Name: Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj ilościowe metody analizy morfologii synaps, mięśni i mitochondriów u Caenorhabditis elegans przy użyciu oprogramowania CellProfiler i Fiji. Techniki te umożliwiają obiektywną ocenę zmian strukturalnych spowodowanych mutacjami genetycznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Neumanna za cenne dyskusje i wkład. Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Autorzy dziękują firmie WormBase za bogactwo informacji na temat C. elegans i dziękują firmie Monash Micro Imaging z Uniwersytetu Monash za dostarczenie oprzyrządowania, szkolenia i wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez granty badawcze CMTAA (2015 i 2018) oraz granty projektowe NHMRC 1101974 i 1099690 przyznane B.N.

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. , (1974).</li>
<li>Markaki, M., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li>
<li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. , (2017).</li>
<li>Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+C.+elegans+as+a+model+to+study+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases.</a> Frontiers in Genetics. , (2014).</li>
<li>Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+Proteins+Act+as+Transcriptional+Guarantors+to+Ensure+Terminal+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation.</a> Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).</li>
<li>Koushika, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Caenorhabditis+elegans+cytoplasmic+dynein+components+reveal+specificity+of+neuronal+retrograde+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo.</a> Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).</li>
<li>Byrne, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+dynamics+affects+behaviour+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+High-Resolution+Second-Harmonic+Generation+Imaging+of+Endogenous+Structural+Proteins+in+Biological+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues.</a> Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ilastik%3A+Interactive+learning+and+segmentation+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%222011+IEEE+International+Symposium+on+Biomedical+Imaging%3A+From+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).</li>
<li>Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+microfluidic+devices+for+in+vivo+imaging+of+C.+elegans%2C+Drosophila+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+image+restoration+and+segmentation%3A+A+generalized+linear+model%2Fbregman+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Computer+Vision%22%5BJournal%5D)">Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective.</a> International Journal of Computer Vision. , (2013).</li>
<li>Rizk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmentation+and+quantification+of+subcellular+structures+in+fluorescence+microscopy+images+using+Squassh%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh.</a> Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).</li>
<li>Akella, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEC-17+is+an+alpha-tubulin+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase.</a> Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).</li>
<li>Neumann, B., Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MEC-17+leads+to+microtubule+instability+and+axonal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration.</a> Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).</li>
<li>Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+alpha-tubulin+K40+acetyltransferase+alphaTAT1+promotes+rapid+ciliogenesis+and+efficient+mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).</li>
<li>Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maintenance+of+synaptic+structure+is+mediated+by+the+alpha-tubulin+acetyltransferase+MEC-17%2F%CE%B1TAT1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1.</a> bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).</li>
<li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBird%2C+TD+%22Charcot-Marie-Tooth+Neuropathy+Type+2%22">Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2</a>. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).</li>
<li>Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+regulation+of+mitofusin-2+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease.</a> Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).</li>
<li>Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+genes+associated+with+Charcot-Marie-Tooth+type+2+lead+to+common+behavioural%2C+cellular+and+molecular+defects+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , 605584(2019).</li>
<li>Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-related+protein+1+has+membrane+constricting+and+severing+abilities+sufficient+for+mitochondrial+and+peroxisomal+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission.</a> Nature Communications. , (2018).</li>
<li>Zhu, P. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+Intermolecular+Domain+Interactions+of+the+C-terminal+GTPase+Effector+Domain+of+the+Multimeric+Dynamin-like+GTPase+Drp1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).</li>
<li>Osellame, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+and+independent+roles+of+the+Drp1+adaptors+Mff%2C+MiD49+and+MiD51+in+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission.</a> Journal of Cell Science. , (2016).</li>
<li>Dima, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+segmentation+algorithms+for+fluorescence+microscopy+images+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells.</a> Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).</li>
<li>Trevisan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+Mitochondria+Dynamics+Reveals+Separate+Roles+for+Form+and+Function+in+Mitochondria+Distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution.</a> Cell Reports. , (2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Różnice morfologiczne często oceniano poprzez ręczne liczenie zauważalnych różnic lub przy użyciu arbitralnych progów w celu określenia wad w porównaniu z fenotypem typu dzikiego. Ostatnio jednak metody ilościowe zostały wykorzystane do porównawczych badań morfologii, aby dokładnie zmierzyć i opisać zmiany na poziomie komórkowym i subkomórkowym w bezstronny sposób. Zdolność do identyfikowania subtelnych, ale biologicznie istotnych różnic między fenotypami jest potężnym sposobem na zrozumienie podstawowych mechanizmów mol...

Nicień Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest coraz częściej wykorzystywany jako system modelowy do odkrywania biologicznych i molekularnych procesów związanych z chorobami ludzkimi. Dorosły nicień ma długość ciała nieco ponad 1 mm i może wyprodukować duży lęg do 300 jaj1. Po wykluciu C. elegans potrzebuje tylko 3-4 dni, aby osiągnąć dorosłość i żyje około 2 do 3 tygodni2. Ze względu na łatwość hodowli, C. elegans jest obecnie jednym z najbardziej poszukiwanych modeli zwierzęcych in vivo do przeprowadzania opłacalnych, szybkich badań przesiewowych leków w celu zidentyfikowania środków terapeutycznych stosowanych w chorobach u ludzi. Dodatkowo, jego ochrona genetyczna, dobrze zdefiniowane paradygmaty behawioralne, przezroczysty korpus do fluorescencji lub mikroskopii świetlnej oraz łatwość manipulacji genetycznej sprawiają, że badanie komórkowych i molekularnych konsekwencji mutacji genetycznych jest łatwo osiągalne3. Genom C. elegans ma około 60-80% wspólnej ortologii z ludzkimi genami, a około 40% tych genów jest znanych jako związane z chorobą. Niektóre z chorób ludzkich, które zostały modelowane i badane u C. elegans, obejmują zaburzenia neurodegeneracyjne (choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, stwardnienie zanikowe boczne, choroba Charcota-Mariego-Tootha), choroby związane z mięśniami (dystrofia mięśniowa Duchenne'a) i choroby metaboliczne (hiperglikemia)2,4. W większości zaburzeń u ludzi dochodzi do indukowanej chorobą lokalizacji komórkowej i organelli oraz zmian morfologicznych, które można łatwo ocenić w modelu nicieni.
Markery fluorescencyjne są powszechnie używane do oznaczania tkanek i organelli do dynamicznej wizualizacji pod mikroskopem. Jednak u C. elegans konwencjonalne metody, które oceniają nieprawidłowości morfologiczne spowodowane mutacjami genetycznymi, w dużej mierze opierały się na opisach wizualnych. Podczas gdy oceny jakościowe mogą obejmować szerszy zakres opisów fenotypowych (morfologia synaptyczna, zlepianie się GFP, specyficzny kształt aksonów, grubość włókien mięśniowych itp.) i zapewniać spojrzenie z lotu ptaka na zmiany morfologiczne, są one mniej odpowiednie do porównywania małych różnic w różnych grupach. Ponadto oceny jakościowe opierają się na wizualnej, subiektywnej ocenie, co może prowadzić do przeszacowania lub niedoszacowania nieprawidłowości morfologicznych. Wreszcie, obserwacje jakościowe mogą się również znacznie różnić między osobami, co stwarza trudności z replikacją danych. 
W ostatnich latach opracowano szereg przyjaznych dla użytkownika, łatwo dostępnych algorytmów obliczeniowych, które mogą analizować ilościowo obrazy. Jednak wykorzystanie takiego oprogramowania do analizy obrazu w niektórych badaniach morfologicznych, zwłaszcza w odniesieniu do mięśni ścian ciała i mitochondriów, w badaniach nad C. elegans pozostaje w tyle. Aby udoskonalić podstawową analizę strukturalną u C. elegans, przetestowano niektóre z łatwo dostępnych programów do analizy obrazów typu open source w celu ilościowego porównania wpływu mutacji genetycznych na mitochondria mięśniowe, mięśnie ścian ciała i morfologię synaptyczną. Te procedury eksperymentalne szczegółowo opisują, w jaki sposób te programy (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) mogą być wykorzystywane do oceny zmian w wielkości synaps i lokalizacji białek synaptycznych, powierzchni mięśni ściany ciała i długości włókien oraz wielkości i kolistości mitochondriów w wyniku mutacji genetycznych w nicieniach.

<table><tbody><tr><td>Agar-agar</td><td>Merck</td><td>1.01614.1000</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td>Odwrócona platforma</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Zeiss Axio Imager M2</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane #1</td><td>Thermo scientifique</td><td>MENCS22221GP</td><td></td></tr><tr><td>Szkło Szkiełka nakrywkowe #1.5</td><td>Zeiss</td><td>474030-9000-000</td><td>Wykonane przez SCHOTT</td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>szklane Thermo scientifique</td><td>MENS41104A/40</td><td></td></tr><tr><td>Light LED</td> Mikroskop stereoskopowy <td>Schott</td><td>KL 300 LED</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Trypton (pepton z kazeiny)</td> <td>Merck</td><td>107213</td><td>Składniki bulionu lizogennego (LB) średni</td></tr><tr><td>ekstrakt drożdżowy</td><td>Merck</td><td>103753</td><td>Składniki na bulion lizogeniczny (LB) podłoże</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Składniki na bulion lizogeniczny (LB) średni</td></tr><tr><td>pepton (pepton z mięsa)</td><td>Merck</td><td>107214</td><td>Składniki na pożywkę wzrostową nicieni (NGM) agar</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td>Składniki na pożywkę wzrostową nicieni (NGM) agar</td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>soduMerck</td><td>106404</td><td>Składniki na pożywkę wzrostu nicieni (NGM) agar</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>Składniki na pożywkę wzrostu nicieni (NGM) agar</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Merck</td><td>102382</td><td>Składniki na pożywkę wzrostu nicieni (NGM) agar</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>105886 Merck</td><td></td><td>Składniki na podłoże wzrostu nicieni (NGM) agar</td></tr><tr><td>Fosforan dipotasowy</td><td>Merck</td><td>105101</td><td>Składniki na pożywkę do wzrostu nicieni (NGM) agar</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Merck</td><td>104873</td><td>Składniki na podłoże wzrostu nicieni (NGM) agar</td></tr><tr><td>Fosforan disodowy</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>Składniki na bufor M9</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Składniki na bufor M9</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan</td> <td>potasuMerck</td><td>104873</td><td>Składniki na bufor M9</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Merck</td><td>105886</td><td>Składniki na bufor M9</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Corning</td><td>CLS7095D5X-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Corning</td><td>CLS430589-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Drut platynowy</td><td>Sigma</td><td>267201-2G</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Met-app</td><td>2616</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetraizolu</td><td>Sigma</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u caenorhabditis elegans

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Zdefiniowanie mechanizmów komórkowych leżących u podstaw choroby jest niezbędne do opracowania nowych metod leczenia. Strategią często stosowaną w celu rozwikłania tych mechanizmów jest wprowadzenie mutacji w genach kandydujących i jakościowe opisanie zmian w morfologii tkanek i organelli komórkowych. Jednak opisy jakościowe mogą nie oddawać subtelnych różnic fenotypowych, mogą błędnie przedstawiać różnice fenotypowe między osobami w populacji i często są oceniane subiektywnie. W tym miejscu opisano podejścia ilościowe do badania morfologii tkanek i organelli nicieni Caenorhabditis elegans przy użyciu laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej w połączeniu z dostępnym na rynku oprogramowaniem do przetwarzania bioobrazów. Przeprowadzono analizę ilościową fenotypów wpływających na integralność synaps (wielkość i zintegrowane poziomy fluorescencji), rozwój mięśni (wielkość komórek mięśniowych i długość włókien miozyny) oraz morfologię mitochondriów (kolistość i wielkość), aby zrozumieć wpływ mutacji genetycznych na te struktury komórkowe. Te podejścia ilościowe nie ograniczają się do opisanych tutaj zastosowań, ponieważ można je łatwo wykorzystać do ilościowej oceny morfologii innych tkanek i organelli w nicieniach, a także w innych organizmach modelowych.

C. elegans jest idealnym organizmem modelowym do badania morfologii różnych tkanek i organelli ze względu na swoją prostotę, znaną linię komórkową, przezroczystość oraz dostępne narzędzia. W niniejszym materiale przedstawiamy ilościowe podejścia do badania organelli (np. mitochondriów) oraz tkanek, w tym synaps i mięśni, z wykorzystaniem obrazowania fluorescencyjnego żywych organizmów oraz bezpłatnego oprogramowania do przetwarzania obrazów biologicznych.
<p class="jove_conte...

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Zdolność do ilościowego określania zmian w morfologii tkanek i organelli jest ważna dla zrozumienia funkcji genów, a także wpływu mutacji genetycznych. Nasze protokoły wyjaśniają, w jaki sposób można wykorzystać ogólnodostępne oprogramowanie do niesubiektywnej oceny morfologii synaps, mięśni i mitochondriów u nicienia C.elegans. Wiele wcześniejszych badań opierało się na jakościowych metodach porównywania zmian morfologicznych.Mogą one jednak być problematyczne, ponieważ mogą nie wychwytywać subtelnych różnic fenotypowych, mogą zawyżać i zaniżać zmiany i są oceniane subiektywnie. Nasze metody ilościowe zapewniają bardziej wiarygodne i mniej tendencyjne środki oceny zmian morfologicznych. Metody te mogą być z łatwością wykorzystane do badania zmian morfologicznych w innych strukturach komórkowych lub organizmach modelowych w celu określenia funkcji genów i konsekwencji mutacji związanych z chorobą.Zacznij od przygotowania preparatów do obrazowania. Umieść kroplę stopionej agarozy na szkiełku mikroskopowym i natychmiast dociśnij kroplę innym szkiełkiem mikroskopowym, delikatnie spłaszczając agarozę. Pozostaw agarozę do wyschnięcia na minutę, a następnie ostrożnie oddziel dwa szkiełka i pozostaw zestaloną podkładkę na jednym z szkiełek.Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i dodaj od pięciu do 10 mililitrów kropli środka znieczulającego na środek podkładki agarozowej. Użyj sterylizowanego termicznie kilofa, aby szybko przenieść od 10 do 15 zwierząt z talerza podstawowego do kropli środka znieczulającego, zanim roztwór wyschnie. Następnie nałóż szkiełko nakrywkowe, umieszczając je tuż nad wacikiem agarozowym i delikatnie upuszczając w dół.Zobrazuj regiony synaptyczne za pomocą mikroskopu konfokalnego ze skaningiem liniowym sprzężonego z optycznie pompowanym laserem diodowym półprzewodnikowym o długości 488 i 552 nanometrów i wyposażonego w oprogramowanie do przechwytywania obrazu. Po zlokalizowaniu robaków przełącz się na 40-krotne powiększenie i zastosuj medium zanurzeniowe. Uwidocznij obszar synaptyczny poprzez wzbudzenie fluoroforów za pomocą lasera o długości 552 nanometrów, 1% mocy dla fluoroforu tagRFP i 488 nanometrów, 2% mocy dla fluoroforu GFP.Rób zdjęcia za pomocą hybrydowego fotodetektora i ustaw wzmocnienia, aby zapobiec prześwietleniu fluoroforów. Zbieraj obrazy stosu Z, aby pokryć całą synapsę, używając optymalnego rozmiaru kroku Z w zależności od obiektywu. Aby przeanalizować region synaptyczny, zacznij od załadowania obrazów do oprogramowania CellProfiler 3.1.5.Skonfiguruj moduł NameAndType i określ region synaptyczny za pomocą ręcznej definicji przy użyciu rozproszonego tagRFP wyrażonego z transgenu UIS-115. Zmierz rozmiar i fluorescencję ręcznie zdefiniowanej synapsy, dodając moduły MeasureObjectSizeShape i MeasureObjectIntensity do potoku. Następnie oblicz względną zintegrowaną intensywność fluorescencji, dodając moduł CalculateMath i dzieląc zintegrowane jednostki intensywności uzyskane z JSIS37 przez te uzyskane z UIS-115.Po zakończeniu wyeksportuj wszystkie pomiary i obliczenia. Aby zmierzyć obszar komórek mięśniowych, otwórz obraz w oprogramowaniu Fiji i użyj wyboru wielokąta, aby dokładnie prześledzić wokół pojedynczej ukośnej komórki mięśniowej. Dostosuj linię wielokąta na końcu, przeciągając kropkę zakotwiczenia, aby poprawić obrysowywanie.Przejdź do karty Analizuj w górnej części oprogramowania i kliknij przycisk Zmierz, aby obliczyć wybrany obszar. W przypadku komórek mięśniowych ze zdegenerowanym lub brakującym regionem obrysuj brakujący obszar za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów i ponownie kliknij przycisk Zmierz. Jeśli jest wiele przerw, prześledź każdą z nich osobno.Oblicz stosunek obszaru przerwy do obszaru całej komórki. Wysoki współczynnik wskazuje na większy stopień zwyrodnienia mięśni. A jeśli nie ma brakujących regionów, współczynnik jest obliczany jako zero.Otwórz Elastic i wybierz Klasyfikacja pikseli w obszarze Create New Project (Utwórz nowy projekt). Następnie zmień nazwę i zapisz projekt. Przejdź do karty danych wejściowych i kliknij Dodaj nowy, a następnie Dodaj oddzielne obrazy.Skieruj wyskakujące okienko do folderu z plikami TIF i wybierz żądany obraz. Na karcie Feature Selection (Wybór funkcji) kliknij Select Features (Wybierz obiekty), aby zaznaczyć wszystkie cechy pikseli oznaczone zielonymi polami wyboru. Wybór pikseli w tym kroku służy do rozróżniania różnych klas pikseli w następnym kroku.Użyj panelu treningowego, aby odróżnić poszczególne włókna miozyny wykazujące ekspresję GFP od niechcianego tła. Kliknij Dodaj etykietę i nabazgraj niechciane tła i odstępy między włóknami, aby rozpocząć szkolenie klasyfikatora. Dodaj drugą etykietę, zmień jej nazwę na Filament i nabazgraj kilka filamentów.Kliknij Live Update, aby upewnić się, że klasyfikacja została wykonana poprawnie. W razie potrzeby dodaj więcej bazgrołów, aby dostroić trening. Po wykonaniu klasyfikatora treningowego przejdź do panelu Eksport predykcji i kliknij Wybierz opcję Eksportuj ustawienia obrazu z prawdopodobieństwami jako źródłem.Upewnij się, że podregiony wycięcia x i y są zaznaczone, a c nie jest zaznaczone. Wybierz zero i jeden jako wartości początkowe i końcowe dla c, a następnie Konwertuj typ danych na 8-bitowy bez znaku. Zaznacz opcję Normalizuj ponownie, a następnie zmień plik wyjściowy wideo na png, zmieniając nazwę pliku i katalogu zgodnie z potrzebami.Zamknij okno Eksportuj ustawienia i wyeksportuj obraz, który właśnie został podzielony na segmenty. Następnie otwórz plik png w oprogramowaniu Fidżi. Dostosuj próg obrazu za pomocą ustawień domyślnych i zastosuj wtyczkę szkieletyzacji, która utworzy osobną tabelę wyników.Protokół ten został wykorzystany do zbadania funkcji acetylotransferazy alfa-tubuliny MEC-17 w rozwoju synaps. Analiza ilościowa obrazów tylnych/bocznych mikrotubul lub synaps PLM wskazuje, że nadekspresja MEC-17 zaburza normalne funkcjonowanie neuronów. W porównaniu z dzikimi zwierzętami kontrolnymi, nadekspresja MEC-17 znacznie zmniejszyła regiony presynaptyczne i integralność synaptyczną.Techniki te zostały również wykorzystane do analizy modeli C.elegans Charcota-Marie-Tootha typu 2 lub CMT2 przenoszących mutacje w genach związanych z CMT2. Wizualna ocena morfologii mięśni ściany ciała wykazała od 2,5 do 3,5-krotny wzrost wad u badanych zwierząt w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego. Zwierzęta z mutacjami w fzo-1 i unc-116 doświadczyły utraty prążków mięśniowych, nagromadzenia szczątków komórkowych i zwyrodnienia włókien mięśniowych.Podczas gdy zwierzęta z mutacjami w dyn-1 doświadczyły znacznie mniej defektów w morfologii mięśni. Mutanty fzo-1 i unc-116 wykazywały pięcio- do sześciokrotny wzrost stosunku przerwy do całkowitej powierzchni pojedynczej komórki i znacznie krótszą średnią długość włókien w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego. W celu dokonania porównań między próbkami ważne jest określenie najbardziej optymalnych warunków pozyskiwania obrazu i zapewnienie, że warunki te są konsekwentnie stosowane.Techniki te umożliwią naukowcom porównywanie zmian morfologicznych w różnych tłach genetycznych za pomocą podejść ilościowych. Zmniejsza to subiektywność, a tym samym przyczynia się do zwiększenia reprezentatywności generowanych danych.

quantitative-approaches-for-studying-cellular-structures-organelle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Prezentujemy zautomatyzowaną metodę trójwymiarowej rekonstrukcji linii zarodkowej Caenorhabditis elegans. Nasza metoda określa liczbę i położenie każdego jądra w linii zarodkowej oraz analizuje rozmieszczenie białek linii zarodkowej i strukturę cytoszkieletu.

Analiza obliczeniowa linii zarodkowej Caenorhabditis elegans w celu zbadania rozmieszczenia jąder, białek i cytoszkieletu

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Ten protokół opisuje podejścia do wykrywania i ilościowego oznaczania dużych zagregowań i/lub organelli (~4 μm) wytwarzanych przez komórki C. elegans w postaci egzoferów związanych z błoną. Opisujemy szczepy, warunki wzrostu, kryteria punktacji, czas i rozważania mikroskopowe potrzebne do ułatwienia sekcji tego mechanizmu wydalania gruzu.

Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Poznaj ilościowe metody analizy morfologii synaps, mięśni i mitochondriów u Caenorhabditis elegans przy użyciu oprogramowania CellProfiler i Fiji. Techniki te umożliwiają obiektywną ocenę zmian strukturalnych spowodowanych mutacjami genetycznymi.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów