Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Nasza metoda jest jedną z pierwszych, która jest w stanie przeanalizować genetyczne podstawy różnic w cechach w skali całego genomu między gatunkami, a nie w obrębie gatunku. Głównymi zaletami tej techniki jest wysoka przepustowość, wysoka rozdzielczość i szerokie zastosowanie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać szczep zapasowy JR507 z zamrażarki z magazynu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i rozprowadzić go na pojedyncze kolonie na płytce agarowej YPD.

Inkubować w temperaturze 26 stopni Celsjusza przez dwa dni lub do momentu pojawienia się kolonii. Następnie zaszczepić 100 mililitrów płynnego YPD w szklanej kolbie o pojemności 250 mililitrów pojedynczą kolonią JR507 i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 200 obr./min przez 24 godziny lub do osiągnięcia fazy stacjonarnej. Następnego dnia zmierz od600 z nocnej hodowli.

Ponownie rozcieńczyć część nocnej kultury ze świeżym płynem YPD do nowej kolby o pojemności jednego litra, aby stworzyć nową kulturę o od600 punktu zerowego dwa i objętości 500 mililitrów. Powtórz ten proces jeszcze trzy razy, aby utworzyć w sumie cztery kultury z od600 punktu zerowego dwa, używając tej samej kultury nocnej dla wszystkich nowych kultur. Inkubuj wszystkie kultury w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez sześć godzin, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.

Następnie połącz dwie z 500 mililitrowych kultur, aby utworzyć kulturę o pojemności jednego litra. Połącz pozostałe dwie kultury o pojemności 500 mililitrów, aby utworzyć drugą kulturę o pojemności jednego litra. Najpierw podziel każdą z litrowych kultur na 20 50-mililitrowych podwielokrotności każda w plastikowej stożkowej probówce, co daje w sumie 40 probówek.

Odłóż na bok 20 probówek. Odwirować pozostałe 20 probówek o sile 1000 razy G przez trzy minuty, aby osadzać komórki drożdży. Odrzuć supernatant i ponownie zamieszaj każdą granulkę z 25 mililitrami sterylnej wody przez wirowanie.

Wirować w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę z pięcioma mililitrami 1X Tris-EDTA punkt zerowy jeden molowy bufor octanu litu przez wirowanie. Wirować w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty.

Odrzuć supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę za pomocą pięciu mililitrów 1X Tris-EDTA punkt zerowy jeden molowy bufor octanu litu przez wirowanie. Wirować w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty. Podczas wirowania komórek przygotuj co najmniej 120 mililitrów roztworu zawierającego glikol polietylenowy, octan litu i bufor Tris-EDTA.

Przechowywać ten roztwór na lodzie. Aby przygotować DNA osocza do transformacji, najpierw gotuj cztery mililitry DNA plemników łososia w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie natychmiast schłodzić go na lodzie przez pięć minut.

Wymieszaj 20 mililitrów pJR487 w stężeniu 538 nanogramów na mililitr z czterema mililitrami DNA plemników zimnego łososia. Trzymaj tę mieszaninę na lodzie, aż będzie gotowa do użycia. Następnie dodaj 600 mikrolitrów mieszaniny osocza i DNA plemników na wierzch każdej osadki komórki.

Dodaj trzy mililitry mieszaniny octanu litu PEG TE do każdej granulki. Zawieszamy przez pipetowanie w górę iw dół, a następnie wirowanie. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie poddaj każdą rurkę szokowi cieplnemu w łaźni wodnej w temperaturze 39 stopni Celsjusza przez 26 minut, upewniając się, że każda rurka jest odwracana co kilka minut. Odwirować probówki w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę w 10 mililitrach YPD przez wirowanie.

Następnie połącz wszystkie 20 probówek w nowej szklanej kolbie. Dodaj 433 punkty cztery mililitry płynu YPD do nowej jednolitrowej szklanej kolby. Następnie przenieś 66 punktów sześć mililitrów komórek do kolby.

Powtórz ten proces przenoszenia jeszcze dwa razy, aby wykorzystać całą objętość przekształconych komórek. Następnie zmierz od600 każdej nowej 500-mililitrowej kultury. Inkubuj wszystkie trzy kultury w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwie godziny, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.

Następnie dodaj punkt zerowy, pięć mililitrów po 300 miligramów na mikrolitr G418 do każdej z kolb do końcowego stężenia 300 mikrogramów na mililitr. Umieścić kolby z powrotem w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28 stopni Celsjusza i prędkości 200 obr./min. Powtórz cały ten proces z pozostałymi 20 stożkowymi rurkami.

W tym momencie powinno być sześć jednolitrowych kolb, z których każda zawiera 500 mililitrów ogniw z dodatkiem G418. Inkubować wszystkie sześć kolb w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 200 obr./min przez około dwa dni lub do momentu, gdy w każdej kolbie zostanie osiągnięty od600 o wartości około dwóch punktów trzech. Następnie połącz ze sobą wszystkie sześć kolb, aby stworzyć jedną kulturę.

Użyj tej połączonej kultury, aby zaszczepić dwie nowe jednolitrowe kolby z 500 mililitrami YPD i G418 do od600 punktu zerowego dwa. Inkubuj te nowe kultury przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 200 obr./min, aż osiągnie od600 około dwóch punktów dwóch. Następnie połącz obie kultury w jedną kulturę i zmierz od600 połączonej kultury.

Odwirować 25 mililitrów tej kultury w 1000 razy G przez trzy minuty. Oblicz całkowitą liczbę jednostek od600 komórek, które znajdują się w 25 mililitrach, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w wystarczającej ilości wody, aby utworzyć zawiesinę komórek o od600 o wartości jednego punktu osiem pięć na mililitr.

Używając szklanych kulek, umieść jeden mililitr zawieszonych komórek na każdej z 12 dużych, kwadratowych, kompletnych syntetycznych płytek agarowych z 5-FOA. Inkubuj każdą płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni lub do momentu, gdy na talerzu utworzy się trawnik. Następnie użyj małych sterylnych ściągaczek, aby zeskrobać komórki z połowy płytki i do probówki zawierającej 35 mililitrów sterylnej wody.

Powtórz ten proces dla pozostałych sześciu płytek, w wyniku czego dwie probówki z komórkami znajdą się w wodzie. Połączyć zawiesiny komórek w jedną kolbę i zmierzyć od600 w zawiesinie, używając wody jako ślepej próby. Użyj wody, aby dostosować stężenie komórek, aż od600 osiągnie 44 punkty cztery na mililitr.

Następnie przygotuj zapasy komórek w zamrażarce i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, jak opisano w protokole tekstowym. W tym badaniu S.Cerevisiae i S.Paradoxus są łączone w celu utworzenia sterylnej hybrydy, która jest poddawana transpozycji podczas mutagenezy. Każdy mutagenizowany klon jest hemizygotą, diploidalną hybrydą, w której jeden allel jednego genu jest zaburzony.

Hemizygoty są konkurujące w wysokiej temperaturze, a DNA jest izolowane z każdej kultury. DNA jest marszczone i ligowane do adapterów, a połączenie między transpozonem a genomem jest amplifikowane starterem specyficznym dla transpozonu i starterem specyficznym dla adaptera. Zliczając sekwencjonowanie zbiorcze, odczyt zlicza się z amplikonu, zgłasza przydatność klonu w populacji.

Mając w ręku wyniki tego sekwencjonowania, obfitość hemizygot dla danego genu może być porównana w dwóch temperaturach między dwiema klasami hemizygot. Klony, w których tylko allel S.Cerevisiae był typu dzikiego i funkcjonalny, oraz klony opierające się tylko na allelu S.Paradoxus. W tej reprezentatywnej implementacji wykrywane są silne sygnały w ośmiu genach porządkowania.

W każdym przypadku insercje transpozonów w allelu S. Cerevisiae w hybrydzie upośledzały wzrost w wysokiej temperaturze. Te niskie si reprezentowały kandydujące determinanty cechy termotolerancji, która odróżnia S.Cerevisiae od S.Paradoxus. Teraz, gdy zakończyliśmy ten eksperyment, możemy przeanalizować inne cechy, które różnią się między tymi gatunkami, takie jak tolerancja na zimno lub sól.