Transformacja, edycja genomu i fenotypowanie tropikalnego drzewa Cannabaceae Parasponia andersonii wiążącego azot

Parasponia to tropikalne drzewo z rodziny konopi, które jest w stanie ustanowić symbiozę wiążącą azot z rhizobium. Badania porównawcze między parasponią a roślinami strączkowymi mogą dostarczyć informacji na temat podstawowych sieci genetycznych leżących u podstaw symbiozy ryzobium. Dzięki temu protokołowi stabilne transgeniczne linie mutantów Parasponia andersonii mogą zostać wygenerowane w okresie od dwóch do trzech miesięcy.

Linie te mogą być skutecznie rozmnażane poprzez rozmnażanie in vitro. Protokół ten stanowi eksperymentalną platformę do badania symbiozy ryzobialnej, a także innych aspektów biologii tego tropikalnego drzewa. Podstawowe umiejętności w zakresie hodowli tkankowej i klonowania molekularnego są wystarczające do wdrożenia tego protokołu.

Dzięki temu każde laboratorium może zaadaptować Parasponię jako model badawczy. Procedurę zademonstrują doktoranci Titis Wardhani i Yuda Roswanjaya wraz z Marijke Hartog, technikiem w naszym laboratorium. Aby wyhodować drzewa Parasponia andersonii, zacznij od wykiełkowania nasion.

Usuń nasiona z jagód Parasponia, pocierając je o wnętrze sitka do herbaty lub zgniatając je na kawałku bibuły. Zdezynfekuj nasiona za pomocą 4% wybielacza podchlorynowego przez 15 do 20 minut, a następnie umyj nasiona sześć razy wysterylizowaną wodą. Przenieś nasiona do sterylnych probówek PCR o pojemności 200 mikrolitrów i napełnij probówki wysterylizowaną wodą, aby zanurzyć nasiona.

Inkubuj probówki przez 10 dni w termocyklerze zgodnie z instrukcjami manuskryptu. Po 10-dniowej inkubacji przenieś nasiona na płytki SH-0 i zamknij je dwiema warstwami elastycznej folii uszczelniającej, aby zapobiec wysuszeniu. Inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza z 16-godzinnym cyklem dnia i ośmiogodzinnej nocy przez trzy do czterech tygodni.

Gdy sadzonki rozwiną pierwszy zestaw prawdziwych liści, przenieś je do doniczek wypełnionych komercyjną ziemią doniczkową i przykryj półprzezroczystym plastikowym kubkiem, aby zapobiec wysuszeniu. Umieść doniczki w pomieszczeniu o temperaturze 28 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 85% lub szklarni w reżimie 16 godzin dziennie i ośmiu godzin nocy. Po tygodniu wyjmij plastikowy kubek.

Regularnie podlewaj doniczki i uzupełniaj nawozem, aby podtrzymać wzrost drzew. Przygotuj się do transformacji, zbierając młode pięcio- lub ośmiocentymetrowe gałęzie z drzew uprawianych w szklarni, upewniając się, że używasz tylko zdrowych, niezainfekowanych gałęzi. Odetnij liście, pozostawiając jeden centymetr kwadratowy tkanki liścia na końcu każdego ogonka.

Dezynfekuj tkankę przez 15 minut 2% wybielaczem podchlorynowym zawierającym kilka kropli polisorbatu 20, a następnie spłucz ją osiem razy wodą z autoklawizem. Ponownie zawiesić komórki Agrobacterium w 25 mililitrach pożywki infiltracyjnej do gęstości optycznej około pięciu. Pokrój łodygę i tkankę ogonka liściowego na jednocentymetrowe kawałki wewnątrz zawiesiny komórkowej.

Usuń tkanki liści i inkubuj kawałki łodygi i ogonków liściowych w zawiesinie komórkowej przez 10 do 30 minut. Wysuszyć kawałki tkanek na sterylnym kawałku bibuły filtracyjnej i umieścić je na podłożu ukorzeniającym przygotowanym zgodnie z instrukcjami rękopisu. Inkubuj płytki w ciemności w temperaturze 21 stopni Celsjusza przez dwa dni.

Po dwóch dniach sprawdź płytki pod kątem zanieczyszczenia grzybiczego lub bakteryjnego i wyrzuć zanieczyszczone płytki. Przenieść kawałki tkanek do 10 mililitrów pożywki SH-10 przygotowanej zgodnie z instrukcjami rękopisu. Pozostaw chusteczkę w podłożu na co najmniej 10 minut i delikatnie mieszaj co dwie do trzech minut w celu umycia.

Przygotować podłoże ukorzeniające z cefotaksymem i kanamycyną zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i wlać płytki. Wysuszyć chusteczki na sterylnych kawałkach bibuły filtracyjnej i przenieść je na płytki. Inkubuj płytki przez siedem dni w temperaturze 28 stopni Celsjusza w schemacie 16 godzin dziennie i ośmiu godzin nocy.

Co dwa dni sprawdzaj tabliczki pod kątem zanieczyszczenia grzybiczego lub bakteryjnego. Jeśli dojdzie do zanieczyszczenia, niezakażone kawałki tkanki przenieść na nową płytkę. Po siedmiu dniach przenieść fragmenty tkanek na pożywkę do rozmnażania przygotowaną zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza w reżimie 16 godzin w dzień i osiem godzin w nocy.

Odświeżaj płytki raz w tygodniu, aż rozwiną się pędy transgeniczne, upewniając się, że przenosisz tylko niezainfekowane fragmenty tkanek na nowe płytki. Gdy przypuszczalne pędy transgeniczne osiągną co najmniej jeden centymetr długości, odetnij pędy i hoduj je niezależnie w pożywce rozmnożeniowej z antybiotykami. Aby upewnić się, że pędy reprezentują niezależne transformanty, weź tylko jeden pęd z każdej strony eksplantu.

Rozmnażać tkankę, umieszczając około 10 pędów na świeżej płytce pożywki rozmnożeniowej i zamykając płytkę dwiema warstwami elastycznej folii uszczelniającej. Inkubuj płytki w temperaturze 28 stopni Celsjusza w schemacie 16 godzin w dzień i osiem godzin w nocy i powtarzaj ten krok co cztery tygodnie. Gdy pędy osiągną jeden centymetr długości, odetnij je u podstawy i umieść na podłożu ukorzeniającym.

Ustaw pędy pionowo, wkładając podstawową końcówkę pędu do podłoża. Na jednej płytce można umieścić około 10 pędów. Zacznij od przygotowania inokulum rhizobium.

Zaszczepić 10 mililitrów płynnej pożywki YEM z pojedynczej kolonii Mesorhizobium plurifarium BOR2 i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwa dni. Użyj tej kultury, aby zaszczepić większą objętość płynnej pożywki YEM. Po wyhodowaniu odwiruj kulturę bakteryjną przez 10 minut w temperaturze 3 500 g w celu zebrania komórek.

Ponownie zawiesić osad bakteryjny w ciekłym podłożu EKM i określić gęstość optyczną. Przygotuj trzy litry pożywki EKM, która wystarcza na około 20 doniczek i zaszczep ją zawiesiną ryzobialną. Wymieszaj podłoże z 1,25 kilograma perlitu i dodaj 210 gramów tej mieszaniny do sterylnych półprzezroczystych garnków polipropylenowych.

Posadź od jednej do trzech sadzonek Parasponia andersonii do każdej doniczki i przygotuj kilka doniczek z sadzonkami przekształconymi za pomocą konstruktu kontrolnego. Zważ kilka doniczek i przykryj dno każdej doniczki, aby chronić korzenie przed światłem. Inkubuj doniczki w klimatyzowanym pomieszczeniu do uprawy w temperaturze 28 stopni Celsjusza w reżimie 16 godzin dziennie i ośmiu godzin w nocy przez cztery do sześciu tygodni.

Raz w tygodniu zważ kilka doniczek, aby określić utratę wody. Jeśli utrata wody przekracza 10 mililitrów, uzupełnij ją ultraczystą wodą, aby zrekompensować ubytek. Po inkubacji oczyść korzenie z perlitu i określ liczbę guzków za pomocą lornetki.

Technika ta została wykorzystana do skutecznego przekształcenia ogonków liściowych i segmentów łodyg Parasponia andersonii za pomocą szczepu Agrobacterium AGL1. Najpierw eksplantaty tkankowe są współuprawiane z Agrobacterium przez dwa dni. Długotrwała kohodowla powoduje nadmierną kolonizację bakterii i należy jej zapobiegać.

Kilka tygodni później na pierwotnej powierzchni rany obserwuje się małe zielone mikrokalusy. Te kalusy nadal rosną i rozwijają jeden lub więcej przypuszczalnie przekształconych pędów po sześciu do ośmiu tygodniach od rozpoczęcia transformacji. Wydajność przemiany waha się od 10 do 30% w przypadku eksplantatów tkankowych z dojrzałych gałęzi do 65 do 75% w przypadku eksplantatów tkankowych z młodych i szybko rosnących gałęzi.

Pędy transgeniczne można rozmnażać poprzez rozmnażanie in vitro, w wyniku czego w ciągu miesiąca powstają dziesiątki pędów. Pędy te można umieścić na podłożu ukorzeniającym, które wywoła ukorzenienie w ciągu około dwóch tygodni i da rośliny, które można wykorzystać do eksperymentów. Rozpoczynając eksperyment ze stabilną transformacją, ważne jest, aby wybrać zdrowe gałęzie jako materiał źródłowy.

Linie transgeniczne Parasponia T0 rozmnaża się in vitro. Dlatego tak ważne jest dokładne genotypowanie linii transgenicznych Parasponia. Ustanowienie Parasponia jako modelu eksperymentalnego pozwala na analizę porównawczą między dwiema daleko spokrewnionymi liniami guzkowatymi, Parasponią i roślinami strączkowymi.

Pozwoli to zidentyfikować konserwatywne sieci genetyczne leżące u podstaw symbiozy rhizobium. Parasponia może być również cennym modelem do badania innych tematów badawczych, takich jak tworzenie drewna, rozwój kwiatów biseksualnych lub biosynteza metabolitów wtórnych specyficznych dla Cannabaceae.