Name: Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Odkryj metodę RH-seq do mapowania różnic genetycznych między gatunkami Saccharomyces. Technika ta umożliwia analizę termotolerancji drożdży na skalę całego genomu z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy J. Roopowi, R. Hackleyowi, I. Grigorievowi, A. Arkinowi i J. Skerkerkowi za ich wkład w oryginalne badanie, F. AlZabenowi, A. Flury'emu, G. Geiselmanowi, J. Hongowi, J. Kimowi, M. Maurerowi i L. Oltrogge za pomoc techniczną, D. Savage'owi za hojność w zakresie zasobów mikroskopowych, oraz B. Blackmanowi, S. Coradettiemu, A. Flamholzowi, V. Guacci, D. Koshlandowi, C. Nelsona i A. Sasikumara za dyskusje; Dziękujemy również J. Dueberowi (Wydział Bioinżynierii, UC Berkeley) za plazmid PiggyBac. Prace te były wspierane przez R01 GM120430-A1 oraz przez Community Sequencing Project 1460 dla RBB w Joint Genome Institute Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych, DOE Office of Science User Facility. Prace prowadzone przez tę ostatnią były wspierane przez Biuro Nauki Departamentu Energii USA w ramach umowy nr 1. DE-AC02-05CH11231.

<ol><li>Flint, J., Mott, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+molecular+basis+of+quantitative+traits%3A+successes+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Finding the molecular basis of quantitative traits: successes and pitfalls.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 437-445 (2001).</li>
<li>Allen Orr, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+species+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genetics of species differences.</a> Trends in Ecology and Evolution. 16, 343-350 (2001).</li>
<li>Weiss, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+interspecific+differences+in+yeast+thermotolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of interspecific differences in yeast thermotolerance.</a> Nature Genetics. 50, 1501-1504 (2018).</li>
<li>Stern, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+loci+that+cause+phenotypic+variation+in+diverse+species+with+the+reciprocal+hemizygosity+test%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of loci that cause phenotypic variation in diverse species with the reciprocal hemizygosity test.</a> Trends in Genetics. 30, 547-554 (2014).</li>
<li>Steinmetz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+architecture+of+a+quantitative+trait+locus+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dissecting the architecture of a quantitative trait locus in yeast.</a> Nature. 416, 326-330 (2002).</li>
<li>Scannell, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Awesome+Power+of+Yeast+Evolutionary+Genetics%3A+New+Genome+Sequences+and+Strain+Resources+for+the+Saccharomyces+sensu+stricto+Genus%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensu stricto Genus.</a> G3 (Bethesda). 1, 11-25 (2011).</li>
<li>Wetmore, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+mutant+fitness+in+diverse+bacteria+by+sequencing+randomly+bar-coded+transposons%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of mutant fitness in diverse bacteria by sequencing randomly bar-coded transposons.</a> MBio. 6, e00306-e00315 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 550(2014).</li>
<li>Wilkening, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+high-throughput+approaches+to+QTL+mapping+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">An evaluation of high-throughput approaches to QTL mapping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 196, 853-865 (2014).</li>
<li>Kim, H. S., Huh, J., Riles, L., Reyes, A., Fay, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noncomplementation+screen+for+quantitative+trait+alleles+in+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A noncomplementation screen for quantitative trait alleles in saccharomyces cerevisiae.</a> G3 (Bethesda). 2, 753-760 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przewaga RH-seq nad dotychczasowymi metodami statystyczno-genetycznymi jest kilkukrotna. W przeciwieństwie do analizy sprzężeń i asocjacji, RH-seq zapewnia rozdzielczość mapowania pojedynczego genu; W związku z tym będzie prawdopodobnie bardzo przydatny nawet w badaniach nad zmiennością cech u osobników danego gatunku, a także różnicami międzygatunkowymi. Ponadto wcześniejsze próby analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu wykorzystywały zbiory mutantów delecji genów, z których niektóre zawierają wtórne mutacje, ...

Od zarania tej dziedziny, głównym celem genetyki było zrozumienie mechanistycznych podstaw zmienności wśród dzikich osobników. Gdy mapujemy loci leżące u podstaw interesującej nas cechy, pojawiające się geny mogą być natychmiast wykorzystane jako cele w diagnostyce i lekach, a także mogą rzucić światło na zasady ewolucji. Standardem branżowym w tym celu jest testowanie związku między genotypem a fenotypem w całej populacji poprzez powiązanie lub asocjację1. Choć podejścia te są potężne, mają jedno kluczowe ograniczenie - opierają się na dużych panelach rekombinowanego potomstwa z krzyżówek między osobnikami interpłodnymi. Nie są one przydatne w badaniach nad gatunkami, które nie mogą łączyć się w pary, aby stworzyć potomstwo. W związku z tym dziedzina ta ma niewielkie możliwości bezstronnej analizy różnic cech między gatunkami izolowanymi reprodukcyjnie2.
W tej pracy przedstawiamy techniczne podstawy nowej metody, RH-seq3, do badań w skali genomu genetycznych podstaw zmienności cech między gatunkami. To podejście jest masowo równoległą wersją testu wzajemnej hemizygoty4,5, który został po raz pierwszy pomyślany jako sposób oceny fenotypowych skutków różnic allelicznych między dwoma genetycznie odrębnymi tłami w określonym locus (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). W tym schemacie dwa rozbieżne osobniki są najpierw łączone, aby utworzyć hybrydę, której połowa genomu pochodzi od każdego z odpowiednich rodziców. W tym tle generowanych jest wiele szczepów, z których każdy zawiera przerwaną lub usuniętą kopię allelu locus każdego z rodziców. Szczepy te są hemizygotyczne, ponieważ pozostają diploidalne w całym genomie, z wyjątkiem miejsca zainteresowania, gdzie są uważane za haploidalne, i są określane jako wzajemne, ponieważ każdy z nich nie ma tylko allelu jednego rodzica, a pozostały allel pochodzi od drugiego rodzica. Porównując fenotypy tych wzajemnych szczepów hemizygoty, można wywnioskować, czy warianty sekwencji DNA w manipulowanym locus przyczyniają się do cechy będącej przedmiotem zainteresowania, ponieważ warianty w locus są jedyną różnicą genetyczną między wzajemnymi szczepami hemizygoty. W ten sposób możliwe jest powiązanie różnic genetycznych między gatunkami z różnicą fenotypową między nimi w dobrze kontrolowanym układzie eksperymentalnym. Do tej pory zastosowania tego testu były w ramach genu kandydującego - to znaczy przypadków, w których istnieje już hipoteza, że naturalna zmienność w locus kandydata może wpływać na cechę.
W dalszej części przedstawiamy protokół badania przesiewowego wzajemnej hemizygotyczności w skali genomu, używając drożdży jako systemu modelowego. Nasza metoda tworzy genomowe uzupełnienie mutantów hemizygoty, generując żywotne, sterylne hybrydy F1 między gatunkami i poddając je mutagenezie transpozonów. Łączymy hemizygoty, mierzymy ich fenotypy w testach opartych na sekwencjonowaniu i testujemy różnice w częstości występowania między klonami puli zawierającymi allele dwojga rodziców danego genu. Rezultatem jest katalog loci, w których warianty między gatunkami wpływają na cechę będącą przedmiotem zainteresowania. Wdrażamy przepływ pracy RH-seq, aby wyjaśnić genetyczne podstawy różnic w termotolerancji między dwoma pączkującymi gatunkami drożdży, Saccharomyces cerevisiae i S. paradoxus, które rozdzieliły się ~5 milionów lat temu6.

<table><tbody><tr><td>1-2 plazmidowe zestawy Gigaprep</td><td>Zymo Research</td><td>D4204</td><td>Liczba wymaganych zestawów zależy od tego, jak wydajne są twoje przygotowania w każdym zestawie. Ten zestaw jest dostarczany z 5 indywidualnymi kolumnami do przygotowania plazmidu. Przepuść 1 l nasyconej kultury E. coli przez każdą kolumnę przygotowawczą, ponieważ użycie więcej niż 1 l na kolumnę może spowodować zatkanie filtra przygotowawczego, prowadząc do niskiej wydajności i niskiej jakości DNA.</td></tr><tr><td>10X bufor Tris-EDTA (TE) (100 mM Tris-HCl i 10 mM EDTA)</td> <td>Dowolny</td> filtr <td>N / A</td><td>sterylizuje przez 0,22 &mu; m filtr przed użyciem.</td></tr><tr><td>1M LiOAc</td><td>Dowolny</td> filtr <td>N/A</td><td>sterylizuje przez 0,22 &mu; m filtr przed użyciem.</td></tr><tr><td>300 mg/ml Geneticin (G418)</td><td>Gibco</td><td>11811023</td><td></td></tr><tr><td>52% glikol polietylenowy (PEG) 3350</td><td>Sigma</td><td>1546547</td><td>Rozpuść w wodzie i przefiltruj sterylizować przez 0,22 &mu; m filtr przed użyciem. 1X trafo mix: 228 uL 52% PEG, 36 uL 1M LiOAc, 36 uL 10X TE</td></tr><tr><td>buffer Autoklawizowany płynny bulion LB</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Przygotuj płynny bulion LB przy użyciu proszku dowolnej marki i wody miliQ. Autoklawuj go przed użyciem.</td></tr><tr><td>Zapas karbenicyliny w wodzie (100 mg / ml)</td> <td>Dowolny</td> filtr <td>N / A</td><td>sterylizować przez 0,22 &mu; m filtr przed użyciem.</td></tr><tr><td>Kompletne syntetyczne płytki agarowe (24,1 cm x 24,1 cm) z kwasem 5-fluoroorotycznym (5-FOA) [0,2% mieszanka aminokwasów drop-out bez uracylu lub drożdżowej zasady azotowej (YNB), 0,005% uracylu, 2% D-glukozy, 0,67% YNB bez aminokwasów, 0,075% 5-FOA]</td><td>5-FOA: Zymo Research, Drop-out mix: US Biological, Uracil: Sigma, D-glukoza: Sigm), YNB: Difco</td><td>5-FOA: F9001-5, Drop-out mix: D9535, Uracyl: U0750, D-glukoza: G8270, YNB: DF0919</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Dowolny</td> szczep <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>E. COLI przenoszący pJR487 (plazmid zawierający piggyBac) CEN-/ARS+ N</td><td></td><td>/A</td><td>Prośba z laboratorium Brem.</td></tr><tr><td>Hybrydowy szczep drożdży JR507 (S. cerevisiae DBVPG1373 x S. paradoxus Z1, URA-/URA-)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Zapytanie z laboratorium Brem.</td></tr><tr><td>Illumina Hiseq 2500</td><td></td><td></td><td>używany do odczytów SE-150</td></tr><tr><td>Duże inkubatory z wytrząsaniem ze zmiennymi ustawieniami temperatury</td><td>Dowolne</td> płytki agarowe <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LB + karbenicylina (100 &mu; g / mL)</td><td>Agar: BD Difco</td><td>Agar: 214010</td><td>Ułóż płytki agarowe LB jak zwykle i dodaj karbenicylinę do 100 &mu; g/ml przed suszeniem.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Fluorymetr kubitowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33240</td><td></td></tr><tr><td>DNA plemników łososia</td><td>Invitrogen</td><td>15632011</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna w temperaturze 39& C</td><td>Dowolna</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania gDNA grzybów drożdżowych</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>Płynne podłoże dekstrozy peptonu drożdżowego (YPD) Pepton</td><td>BD Difco</td><td>Pepton: 211677, Ekstrakt drożdżowy: 212750</td><td>Dodaj sterylizowaną filtrem D-glukozę do 2% po autoklawowaniu.</td></tr><tr><td>Płytki agarowe YPD + G418 (300 &mu; g / mL)</td><td>Agar: BD Difco</td><td>Agar: 214010</td><td>Zrób płytki agarowe YPD jak zwykle i dodaj G418 do 300 &mu; g/ml przed suszeniem.</td></tr><tr><td>Płytki agarowe YPD</td><td>Agar: BD Difco</td><td>Agar: 214010</td><td></td></tr></tbody></table>

mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Głównym celem współczesnej genetyki jest zrozumienie, jak i dlaczego organizmy żyjące na wolności różnią się fenotypem. Do tej pory dziedzina ta poczyniła postępy w dużej mierze dzięki metodom mapowania powiązań i asocjacji, które śledzą związek między wariantami sekwencji DNA a fenotypem w rekombinowanym potomstwie z krzyżowania się osobników gatunku. Podejścia te, choć skuteczne, nie są dobrze dostosowane do różnic w cechach między gatunkami izolowanymi reprodukcyjnie. W tym miejscu opisujemy nową metodę analizy zmienności cech naturalnych w całym genomie, którą można łatwo zastosować do niekompatybilnych gatunków. Nasza strategia, RH-seq, polega na wdrożeniu testu wzajemnej hemizygoty w całym genomie. Wykorzystaliśmy go do zidentyfikowania genów odpowiedzialnych za uderzająco wysoki wzrost temperatury drożdży Saccharomyces cerevisiae w stosunku do ich siostrzanego gatunku S. paradoxus. RH-seq wykorzystuje mutagenezę transpozonów do stworzenia puli wzajemnych hemizygot, które są następnie śledzone przez konkurencję w wysokiej temperaturze za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Nasz przepływ pracy RH-seq, jak opisano tutaj, zapewnia rygorystyczny, bezstronny sposób analizowania starożytnych, złożonych cech w pączkującym kladzie drożdży, z zastrzeżeniem, że potrzebne jest głębokie sekwencjonowanie wymagające dużej ilości zasobów, aby zapewnić pokrycie genomu do mapowania genetycznego. Wraz ze spadkiem kosztów sekwencjonowania, podejście to jest bardzo obiecujące pod względem przyszłego zastosowania u eukariontów.

Skrzyżowaliśmy S. cerevisiae i S. paradoxus, aby utworzyć sterylnego hybryda, którą poddaliśmy mutagenezie transpozonom. Każdy zmutowany klon był hemizygotą, czyli hybrydą diploidalną, w której jeden allel jednego genu jest uszkodzony (Rysunek 1A, Rysunek 2). Przeprowadziliśmy konkurencję hemizygot między sobą poprzez wzrost w temperaturze 39 °C, a w osobnym eksperymencie kontrolnym w temperaturze 28 °C (Ry...

Wzajemna hemizygotyczność poprzez sekwencjonowanie (RH-seq) to nowa, potężna metoda mapowania genetycznych podstaw różnic między gatunkami. Pule hemizygot są generowane przez mutagenezę transpozonów, a ich sprawność jest śledzona poprzez wzrost konkurencyjności przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej długości czasu. Analiza uzyskanych danych wskazuje geny leżące u podstaw tej cechy.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Nasza metoda jest jedną z pierwszych, która jest w stanie przeanalizować genetyczne podstawy różnic w cechach w skali całego genomu między gatunkami, a nie w obrębie gatunku. Głównymi zaletami tej techniki jest wysoka przepustowość, wysoka rozdzielczość i szerokie zastosowanie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać szczep zapasowy JR507 z zamrażarki z magazynu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i rozprowadzić go na pojedyncze kolonie na płytce agarowej YPD.Inkubować w temperaturze 26 stopni Celsjusza przez dwa dni lub do momentu pojawienia się kolonii. Następnie zaszczepić 100 mililitrów płynnego YPD w szklanej kolbie o pojemności 250 mililitrów pojedynczą kolonią JR507 i inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 200 obr./min przez 24 godziny lub do osiągnięcia fazy stacjonarnej. Następnego dnia zmierz od600 z nocnej hodowli.Ponownie rozcieńczyć część nocnej kultury ze świeżym płynem YPD do nowej kolby o pojemności jednego litra, aby stworzyć nową kulturę o od600 punktu zerowego dwa i objętości 500 mililitrów. Powtórz ten proces jeszcze trzy razy, aby utworzyć w sumie cztery kultury z od600 punktu zerowego dwa, używając tej samej kultury nocnej dla wszystkich nowych kultur. Inkubuj wszystkie kultury w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez sześć godzin, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.Następnie połącz dwie z 500 mililitrowych kultur, aby utworzyć kulturę o pojemności jednego litra. Połącz pozostałe dwie kultury o pojemności 500 mililitrów, aby utworzyć drugą kulturę o pojemności jednego litra. Najpierw podziel każdą z litrowych kultur na 20 50-mililitrowych podwielokrotności każda w plastikowej stożkowej probówce, co daje w sumie 40 probówek.Odłóż na bok 20 probówek. Odwirować pozostałe 20 probówek o sile 1000 razy G przez trzy minuty, aby osadzać komórki drożdży. Odrzuć supernatant i ponownie zamieszaj każdą granulkę z 25 mililitrami sterylnej wody przez wirowanie.Wirować w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę z pięcioma mililitrami 1X Tris-EDTA punkt zerowy jeden molowy bufor octanu litu przez wirowanie. Wirować w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty.Odrzuć supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę za pomocą pięciu mililitrów 1X Tris-EDTA punkt zerowy jeden molowy bufor octanu litu przez wirowanie. Wirować w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty. Podczas wirowania komórek przygotuj co najmniej 120 mililitrów roztworu zawierającego glikol polietylenowy, octan litu i bufor Tris-EDTA.Przechowywać ten roztwór na lodzie. Aby przygotować DNA osocza do transformacji, najpierw gotuj cztery mililitry DNA plemników łososia w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie natychmiast schłodzić go na lodzie przez pięć minut.Wymieszaj 20 mililitrów pJR487 w stężeniu 538 nanogramów na mililitr z czterema mililitrami DNA plemników zimnego łososia. Trzymaj tę mieszaninę na lodzie, aż będzie gotowa do użycia. Następnie dodaj 600 mikrolitrów mieszaniny osocza i DNA plemników na wierzch każdej osadki komórki.Dodaj trzy mililitry mieszaniny octanu litu PEG TE do każdej granulki. Zawieszamy przez pipetowanie w górę iw dół, a następnie wirowanie. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Następnie poddaj każdą rurkę szokowi cieplnemu w łaźni wodnej w temperaturze 39 stopni Celsjusza przez 26 minut, upewniając się, że każda rurka jest odwracana co kilka minut. Odwirować probówki w temperaturze 1000 razy G przez trzy minuty. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę w 10 mililitrach YPD przez wirowanie.Następnie połącz wszystkie 20 probówek w nowej szklanej kolbie. Dodaj 433 punkty cztery mililitry płynu YPD do nowej jednolitrowej szklanej kolby. Następnie przenieś 66 punktów sześć mililitrów komórek do kolby.Powtórz ten proces przenoszenia jeszcze dwa razy, aby wykorzystać całą objętość przekształconych komórek. Następnie zmierz od600 każdej nowej 500-mililitrowej kultury. Inkubuj wszystkie trzy kultury w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dwie godziny, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.Następnie dodaj punkt zerowy, pięć mililitrów po 300 miligramów na mikrolitr G418 do każdej z kolb do końcowego stężenia 300 mikrogramów na mililitr. Umieścić kolby z powrotem w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28 stopni Celsjusza i prędkości 200 obr./min. Powtórz cały ten proces z pozostałymi 20 stożkowymi rurkami.W tym momencie powinno być sześć jednolitrowych kolb, z których każda zawiera 500 mililitrów ogniw z dodatkiem G418. Inkubować wszystkie sześć kolb w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wytrząsając przy 200 obr./min przez około dwa dni lub do momentu, gdy w każdej kolbie zostanie osiągnięty od600 o wartości około dwóch punktów trzech. Następnie połącz ze sobą wszystkie sześć kolb, aby stworzyć jedną kulturę.Użyj tej połączonej kultury, aby zaszczepić dwie nowe jednolitrowe kolby z 500 mililitrami YPD i G418 do od600 punktu zerowego dwa. Inkubuj te nowe kultury przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 200 obr./min, aż osiągnie od600 około dwóch punktów dwóch. Następnie połącz obie kultury w jedną kulturę i zmierz od600 połączonej kultury.Odwirować 25 mililitrów tej kultury w 1000 razy G przez trzy minuty. Oblicz całkowitą liczbę jednostek od600 komórek, które znajdują się w 25 mililitrach, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w wystarczającej ilości wody, aby utworzyć zawiesinę komórek o od600 o wartości jednego punktu osiem pięć na mililitr.Używając szklanych kulek, umieść jeden mililitr zawieszonych komórek na każdej z 12 dużych, kwadratowych, kompletnych syntetycznych płytek agarowych z 5-FOA. Inkubuj każdą płytkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez jeden do dwóch dni lub do momentu, gdy na talerzu utworzy się trawnik. Następnie użyj małych sterylnych ściągaczek, aby zeskrobać komórki z połowy płytki i do probówki zawierającej 35 mililitrów sterylnej wody.Powtórz ten proces dla pozostałych sześciu płytek, w wyniku czego dwie probówki z komórkami znajdą się w wodzie. Połączyć zawiesiny komórek w jedną kolbę i zmierzyć od600 w zawiesinie, używając wody jako ślepej próby. Użyj wody, aby dostosować stężenie komórek, aż od600 osiągnie 44 punkty cztery na mililitr.Następnie przygotuj zapasy komórek w zamrażarce i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, jak opisano w protokole tekstowym. W tym badaniu S.Cerevisiae i S.Paradoxus są łączone w celu utworzenia sterylnej hybrydy, która jest poddawana transpozycji podczas mutagenezy. Każdy mutagenizowany klon jest hemizygotą, diploidalną hybrydą, w której jeden allel jednego genu jest zaburzony.Hemizygoty są konkurujące w wysokiej temperaturze, a DNA jest izolowane z każdej kultury. DNA jest marszczone i ligowane do adapterów, a połączenie między transpozonem a genomem jest amplifikowane starterem specyficznym dla transpozonu i starterem specyficznym dla adaptera. Zliczając sekwencjonowanie zbiorcze, odczyt zlicza się z amplikonu, zgłasza przydatność klonu w populacji.Mając w ręku wyniki tego sekwencjonowania, obfitość hemizygot dla danego genu może być porównana w dwóch temperaturach między dwiema klasami hemizygot. Klony, w których tylko allel S.Cerevisiae był typu dzikiego i funkcjonalny, oraz klony opierające się tylko na allelu S.Paradoxus. W tej reprezentatywnej implementacji wykrywane są silne sygnały w ośmiu genach porządkowania.W każdym przypadku insercje transpozonów w allelu S. Cerevisiae w hybrydzie upośledzały wzrost w wysokiej temperaturze. Te niskie si reprezentowały kandydujące determinanty cechy termotolerancji, która odróżnia S.Cerevisiae od S.Paradoxus. Teraz, gdy zakończyliśmy ten eksperyment, możemy przeanalizować inne cechy, które różnią się między tymi gatunkami, takie jak tolerancja na zimno lub sól.

genetic-mapping-thermotolerance-differences-between-species

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Test translokacji stymulowanej przez HO monitoruje proces wyżarzania pojedynczej nici po powstaniu pęknięć obu nici DNA w wielu loci u diploidalnych Saccharomyces cerevisiae. Mechanizm ten może służyć jako model przemieszczeń genomowych w komórkach somatycznych wyższych eukariotów po ekspozycji na wysokie dawki promieniowania jonizującego.

Ilościowe oznaczenie i analiza powstawania translokacji chromosomowych indukowanych przez endonukleazę HO poprzez odżarzanie pojedynczych nici w Saccharomyces cerevisiae

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

NAJLEPSZE: Sekwencjonowanie tetrad z obsługą kodów kreskowych

Przedstawiono strategię generowania mutacji w genach histonów w ich endogennym położeniu u Saccharomyces cerevisiae.

Ukierunkowana mutageneza in situ genów histonów u pączkujących drożdży

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny zmodyfikowanych histonów z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecypitowane DNA jest następnie wykorzystywane do ilościowego PCR w celu zbadania obfitości i lokalizacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) modyfikacji histonów z Saccharomyces cerevisiae

Prezentujemy prosty protokół ekranu tłumiącego w drożdżach rozszczepienia. Metoda ta jest skuteczna, wolna od mutagenów i selektywna w przypadku mutacji, które często występują w pojedynczym locus genomu. Protokół jest odpowiedni do izolowania supresorów, które łagodzą defekty wzrostu w płynnej kulturze, które są spowodowane mutacją lub lekiem.

Wspomagane głębokim sekwencjonowaniem, spontaniczne badanie supresorowe w drożdżach rozszczepienia Schizosaccharomyces pombe

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

W tej pracy opisana jest solidna metoda ilościowego oznaczania efektywności krycia drożdży Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta jest szczególnie przydatna do ilościowego oznaczania barier przedzygotycznych w badaniach specjacji.

Oznaczanie efektywności krycia haploidów u Saccharomyces cerevisiae

Protokół ten zapewnia metodę pomiaru częstotliwości i dystrybucji krzyżowania podczas mejozy u Caenorhabditis elegans. Do określenia pochodzenia chromosomów wykorzystano genotypowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Mapowanie 4-punktowe pozwoliło określić rozkłady krzyżowe regionów lewego, środkowego i prawego ramienia każdego chromosomu. ...

Częstotliwość i dystrybucja krzyżowania się w mejozie Caenorhabditis elegans za pomocą genotypowania SNP przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym

Odkryj metodę RH-seq do mapowania różnic genetycznych między gatunkami Saccharomyces. Technika ta umożliwia analizę termotolerancji drożdży na skalę całego genomu z wysoką rozdzielczością.

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu (Wideo) | JoVE Journal

Mapowanie genetyczne różnic w termotolerancji między gatunkami drożdży Saccharomyces za pomocą analizy wzajemnej hemizygotyczności całego genomu

Przeglądaj więcej filmów