i należy jej zapobiegać.Kilka tygodni później na pierwotnej powierzchni rany obserwuje się małe zielone mikrokalusy. Te kalusy nadal rosną i rozwijają jeden lub więcej przypuszczalnie przekształconych pędów po sześciu do ośmiu tygodniach od rozpoczęcia transformacji. Wydajność przemiany waha się od 10 do 30% w przypadku eksplantatów tkankowych z dojrzałych gałęzi do 65 do 75% w przypadku eksplantatów tkankowych z młodych i szybko rosnących gałęzi.Pędy transgeniczne można rozmnażać poprzez rozmnażanie in vitro, w wyniku czego w ciągu miesiąca powstają dziesiątki pędów. Pędy te można umieścić na podłożu ukorzeniającym, które wywoła ukorzenienie w ciągu około dwóch tygodni i da rośliny, które można wykorzystać do eksperymentów. Rozpoczynając eksperyment ze stabilną transformacją, ważne jest, aby wybrać zdrowe gałęzie jako materiał źródłowy.Linie transgeniczne Parasponia T0 rozmnaża się in vitro. Dlatego tak ważne jest dokładne genotypowanie linii transgenicznych Parasponia. Ustanowienie Parasponia jako modelu eksperymentalnego pozwala na analizę porównawczą między dwiema daleko spokrewnionymi liniami guzkowatymi, Parasponią i roślinami strączkowymi.Pozwoli to zidentyfikować konserwatywne sieci genetyczne leżące u podstaw symbiozy rhizobium. Parasponia może być również cennym modelem do badania innych tematów badawczych, takich jak tworzenie drewna, rozwój kwiatów biseksualnych lub biosynteza metabolitów wtórnych specyficznych dla Cannabaceae.

transforming-genome-editing-phenotyping-nitrogen-fixing-tropical

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Korzystając z montażu DNA, wiele wektorów CRISPR może być konstruowanych równolegle w jednej reakcji klonowania, co sprawia, że budowa dużej liczby wektorów CRISPR jest prostym zadaniem. Owłosione korzenie pomidora są doskonałym systemem modelowym do walidacji wektorów CRISPR i generowania zmutowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa konstrukcja wektora CRISPR i charakterystyka modyfikacji DNA przez generowanie owłosionych korzeni pomidora

Analizy ekspresji promotorów są kluczowe dla lepszego zrozumienia regulacji genów i czasoprzestrzennej ekspresji docelowych genów. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół identyfikacji, izolacji i klonowania promotora roślin. Ponadto opisujemy charakterystykę promotora specyficznego dla guzków w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej.

Analiza promotora roślin: identyfikacja i charakterystyka promotora specyficznego dla brodawek korzeniowych w fasoli zwyczajnej

Ten protokół dostarcza kroków eksperymentalnych i informacji o odczynnikach, sprzęcie i narzędziach analitycznych dla badaczy, którzy są zainteresowani przeprowadzeniem analizy porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) na bazie całego genomu zmian liczby kopii u roślin.

Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium za pomocą metody zanurzania kwiatów może być z powodzeniem wykorzystana do stworzenia stabilnych linii transgenicznych modelu ekstremofitu Schrenkiella parvula. Przedstawiamy protokół zmodyfikowany w stosunku do tego dla Arabidopsis thaliana, biorąc pod uwagę różne nawyki wzrostu i cechy fizjologiczne ekstremofitu.

Wzrost roślin i przemiana kwiatowa za pośrednictwem Agrobacterium ekstremofitu Schrenkiella parvula

Ze względu na jej wszechstronne zastosowanie jako gatunku modelowego w różnych dziedzinach nauki, istnieje potrzeba stworzenia zestawu narzędzi do transformacji genetycznej u babki lancetowatej (Plantago lanceolata). Tutaj, przy użyciu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens, przedstawiono protokół, w wyniku którego powstają stabilne linie transgeniczne o wydajności transformacji wynoszącej 20%.

Transformacja genetyczna babki wąskolistnej za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens

W tym badaniu, w bambusie opracowano nowatorską metodę ekspresji genów planta i edycji genów, w której pośredniczy Agrobacterium. Metoda ta znacznie poprawiła skuteczność walidacji funkcji genów w bambusie, co ma znaczące implikacje dla przyspieszenia procesu hodowli bambusa.

W Planta Ekspresja genów i edycja genów w liściach bambusa Moso

Protokół opisuje indukcję owłosionych korzeni za pomocą łodyg kwiatostanu Arabidopsis i hipokotyli Brassica napus. Owłosione korzenie mogą być hodowane i wykorzystywane jako eksplantaty do regeneracji roślin transgenicznych.

Transformacja i regeneracja korzeni owłosionych u Arabidopsis thaliana i Brassica napus

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Opisujemy tutaj stosunkowo szybkie i proste podejście do mapowania czasu replikacji ssaków w całym genomie, od izolacji komórki do podstawowej analizy wyników sekwencjonowania. Mapa genomiczna reprezentatywnego programu replikacji zostanie dostarczona zgodnie z protokołem.

Określenie czasu replikacji ssaków w całym genomie za pomocą pomiaru zawartości DNA

Poznaj protokół transformacji Agrobacterium i edycji genomu CRISPR/Cas9 w drzewie Parasponia andersonii. Metoda umożliwia generowanie stabilnych linii transgenicznych do badań symbiozy z rizobium.

Transformacja, edycja genomu i fenotypowanie tropikalnego drzewa Cannabaceae Parasponia andersonii wiążącego azot

Przeglądaj więcej filmów