Name: Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj metodę analizy mikrobioty za pomocą sekwencjonowania 16S rRNA i bioinformatycznych narzędzi. Protokół obejmuje izolację DNA z próbek kałowych oraz przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za finansowanie z NIAID/NIH (1R01AI137075-01), Carver Trust Medical Research Initiative Grant oraz University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).

Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Iowa.
1. Pobieranie i postępowanie z próbkami kału
<ol>
	<li>Wysterylizuj pudełka rozdzielające (patrz Tabela materiałów, Rysunek uzupełniający 1) 70% etanolem.</li>
	<li>Wstępnie oznaczyć probówki do mikrowirówek (po jednej na mysz) identyfikatorem próbki i grupą poddawaną działaniu substancji (jeśli dotyczy).</li>
	<li>Umieść myszy w wysterylizowanych pudełkach do rozdzielania i pozwól im normalnie się wypróżniać przez maksymalnie 1 godzinę.</li>
	<li>Zbierz granulki kału do pustej, wstępnie oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą sterylnych kleszczyków i dokładnie zamknij probówkę. Wysterylizuj kleszcze po zebraniu z każdej myszy.</li>
	<li>Umieść probówkę do mikrowirówki zawierającą granulki kału w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania. 
	nuta: Pudełka z przegrodami są korzystne, ponieważ umożliwiają jednoczesne pobieranie próbek kału od wielu myszy (do 12) w tym samym czasie.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Wyjmij próbki kału (mysz lub człowiek) z zamrażarki i rozmroź w temperaturze pokojowej (RT). 
	nuta: Zaleca się rozmrażanie próbek kału ludzkiego przez noc w temperaturze 4 °C, w zależności od potrzeb w celu pobrania 200 mg lub wymaganej ilości z próbek podstawowych.</li>
	<li>Użyć 200 mg materiałów wyjściowych i wymyć DNA do końcowej objętości 50 μl.</li>
	<li>Dołącz ślepy zestaw do izolacji DNA, do którego nie dodaje się próbki kału, ale jest ona przetwarzana przez wszystkie etapy ekstrakcji DNA. 
	nuta: Użyto specjalnego zestawu do izolacji DNA (patrz tabela materiałów), ponieważ zawiera on specyficzne odczynniki do usuwania materiałów hamujących, takich jak biologiczne odpady stałe, niestrawiony materiał roślinny i związki hemowe z lizowanych czerwonych krwinek obecnych w próbkach kału ludzkiego i myszy.</li>
	<li>Umieścić rurkę z kulkami w homogenizatorze (patrz tabela materiałów) i homogenizować próbki przez 45 s przy temperaturze pokojowej i prędkości 4,5 m/s. 
	nuta: Można zastosować homogenizator do ubijania kulek dowolnego producenta. Zaleca się jednak standaryzację metody, a w szczególności szybkości i czasu trwania homogenizacji, w przypadku stosowania homogenizatora do ubijania kulek od innego dostawcy.</li>
	<li>Wyizolować DNA z poszczególnych próbek kału myszy za pomocą zestawu do izolacji bakteryjnego DNA zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów) z niewielkimi modyfikacjami. Określić ilościowo wyizolowany DNA, ładując 1 μl DNA do fluorymetru lub na chip do elektroforezy o wysokiej czułości (patrz tabela materiałów). 
	nuta: Oczekiwana wydajność DNA może wynosić od 500 do 2,500 ng, zaczynając od 200 mg próbki kału.</li>
	<li>Dostosuj stężenie DNA do 4–20 ng/μl za pomocą buforu elucyjnego. Ponownie określić ilościowo DNA (jak to zrobiono w kroku 2.5) przed przystąpieniem do amplifikacji genu 16S rRNA (PCR1), jeśli PCR1 nie zostanie wykonany tego samego dnia.</li>
</ol>
3. Amplifikacja genu 16S rRNA (PCR1)
<ol>
	<li>Ustawić amplifikację genu 16S rRNA (PCR1) w 96-dołkowej płytce PCR, używając objętości reakcyjnej 25 μl.</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 12,5 μl 2x mieszanki enzymów polimerazy o wysokiej wierności wraz z buforem, oprócz dNTP (patrz tabela materiałów): 40 ng DNA w całkowitej objętości do 10,5 μl (dostosuj całkowitą objętość wodą klasy PCR): 1 μl (każdy) starterów do przodu i do tyłu przy stężeniu 1 μM. 
	nuta: Sekwencje starterów są następujące: 
	starter do przodu = 5'-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGGGGCWGCAG-3' starter odwrotny = 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGATCTAATC C-3'. Dołącz ślepą próbę zestawu z kroku 2.3 (kontrola odczynnika w zestawie) do płytki PCR.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę PCR i odwirować przy 1 000 x g w temperaturze 20 °C przez 1 minutę w wirówce stołowej (patrz tabela materiałów) i przeprowadzić PCR w termocyklerze zaprogramowanym na: 95 °C przez 3 min; 25 cykli po 1) 95 °C przez 30 s, 2) 55 °C przez 30 s, 3) 72 °C przez 30 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min; i utrzymywać w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Chociaż ta metoda amplifikacji genu 16S rRNA powinna działać z różnymi typami próbek biologicznych, zaleca się standaryzację liczby cykli amplifikacji podczas rozpoczynania nowego projektu.</li>
	<li>Potwierdź wielkość produktu PCR1, ładując 1 μl DNA na chip do elektroforezy o wysokiej czułości. Alternatywnie, uruchom 5 μl produktu amplifikowanego 16S rRNA na 1,5% żelu agarozowym, aby potwierdzić 550 pz produktu PCR1. 
	nuta: Oczyszczanie produktu amplifikowanego 16S rRNA jest opcjonalne i zależy od zastosowanego zestawu/metody izolacji DNA. W przypadku stosowania własnej metody izolacji DNA, produkt PCR1 można oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania DNA mikrobiomu zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów). Zastosowany tutaj zestaw do izolacji DNA daje ultraczyste DNA i nie wymaga czyszczenia produktu PCR1.</li>
</ol>
4. Budowa biblioteki DNA przy użyciu indeksowanego PCR (PCR2)
<ol>
	<li>Startery z kodami kreskowymi Indeksu 1 i Indeksu 2 należy umieścić w specjalnym stojaku (patrz Spis materiałów) dla 96 bibliotek.
	<ol>
		<li>Ułóż starter indeksu 1 w kolumnach 1–12, a starter indeksu 2 w rzędach A–H specjalnego stojaka.</li>
		<li>Dodać 2,5 μl wskaźnika 1 w kolumnach 1–12 i startera indeksu 2 w rzędach A–H za pomocą pipet wielokanałowych. Umieść nową nasadkę (patrz Tabela materiałów) na starterach o indeksie 1 i indeksie 2 i przechowuj ją w zamrażarce o temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 12,5 μl 2x mieszanki enzymów polimerazy o wysokiej wierności zawierającej bufor, oprócz dNTP (patrz tabela materiałów); 5 μl wody klasy PCR i 2,5 μl produktu amplifikowanego 16S rRNA. 
	nuta: Dodaj unikatowe indeksy do każdej próbki, aby multipleksować więcej niż 96 bibliotek w jednym przebiegu, zgodnie z opisem w Kiernan et al.27. Niniejszy protokół wykorzystuje adaptery z komercyjnego zestawu (np. Nextera XT Index Kit) zgodnie z instrukcją producenta dostarczoną w metodzie sekwencjonowania metagenomiki 16S (np. Illumina).</li>
	<li>Uszczelnić i odwirować zindeksowaną płytkę PCR przy 1 000 x g w temperaturze 20 °C przez 1 minutę i przeprowadzić PCR w termocyklerze zaprogramowanym na: 95 °C przez 3 minuty; 8 cykli po 1) 95 °C przez 30 s, 2) 55 °C przez 30 s, 3) 72 °C przez 30 s; i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min.</li>
	<li>Potwierdź wielkość zasady 630 indeksowanego produktu PCR, ładując 1 μl DNA na chip do elektroforezy o wysokiej czułości. Alternatywnie, uruchom 5 μl indeksowanego produktu PCR na 1,5% żelu agarozowym, aby potwierdzić wielkość i intensywność produktu.</li>
</ol>
5. Czyszczenie indeksowanego PCR (PCR2) i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Zebrać 5 μl amplikonu PCR2 za pomocą pipet wielokanałowych z każdej studzienki do wielokanałowej tacy zbiornika wolnej od wykrywalnych DNaz, RNaz, ludzkiego DNA i bakterii pirogennych (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przenieś zebrany produkt z tacki zbiornika wielokanałowego do pustej, wstępnie oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przemieszaj do wymieszania.</li>
	<li>Oczyść produkt PCR2 za pomocą standardowego zestawu kulek magnetycznych (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta. Pozostałe 20 μl PCR2 należy zapieczętować i przechowywać na tej samej płytce w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania, jeśli zajdzie taka potrzeba.</li>
	<li>Przygotuj świeży 80% etanol, dodając 4 ml 100% etanolu do 1 ml wody klasy PCR.</li>
	<li>Zrównoważ koralik magnetyczny z RT i wiruj przez 30 sekund, aby równomiernie rozproszyć koraliki.</li>
	<li>Krótko odwirować i odwirować zebrane próbki amplikonu PCR2.</li>
	<li>Dodaj 80 μl kulek magnetycznych do wstępnie oznakowanej, sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z 80 μl połączonych produktów PCR, a następnie wiruj i krótko odwiruj, aby równomiernie zawiesić kulki magnetyczne.</li>
	<li>Inkubować zawartość w temperaturze pokojowej przez 15 minut, nie naruszając probówek.</li>
	<li>Umieść probówkę z DNA i kulkami magnetycznymi na stojaku magnetycznym (patrz Tabela Materiałów) na 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć i wyrzucić 150 μl supernatantu.</li>
	<li>Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu bez naruszania kulek i inkubuj przez 30 sekund.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć i wyrzucić cały supernatant.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.11–5.12. Usuń pozostałą objętość za pomocą pipety P10. Pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut, pozostawiając probówkę wskaźnikową PCR na stojaku magnetycznym.</li>
	<li>Zdejmij ze stojaka magnetycznego. Dodać 33 μl buforu elucyjnego (dopuszczalny jest bufor elucyjny zestawu DNA). Dobrze odwiruj i wykonaj szybkie wirowanie, aby usunąć pozostały płyn z boku. Inkubować przez 2 minuty i umieścić na stojaku magnetycznym na 5 minut.</li>
	<li>Przenieść 30 μl supernatantu (czyste produkty PCR) do wstępnie znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Oznacz ilościowo oczyszczoną pulę, ładując 1 μl oczyszczonej puli do fluorymetru lub chipa do elektroforezy o wysokiej czułości, ponieważ będzie to wymagane podczas sekwencjonowania. Wykonaj MiSeq zgodnie z opisem poniżej.</li>
</ol>
6. Sekwencjonowanie MiSeq
<ol>
	<li>Utwórz arkusz próbny zawierający informacje o kodzie kreskowym specyficzne dla próbki do przepływu pracy metagenomiki i demultipleksowania na instrumencie MiSeq (patrz Tabela materiałów). Prześlij ten przykładowy arkusz do oprogramowania (np. Illumina Experiment Manager).</li>
	<li>Rozcieńcz biblioteki w puli od kroku 5.15 do 4 nM.</li>
	<li>Denaturyzacja połączonych bibliotek poprzez połączenie 5 μl z puli bibliotecznej 4 nM z 5 μl świeżo przygotowanego 0,2 M NaOH w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Krótko wirować w celu wymieszania, krótko odwirować i inkubować przez 5 minut w temperaturze otoczenia.</li>
	<li>Dodać 990 μl lodowatego buforu hybrydyzacyjnego (bufor HB) i delikatnie odpipetować do wymieszania. Da to bibliotekę o pojemności 20 pM.</li>
	<li>Połącz 2 μl z biblioteki kontrolnej 10 nM z 3 μl buforu EBT (10 mM Tris-HCl, pH = 8,5, z 0,1% Tween 20), aby uzyskać bibliotekę kontrolną 4 nM. Dodać 5 μl świeżo przygotowanego 0,2 N NaOH i krótko zmieszać. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 990 μl lodowatego buforu do hybrydyzacji (bufor HB) i delikatnie odpipetować do wymieszania. Spowoduje to otrzymanie bibliotek kontrolnych 20 pM. 
	UWAGA: Zdenaturowane biblioteki kontrolne 20 pM mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do 4 tygodni. Po 4 tygodniach liczba klastrów ma tendencję do zmniejszania się.
	<ol>
		<li>Połączyć 210 μl z biblioteki 20 pM z 40 μl biblioteki kontrolnej 20 pM (stężenie końcowe = ~18%) i dodać 350 μl buforu HB. Załaduj bibliotekę do końcowego stężenia 7 pM. 
		nuta: Szczegóły danych wejściowych należy dostosować zgodnie z wydajnością przebiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować próbki przez 2 minuty w temperaturze 96 °C. Umieścić na lodzie na 5 minut. Załadować 600 μl końcowej puli do odpowiedniego dołka wkładów MiSeq. 
	nuta: Sekcja 6 powyżej może być wykonana w ośrodku genomicznym/DNA.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie danych i analiza sekwencji
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania R (wersja 3.5) do przetwarzania i analizy danych DADA2. W przypadku kroków 7.1–7.4 należy użyć oprogramowania o otwartym dostępie, zgodnie z opisem we wcześniej opracowanym samouczku online DADA2, który można znaleźć pod adresem <https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html>. 
	nuta: Łatwy w użyciu skrypt języka R został dołączony jako plik uzupełniający 2, a użytkownicy muszą zmienić nazwę i źródło plików sekwencjonowania (np. SAMPLENAME_R1_001.fastq i SAMPLENAME_R2_001.fastq).</li>
	<li>Wizualizacja profilów jakości odczytów do przodu i do tyłu za pomocą polecenia plotQualityProfile.</li>
	<li>Przycinanie nukleotydów z odczytów do przodu i do tyłu na podstawie wykresu jakości. Te parametry są określone przez parametr truncLen w DADA2. 
	nuta: W tym przypadku 280 jest używany jako próg długości, dla którego odczyty do przodu zostaną odrzucone, a 260 jest używany jako próg długości, dla którego odczyty odwrotne zostaną odrzucone.</li>
	<li>Przetwarzaj surowe dane 16S jako pliki fastq przez potok DADA2, zgodnie z opisem w samouczku online (dostępnym pod adresem <https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html>), aby scalić odczyty R1 i R2 i utworzyć warianty sekwencji amplikonów (ASV), które są następnie używane do przypisywania taksonów do referencyjnej bazy danych Silva23. 
	UWAGA: Przykładowa tabela wariantów sekwencji amplikonów wygenerowana z potoku DADA2 jest dołączona jako plik uzupełniający 3. Można użyć referencyjnej bazy danych Greengene lub Silva, ponieważ przy użyciu żadnej z tych baz danych nie stwierdzono żadnych różnic w klasyfikacji bakterii.</li>
	<li>Wygeneruj zdefiniowany przez użytkownika plik mapowania, który zawiera metadane (tj. genotyp, płeć, leczenie itp.) dla każdej próbki. Przykładowy plik metadanych został dołączony jako plik uzupełniający 4.</li>
	<li>Oblicz różnorodność alfa (indeks Shannona) i różnorodność beta za pomocą analizy współrzędnych głównych (PCA) na podstawie rozrzedzonych liczb OTU przy użyciu Phyloseq28, jak opisano w samouczku online, który znajduje się pod adresem <https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html>.</li>
	<li>Wykonaj następującą analizę w METAGENassist29. 
	UWAGA: Przeprowadź analizę liczebności różnicowej za pomocą testu sumy rang Wilcoxona na poziomie rodzaju. Mapy cieplne i taksony o zróżnicowanej liczebności są wyróżniane za pomocą METAGENassist29, publicznie dostępnego internetowego potoku analiz.
	<ol>
		<li>Przekaż tabelę liczebności taksonomicznej (format CSV) i wybierz pozycję Próbki w kolumnie.</li>
		<li>Przekaż plik mapowania (format CSV) i wybierz pozycję Przykłady w wierszu.</li>
		<li>Wybierz pozycję Opcje, aby usunąć zmienne z ponad 50% zerami i wykluczyć nieprzypisane i niezamapowane odczyty.</li>
		<li>Wybierz pozycję Opcje, aby znormalizować wiersze według sumy i dziennika normalizować kolumny.</li>
		<li>Utwórz wykres Volcano, PCA lub PLSDA, klikając go w tej samej kolumnie po lewej stronie, a następnie kliknij Usuń nazwę próbek, aby utworzyć wykres.</li>
		<li>Wykonaj test t (jeśli tylko dwie grupy) lub ANOVA (jeśli są większe niż dwie grupy), aby zobrazować cechy (bakterie), które różnią się między grupami. Kliknij opcję Wybrane obiekty, aby wyświetlić określone bakterie, które różnią się między grupami.</li>
		<li>Kliknij Dendrogram lub Mapa skupień, aby utworzyć odpowiednie wykresy. Można przeprowadzić dodatkową analizę, taką jak przykładowa wizualizacja według grup lub 25 najważniejszych funkcji opartych na teście/ANOVA.</li>
		<li>Kliknij pozycję RandomForest, aby utworzyć wykresy przedstawiające obiekty, których można użyć do klasyfikacji. Kliknij kartę Wariancja u góry, aby utworzyć wykresy dla najważniejszych obiektów, które różnią się między grupami. Kliknij opcję Szczegóły funkcji, aby wyświetlić listę bakterii, które różnią się między grupami, a następnie kliknij każdą bakterię, aby utworzyć jej graficzne podsumowanie.</li>
		<li>Kliknij kartę Outlier (Wartości odstające) u góry, aby wyświetlić przykłady, które są elementami odstającymi.</li>
		<li>Na koniec kliknij Pobierz i wybierz 1) plik zip zawierający całą wykonaną analizę lub 2) żądane funkcje do pobrania. Ten plik powinien zostać zapisany jako unikalna nazwa i będzie musiał zostać rozpakowany przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
UWAGA: Szczegółowe testy statystyczne wykonywane podczas analizy mikrobiomu znajdują się w pracach Chen et al. oraz Hugerth et al.14,30.

A. M. otrzymywał tantiemy od Mayo Clinic (wypłacane przez Evelo Biosciences) jako jeden z wynalazców technologii twierdzącej, że Prevotella histicola ma zastosowanie w leczeniu chorób autoimmunologicznych.

Opisany protokół jest prosty, z łatwymi do wykonania krokami do przeprowadzenia profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA z dużej liczby interesujących biopróbek. Sekwencjonowanie nowej generacji zmieniło badania nad ekologią drobnoustrojów, zwłaszcza w modelach chorób ludzkich i przedklinicznych31,32. Główną zaletą tej techniki jest jej zdolność do skutecznej analizy złożonych kompozycji mikrobiologicznych (drobnoustrojów hod...

Mikrobiota odnosi się do zbioru mikroorganizmów (bakterii, wirusów, archeonów, bakteriofagów i grzybów) żyjących w określonym środowisku, a mikrobiom odnosi się do zbiorowego genomu mikroorganizmów rezydujących. Ponieważ bakterie są jednymi z najliczniejszych drobnoustrojów u ludzi i myszy, badanie to koncentruje się wyłącznie na profilowaniu bakterii. Ludzkie jelita są skolonizowane przez biliony bakterii i setki szczepów bakteryjnych1. Prawidłowa mikrobiota jelitowa odgrywa istotną rolę w utrzymaniu zdrowego stanu gospodarza poprzez regulację funkcji (tj. utrzymanie nienaruszonej bariery jelitowej, metabolizm pokarmu, homeostazę energetyczną, hamowanie kolonizacji przez organizmy chorobotwórcze i regulację odpowiedzi immunologicznej)2,3,4,5. Zaburzenia składu mikrobioty jelitowej (dysbioza jelitowa) zostały powiązane z wieloma chorobami człowieka, w tym zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi6, otyłość7,8, stroke9, cancer10, diabetes8,11, reumatoidalne zapalenie stawów12, alergie13oraz choroby związane z ośrodkowym układem nerwowym, takie jak stwardnienie rozsiane (SM)14,15 i choroba Alzheimera (AD)8,16. Dlatego w ostatnich latach rośnie zainteresowanie narzędziami do identyfikacji składu bakteryjnego w różnych miejscach ciała. Niezawodna metoda powinna charakteryzować się takimi cechami, jak wysoka przepustowość i łatwość użycia, możliwość klasyfikowania mikrobioty bakteryjnej z wysoką rozdzielczością oraz niski koszt.
Techniki mikrobiologiczne oparte na kulturach nie są wystarczająco czułe, aby zidentyfikować i scharakteryzować złożony mikrobiom jelitowy z powodu niepowodzenia kilku bakterii jelitowych w rozwoju w kulturze. Pojawienie się technologii opartej na sekwencjonowaniu, zwłaszcza sekwencjonowania metagenomicznego opartego na 16S rRNA, przezwyciężyło niektóre z tych wyzwań i zmieniło badania nad mikrobiomem17. Zaawansowana technologia sekwencjonowania oparta na 16S rRNA pomogła w ustaleniu kluczowej roli mikrobiomu jelitowego w zdrowiu człowieka. Human Microbiome Project, inicjatywa National Institutes of Health18, oraz projekt MetaHIT (inicjatywa europejska)19 pomogły w ustanowieniu podstawowych ram analizy mikrobiomu. Inicjatywy te pomogły zainicjować wiele badań mających na celu określenie roli mikrobiomu jelitowego w zdrowiu i chorobach człowieka.
Wiele grup wykazało dysbiozę jelit u pacjentów z chorobami zapalnymi12,14,15,20,21,22. Pomimo tego, że jest szeroko stosowany do profilowania taksonomicznego ze względu na możliwość multipleksacji i niskie koszty, nie ma jednolitych protokołów profilowania taksonomicznego opartego na 16S rRNA. Kolejnym ograniczeniem jest niska rozdzielczość przypisania taksonomicznego ze względu na mniejsze odczyty sekwencjonowania (150 bp lub 250 bp) oraz stosowanie tylko odczytu sekwencjonowania do przodu (R1) ze względu na niską jakość odczytów sekwencjonowania wstecznego (R2). Jednak postępy w technologii sekwencjonowania pomogły przezwyciężyć niektóre z tych wyzwań, takie jak możliwość sekwencjonowania dłuższych odczytów przy użyciu odczytów sparowanych końców (np. Illumina MiSeq 2x300bp).
Obecna technologia sekwencjonowania może sekwencjonować 600 bp odczytów dobrej jakości, co pozwala na łączenie odczytów R1 i R2. Te połączone dłuższe odczyty R1 i R2 umożliwiają lepsze przypisania taksonomiczne, zwłaszcza dzięki otwartej platformie DADA2 (Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2) opartej na języku R. DADA2 wykorzystuje przypisania oparte na wariantach sekwencji amplikonów (ASV) zamiast operacyjnych jednostek taksonomicznych (OTU) opartych na 97% podobieństwie wykorzystanym przez QIIME23. Dopasowania ASV skutkują dokładnym dopasowaniem sekwencji w bazie danych w obrębie 1–2 nukleotydów, co prowadzi do przypisania na poziomie rodzaju i gatunku. W związku z tym połączenie dłuższych, dobrej jakości odczytów sparowanych końców i lepszych narzędzi do przypisywania taksonomii (takich jak DADA2) zmieniło badania mikrobiomu.
Dostępny tutaj jest przewodnik krok po kroku do wykonywania profilowania bakteryjnego za pomocą dwuetapowej amplifikacji regionu V3–V4 16S rRNA i analizy danych przy użyciu potoków DADA2, Phyloseq i METAGENassist. W tym badaniu wykorzystano transgeniczne myszy z ludzkim antygenem leukocytarnym (HLA) klasy II, ponieważ niektóre allele HLA klasy II są związane z predyspozycją do chorób autoimmunologicznych, takich jak MS20,24,25. Jednak znaczenie genów HLA klasy II w regulacji składu mikrobioty jelitowej jest nieznane. Przypuszcza się, że cząsteczka HLA klasy II będzie wpływać na społeczność drobnoustrojów jelitowych poprzez selekcję określonych bakterii. Myszy z nokautem klasy II (AE.KO) lub myszy eksprymujące ludzkie cząsteczki HLA-DQ8 (HLA-DQ8) (HLA-DQ8) 24,25,26 zostały wykorzystane w celu zrozumienia znaczenia cząsteczek HLA klasy II w kształtowaniu społeczności drobnoustrojów jelitowych. Uważa się, że ten kompletny i uproszczony przepływ pracy z analizą danych opartą na języku R będzie doskonałym narzędziem dla naukowców zainteresowanych przeprowadzeniem badań profilowania mikrobiomu.
Pokolenie myszy pozbawione endogennych mysich genów MHC klasy II (AE.KO) i AE-/-. Transgeniczne myszy HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) z tłem C57BL/6J zostały opisane wcześniej26. Próbki kału pobiera się od myszy obojga płci (w wieku 8–12 tygodni). Myszy były wcześniej hodowane i utrzymywane w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu Iowa zgodnie z wytycznymi NIH i instytucjonalnymi. Strategie kontroli zanieczyszczeń, takie jak odsadzanie myszy w komorze z przepływem laminarnym, zmiana rękawiczek między różnymi szczepami myszy i właściwa konserwacja myszy, są kluczowymi krokami w profilowaniu mikrobiomu jelitowego.
Odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) są wysoce zalecane podczas całej procedury. Odpowiednie kontrole ujemne powinny być włączone podczas przeprowadzania etapów izolacji DNA, amplifikacji PCR1 i PCR2 oraz sekwencjonowania. Zaleca się stosowanie sterylnych, wolnych od DNaz, RNaz i pirogenów materiałów. Przez cały czas trwania protokołu należy używać wyznaczonego pipetora do pracy z mikrobiomem i końcówek pipet z filtrem. Analiza mikrobioty składa się z siedmiu etapów: 1) pobranie i przetworzenie próbki kału; 2) ekstrakcja DNA; 3) amplifikacja genu 16S rRNA; 4) budowa biblioteki DNA z wykorzystaniem indeksowanego PCR; 5) oczyszczanie i kwantyfikacja indeksowanego PCR (biblioteka); 6) Sekwencjonowanie MiSeq; oraz 7) przetwarzanie danych i analiza sekwencji. Schemat ideowy wszystkich kroków protokołu jest pokazany w Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml naturalna probówka do mikrowirówek</td><td>USA, Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Ściągaczka do zbierania kału</td></tr> Ściągaczka <tr><td>do aplikatora ręcznego 3M PA1-G</td><td>3M, MN, US</td><td></td> 7100038651 <td>Ściągaczka do prawidłowego uszczelniania płytki PCR</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter, IN, USA</td><td>A63880</td><td>Oczyszczanie PCR, NGS Oczyszczanie, oczyszczanie PCR</td></tr><tr><td>Odczynnik Agilent DNA 1000 Agilent</td><td>Technologies, CA, USA</td><td>5067-1504</td><td>Kwantyfikacja DNA i kontrola jakości</td></tr><tr><td>Bioanalizator DNA 1000</td><td>chip Agilent Technologies, CA, USA</td><td>5067-1504</td><td>Kwantyfikacja DNA i kontrola jakości</td></tr><tr><td>Wymienne nasadki do adoptowania indeksu</td><td>Illumina, Inc., CA, USA</td><td>15026762</td><td>Nowa nasadka do startera o indeksie 1 i 2</td></tr><tr><td>DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit</td><td>MoBio teraz część QIAGEN, Walencja, Kalifornia, USA</td><td>12855-100</td><td>DNA izolacja</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)</td><td>Kapa Biosystem, MA, Stany Zjednoczone</td><td>KK2602</td><td>Gotowa mieszanka PCR do Amplicon PCR1 i indeksowanego PCR2</td></tr><tr><td>Skrzynki dzielone Lewisa</td><td>Pojemniki Lewisa, WI, USA</td><td>ND03080</td><td>Zbiórka kału</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>New England BioLabs, MA, USA</td><td>S1509S</td><td>Do czyszczenia PCR</td></tr><tr><td>MicroAmp Szybka optyczna 96-dołkowa płytka</td> <td>reakcyjna MicroAmpApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, Stany Zjednoczone</td><td>4346906</td><td>PCR Plate</td></tr><tr><td>MicroAmp Optyczny klej foliowy</td><td>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td><td>4311971</td><td>PCR Plate Sealer</td></tr><tr><td>Microfuge 20 Wirówka</td><td>Beckman Coulter, IN, USA</td><td>B30154</td><td>Wirówka używana do izolacji DNA</td></tr><tr><td>Zestaw odczynników MiSeq (600 cykli) v.3</td><td>Illumina, Inc., CA, USA</td><td>MS-102-3003</td><td>Do sekwencjonowania MiSeq</td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT</td><td>Illumina, Inc., CA, USA</td><td>FC-131-1001</td><td>16S rRNA Biblioteka DNA Przygotowanie</td></tr> zbiorników <tr><td>odczynników Tace wielokanałowe</td><td>ASI, FL, USA</td><td>RS71-1</td><td>Do poolingu płytki produktu PCR2</td></tr><tr><td>Cetrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td><td>75004393</td><td>Do mieszania odczynników PCR i usuwania pęcherzyków powietrza z płyty</td></tr><tr><td>PhiX Control</td><td>Illumina, Inc., CA, USA</td><td>FC-110-3001</td><td>Do kontroli sekwencjonowania MiSeq</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania DNA mikrobiomu</td><td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td><td>A29789</td><td>Do oczyszczania produktu PCR1</td></tr><tr><td>Homogenizator PowerLyzer 24</td><td>Omni International, GA, USA</td><td>19-001</td><td>Ubijak do kulek do izolacji DNA</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kubitów DSDNA HS (wysoka czułość)</td><td>Thermo Fisher Scientific, CA, USA</td><td>Q32854</td><td>Kwantyfikacja DNA</td></tr><tr><td>Oprawa płytki indeksowej TruSeq</td><td>Illumina, Inc., CA, USA</td><td>FC-130-1005</td><td>Do układania starterów indeksowych</td></tr><tr><td>Dzielniki pionowe (duże)</td><td>Pojemniki Lewisa, WI, USA</td><td>DV-2280</td><td>Zbieranie kału</td></tr><tr><td>Pionowe przegrody (małe)</td><td>Pojemniki Lewis, WI, US</td><td>DV-1780</td><td>Zbieranie kału</td></tr></tbody></table>

analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji pcr i sekwencjonowania genów 16s rrna nowej generacji

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Ludzkie jelito jest skolonizowane przez biliony bakterii, które wspierają funkcje fizjologiczne, takie jak metabolizm żywności, zbieranie energii i regulacja układu odpornościowego. Sugeruje się, że zaburzenia zdrowego mikrobiomu jelitowego odgrywają rolę w rozwoju chorób zapalnych, w tym stwardnienia rozsianego (SM). Czynniki środowiskowe i genetyczne mogą wpływać na skład mikrobiomu; Dlatego identyfikacja społeczności drobnoustrojów związanych z fenotypem choroby stała się pierwszym krokiem w kierunku zdefiniowania roli mikrobiomu w zdrowiu i chorobie. Zastosowanie sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA do profilowania społeczności bakteryjnej pomogło w postępie w badaniach nad mikrobiomem. Pomimo jego szerokiego zastosowania, nie ma jednolitego protokołu analizy profilowania taksonomicznego opartego na 16S rRNA. Kolejnym ograniczeniem jest niska rozdzielczość przypisania taksonomicznego ze względu na trudności techniczne, takie jak mniejsze odczyty sekwencjonowania, a także stosowanie w analizie końcowej tylko odczytów do przodu (R1) ze względu na niską jakość odczytów wstecznych (R2). Istnieje potrzeba zastosowania uproszczonej metody o wysokiej rozdzielczości do scharakteryzowania różnorodności bakteryjnej w danej próbce biologicznej. Postępy w technologii sekwencjonowania z możliwością sekwencjonowania dłuższych odczytów w wysokiej rozdzielczości pomogły przezwyciężyć niektóre z tych wyzwań. Obecna technologia sekwencjonowania w połączeniu z publicznie dostępnym potokiem analiz metagenomicznych, takim jak oparty na R algorytm denoisingu divisive amplicon-2 (DADA2), pomogła w rozwoju profilowania mikrobiologicznego w wysokiej rozdzielczości, ponieważ DADA2 może przypisywać sekwencję na poziomie rodzaju i gatunku. Poniżej opisano przewodnik dotyczący wykonywania profilowania bakteryjnego przy użyciu dwuetapowej amplifikacji regionu V3-V4 genu 16S rRNA, a następnie analizy przy użyciu ogólnodostępnych narzędzi analitycznych (tj. DADA2, Phyloseq i METAGENassist). Uważa się, że ten prosty i kompletny przepływ pracy będzie doskonałym narzędziem dla badaczy zainteresowanych przeprowadzeniem badań profilowania mikrobiomu.

Ponieważ cząsteczki MHC klasy II (HLA u ludzi) odgrywają centralną rolę w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i wykazują silne powiązania z predyspozycją do SM24,25,26, postawiono hipotezę, że cząsteczka HLA klasy II wpływa na skład mikrobiomu jelitowego. W związku z tym, w celu zrozumienia znaczenia cząsteczek HLA klasy II w kształtowaniu społeczności mikrobiologicznej jelit, wykorzystano myszy pozbawione genu MHC klasy II ...

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Profilowanie mikrobiomu jest pierwszym krokiem w kierunku zdefiniowania roli mikrobiomu w zdrowiu i chorobie. Tutaj opisujemy prostą procedurę izolowania wysokiej jakości bakteryjnego DNA z biblioteki przygotowywania próbek kału, wykonywania 16SR RNA oraz sekwencjonowania metagenomicznego i analizy danych mikrobiomu. Protokół ten pomoże naukowcom nowym w dziedzinie mikrobiomu, a także naukowcom pracującym w dziedzinie mikrobiomu w ustanowieniu rurociągu mikrobiomu w ich laboratorium. Protokół ten można rozszerzyć o profilowanie mikrobiomu z innych próbek biologicznych, takich jak próbki nosa, jamy ustnej lub skóry zwierząt i ludzi. Zbieranie ściegu jest najważniejszym krokiem, ponieważ wszystkie dalsze etapy zależą od wysokiej jakości DNA. Prawidłowe uszczelnienie płytki konserwującej jest ważne, ponieważ niepełne uszczelnienie może prowadzić do ucisku amplifikowanego produktu, co skutkuje niską jakością danych sekwencjonowania. Na początek wysterylizuj pudełka przegródkowe 70% etanolem. Umieść myszy w wysterylizowanych pudełkach na przegrody i pozwól im normalnie się wypróżnić przez maksymalnie godzinę. Użyj sterylnych kleszczy, aby zebrać granulki kału w pustej, wstępnie oznakowanej 1.5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Szczelnie zamknij rurkę. Wysterylizuj kleszcze 70% etanolem, a następnie bakteriobójczą jednorazową chusteczką, po zebraniu kału od każdej myszy. Zważ 200 miligramów granulek kału do 1,5-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej z 0,1 mililitra szklanych kulek i umieść probówkę z kulkami w homogenizatorze ubijającym kulki i homogenizuj próbki przez 45 sekund w temperaturze pokojowej, z prędkością 4,5 metra na sekundę. Wyekstrahuj DNA zgodnie z instrukcjami producenta zestawu i wymyj DNA w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Po wyizolowaniu DNA należy określić ilościowo wyizolowane DNA, ładując 1 mikrolitr DNA na fluorometr. Ustaw amplifikację genu rybosomalnego RNA 16S PCR1 w 96-dołkowej płytce PCR, używając objętości reakcyjnej 25 mikrolitrów. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 40 nanogramów DNA, 13,5 mikrolitrów mieszanki enzymów polimerazy o wysokiej wierności, zawierającej bufor, a także DNTP w starterze do przodu i do tyłu. Prawidłowo uszczelnij płytkę PCR od góry do dołu wzdłuż wszystkich czterech krawędzi. I odwirować przy 1000 razy G przy 20

microbiota-analysis-using-two-step-pcr-next-generation-16s-rrna-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Tutaj prezentujemy protokół sekwencjonowania nowej generacji dla sekwencjonowania 16S rRNA, który umożliwia identyfikację i charakterystykę społeczności mikrobiologicznych w wektorach. Metoda ta obejmuje ekstrakcję DNA, amplifikację i kodowanie kreskowe próbek za pomocą PCR, sekwencjonowanie na komórce przepływowej oraz bioinformatykę w celu dopasowania danych sekwencji do informacji filogenetycznej.

Charakterystyka mikrobiomu kleszczowego za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA nowej generacji

Ten protokół szczegółowo opisuje kompleksowe podejście do hodowli, sekwencjonowania i hybrydowego składania genomu de novo bakterii moczowych. Zapewnia powtarzalną procedurę generowania kompletnych, kolistych sekwencji genomu przydatnych w badaniu zarówno chromosomalnych, jak i pozachromosomalnych elementów genetycznych przyczyniających się do kolonizacji dróg moczowych, patogenezy i rozprzestrzeniania się oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Hybrydowe składanie genomu de novo w celu generowania kompletnych genomów bakterii moczowych przy użyciu technologii sekwencjonowania krótkiego i długiego odczytu

Produkty na bazie glifosatu (GBP) są najpopularniejszymi herbicydami o szerokim spektrum działania na świecie. W tym artykule przedstawiamy ogólne wytyczne dotyczące ilościowego określania wpływu GBP na mikrobiomy, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne.

Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy

Ten protokół zapewnia prostą, opłacalną metodę izolacji DNA do analizy zmian mikroflory jelitowej myszy podczas rozwoju choroby autoimmunologicznej.

Analiza dynamiki mikrobioty kałowej u myszy podatnych na toczeń przy użyciu prostej, opłacalnej metody izolacji DNA

Analiza ekspresji genów bakteryjnych z wykorzystaniem mikromacierzy

Poznaj metodę analizy mikrobioty za pomocą sekwencjonowania 16S rRNA i bioinformatycznych narzędzi. Protokół obejmuje izolację DNA z próbek kałowych oraz przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów