Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans
5 lipca 2019
To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.
Zdolność do ilościowego określania zmian w morfologii tkanek i organelli jest ważna dla zrozumienia funkcji genów, a także wpływu mutacji genetycznych. Nasze protokoły wyjaśniają, w jaki sposób można wykorzystać ogólnodostępne oprogramowanie do niesubiektywnej oceny morfologii synaps, mięśni i mitochondriów u nicienia C.elegans. Wiele wcześniejszych badań opierało się na jakościowych metodach porównywania zmian morfologicznych.
Mogą one jednak być problematyczne, ponieważ mogą nie wychwytywać subtelnych różnic fenotypowych, mogą zawyżać i zaniżać zmiany i są oceniane subiektywnie. Nasze metody ilościowe zapewniają bardziej wiarygodne i mniej tendencyjne środki oceny zmian morfologicznych. Metody te mogą być z łatwością wykorzystane do badania zmian morfologicznych w innych strukturach komórkowych lub organizmach modelowych w celu określenia funkcji genów i konsekwencji mutacji związanych z chorobą.
Zacznij od przygotowania preparatów do obrazowania. Umieść kroplę stopionej agarozy na szkiełku mikroskopowym i natychmiast dociśnij kroplę innym szkiełkiem mikroskopowym, delikatnie spłaszczając agarozę. Pozostaw agarozę do wyschnięcia na minutę, a następnie ostrożnie oddziel dwa szkiełka i pozostaw zestaloną podkładkę na jednym z szkiełek.
Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i dodaj od pięciu do 10 mililitrów kropli środka znieczulającego na środek podkładki agarozowej. Użyj sterylizowanego termicznie kilofa, aby szybko przenieść od 10 do 15 zwierząt z talerza podstawowego do kropli środka znieczulającego, zanim roztwór wyschnie. Następnie nałóż szkiełko nakrywkowe, umieszczając je tuż nad wacikiem agarozowym i delikatnie upuszczając w dół.
Zobrazuj regiony synaptyczne za pomocą mikroskopu konfokalnego ze skaningiem liniowym sprzężonego z optycznie pompowanym laserem diodowym półprzewodnikowym o długości 488 i 552 nanometrów i wyposażonego w oprogramowanie do przechwytywania obrazu. Po zlokalizowaniu robaków przełącz się na 40-krotne powiększenie i zastosuj medium zanurzeniowe. Uwidocznij obszar synaptyczny poprzez wzbudzenie fluoroforów za pomocą lasera o długości 552 nanometrów, 1% mocy dla fluoroforu tagRFP i 488 nanometrów, 2% mocy dla fluoroforu GFP.
Rób zdjęcia za pomocą hybrydowego fotodetektora i ustaw wzmocnienia, aby zapobiec prześwietleniu fluoroforów. Zbieraj obrazy stosu Z, aby pokryć całą synapsę, używając optymalnego rozmiaru kroku Z w zależności od obiektywu. Aby przeanalizować region synaptyczny, zacznij od załadowania obrazów do oprogramowania CellProfiler 3.1.5.
Skonfiguruj moduł NameAndType i określ region synaptyczny za pomocą ręcznej definicji przy użyciu rozproszonego tagRFP wyrażonego z transgenu UIS-115. Zmierz rozmiar i fluorescencję ręcznie zdefiniowanej synapsy, dodając moduły MeasureObjectSizeShape i MeasureObjectIntensity do potoku. Następnie oblicz względną zintegrowaną intensywność fluorescencji, dodając moduł CalculateMath i dzieląc zintegrowane jednostki intensywności uzyskane z JSIS37 przez te uzyskane z UIS-115.
Po zakończeniu wyeksportuj wszystkie pomiary i obliczenia. Aby zmierzyć obszar komórek mięśniowych, otwórz obraz w oprogramowaniu Fiji i użyj wyboru wielokąta, aby dokładnie prześledzić wokół pojedynczej ukośnej komórki mięśniowej. Dostosuj linię wielokąta na końcu, przeciągając kropkę zakotwiczenia, aby poprawić obrysowywanie.
Przejdź do karty Analizuj w górnej części oprogramowania i kliknij przycisk Zmierz, aby obliczyć wybrany obszar. W przypadku komórek mięśniowych ze zdegenerowanym lub brakującym regionem obrysuj brakujący obszar za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów i ponownie kliknij przycisk Zmierz. Jeśli jest wiele przerw, prześledź każdą z nich osobno.
Oblicz stosunek obszaru przerwy do obszaru całej komórki. Wysoki współczynnik wskazuje na większy stopień zwyrodnienia mięśni. A jeśli nie ma brakujących regionów, współczynnik jest obliczany jako zero.
Otwórz Elastic i wybierz Klasyfikacja pikseli w obszarze Create New Project (Utwórz nowy projekt). Następnie zmień nazwę i zapisz projekt. Przejdź do karty danych wejściowych i kliknij Dodaj nowy, a następnie Dodaj oddzielne obrazy.
Skieruj wyskakujące okienko do folderu z plikami TIF i wybierz żądany obraz. Na karcie Feature Selection (Wybór funkcji) kliknij Select Features (Wybierz obiekty), aby zaznaczyć wszystkie cechy pikseli oznaczone zielonymi polami wyboru. Wybór pikseli w tym kroku służy do rozróżniania różnych klas pikseli w następnym kroku.
Użyj panelu treningowego, aby odróżnić poszczególne włókna miozyny wykazujące ekspresję GFP od niechcianego tła. Kliknij Dodaj etykietę i nabazgraj niechciane tła i odstępy między włóknami, aby rozpocząć szkolenie klasyfikatora. Dodaj drugą etykietę, zmień jej nazwę na Filament i nabazgraj kilka filamentów.
Kliknij Live Update, aby upewnić się, że klasyfikacja została wykonana poprawnie. W razie potrzeby dodaj więcej bazgrołów, aby dostroić trening. Po wykonaniu klasyfikatora treningowego przejdź do panelu Eksport predykcji i kliknij Wybierz opcję Eksportuj ustawienia obrazu z prawdopodobieństwami jako źródłem.
Upewnij się, że podregiony wycięcia x i y są zaznaczone, a c nie jest zaznaczone. Wybierz zero i jeden jako wartości początkowe i końcowe dla c, a następnie Konwertuj typ danych na 8-bitowy bez znaku. Zaznacz opcję Normalizuj ponownie, a następnie zmień plik wyjściowy wideo na png, zmieniając nazwę pliku i katalogu zgodnie z potrzebami.
Zamknij okno Eksportuj ustawienia i wyeksportuj obraz, który właśnie został podzielony na segmenty. Następnie otwórz plik png w oprogramowaniu Fidżi. Dostosuj próg obrazu za pomocą ustawień domyślnych i zastosuj wtyczkę szkieletyzacji, która utworzy osobną tabelę wyników.
Protokół ten został wykorzystany do zbadania funkcji acetylotransferazy alfa-tubuliny MEC-17 w rozwoju synaps. Analiza ilościowa obrazów tylnych/bocznych mikrotubul lub synaps PLM wskazuje, że nadekspresja MEC-17 zaburza normalne funkcjonowanie neuronów. W porównaniu z dzikimi zwierzętami kontrolnymi, nadekspresja MEC-17 znacznie zmniejszyła regiony presynaptyczne i integralność synaptyczną.
Techniki te zostały również wykorzystane do analizy modeli C.elegans Charcota-Marie-Tootha typu 2 lub CMT2 przenoszących mutacje w genach związanych z CMT2. Wizualna ocena morfologii mięśni ściany ciała wykazała od 2,5 do 3,5-krotny wzrost wad u badanych zwierząt w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego. Zwierzęta z mutacjami w fzo-1 i unc-116 doświadczyły utraty prążków mięśniowych, nagromadzenia szczątków komórkowych i zwyrodnienia włókien mięśniowych.
Podczas gdy zwierzęta z mutacjami w dyn-1 doświadczyły znacznie mniej defektów w morfologii mięśni. Mutanty fzo-1 i unc-116 wykazywały pięcio- do sześciokrotny wzrost stosunku przerwy do całkowitej powierzchni pojedynczej komórki i znacznie krótszą średnią długość włókien w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego. W celu dokonania porównań między próbkami ważne jest określenie najbardziej optymalnych warunków pozyskiwania obrazu i zapewnienie, że warunki te są konsekwentnie stosowane.
Techniki te umożliwią naukowcom porównywanie zmian morfologicznych w różnych tłach genetycznych za pomocą podejść ilościowych. Zmniejsza to subiektywność, a tym samym przyczynia się do zwiększenia reprezentatywności generowanych danych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na ilościowym określaniu wielkości synaps, morfologii mięśni oraz kształtu mitochondriów u organizmu modelowego C. elegans, z wykorzystaniem ogólnodostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów w analizie. Przedstawione metody umożliwiają wiarygodne porównanie zmian strukturalnych w tkankach i organellach wynikających z mutacji genetycznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Ilościowa analiza zmian morfologicznych
- Wpływ mutacji genetycznych na struktury komórkowe
- Postępy w technikach obrazowania
Wstęp
- Znaczenie ilościowego określania zmian morfologicznych dla zrozumienia funkcji genów
- Ograniczenia poprzednich metodologii jakościowych
- Potrzeba zastosowania odpornych i mniej stronniczych technik oceny
Zastosowane metody
- Protokoły przetwarzania obrazów z wykorzystaniem oprogramowania CellProfiler i Fiji
- C. elegans jako organizm modelowy
- Techniki obejmujące mikroskopię konfokalną i klasyfikację pikseli
Główne wyniki
- Dostarczenie ilościowych danych na temat integralności synaptycznej i powierzchni komórek mięśniowych
- Identyfikacja istotnych wad morfologii mięśni w modelach genetycznych
- Ustanowienie powiązań między mutacjami genów a fenotypami morfologicznymi
Wnioski
- Badanie wykazuje wartość metod ilościowych w ocenie zmian morfologicznych u C. elegans
- Wyniki mają znaczenie dla przyszłych badań genetycznych i związanych z chorobami
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ilościowa analiza morfologiczna w organizmach modelowych umożliwia obiektywną ocenę wpływu mutacji genetycznych na struktury komórkowe, ograniczając subiektywizm w ocenie fenotypowej. Podejście to wspiera walidację celów terapeutycznych, dostarczając powtarzalnych i mierzalnych wyników w zakresie integralności synaptycznej, rozwoju mięśni oraz morfologii organelli. Takie dane zwiększają wiarygodność predykcyjną na wczesnych etapach odkrywania leków, wiążąc perturbacje genetyczne z mierzalnymi efektami fenotypowymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutyków
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mierzalne zmiany rozmiaru synaps i intensywności fluorescencji.
- Wartość operacyjna: Dostarcza znormalizowanych mierników pola powierzchni komórek mięśniowych i długości filamentów miozyny w celu oceny funkcjonalnego oddziaływania na cel.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów z portfela badań poprzez ilościowe określanie zmian morfologii mitochondriów jako wskaźników stresu lub dysfunkcji komórkowej.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość analizy: Generuje znormalizowane potoki analizy obrazu przy użyciu CellProfiler i Fiji w celu powtarzalnej kwantyfikacji morfologicznej.
- Skalowalność: Umożliwia przygotowanie do wysokoprzepustowych analiz obrazowych (high-content screening) poprzez zautomatyzowany pomiar wielkości organelli, ich kolistości oraz zintegrowanej fluorescencji.
- Użyteczność międzyplatformowa: Ułatwia przenoszenie testów między systemy modelowe poprzez ustanowienie ilościowych punktów odniesienia dla morfologii tkanek i organelli.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorób: Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w modelach chorób neurodegeneracyjnych i nerwowo-mięśniowych poprzez ilościowe określanie defektów synaptycznych i mięśniowych.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia dopasowanie biomarkerów poprzez mierzalne zmiany morfologii mitochondriów powiązane z mutacjami genetycznymi.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza podstaw do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez określenie ilościowych progów nasilenia defektów morfologicznych w modelach chorób.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków poprzez przekształcanie jakościowych obserwacji fenotypowych w mierzalne zestawy danych, wykorzystywane w fazach walidacji celu oraz identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez, umożliwiając statystyczne porównanie wielkości synaps oraz fluorescencji w różnych liniach genetycznych.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu obrazowaniu Z-stack oraz zautomatyzowanemu pomiarowi obiektów w programie CellProfiler.
- Analityka: Generuje wyniki ilościowe, w tym zintegrowane stosunki intensywności fluorescencji, stosunki pola powierzchni mięśni do przerw oraz wskaźniki kolistości mitochondriów.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną, dostarczając istotnych dla chorób parametrów morfologicznych w modelach neurodegeneracji i schorzeń mięśni u C. elegans.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku strukturę obrazowania i analizy, którą można zastosować do wielu organelli i obszarów chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną, zapewniając obiektywne, ilościowe odczyty zmian w strukturze komórkowej.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność i standaryzację między laboratoriami dzięki ogólnodostępnemu oprogramowaniu i zdefiniowanym protokołom obrazowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrywanie efektów fenotypowych, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez mierzalne wskaźniki defektów w modelach mięśniowych i synaptycznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii konfokalnej oraz w obsłudze oprogramowania do analizy obrazów, takiego jak CellProfiler i Fiji.
- Zależność od spójnych warunków obrazowania, w tym mocy lasera, wielkości kroku Z oraz znakowania przeciwciałami, w celu uzyskania wiarygodnej kwantyfikacji.
- Konieczność standaryzacji protokołów akwizycji i analizy obrazów pomiędzy zespołami w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji przy stosowaniu ilościowych analiz morfologicznych w odniesieniu do różnych typów tkanek lub organizmów modelowych.
- Ograniczenie wynikające z potrzeby zastosowania reporterów transgenicznych lub znaczników fluorescencyjnych do zdefiniowania interesujących struktur, co zauważono przy definiowaniu obszarów synaptycznych za pomocą tagRFP.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:59
Slide Preparation
1:48
Assessing Synaptic Morphology
2:47
Quantification of the Synaptic Region
3:45
Measurement of Muscle Cell Area
4:36
Segmentation and Quantification of Myosin Fiber Length
6:39
Results: Function of MEC-17 in the Nervous System
8:14
Conclusion
