Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Znaczenie dla przemysłu

Profilowanie mikrobiomu jest podstawowym etapem walidacji celu w przypadku chorób zapalnych i metabolicznych, umożliwiając formułowanie hipotez dotyczących udziału drobnoustrojów w patogenezie. Niniejszy protokół wspiera opracowywanie modeli przedklinicznych poprzez dostarczanie wysokorozdzielczych danych taksonomicznych z złożonych biospecimenów, co ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego w interwencjach ukierunkowanych na mikrobiom. Standaryzowany proces usprawnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć do identyfikacji wiodącego kandydata w programach terapeutycznych modulujących mikrobiom.

Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym

Wczesna faza odkrywania i walidacja celu

• Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie konkretnych taksonów bakteryjnych z fenotypami chorobowymi w modelach przedklinicznych.
• Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne profilowanie społeczności drobnoustrojów w celu wsparcia priorytetyzacji celów oraz wysiłków na rzecz wyjaśnienia szlaków sygnałowych.

Przesiewy i opracowanie testów

• Wartość naukowa: Generuje ilościowe, wysokorozdzielcze wyniki taksonomiczne odpowiednie dla inicjatyw w zakresie standaryzacji testów i odkrywania biomarkerów.
• Wartość operacyjna: Ustanawia skalowalny i wielokrotnego użytku proces analizy do przesiewowego badania zmian w mikrobiomie w różnych typach próbek i warunkach terapeutycznych.

Badania translacyjne i przedkliniczne

• Wartość naukowa: Wspiera charakteryzację układów istotnych dla przebiegu chorób, umożliwiając podłużne śledzenie zmian w mikrobiomie w odpowiedzi na potencjalne środki terapeutyczne.
• Wartość operacyjna: Ułatwia współpracę międzyfunkcyjną dzięki standaryzowanym formatom danych i narzędziom analitycznym, takim jak DADA2 i Phyloseq.

Integracja potoku i przepływu pracy

Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając praktycznych danych o mikrobiomie, które pomagają w wyborze celu oraz prowadzeniu badań mechanistycznych przed optymalizacją wiodącego związku.

• Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków metabolicznych poprzez precyzyjną identyfikację taksonomiczną na poziomie rodzaju i gatunku.
• Screening: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne profile mikrobiologiczne, które umożliwiają wiarygodne porównanie warunków eksperymentalnych.
• Analityka: Zapewnia ilościowe warianty sekwencji i wskaźniki różnorodności, które wspierają porównania statystyczne i korelację biomarkerów.
• Badania translacyjne: Łączy wyniki odkrywcze z walidacją przedkliniczną poprzez umożliwienie spójnego monitorowania mikrobiomu w różnych fazach badania.
• Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowane, międzywydziałowe możliwości analizy mikrobiomu, które można zastosować w wielu obszarach terapeutycznych.

Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy

• Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w interakcjach gospodarz-mikrob.
• Wartość operacyjna: Zapewnia odtwarzalność i skalowalność dzięki standaryzowanej dwuetapowej reakcji PCR oraz analizie bioinformatycznej.
• Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), umożliwiając wczesne wykrywanie czynników zakłócających pośredniczonych przez mikrobiom w modelach chorób.
• Wpływ na portfolio: Wspiera optymalizację postępów w badaniach z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając opartych na danych informacji o poprawności mechanizmów ukierunkowanych na mikrobiom.

Wskazówki dotyczące wdrożenia

• Wymagana jest wiedza z zakresu biologii molekularnej i bioinformatyki w celu przygotowania reakcji PCR oraz przeprowadzenia analizy w oparciu o program DADA2.
• Metoda zależy od dostępu do infrastruktury sekwencjonowania następnej generacji oraz zasobów obliczeniowych niezbędnych do przetwarzania danych metagenomicznych.
• Konieczna jest standaryzacja obchodzenia się z próbkami, ekstrakcji DNA oraz przygotowania bibliotek sekwencjonowania pomiędzy poszczególnymi zespołami.
• W przypadku rozszerzenia protokołu na biospecymeny inne niż kał, np. próbki z jamy ustnej lub skóry, należy uwzględnić kwestie adaptacji metody.
• Ograniczenia praktyczne obejmują błędy PCR oraz głębokość sekwencjonowania, które wpływają na wykrywanie taksonów o niskiej liczebności.

Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji