Name: Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj edycję genomu CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa w komórkach krwiotwórczych myszy. Ta metoda umożliwia szybkie i ekonomiczne tworzenie modeli zwierzęcych z określonymi mutacjami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S. S. był wspierany przez stypendium podoktoranckie American Heart Association 17POST33670076. K. W. był wspierany przez granty NIH R01 HL138014, R01 HL141256 i R01 HL139819.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Wirginii.
1. Wytwarzanie i oczyszczanie cząsteczek lentiwirusa
UWAGA: Cząsteczki lentiwirusa zawierające zoptymalizowany przewodnik RNA mogą być wytwarzane za pomocą szczegółowych protokołów dostarczonych przez Addgene: <https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf)>. Zoptymalizowane metody przygotowania i przechowywania lentiwirusa o wysokim mianie są omówione w innym miejscu17,18. Krótko mówiąc, lentiwirusy są wytwarzane przez jednoczesną transfekcję plazmidu wektorowego lentiwirusa, psPAX2 i pMD2.G do komórek HEK 293T. Supernatant hodowli zbiera się po 48 godzinach od transfekcji i zagęszcza przez ultrawirowanie. Miano lentiwirusa określa się za pomocą dostępnego na rynku testu opartego na qPCR. Procedura ta powinna być wykonywana w komorze bezpieczeństwa biologicznego II klasy.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór kolagenu (0,0005%) w proporcji 1:200 w 1x PBS.</li>
	<li>Pokryj 6-dołkową płytkę roztworem kolagenu i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez ~30 min.</li>
	<li>Wysiewać komórki 293T o gęstości 1 x 106 komórek na studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez ~ 2 godziny.</li>
	<li>Aby przygotować mieszaninę trzech plazmidów transfekcyjnych dla jednej studzienki, połącz 0,9 μg wektora lentiwirusa, 0,6 μg psPAX2 i 0,3 μg pMD2.G, a następnie osiągnij całkowitą objętość 10 μl, dodając wodę dejonizowaną. Dostosuj odpowiednio ilości w zależności od liczby dołków. Ilość i stosunek każdego plazmidu może wymagać dalszej optymalizacji, aby odpowiadał potrzebom badaczy.</li>
	<li>Ostrożnie dodać 50 μl 1x PBS i 5 μL rozcieńczonego PEI MAX (1,0 mg/mL) do mieszaniny plazmidu i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) (Tabela 1).</li>
	<li>Dodaj 1 ml DMEM do mieszaniny.</li>
	<li>Odessać pożywkę z płytki 6-dołkowej, dodać 1 ml mieszaniny plazmidu i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez ~ 3 godziny.</li>
	<li>Zastąp pożywkę 2 ml świeżego DMEM i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Dodać 1 ml świeżego DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez dodatkowe 24 godziny (całkowity czas inkubacji wynosi 48 godzin).</li>
	<li>Przenieść supernatant hodowli do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 3 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia wszelkich swobodnie pływających komórek.</li>
	<li>Przefiltrować supernatant przez filtr 0,45 μm.</li>
	<li>Przenieść filtrat do polipropylenowych probówek wirówkowych.</li>
	<li>Ultrawirować w temperaturze 4 °C i 72 100 x g przy rmax przez 3 godziny.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając biały osad.</li>
	<li>Zawiesić osad ze 100 μl pożywki do namnażania komórek krwiotwórczych bez surowicy bez napowietrzania.</li>
	<li>Zachować 10 μl podwielokrotności do pomiaru miana wirusa i przechowywać wszystkie pozostałe podwielokrotności w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie to wymagane.</li>
	<li>Miareczkować wirusa za pomocą testu opartego na qPCR zgodnie z instrukcjami producenta, używając 10 μl podwielokrotności wirusa.</li>
</ol>
2. Izolacja i transdukcja komórek line-ujemnych ze szpiku kostnego myszy (Rysunek 1A)
UWAGA: Zazwyczaj, aby wyizolować wystarczającą ilość komórek, z każdej myszy pobiera się pary piszczeli, kości udowych i ramiennych. Kości miednicy i kręgosłupa mogą być również pobierane jako źródło komórek ujemnych pod względem linii.
<ol>
	<li>Izolacja komórek szpiku kostnego
	<ol>
		<li>Eutanazja 8-10-tygodniowych samców myszy knock-in CRISPR/Cas9 za pomocą 5% izofluranu, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, a następnie dezynfekcja ich skóry 70% etanolem.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj poprzeczne nacięcie w skórze tuż pod klatką piersiową i oderwij skórę dystalnie w obu kierunkach, aby odsłonić nogi i ramiona.</li>
		<li>Ostrożnie oddziel kończyny dolne od kości biodrowej, zwichając staw biodrowy. Przeciąć wzdłuż głowy kości udowej, aby całkowicie usunąć kość udową z biodra. Zwichnąć kolano i przeciąć staw, aby oddzielić kość udową i piszczelową, zachowując nienasadę kości. Zwichnij staw skokowy i oderwij stopę i dodatkowe mięśnie.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć ramię, aby odłączyć kończyny górne. Zwichnij ramię, a następnie przeciąć staw łokciowy, aby pobrać kość ramienną.</li>
		<li>Użyj chusteczek z włókien celulozowych, aby ostrożnie usunąć mięśnie z kości udowych, piszczeli i kości ramiennej. Podejmij dodatkowe środki ostrożności, aby upewnić się, że kości nie pękną podczas tego procesu.</li>
		<li>Umieść odizolowane kości w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej RPMI i umieść na lodzie. 
		UWAGA: Następujące czynności należy wykonać w komorze klasy bezpieczeństwa biologicznego II.</li>
		<li>Przenieś kości do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm.</li>
		<li>Chwyć kość kleszczami i za pomocą nożyczek preparacyjnych ostrożnie przetnij obie nasady. 
		UWAGA: Niewystarczające cięcie doprowadzi do niepełnego wypłukania szpiku kostnego, podczas gdy zbyt agresywne cięcie spowoduje utratę komórek.</li>
		<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml lodowatym RPMI i za pomocą igły 22 G przepłucz szpik kostny z trzonu do nowego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm. 
		UWAGA: Kości staną się białe i półprzezroczyste, jeśli trzon kości został dobrze przepłukany. Jeśli nie, ponownie odetnij końce kości i ponownie przepłucz.</li>
		<li>Po pobraniu całego szpiku kostnego należy sporządzić zawiesinę jednokomórkową, kilkakrotnie przepuszczając szpik kostny przez strzykawkę o pojemności 10 ml z igłą 18 G. Powtórz 10 razy, aby zapewnić zawiesinę jednokomórkową.</li>
		<li>Zawiesinę komórek filtracyjnych przez sitko o pojemności 70 μm do stożkowej rurki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Wirować przy 310 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w odpowiedniej objętości zoptymalizowanego buforu separacyjnego do następnego procesu separacji komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja i transdukcja lentiwirusa komórek line-ujemnych 
	UWAGA: Komórki ujemne pod względem linii myszy są izolowane ze szpiku kostnego myszy transgenicznych Cas9 3 lub innych szczepów myszy, przy użyciu zestawu do zmniejszania linii zgodnie z instrukcjami producenta. Zazwyczaj komórki ujemne pod względem linii stanowią 2%-5% komórek jądrzastych całego szpiku kostnego, a czystość jest zwykle większa niż 90% po izolacji. Izolowane komórki ujemne pod względem linii są hodowane w pożywce do eksploratorium komórek krwiotwórczych bez surowicy, uzupełnionym rekombinowanym mysim TPO o stężeniu 20 ng / ml i rekombinowanym mysim SCF o stężeniu 50 ng / mL, a następnie transdukowane wektorem lentiwirusa przez 16 godzin przy wielokrotności infekcji (MOI) = 100.
	<ol>
		<li>Aby wyizolować komórki o ujemnym wpływie linii, użyj zestawu do zubożenia komórek liniowych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Po izolacji ponownie zawiesić komórki ujemne pod względem linii w 1 ml pożywki do ekspandowania komórek krwiotwórczych bez surowicy.</li>
		<li>Zasiej komórki na płytce 6-dołkowej o gęstości 1,5 x 106 komórek/ml (5 x 10,5 komórek ujemnych linii/myszy).</li>
		<li>Dodać rekombinowane mysie TPO i SCF do studzienek w końcowych stężeniach odpowiednio 20 ng / ml i 50 ng / ml.</li>
		<li>Wstępną inkubację komórek w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez ~ 2 godziny.</li>
		<li>Dodać lentiwirusa w MOI = 100, 4 μg/ml polibrenu i penicyliny/streptomycyny do studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 16-20 godzin (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Następnego dnia zebrać transdukowane komórki lentiwirusa do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 g przez 10 minut.</li>
		<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl RPMI na mysz. Utrzymuj komórki w RT do czasu przeszczepienia myszom (sekcja 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przeszczepienie transdukowanych komórek do śmiertelnie napromieniowanych myszy
<ol>
	<li>W dniu przeszczepu szpiku kostnego należy umieścić myszy biorcy w klatce z ośmioma plasterkami ciasta i poddać je dwóm dawkom napromieniania całego ciała (550 Rad/dawkę, dawka całkowita = 1100 Rad), z około 4 godzinami między każdą sesją napromieniania.</li>
	<li>Po drugiej sesji napromieniania wstrzyknąć transdukowane komórki ujemne linii do każdej znieczulonej myszy biorcy przez splot żyły zaoczodołowej (łącznie 200 μl) za pomocą strzykawki insulinowej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1C).</li>
	<li>Po napromienieniu myszy powinny być trzymane w wysterylizowanych klatkach i zapewnić im miękką dietę oraz wodę pitną uzupełnioną antybiotykami przez 14 dni.</li>
	<li>Po 3-4 tygodniach od przeszczepienia szpiku kostnego należy przeanalizować krew obwodową, aby sprawdzić, czy doszło do wszczepienia transdukowanych komórek dawcy (sekcja 4).</li>
</ol>
4. Ocena chimeryzmu krwi obwodowej
<ol>
	<li>Znieczulić myszy 5% izofluranem i uzyskać próbkę krwi z żyły zaoczodołowej za pomocą kapilar i zebrać ją do probówek K2EDTA (objętość w jednej probówce kapilarnej jest wystarczająca do następnego testu).</li>
	<li>Przenieś 20 μl krwi z probówek K2EDTA do probówek z polistyrenu o pojemności 5 ml z okrągłym dnem i umieść na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 1,5 ml buforu do lizy RBC, aby zlizować czerwone krwinki. Inkubować przez 5 minut na lodzie.</li>
	<li>Aby zneutralizować bufor do lizy, przemyj próbki buforem FACS (1,5 ml/próbkę).</li>
	<li>Wirować przy 609 x g przymaksymalnej prędkości obrotowej przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Inkubować komórki z koktajlem przeciwciał monoklonalnych (rozcieńczonych w 100 μl buforu/próbce FACS) w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Pełna lista przeciwciał znajduje się w sekcji Materiały powyżej.</li>
	<li>Przemyć komórki raz buforem FACS (2 ml/próbkę). Wirować przy 609 x g przymaksymalnej prędkości obrotowej (1 800 obr./min) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Utrwalić komórki buforem utrwalającym zawierającym paraformaldehyd (100 μl/probówkę) przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć komórki raz buforem FACS (3 ml/próbkę). Wirować przy 609 x g przymaksymalnej prędkości obrotowej (1 800 obr./min) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Całkowicie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 400 μl buforu FACS.</li>
	<li>Próbki należy utrzymywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>

<ol><li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+immune+responses+in+mice+lacking+LUBAC-mediated+linear+ubiquitination+in+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells.</a> EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).</li>
<li>Ogilvy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+vav%2C+a+gene+expressed+throughout+the+hematopoietic+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment.</a> Blood. 91, 419-430 (1998).</li>
<li>Meyer, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT3A+Haploinsufficiency+Transforms+FLT3ITD+Myeloproliferative+Disease+into+a+Rapid%2C+Spontaneous%2C+and+Fully+Penetrant+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia.</a> Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).</li>
<li>Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269, 1427-1429 (1995).</li>
<li>Cole, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PML-RARA+requires+DNA+methyltransferase+3A+to+initiate+acute+promyelocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154, 1370-1379 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153, 910-918 (2013).</li>
<li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR%3A+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92(2017).</li>
<li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knock-out+mouse+models+using+long+ssDNA+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors.</a> Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+Gene+Editing+to+Assess+the+Roles+of+Tet2+and+Dnmt3a+in+Clonal+Hematopoiesis+and+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease.</a> Circulation Research. 123, 335-341 (2018).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters.</a> BMC Research Notes. 9 (312), (2016).</li>
<li>Chu, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+primary+immune+cells+using+CrispRGold+and+a+C57BL%2F6+Cas9+transgenic+mouse+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).</li>
<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+hematopoiesis+associated+with+TET2+deficiency+accelerates+atherosclerosis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice.</a> Science. 355, 842-847 (2017).</li>
<li>Sano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2-Mediated+Clonal+Hematopoiesis+Accelerates+Heart+Failure+Through+a+Mechanism+Involving+the+IL-1beta%2FNLRP3+Inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).</li>
<li>Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Hematopoiesis+and+Its+Impact+on+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Journal%22%5BJournal%5D)">Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).</li>
<li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875(2015).</li>
<li>Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+production+and+concentration+of+lentiviral+vectors+to+achieve+high+transduction+in+primary+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells.</a> BMC Biotechnology. 13, 98(2013).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42, e168(2014).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Survey+of+Validation+Strategies+for+CRISPR-Cas9+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.</a> Scientific Reports. 8, 888(2018).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561, 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+a+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+Cas9+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).</li>
<li>Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+double-strand+breaks+induced+by+CRISPR-Cas9+leads+to+large+deletions+and+complex+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.</a> Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).</li>
<li>El-Brolosy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+compensation+triggered+by+mutant+mRNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation.</a> Nature. 568, 193-197 (2019).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTC-bearing+mRNA+elicits+a+genetic+compensation+response+via+Upf3a+and+COMPASS+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components.</a> Nature. 568, 259-263 (2019).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154, 442-451 (2013).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152, 1173-1183 (2013).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).</li>
<li>Fuster, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Mutations+and+Clonal+Hematopoiesis%3A+Unexpected+Potential+New+Drivers+of+Age-Related+Cardiovascular+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease.</a> Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).</li>
<li>Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKahn%2C+JD+%22Blood%22">Blood</a>. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zaletą tego protokołu jest tworzenie modeli zwierzęcych zawierających specyficzne mutacje w komórkach krwiotwórczych w szybki i wysoce opłacalny sposób w porównaniu z konwencjonalnymi metodami transgenicznymi na myszach. Stwierdzono, że metodologia ta umożliwia generowanie myszy z manipulacją genami komórek krwiotwórczych w ciągu 1 miesiąca. W tym protokole jest kilka krytycznych kroków, które wymagają dalszego rozważenia.
Badania przesiewowe sekwencji gRNA 
<p class="jove...

Wiele badań z zakresu hematologii i immunologii opiera się na dostępności genetycznie modyfikowanych myszy, w tym konwencjonalnych i warunkowo transgenicznych/nokautujących myszy, które wykorzystują specyficzne dla układu krwiotwórczego sterowniki Cre, takie jak Mx1-Cre, Vav-Cre i inne1,2,3,4,5. Strategie te wymagają stworzenia nowych szczepów myszy, co może być czasochłonne i obciążające finansowo. Podczas gdy rewolucyjne postępy w technologii edycji genomu umożliwiły wygenerowanie nowych szczepów myszy w ciągu zaledwie 3-4 miesięcy dzięki odpowiedniej wiedzy technicznej6,7,8,9, potrzeba znacznie więcej czasu, aby amplifikacja kolonii myszy została przeprowadzona przed rozpoczęciem eksperymentów. Ponadto procedury te są kosztowne. Na przykład Jackson Laboratory podaje obecną cenę usług generowania myszy knock-out na poziomie 16 845 USD za szczep (stan na grudzień 2018 r.). W związku z tym metody, które są bardziej ekonomiczne i wydajne niż konwencjonalne mysie podejścia transgeniczne, są korzystniejsze.
Technologia CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9) doprowadziła do opracowania nowych narzędzi do szybkiej i efektywnej edycji genomu opartego na RNA, specyficznej dla sekwencji. Pierwotnie odkryty jako bakteryjny adaptacyjny mechanizm immunologiczny do niszczenia atakującego DNA patogenu, system CRISPR/Cas9 został wykorzystany jako narzędzie zwiększające skuteczność edycji genomu w komórkach eukariotycznych i modelach zwierzęcych. Zastosowano szereg podejść do przesyłania maszynerii CRISPR/Cas9 do hematopoetycznych komórek macierzystych (tj. elektroporacja, nukleofekcja, lipofekcja, dostarczanie wirusa i inne).
Tutaj system lentiwirusowy jest używany do transdukcji komórek ze względu na jego zdolność do skutecznego infekowania mysich hematopoetycznych komórek macierzystych z ekspresją Cas9 i pakowania razem przewodnika ekspresji RNA, promotorów, sekwencji regulatorowych i genów kodujących fluorescencyjne białka reporterowe (np. GFP, RFP). Za pomocą tej metody uzyskano edycję genów ex vivo krwiotwórczych komórek macierzystych myszy, a następnie udaną rekonstytucję szpiku kostnego u śmiertelnie napromieniowanych myszy10. Wektor lentiwirusowy zastosowany w tym badaniu wykazuje ekspresję genów reporterowych Cas9 i GFP ze wspólnego rdzeniowego promotora EF1a z wewnętrznym rybosomalnym miejscem wejścia przed genem reporterowym. Sekwencja przewodnikowego RNA jest wyrażana z oddzielnego promotora U6. System ten jest następnie wykorzystywany do tworzenia mutacji insercyjnych i delecyjnych w kandydujących genach napędzających hematopoezę klonalną Tet2 i Dnmt3a10. Jednak wydajność transdukcji tą metodą jest stosunkowo niska (~5%-10%) ze względu na duży rozmiar wstawki wektorowej (13 Kbp), który ogranicza wydajność transdukcji i zmniejsza miano wirusa podczas produkcji.
W innych badaniach wykazano, że większy rozmiar wirusowego RNA negatywnie wpływa zarówno na produkcję wirusa, jak i na efektywność transdukcji. Na przykład, wzrost rozmiaru wkładki o 1 kb zmniejsza produkcję wirusa o ~50%, a wydajność transdukcji spadnie do ponad 50% w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy11. Dlatego korzystne jest maksymalne zmniejszenie rozmiaru wstawki wirusowej, aby poprawić wydajność systemu.
To niedociągnięcie można przezwyciężyć poprzez zastosowanie transgenicznych myszy Cas9, u których białko Cas9 jest wyrażane w sposób konstytutywny lub indukowalny12. Składowe myszy knock-in CRISPR / Cas9 eksprymują endonukleazę Cas9 i EGFP z promotora CAG w locus Rosa26 w powszechny sposób. W ten sposób konstrukt z sgRNA pod kontrolą promotora U6 i genu reporterowego RFP pod kontrolą głównego promotora EF1a może być dostarczony przy użyciu wektora lentiwirusa w celu uzyskania edycji genomu. Dzięki temu systemowi geny hematopoetycznych komórek macierzystych zostały pomyślnie zredagowane, wykazując ~90% skuteczność transdukcji. W ten sposób protokół ten zapewnia szybką i skuteczną metodę tworzenia myszy, u których do układu krwiotwórczego wprowadzane są docelowe mutacje genów. Chociaż nasze laboratorium wykorzystuje głównie tego typu technologię do badania roli klonalnej hematopoezy w procesach chorób sercowo-naczyniowych13,14,15, ma ona również zastosowanie do badań nad nowotworami hematologicznymi16. Ponadto protokół ten można rozszerzyć o analizę wpływu mutacji DNA w HSPC na inne choroby lub procesy rozwojowe w układzie krwiotwórczym.
Aby stworzyć solidny system wektorów lentiwirusowych, potrzebne są zapasy wirusów o wysokim mianie oraz zoptymalizowane warunki do transdukcji i przeszczepu komórek krwiotwórczych. W protokole w sekcji 1 znajdują się instrukcje dotyczące przygotowania szczepu wirusa o wysokim mianie, optymalizacji warunków hodowli mysich krwiotwórczych komórek macierzystych w sekcji 2, metod przeszczepiania szpiku kostnego w sekcji 3 oraz oceny wszczepienia w sekcji 4.

<table><tbody><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td> <td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Sulfametoksazol i trimetoprim do wstrzykiwań</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc STRZYKAWKA INSULINOWA LO-DOSE</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>zaopatrzenie ogólne</td></tr><tr><td>293T cells</td><td></td><td>ATCC CRL-3216 -</td> <td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>APC-anty-mysz Ly6C (klon AL-21)</td> <td>BD Biosciences</td><td>560599</td><td>przeciwciała</td></tr><tr><td>APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>552094</td><td>Przeciwciała</td></tr><tr><td>Jednorazowe strzykawki BD Luer-Lok, 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td>ogólnego zaopatrzenia</td></tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi BD Microtainer, K2EDTA Dodano</td><td>BD Bioscience</td><td>365974</td><td>ogólne</td></tr><tr><td>zaopatrzenie Igła BD Precisionglide, 18 G</td><td>BD 305195</td><td></td><td>ogólne</td></tr><tr><td>zaopatrzenie Igła BD Precisionglide, 22 G&nbsp;</td><td></td><td>Ogólne zaopatrzenie</td> <td>305155 BD</td></tr><tr><td>BV510-anty-myszy CD8a (klon 53-6.7)</td><td>Przeciwciała Biolegend</td><td>100752</td><td></td></tr><tr><td>BV711-anty-myszy CD3e (klon 145-2C11)</td><td>Przeciwciała Biolegend</td><td>100349</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen ze skóry cielęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9007-34-5</td><td>dostawa ogólna</td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Płytka wielodołkowa, 6-dołkowa&nbsp;</td>Myszy knock-in <td>Millipore Sigma CLS3471</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9</td><td>Myszy</td><td>028555</td><td>Jackson</td>Laboratory</tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM) - wysoka glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429</td><td>Medium</td></tr><tr><td>eBioscience 1X RBC Lysis Buffer</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>00-4333-57</td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TC</td><td>Nauki przyrodnicze</td><td>353003</td><td>zaopatrzenie ogólne</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml probówka z polistyrenu o okrągłym dnie Nauki</td><td>przyrodnicze</td><td>352054</td><td>zaopatrzenie ogólne</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml stożkowy Probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>ogólne zaopatrzenie</td></tr><tr><td>Falcon 6 Well Clear Flat Bottom Multiwell Multiwell Cell Culture Plate z płaskim dnem&nbsp;</td><td>Nauki przyrodnicze</td><td>353046</td><td>ogólne zaopatrzenie</td></tr><tr><td>Rurki kapilarne do mikrohematokrytu Fisherbrand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-362566</td><td>zaopatrzenie ogólne</td></tr><tr><td>Sitka do komórek sterylnych Fisherbrand, 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>ogólne zaopatrzenie</td></tr><tr><td>FITC-anti-mouse CD4 (klon RM4-5)</td> <td>Invitrogen</td><td>11-0042-85</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do utrwalania</td> przeciwciał <td>BD Bioscience</td><td>554655</td><td>Przewodnik po roztworach</td></tr><tr><td>-it Compete Systemy przesiewowe sgRNA</td><td>Clontech</td><td>632636</td><td></td></tr><tr><td>Kit Roztwór izotezji (izofluranu)</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miareczkowania Solution Lenti-X qRT-PCR&nbsp;</td><td>Takara</td><td></td><td>631235 Kit</td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-858</td><td>Zestaw</td></tr><tr><td>filtra strzykawkowego Millex-HV, 0,45 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLHV004SL</td><td>ogólne zaopatrzenie</td></tr><tr><td>PBS pH7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Solution</td></tr><tr><td>PE-Cy7-anti-mouse CD115 (klon AFS98)</td><td>eBioscience</td><td>25-1152-82</td><td>Przeciwciała</td></tr><tr><td>PEI MAX</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>Mieszanina penicyliny i streptomycyny</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5-anty-myszy Ly6G (klon 1A8)</td><td>BD Biosciences</td><td>560602</td><td>Przeciwciała</td></tr><tr><td>pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>57823</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>pMG2D</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>Polybrene Odczynnik do infekcji/transfekcji</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>Polipropylenowe probówki wirówkowe</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>326823</td><td>ogólne zaopatrzenie</td></tr><tr><td>psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>RadDisk &ndash; Dysk naświetlacza gryzoni</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td>Dostawa ogólna</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>Rekombinowany mysz TPO&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>315-14</td><td>Solution</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>09600</td><td>Solution</td></tr><tr><td>TOPO TA zestaw do klonowania do sekwencjonowania za pomocą One Shot TOP10 Chemicznie kompetentny E.coli</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>K457501</td><td>Kit</td></tr><tr><td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Solution&nbsp;</td></tr></tbody></table>

edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego crispr/cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulowanie genami w krwiotwórczych komórkach macierzystych przy użyciu konwencjonalnych metod transgenezy może być czasochłonne, kosztowne i trudne. Korzystając z postępów w technologii edycji genomu i systemów dostarczania transgenów za pośrednictwem lentiwirusa, opisano tutaj wydajną i ekonomiczną metodę, która zakłada myszy, u których geny są manipulowane specyficznie w hematopoetycznych komórkach macierzystych. Lentiwirusy są używane do transdukcji ujemnych komórek szpiku kostnego z ekspresją Cas9 za pomocą przewodnika RNA (gRNA) ukierunkowanego na określone geny i gen reporterowy czerwonej fluorescencji (RFP), a następnie komórki te są przeszczepiane do śmiertelnie napromieniowanych myszy C57BL / 6. Myszy, którym przeszczepiono lentiwirusa z ekspresją niedocelowego gRNA, są używane jako kontrole. Wszczepienie transdukowanych hematopoetycznych komórek macierzystych ocenia się za pomocą analizy cytometrii przepływowej leukocytów RFP-dodatnich krwi obwodowej. Stosując tę metodę, można osiągnąć ~90% transdukcji komórek szpikowych i ~70% komórek limfoidalnych po 4 tygodniach od przeszczepu. Genomowe DNA jest izolowane z komórek krwi RFP-dodatnich, a części DNA w miejscu docelowym są amplifikowane metodą PCR w celu walidacji edycji genomu. Protokół ten zapewnia wysokoprzepustową ocenę genów regulujących hematopoezę i może być rozszerzony na różne modele chorób myszy z udziałem komórek krwiotwórczych.

Stosując opisany powyżej protokół, uzyskano około 0,8-1,0 x 108 komórek szpiku kostnego na mysz. Liczba uzyskanych przez nas komórek lineage-negative wynosi około 3 x 106 komórek na mysz. Zazwyczaj wydajność komórek szpiku kostnego lineage-negative stanowi 4%-5% całkowitej liczby jądrzastych komórek szpiku kostnego.
Chimeryzm przetransdukowanych komórek (RFP-dodatnich) ocenia się za pomocą cytometrii przepł...

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Opracowaliśmy wydajną i ekonomiczną metodę hodowli myszy za pomocą manipulacji genami, szczególnie w hematopoetycznych komórkach macierzystych, wykorzystując technologię edycji genomu i systemy dostarczania transgenów za pośrednictwem lentiwirusa. Zaletą tego protokołu jest to, że możemy tworzyć modele zwierzęce zawierające określone mutacje w komórkach krwiotwórczych w szybki i opłacalny sposób w porównaniu z konwencjonalnymi metodami transgenicznymi u myszy. Procedurę zademonstruje Ying Wang, badaczka z mojego laboratorium.Aby wygenerować cząsteczki lentiwirusa, zacznij od zakodowania sześciodołkowej płytki roztworem kolagenu i inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Następnie wysiewaj komórki 293T na płytce i inkubuj ją przez kolejne dwie godziny. W międzyczasie przygotuj mieszaninę trzech plazmidów transfekcyjnych, łącząc 0,9 mikrograma wektora lentiwirusa, 0,6 mikrograma psPAX2 i 0,3 mikrograma pMD2.G i dejonizowane do 10 mikrolitrów na studzienkę. Następnie ostrożnie dodaj 50 mikrolitrów 1X PBS i pięć mikrolitrów rozcieńczonego PEI MAX do mieszaniny plazmidów i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po inkubacji dodać jeden mililitr DMEM.Odessać pożywkę z płytki sześciodołkowej i dodać jeden mililitr mieszaniny plazmidu do każdej studzienki. Inkubuj płytkę przez kolejne trzy godziny. Zastąp pożywkę świeżym DMEM i inkubuj przez 24 godziny.Dodaj jeden mililitr świeżego DMEM i inkubuj dodatkowe 24 godziny. Po całkowitej 48-godzinnej inkubacji przenieść supernatant do 50-mililitrowej probówki i odwirować go w temperaturze 3000 razy G przez 15 minut, aby usunąć wszelkie swobodnie pływające komórki. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,45 mikrometra i ultraodwirować go przez trzy godziny.Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając biały osad. Ponownie zawiesić osad ze 100 mikrolitrami pożywki do namnażania komórek krwiotwórczych bez surowicy bez napowietrzania. Zachować podwielokrotność 10 mikrolitrów do pomiaru miana wirusa i przechowywać resztę zawiesiny w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu użycia gotowej do użycia.Po wyizolowaniu kości umieść je w 50-mililitrowej stożkowej rurce z RPMI i umieść rurkę na lodzie. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieś kości do sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 100 milimetrów. Następnie chwyć kość kleszczami i użyj nożyczek preparacyjnych, aby ostrożnie przeciąć obie nasady.Napełnij 10-mililitrową strzykawkę lodowatym RPMI i użyj igły o rozmiarze 22, aby przepłukać szpik kostny z trzonu do nowego 100-milimetrowego naczynia hodowlanego. Po pobraniu całego szpiku kostnego należy wykonać zawiesinę pojedynczej komórki, przepuszczając szpik kostny przez 10-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 18. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Następnie odwirować probówkę zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i odessać supernatant. Ponownie zawiesić granulki komórek w odpowiedniej objętości zoptymalizowanego bufora separacyjnego. Aby wyizolować komórki ujemne pod względem linii, należy użyć zestawu do zmniejszania liczby komórek linii zgodnie z instrukcjami producenta.Ponownie zawiesić wyizolowane ujemne komórki linii w pożywce do ekspandowania komórek krwiotwórczych bez surowicy. Wstępnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez dwie godziny. Następnie dodaj lentiwirusa zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i pozostaw komórki w inkubatorze na kolejne 16 do 20 godzin.Następnego dnia zbierz komórki transdukowane lentiwirusem w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i odwiruj je w temperaturze 300 razy G przez 10 minut. Zgodnie z wytycznymi NHA ważne jest, aby obchodzić się z wektorami lentiwirusa na drugim poziomie Grupy Reece'a. Należy podjąć środki ostrożności w oparciu o przepisy zakładu.Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach RPMI na mysz. Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej do czasu przeszczepu myszom. Po drugiej sesji napromieniania, za orbitalnie wstrzyknąć transdukowane ujemne komórki delinearne każdej znieczulonej myszy za pomocą strzykawki insulinowej.Trzy do czterech tygodni po przeszczepie szpiku kostnego należy pobrać próbki krwi z żyły zaoczodołowej za pomocą rurek kapilarnych. Przenieś 20 mikrolitrów krwi do okrągłodennych probówek z polistyrenu i umieść na lodzie. Po lizie erytrocytów inkubować komórki z koktajlem przeciwciał monoklonalnych w ciemności przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji umyć, utrwalić i odwirować komórki, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 mikrolitrach buforu FACS. Próbki należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej. Powodzenie ujemnej transdukcji komórkowej można ocenić za pomocą cytometrycznej detekcji RFP metodą cytometrii przepływowej.Wykazano, że po siedmiu dniach hodowli in vitro średnio 75,7% komórek ulega transdukcji. Cytometria przepływowa została również wykorzystana do analizy krwi obwodowej myszy po rekonstytucji za pomocą transdukowanych i nietransdukowanych hematopoetycznych komórek macierzystych. Średnio 94,8% neutrofili, 93,5% monocytów i 82,7% limfocytów B wyraża RFP.Genomowe DNA z komórek krwi RFP-dodatnich zostało amplifikowane metodą PCR i poddane subklonowaniu w celu analizy sekwencji. Wykrywane są różne mutacje, a 69% klonów wykazuje mutacje poza ramką lub przedwczesne zatrzymanie. Aby ta procedura zakończyła się sukcesem, konieczne jest przygotowanie wysokiego zapasu wirusa oraz zoptymalizowane warunki transdukcji i przeszczepu komórek krwiotwórczych.Zastosowaliśmy tę technikę do badania prawa chorób sercowo-naczyniowych. Ale przydatne jest również badanie nowotworów hematologicznych. Metoda ta pozwala na badanie funkcji nowych typów genów w układzie krwiotwórczym w sposób wysoce efektywny i zaawansowany.Wnioskujemy o tym na podstawie dostępności myszy transgenicznych.

lentiviral-crisprcas9-mediated-genome-editing-for-study-hematopoietic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Nowatorskie strategie wiernego modelowania mutacji somatycznych w krwiotwórczych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) są niezbędne do lepszego badania biologii hematopoetycznych komórek macierzystych i nowotworów hematologicznych. W tym miejscu opisano protokół modelowania heterozygotycznych mutacji typu gain-of-function w HSPC poprzez połączenie użycia CRISPR/Cas9 i podwójnej transdukcji dawcy rAAV.

Inżynieria onkogennych heterozygotycznych mutacji wzmocnienia funkcji w ludzkich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Poznaj edycję genomu CRISPR/Cas9 za pośrednictwem lentiwirusa w komórkach krwiotwórczych myszy. Ta metoda umożliwia szybkie i ekonomiczne tworzenie modeli zwierzęcych z określonymi mutacjami.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Przeglądaj więcej filmów