Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans
5 lipca 2019
To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.
Zdolność do ilościowego określania zmian w morfologii tkanek i organelli jest ważna dla zrozumienia funkcji genów, a także wpływu mutacji genetycznych. Nasze protokoły wyjaśniają, w jaki sposób można wykorzystać ogólnodostępne oprogramowanie do niesubiektywnej oceny morfologii synaps, mięśni i mitochondriów u nicienia C.elegans. Wiele wcześniejszych badań opierało się na jakościowych metodach porównywania zmian morfologicznych.
Mogą one jednak być problematyczne, ponieważ mogą nie wychwytywać subtelnych różnic fenotypowych, mogą zawyżać i zaniżać zmiany i są oceniane subiektywnie. Nasze metody ilościowe zapewniają bardziej wiarygodne i mniej tendencyjne środki oceny zmian morfologicznych. Metody te mogą być z łatwością wykorzystane do badania zmian morfologicznych w innych strukturach komórkowych lub organizmach modelowych w celu określenia funkcji genów i konsekwencji mutacji związanych z chorobą.
Zacznij od przygotowania preparatów do obrazowania. Umieść kroplę stopionej agarozy na szkiełku mikroskopowym i natychmiast dociśnij kroplę innym szkiełkiem mikroskopowym, delikatnie spłaszczając agarozę. Pozostaw agarozę do wyschnięcia na minutę, a następnie ostrożnie oddziel dwa szkiełka i pozostaw zestaloną podkładkę na jednym z szkiełek.
Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu i dodaj od pięciu do 10 mililitrów kropli środka znieczulającego na środek podkładki agarozowej. Użyj sterylizowanego termicznie kilofa, aby szybko przenieść od 10 do 15 zwierząt z talerza podstawowego do kropli środka znieczulającego, zanim roztwór wyschnie. Następnie nałóż szkiełko nakrywkowe, umieszczając je tuż nad wacikiem agarozowym i delikatnie upuszczając w dół.
Zobrazuj regiony synaptyczne za pomocą mikroskopu konfokalnego ze skaningiem liniowym sprzężonego z optycznie pompowanym laserem diodowym półprzewodnikowym o długości 488 i 552 nanometrów i wyposażonego w oprogramowanie do przechwytywania obrazu. Po zlokalizowaniu robaków przełącz się na 40-krotne powiększenie i zastosuj medium zanurzeniowe. Uwidocznij obszar synaptyczny poprzez wzbudzenie fluoroforów za pomocą lasera o długości 552 nanometrów, 1% mocy dla fluoroforu tagRFP i 488 nanometrów, 2% mocy dla fluoroforu GFP.
Rób zdjęcia za pomocą hybrydowego fotodetektora i ustaw wzmocnienia, aby zapobiec prześwietleniu fluoroforów. Zbieraj obrazy stosu Z, aby pokryć całą synapsę, używając optymalnego rozmiaru kroku Z w zależności od obiektywu. Aby przeanalizować region synaptyczny, zacznij od załadowania obrazów do oprogramowania CellProfiler 3.1.5.
Skonfiguruj moduł NameAndType i określ region synaptyczny za pomocą ręcznej definicji przy użyciu rozproszonego tagRFP wyrażonego z transgenu UIS-115. Zmierz rozmiar i fluorescencję ręcznie zdefiniowanej synapsy, dodając moduły MeasureObjectSizeShape i MeasureObjectIntensity do potoku. Następnie oblicz względną zintegrowaną intensywność fluorescencji, dodając moduł CalculateMath i dzieląc zintegrowane jednostki intensywności uzyskane z JSIS37 przez te uzyskane z UIS-115.
Po zakończeniu wyeksportuj wszystkie pomiary i obliczenia. Aby zmierzyć obszar komórek mięśniowych, otwórz obraz w oprogramowaniu Fiji i użyj wyboru wielokąta, aby dokładnie prześledzić wokół pojedynczej ukośnej komórki mięśniowej. Dostosuj linię wielokąta na końcu, przeciągając kropkę zakotwiczenia, aby poprawić obrysowywanie.
Przejdź do karty Analizuj w górnej części oprogramowania i kliknij przycisk Zmierz, aby obliczyć wybrany obszar. W przypadku komórek mięśniowych ze zdegenerowanym lub brakującym regionem obrysuj brakujący obszar za pomocą narzędzia do zaznaczania wielokątów i ponownie kliknij przycisk Zmierz. Jeśli jest wiele przerw, prześledź każdą z nich osobno.
Oblicz stosunek obszaru przerwy do obszaru całej komórki. Wysoki współczynnik wskazuje na większy stopień zwyrodnienia mięśni. A jeśli nie ma brakujących regionów, współczynnik jest obliczany jako zero.
Otwórz Elastic i wybierz Klasyfikacja pikseli w obszarze Create New Project (Utwórz nowy projekt). Następnie zmień nazwę i zapisz projekt. Przejdź do karty danych wejściowych i kliknij Dodaj nowy, a następnie Dodaj oddzielne obrazy.
Skieruj wyskakujące okienko do folderu z plikami TIF i wybierz żądany obraz. Na karcie Feature Selection (Wybór funkcji) kliknij Select Features (Wybierz obiekty), aby zaznaczyć wszystkie cechy pikseli oznaczone zielonymi polami wyboru. Wybór pikseli w tym kroku służy do rozróżniania różnych klas pikseli w następnym kroku.
Użyj panelu treningowego, aby odróżnić poszczególne włókna miozyny wykazujące ekspresję GFP od niechcianego tła. Kliknij Dodaj etykietę i nabazgraj niechciane tła i odstępy między włóknami, aby rozpocząć szkolenie klasyfikatora. Dodaj drugą etykietę, zmień jej nazwę na Filament i nabazgraj kilka filamentów.
Kliknij Live Update, aby upewnić się, że klasyfikacja została wykonana poprawnie. W razie potrzeby dodaj więcej bazgrołów, aby dostroić trening. Po wykonaniu klasyfikatora treningowego przejdź do panelu Eksport predykcji i kliknij Wybierz opcję Eksportuj ustawienia obrazu z prawdopodobieństwami jako źródłem.
Upewnij się, że podregiony wycięcia x i y są zaznaczone, a c nie jest zaznaczone. Wybierz zero i jeden jako wartości początkowe i końcowe dla c, a następnie Konwertuj typ danych na 8-bitowy bez znaku. Zaznacz opcję Normalizuj ponownie, a następnie zmień plik wyjściowy wideo na png, zmieniając nazwę pliku i katalogu zgodnie z potrzebami.
Zamknij okno Eksportuj ustawienia i wyeksportuj obraz, który właśnie został podzielony na segmenty. Następnie otwórz plik png w oprogramowaniu Fidżi. Dostosuj próg obrazu za pomocą ustawień domyślnych i zastosuj wtyczkę szkieletyzacji, która utworzy osobną tabelę wyników.
Protokół ten został wykorzystany do zbadania funkcji acetylotransferazy alfa-tubuliny MEC-17 w rozwoju synaps. Analiza ilościowa obrazów tylnych/bocznych mikrotubul lub synaps PLM wskazuje, że nadekspresja MEC-17 zaburza normalne funkcjonowanie neuronów. W porównaniu z dzikimi zwierzętami kontrolnymi, nadekspresja MEC-17 znacznie zmniejszyła regiony presynaptyczne i integralność synaptyczną.
Techniki te zostały również wykorzystane do analizy modeli C.elegans Charcota-Marie-Tootha typu 2 lub CMT2 przenoszących mutacje w genach związanych z CMT2. Wizualna ocena morfologii mięśni ściany ciała wykazała od 2,5 do 3,5-krotny wzrost wad u badanych zwierząt w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego. Zwierzęta z mutacjami w fzo-1 i unc-116 doświadczyły utraty prążków mięśniowych, nagromadzenia szczątków komórkowych i zwyrodnienia włókien mięśniowych.
Podczas gdy zwierzęta z mutacjami w dyn-1 doświadczyły znacznie mniej defektów w morfologii mięśni. Mutanty fzo-1 i unc-116 wykazywały pięcio- do sześciokrotny wzrost stosunku przerwy do całkowitej powierzchni pojedynczej komórki i znacznie krótszą średnią długość włókien w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego. W celu dokonania porównań między próbkami ważne jest określenie najbardziej optymalnych warunków pozyskiwania obrazu i zapewnienie, że warunki te są konsekwentnie stosowane.
Techniki te umożliwią naukowcom porównywanie zmian morfologicznych w różnych tłach genetycznych za pomocą podejść ilościowych. Zmniejsza to subiektywność, a tym samym przyczynia się do zwiększenia reprezentatywności generowanych danych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie koncentruje się na ilościowym określeniu wielkości synaps, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów w organizmie modelowym C. elegans, wykorzystując bezpłatnie dostępne narzędzia do przetwarzania obrazów. Prezentowane metody pozwalają na wiarygodne porównanie zmian strukturalnych tkanek i organelli wynikających z mutacji genetycznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Ilościowa analiza zmian morfologicznych
- Wpływ mutacji genetycznych na struktury komórkowe
- Rozwój technik obrazowania
Tło
- Znaczenie ilościowego określania zmian morfologicznych dla zrozumienia funkcji genów
- Ograniczenia poprzednich metodologii jakościowych
- Potrzeba niezawodnych i mniej uprzedzonych technik oceny
Zastosowanie metod
- Protokoły przetwarzania obrazów z wykorzystaniem oprogramowania CellProfiler i Fiji
- C. elegans jako organizm modelowy
- Techniki w tym mikroskopia konfokalna i klasyfikacja pikseli
Główne wyniki
- Dostarczenie danych ilościowych dotyczących integralności synaps i powierzchni komórek mięśniowych
- Identyfikacja znaczących defektów w morfologii mięśni w modelach genetycznych
- Ustanowienie powiązań między mutacjami genów a fenotypami morfologicznymi
Wnioski
- Badanie pokazuje wartość metod ilościowych w ocenie zmian morfologicznych w C. elegans
- Wyniki mają zastosowanie w przyszłych badaniach genetycznych i związanych z chorobami
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative morphological analysis in model organisms enables objective assessment of genetic mutation effects on cellular structures, reducing subjectivity in phenotypic evaluation. This approach supports target validation by providing reproducible, quantifiable readouts for synaptic integrity, muscle development, and organelle morphology. Such data enhances predictive confidence in early discovery by linking genetic perturbations to measurable phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantifiable changes in synapse size and fluorescence intensity.
- Operational Value: Provides standardized metrics for muscle cell area and myosin filament length to assess functional target engagement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying mitochondrial morphology shifts as indicators of cellular stress or dysfunction.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized image analysis pipelines using CellProfiler and Fiji for reproducible morphological quantification.
- Scalability: Enables high-content screening readiness through automated measurement of organelle size, circularity, and integrated fluorescence.
- Cross-Platform Utility: Facilitates assay transferability across model systems by establishing quantitative benchmarks for tissue and organelle morphology.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports mechanistic de-risking in neurodegenerative and neuromuscular disease models by quantifying synaptic and muscle defects.
- Translational Continuity: Enables biomarker alignment through quantifiable mitochondrial morphology shifts linked to genetic mutations.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing quantitative thresholds for morphological defect severity in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by converting qualitative phenotypic observations into quantifiable datasets for target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling statistical comparison of synaptic size and fluorescence across genetic backgrounds.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized Z-stack imaging and automated object measurement in CellProfiler.
- Analytics: Generates quantitative outputs including integrated fluorescence intensity ratios, muscle area-to-gap ratios, and mitochondrial circularity scores.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant morphological metrics in C. elegans models of neurodegeneration and muscle disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis framework applicable to multiple organelles and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing objective, quantitative readouts of cellular structural changes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs through freely available software and defined imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of phenotypic effects, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable defect ratios in muscle and synaptic models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and image analysis software such as CellProfiler and Fiji.
- Dependent on consistent imaging conditions including laser power, Z-step size, and antibody labeling for reliable quantification.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition and analysis protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying quantitative morphology assays to different tissue types or model organisms.
- Limited by the need for transgenic reporters or fluorescent tags to define structures of interest, as noted in synaptic region definition via tagRFP.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:59
Slide Preparation
1:48
Assessing Synaptic Morphology
2:47
Quantification of the Synaptic Region
3:45
Measurement of Muscle Cell Area
4:36
Segmentation and Quantification of Myosin Fiber Length
6:39
Results: Function of MEC-17 in the Nervous System
8:14
Conclusion
