Name: Identyfikacja kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-14T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA z wykorzystaniem traktowania RNase R. Protokół ten optymalizuje przygotowanie bibliotek i umożliwia badanie ekspresji circRNA w różnych typach próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) z Sun City, Arizona za dostarczenie ludzkich tkanek mózgowych. BBDP jest wspierany przez National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer's Disease Core Center), Departament Usług Zdrowotnych Arizony (umowa 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), Arizona Biomedical Research Commission (umowy 4001, 0011, 05-901 i 1001 do Arizona Parkinson's Disease Consortium) oraz Fundacji Michaela J. Foxa na rzecz Badań nad Chorobą Parkinsona27. Badanie to było również wspierane przez DHS i stan Arizona (grant ADHS # ADHS14-052688). Dziękujemy również Andrei Schmitt (Banner Research) i Cynthii Lechuga (TGen) za wsparcie administracyjne.

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu człowieka. Tkanki mózgowe uzyskano z Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program w Sun City, Arizona. Działania Programu Dawstwa Mózgu i Ciała są zatwierdzane przez Zachodnią Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (protokół WIRB #20120821). Wszyscy uczestnicy lub ich przedstawiciele prawni podpisali świadomą zgodę. Komercyjne (niemózgowe) próbki biologiczne zakupiono od firmy Proteogenex.
1. Leczenie RNazy R
UWAGA: W następujących krokach objętość reakcji jest dostosowywana do całkowitej objętości 50 μL. Jest to minimalna objętość próbki, która powinna być użyta w zestawie do oczyszczania i koncentratora RNA (patrz Tabela materiałów). Dodatkowo, zoptymalizowany protokół opisany tutaj dotyczy ilości wejściowej 4 μg całkowitego RNA. Dłuższy czas inkubacji w przypadku traktowania RNazy R jest zalecany dla ilości wejściowej >4 μg.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć całkowite RNA do 4 μg w 39 μl wody wolnej od RNaz w probówce do mikrowirówek i dobrze wymieszać pipetując.</li>
	<li>W oddzielnej probówce rozcieńczyć RNazę R do stężenia roboczego 2 U/μL za pomocą 1x buforu reakcyjnego RNazy R. Przygotuj tylko tyle do natychmiastowego użycia.</li>
	<li>Odpipetować 39 μl całkowitego RNA i 5 μl 10x buforu reakcyjnego RNazy R do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i dobrze wymieszać przez pipetowanie (50 μl to całkowita objętość reakcji). Następnie dodaj 6 μl RNazy R (2 U/μL).</li>
	<li>Ustawić pipetę na pełną objętość reakcyjną (50 μl) i dobrze wymieszać, pipetując 10 razy w górę i w dół.</li>
	<li>Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut. Upewnij się, że cała objętość reakcyjna jest zanurzona w łaźni wodnej.</li>
	<li>Umieść probówkę na lodzie i natychmiast przystąp do oczyszczania i zagęszczania RNA (sekcja 2).</li>
</ol>
2. Oczyszczanie RNA za pomocą zestawu do oczyszczania i koncentratora RNA
>UWAGA: Podczas stosowania wysokiej jakości RNA (RIN>8, DV200>80%), leczenie RNazą R może spowodować utratę około 60% RNA. Stosując dane wejściowe 4 μg, szacuje się, że po sekcji 1 pozostaje 2–2,5 μg traktowanego RNA.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem należy przygotować bufor do płukania RNA, dodając 48 ml 100% etanolu do koncentratu buforowego i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Umieść kolumny oczyszczające w probówkach zbiorczych (patrz Tabela materiałów) i umieść w stojaku na probówki. 
	nuta: Użyj następujących ustawień wirowania dla wszystkich poniższych kroków: 10 000–16 000 x g. Jeśli leczenie DNazą I zostało już wykonane, należy pominąć leczenie DNazą I na tym etapie.</li>
	<li>Dodać 2 objętości buforu wiążącego RNA do próbki poddanej działaniu RNazy R i dobrze wymieszać przez pipetowanie (całkowita objętość: 150 μl).</li>
	<li>Dodać 1 objętość 100% etanolu do buforu wiążącego RNA i mieszaniny próbki poddanej działaniu RNazy R i dobrze wymieszać przez pipetowanie (całkowita objętość: 300 μl).</li>
	<li>Przenieś całą objętość do kolumny i odwiruj kolumnę przez 30 sekund. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodaj 400 μl buforu przygotowawczego RNA bezpośrednio do kolumny, odwiruj kolumnę przez 30 s i odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodaj 700 μl buforu do płukania RNA bezpośrednio do kolumny, odwiruj kolumnę przez 30 s i odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodaj 400 μl buforu do płukania RNA bezpośrednio do kolumny, odwiruj kolumnę przez 2 minuty i przenieś kolumnę do świeżej probówki 1,5 ml wolnej od RNaz.</li>
	<li>Dodaj 11 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio do kolumny, trzymając końcówkę pipety tuż nad filtrem kolumny i upewniając się, że woda ląduje tylko na filtrze kolumny.</li>
	<li>Inkubować kolumnę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wirować przez 1 minutę.</li>
	<li>Przed wyrzuceniem kolumny należy sprawdzić, czy w probówce wolnej od RNaz przepływa przepływ. Jeżeli elucja przebiegła pomyślnie, należy przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C lub natychmiast przystąpić do przygotowania biblioteki. Końcowa całkowita objętość elucyjna wynosząca około 10 μL jest wykorzystywana do budowy biblioteki. 
	nuta: Punkt zatrzymania: Pozostaw RNA w temperaturze -80 °C na okres do 7 dni przed kontynuowaniem przygotowania biblioteki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie biblioteki circRNA
UWAGA: Zobacz Tabelę materiałów dla zestawu, który zawiera większość odczynników używanych w tej sekcji.
<ol>
	<li>Zubożenie i fragmentacja rRNA
	<ol>
		<li>Przenieś 10 μl oczyszczonego RNA z kroku 2.10 do czystej studzienki na nowej 96-dołkowej płytce PCR o pojemności 0,3 ml. Do dołka dodaj 5 μl buforu wiążącego rRNA, a następnie 5 μl mieszanki do usuwania rRNA. Delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.</li>
		<li>Uszczelnić płytkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze 68 °C na wstępnie zaprogramowanym, wstępnie podgrzanym bloku termocyklera. Po zakończeniu 5-minutowej inkubacji umieścić płytkę na ławce i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
		<li>Usuń uszczelkę z płyty. Dodać 35 μl wirowych kulek do usuwania rRNA w temperaturze pokojowej do próbki. Ustaw pipetę na 45 μl i pipetuj w górę i w dół 10–20 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować płytkę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przenieść płytkę na stojak magnetyczny i inkubować na stojaku przez 1 minutę lub do momentu, gdy roztwór się usunie. Przenieść cały supernatant (~45 μl) do nowego dołka na tej samej płytce lub nowej płytki (w zależności od liczby próbek, z którymi pracujesz).</li>
		<li>Zwirować kulki czyszczące RNA (patrz tabela materiałów) aż do dobrego rozproszenia i dodać 99 μl kulek do każdej próbki. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Przenieś płytkę na stojak magnetyczny i inkubuj przez dodatkowe 5 minut lub do momentu, gdy roztwór się klaruje. Usunąć i wyrzucić cały supernatant ze studzienki.</li>
		<li>Trzymając płytkę nadal na stojaku magnetycznym, dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% EtOH do studzienki, nie naruszając kulek. Inkubować przez 30 s, a następnie usunąć i wyrzucić etanol. Powtórz w sumie 2 prania.</li>
		<li>Dodaj 11 μl buforu elucyjnego do każdej studzienki i pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, a następnie przenieść na stojak magnetyczny, aż roztwór się klaruje (1–5 minut).</li>
		<li>Przenieść 8,5 μl supernatantu z dołka do nowego dołka na tej samej płytce lub na nową płytkę. Dodać 8,5 μl mieszanki Elute, Primer, Fragment High do każdej studzienki zawierającej próbkę. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Uszczelnić płytkę i inkubować przez 8 minut w temperaturze 94 °C na wstępnie zaprogramowanym, wstępnie podgrzanym bloku termocyklera. Wyjąć z termocyklera, gdy osiągnie 4 °C i krótko odwirować. 
		nuta: Przejdź natychmiast do protokołu syntezy pierwszej nici cDNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Syntetyzuj cDNA
	<ol>
		<li>Dla każdej przygotowywanej próbki zmieszać 9 μl mieszanki do syntezy pierwszej nici z 1 μl odwrotnej transkryptazy (patrz tabela materiałów). Dodać 8 μl mieszaniny do próbki. Pipetuj w górę i w dół 6 razy, aby wymieszać.
		<ol>
			<li>Uszczelnić płytkę i inkubować na wstępnie zaprogramowanym, wstępnie podgrzanym bloku termocyklera przy użyciu następujących parametrów: 25 °C przez 10 min, 42 °C przez 15 min, 70 °C przez 15 min, 4 °C hold. Przejdź natychmiast do syntezy drugiej nici.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Do każdej próbki dodać 5 μl buforu do sporządzania zawiesiny, a następnie 20 μl mieszanki wzorcowej do znakowania drugiej nici. Odpipetować całą objętość w górę i w dół 6 razy.</li>
		<li>Uszczelnić płytkę i inkubować na zaprogramowanym, wstępnie podgrzanym bloku termocyklera ustawionym na 16 °C przez 1 godzinę. Po inkubacji wyjąć płytkę z termocyklera i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej.</li>
		<li>Kulki oczyszczające Vortex PCR (patrz tabela materiałów) i dodać 90 μl kulek do każdej studzienki próbki. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Przenieś mieszaninę kulek/próbki na stojak magnetyczny i inkubuj przez 5 minut lub do momentu, gdy płyn się oczyści. Usunąć i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Do każdej próbki dodać 200 μl 80% EtOH. Próbki należy inkubować na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 30 s. Odrzucić supernatant. Powtórz 1x.</li>
		<li>Pozostaw koraliki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 6 minut, a następnie wyjmij z podstawki magnetycznej.</li>
		<li>Zawiesić kulki w 19,5 μl bufora do zawieszania. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, następnie przenieść na stojak magnetyczny i inkubować przez dodatkowe 1 minutę lub do momentu, gdy płyn się klaruje.</li>
		<li>Przenieść 17,5 μl supernatantu do nowej studzienki/nowej płytki. 
		nuta: Jeśli nie zostaną one natychmiast podjęte działania, próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie biblioteki
	<ol>
		<li>Dodać 12,5 μl mieszanki A-tailing do każdego dołka zawierającego supernatant. Odpipetuj całą objętość w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.</li>
		<li>Inkubować reakcję na wstępnie zaprogramowanym, podgrzanym bloku termocyklera ustawionym na 37 °C, stosując następujące parametry: 37 °C przez 30 minut, 70 °C przez 5 minut, 4 °C podtrzymanie. Gdy próbki osiągną temperaturę 4 °C, należy natychmiast przystąpić do ligacji adaptera.</li>
		<li>Do każdej próbki dodaj 2,5 μl buforu do recytacji, 2,5 μl unikalnego adaptera RNA i 2,5 μl mieszanki ligacyjnej. Pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać.</li>
		<li>Inkubować próbki na wstępnie zaprogramowanym, podgrzanym bloku termocyklera w temperaturze 30 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Dodać 5 μl buforu do ligacji zatrzymującej do każdej próbki i pipetować w górę iw dół, aby wymieszać.</li>
		<li>Do każdej próbki dodać 42 μl mieszanych kulek oczyszczających PCR i dokładnie wymieszać. Postępować zgodnie z krokami od 3.2.6 do 3.2.10, ale zmienić objętość rekompozycji na 52 μl, a końcową objętość elucji na 50 μl.</li>
		<li>Powtórzyć ponownie protokół kulek oczyszczających PCR z 50 μl elucji z kroku 3.3.6, ale zmienić objętość resuspension na 22 μl, a końcową objętość elucji na 20 μl. 
		nuta: Jeśli nie zostaną one natychmiast podjęte działania, próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 7 dni.</li>
		<li>Do każdej próbki dodać 5 μl koktajlu PCR Primer Cocktail i 25 μl PCR Master Mix. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Inkubować reakcję na wstępnie zaprogramowanym, wstępnie podgrzanym bloku termocyklera, stosując następujące parametry: 98 °C przez 30 s; następnie 8 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s; następnie 72 °C przez 5 min, następnie 4 °C przytrzymaj. 
		nuta: Optymalizacja całkowitej liczby cykli PCR może być konieczna w celu wygenerowania wystarczającej ilości biblioteki do sekwencjonowania.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z protokołem oczyszczania kulek PCR (kroki od 3.2.4 do 3.2.9), z wyjątkiem dodania 50 μl dobrze wymieszanych kulek oczyszczających PCR i zmiany objętości refuzji na 32,5 μl z końcową objętością elucji 30 μL. 
		nuta: Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja i kontrola jakości za pomocą analizatora kwasów nukleinowych
	<ol>
		<li>Pozwól, aby taśmy i odczynniki zrównoważyły się w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Wymieszaj 2 μl biblioteki z 2 μl buforu HS D1000 i dodaj do kompatybilnej płytki studzienki.</li>
		<li>Szczelnie uszczelnić za pomocą kompatybilnej uszczelki foliowej i wirować przez 1 minutę przy 2 000 obr./min.</li>
		<li>Zakręć w dół i załaduj płytkę na analizatorze zgodnie z instrukcjami oprogramowania. 
		nuta: Biblioteki powinny mieć rozmiar około 260 pz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przepływ pracy analizy danych
<ol>
	<li>Sekwencjonuj biblioteki sekwencyjne RNA (patrz tabela materiałów) w celu wygenerowania 82 bp odczytów sparowanych końców. Konwertuj surowe dane sekwencjonowania w postaci plików basecall (.bcl) na FASTQ za pomocą narzędzia bcl2fastq (v0.2.19).</li>
	<li>Wykryj circRNAs. 
	nuta: Opierając się na wcześniej zgłoszonych dowodach na to, że podejście do wykrywania carcRNA działa lepiej w porównaniu z użyciem pojedynczego narzędzia do wykrywania21,22, sugerujemy użycie wielu narzędzi do wykrywania circRNA. W tym przypadku circRNA zostały zidentyfikowane przy użyciu sześciu istniejących algorytmów przewidywania circRNA: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE i DCC, stosując zalecane ustawienia parametrów dla każdego algorytmu.
	<ol>
		<li>Pobierz i zainstaluj każdy algorytm wykrywania circRNA w klastrze obliczeniowym o wysokiej wydajności systemu Linux, korzystając z instrukcji dostarczonych przez programistów.</li>
		<li>Dopasuj FASTQ sekwencji RNA do genomu referencyjnego (GRCh37), używając nakładek zalecanych dla każdego narzędzia.</li>
		<li>Po wyrównaniu wykonaj algorytmy wykrywania circRNA, stosując odpowiednie zalecane ustawienia parametrów.</li>
		<li>Każde narzędzie wygeneruje wielokolumnowy plik wyników z listą wykrytych circRNA, wyodrębni współrzędne circRNA i liczbę odczytów pomocniczych z tego w celu ilościowego określenia liczby kandydatów wykrytych w każdej próbce/warunkach testowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekonwertuj współrzędne circRNA wyjściowe przez CIRI, Mapsplice i DCC na współrzędne oparte na 0, aby były spójne z pozostałymi trzema algorytmami.</li>
	<li>Wybierz circRNA z dwoma lub więcej pomocniczymi odczytami lub dalszymi analizami i porównaniami. Tabela 1 podsumowuje wszystkie parametry oceniane w naszym badaniu wraz z całkowitą liczbą odczytów sekwencjonowania wygenerowanych dla każdej próby.</li>
	<li>Dla każdego warunku próbki/testu policz liczbę wykrytych circRNA znormalizowanych do liczby zmapowanych odczytów wygenerowanych dla tej biblioteki na milion. Podsumuj wyniki z różnych narzędzi/próbek na wykresach pudełkowych, zgodnie z opisem w Reprezentatywnych wynikach.</li>
</ol>

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PloS One. 7 (2), e30733(2012).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Memczak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+a+large+class+of+animal+RNAs+with+regulatory+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.</a> Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).</li>
<li>Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viroids+are+single-stranded+covalently+closed+circular+RNA+molecules+existing+as+highly+base-paired+rod-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).</li>
<li>Nigro, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrambled+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrambled exons.</a> Cell. 64 (3), 607-613 (1991).</li>
<li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLoS Genetics. 9 (9), e1003777(2013).</li>
<li>Du, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxo3+circular+RNA+promotes+cardiac+senescence+by+modulating+multiple+factors+associated+with+stress+and+senescence+responses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses.</a> European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).</li>
<li>Capel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+transcripts+of+the+testis-determining+gene+Sry+in+adult+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis.</a> Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-dependent+gene+silencing+involving+Ago2-mediated+cleavage+of+a+circular+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA.</a> The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li>
<li>Tan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+landscape+of+circular+RNA+expression+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">A landscape of circular RNA expression in the human heart.</a> Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).</li>
<li>Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+differential+circular+RNA+expression+profiles+reveals+the+regulatory+role+of+circTCF25-miR-103a-3p%2FmiR-107-CDK6+pathway+in+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma.</a> Scientific Reports. 6, 30919(2016).</li>
<li>Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIRI%3A+an+efficient+and+unbiased+algorithm+for+de+novo+circular+RNA+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification.</a> Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573(2015).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MapSplice%3A+accurate+mapping+of+RNA-seq+reads+for+splice+junction+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery.</a> Nucleic Acids Research. 38 (18), e178(2010).</li>
<li>Szabo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistically+based+splicing+detection+reveals+neural+enrichment+and+tissue-specific+induction+of+circular+RNA+during+human+fetal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development.</a> Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695(2015).</li>
<li>Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+identification+and+quantification+of+circular+RNAs+from+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).</li>
<li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+sequence-mediated+exon+circularization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li>
<li>Rybak-Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+in+the+mammalian+brain+are+highly+abundant%2C+conserved%2C+and+dynamically+expressed%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed.</a> Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).</li>
<li>Ji, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+Expression+Landscape+and+Prioritization+of+Circular+RNAs+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals.</a> Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).</li>
<li>Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circular+RNA+prediction+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circular RNA prediction tools.</a> Nucleic Acids Research. 44 (6), e58(2016).</li>
<li>Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+and+evaluation+of+circular+RNA+detection+tools%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools.</a> PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420(2017).</li>
<li>Sekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACValidator%3A+a+novel+assembly-based+approach+for+in+silico+validation+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Westholm, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+drosophila+circular+RNAs+reveals+their+structural+and+sequence+properties+and+age-dependent+neural+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation.</a> Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).</li>
<li>Szabo, L., Salzman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+circular+RNAs%3A+bioinformatic+and+experimental+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).</li>
<li>Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+full-length+circular+RNAs+enables+isoform-level+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification.</a> Genome Medicine. 11 (1), 2(2019).</li>
<li>Beach, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arizona+study+of+aging+and+neurodegenerative+disorders+and+brain+and+body+donation+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program.</a> Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu przetestowano dwa dostępne na rynku zestawy do przygotowania biblioteki, opcje wstępnej obróbki i wejściowe ilości RNA w celu optymalizacji protokołu wzbogacania circRNA do budowy bibliotek sekwencjonowania circRNA. Na podstawie ocen przeprowadzonych w tym badaniu można wskazać szereg kluczowych aspektów i krytycznych kroków w tworzeniu bibliotek sekwencjonowania circRNA. Nasza ocena potwierdza użyteczność wstępnego leczenia RNazy R, co znajduje odzwierciedlenie w zwiększonej liczbie wykrytych circRNA. Ogól...

Okrągłe RNA (CircRNAs) to endogenne, niekodujące RNA, które zyskały uwagę ze względu na ich wszechobecną ekspresję w transkryptomie eukariotycznym 1,2,3. Powstają, gdy eksony łączą się ze sobą wstecznie i dlatego początkowo uważano je za artefakty splicingu4,5. Jednak ostatnie badania wykazały, że circRNA wykazują ekspresję specyficzną dla typu komórki, tkanki i etapu rozwoju3,6 i są ewolucyjnie konserwatywne2,3. Ponadto są zaangażowane w pośredniczenie interakcji białko-białko7, wiązanie mikro-RNA (miRNA)3,8,9,10, oraz regulacja transkrypcji genów rodzicielskich11.
W klasycznym sekwencjonowaniu RNA (sekwencjonowanie RNA), circRNA mogą zostać całkowicie utracone podczas budowy biblioteki w wyniku selekcji poli-A dla mRNA lub mogą być trudne do wyizolowania ze względu na ich niską obfitość. Jednak ostatnie badania charakterystyki circRNA obejmowały etap wstępnego leczenia przy użyciu RNazy R w celu wzbogacenia o circRNAs2,12,13. RNaza R to egzorybonukleaza, która trawi liniowe RNA, pozostawiając koliste struktury RNA. Protokoły wzbogacania CircRNA zostały zoptymalizowane poprzez wygenerowanie i porównanie danych z dwóch dostępnych na rynku zestawów do budowy całej biblioteki transkryptomu, z etapem wstępnej obróbki RNazy R i bez niego, oraz przy użyciu różnych ilości całkowitego wejścia RNA (od 1 do 4 μg). Zoptymalizowany protokół został następnie wykorzystany do oceny obfitości krążków RNA w pięciu różnych regionach mózgu (móżdżek [BC], dolny płat ciemieniowy [IP], środkowy zakręt skroniowy [MG], kora potyliczna [OC] i górny zakręt czołowy [SF]) oraz czterech innych typach tkanek (wątroba [LV], płuca [LU], węzeł chłonny [LN] i trzustka [PA]). Biblioteki sekwencyjne RNA zostały sparowane i zsekwencjonowane na końcach, a dane przeanalizowano przy użyciu sześciu różnych algorytmów przewidywania circRNA: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17 i CIRCexplorer18. Na podstawie naszej analizy największą liczbę unikalnych circRNA wykryto przy użyciu zestawu do przygotowywania biblioteki nici całkowitego RNA ze wstępną obróbką RNazy R i całkowitym wejściowym RNA 4 μg. Zoptymalizowany protokół jest opisany tutaj. Jak wcześniej informowaliśmy19,20, największe wzbogacenie circRNA zaobserwowano w mózgu w porównaniu z innymi typami tkanek.

<table><tbody><tr><td>1 000 i mikro; L końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>SR L 10F</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>SR L 200F</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation Akcesoria (osłony foliowe)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5154</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation Akcesoria (końcówki)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5153</td><td></td></tr><tr><td>Folia samoprzylepna do mikropłytek</td><td>VWR</td><td>60941-064</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPure XP 450 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>Oczyszczanie PCR</td></tr><tr><td>Eppendorf twin.tec 96-dołkowe płytki do PCR Odczynniki</td><td>VWR</td><td>951020401</td><td></td></tr><tr><td>o wysokiej czułości D1000</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>Taśma ekranowa D1000 o wysokiej czułości</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>System sekwencjonowania HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw klastrów PE HiSeq 3000/4000 Illumina</td><td></td><td>PE-410-1001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw HiSeq 3000/4000 SBS (150 cykli)</td>System sekwencjonowania <td>Illumina</td><td>FC-410-1002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw szybkiego klastra HiSeq PE PE v2</td><td>Illumina</td><td>PE-402-4002</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cykli)</td><td>Illumina</td><td>FC-402-4022</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Kapa Total RNA</td><td>Roche</td><td>KK8400</td><td></td></tr><tr><td>Etanol klasy biologii molekularnej</td><td>Fisher Scientific BP28184</td><td></td><td></td></tr><tr>Centrum dostarczania<td>probówek do testów kubitowych</td><td>firmy Thermo Fischer</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do testów Qubit dsDNA High</td><td>Sense Centrum dostaw firmy Thermo Fischer</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczanie i koncentrator RNA - 5</td><td>Zymo</td><td>RCC-100</td><td>Zawiera kolumny oczyszczające, probówki</td></tr> <tr>zbiorcze<td>Koraliki RNAClean XP</td><td>Kulki</td>czyszczące <td>RNA Beckman Coulter Genomics</td><td></td></tr><tr><td>Rnase R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Odwrotna transkryptaza 10 000 jednostek</td><td>ThermoFisher (LifeTech)</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Analizator kwasów nukleinowych</td><td>Agilent Technologies</td><td></td></tr><tr><td>TElowE</td><td>VWR</td><td>10128-588</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki TruSeq Stranded Total RNA</td><td>Zestaw Illumina</td><td>20020596</td><td>używany w sekcji 3</td></tr><tr><td>Dwukomorowa dzielona taca</td><td>VWR</td><td>3054-1004</td><td></td></tr><tr>Centrum zaopatrzenia w<td>wodę ultraczystą</td><td>firmy Thermo Fischer</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalna kontrola RNA</td><td>Agilent</td><td>740000</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja kolistych rna za pomocą sekwencjonowania rna

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Koliste RNA (circRNA) to klasa niekodujących RNA zaangażowanych w funkcje takie jak regulacja mikro-RNA (miRNA), mediacja interakcji białko-białko i regulacja transkrypcji genów rodzicielskich. W klasycznym sekwencjonowaniu RNA nowej generacji (sekwencjonowanie RNA) circRNA są zwykle pomijane w wyniku selekcji poli-A podczas budowy bibliotek mRNA lub występują w bardzo niskiej obfitości, a zatem są trudne do wyizolowania i wykrycia. W tym przypadku protokół budowy biblioteki circRNA został zoptymalizowany poprzez porównanie zestawów do przygotowania biblioteki, opcji wstępnego leczenia i różnych całkowitych ilości wejściowych RNA. Przetestowano dwa dostępne na rynku zestawy do przygotowania całej biblioteki transkryptomu, ze wstępną obróbką RNazy R i bez niej, przy użyciu zmiennych ilości całkowitego wejścia RNA (od 1 do 4 μg). Wreszcie, wiele typów tkanek; w tym wątroba, płuca, węzły chłonne i trzustka; a także wiele obszarów mózgu; w tym móżdżek, dolny płat ciemieniowy, środkowy zakręt skroniowy, kora potyliczna i górny zakręt czołowy; porównano w celu oceny liczebności krążonego RNA w różnych typach tkanek. Analiza wygenerowanych danych sekwencyjnych RNA przy użyciu sześciu różnych narzędzi do wykrywania circRNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC i CIRCexplorer) wykazała, że zestaw do przygotowania całkowitej biblioteki RNA z nicią z wstępną obróbką RNazy R i wejściem RNA 4 μg jest optymalną metodą identyfikacji najwyższej względnej liczby circRNA. Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, największe wzbogacenie circRNA zaobserwowano w tkankach mózgowych w porównaniu z innymi typami tkanek.

W pierwszej kolejności oceniono dane wygenerowane przy użyciu komercyjnie dostępnego uniwersalnego kontrolnego RNA (UC) oraz dwóch zestawów do przygotowania bibliotek, z których oba obejmowały etap usuwania rybosomalnego RNA w swoich protokołach. Wykorzystując analityczny schemat postępowania (Schemat analizy danych, sekcja 4), stwierdzono, że w zestawach danych TruSeq wykryto ogólnie większą liczbę circRNA w porównaniu do zestawów Kapa (Rysunek 1). Chociaż procentowy udział rybosomalnego RN...

Koliste RNA (circRNA) to niekodujące RNA, które mogą odgrywać rolę w regulacji transkrypcji i pośredniczeniu w interakcjach między białkami. Po dokonaniu oceny różnych parametrów budowy bibliotek sekwencjonowania circRNA, opracowano protokół wykorzystujący przygotowanie biblioteki nici całkowitego RNA ze wstępną obróbką RNazy R i przedstawiono go tutaj.

Identyfikacja kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Protokół ten jest wynikiem oceny kluczowych aspektów przygotowania biblioteki circRNA, takich jak typ zestawu, leczenie RNazą R, ilości wejściowe i ich wpływ na wykrywanie circRNA. Umożliwia optymalną detekcję circRNA i dostarcza danych o regulowanych parametrach w zależności od potrzeb użytkownika. Identyfikacja circRNA w różnych typach próbek pomoże nam lepiej zrozumieć rozkład ich ekspresji i przygotuje grunt pod określenie funkcjonalnej roli tych cząsteczek.Metodę tę można zastosować do dowolnej próbki całkowitego RNA. Ważne jest, aby przed rozpoczęciem protokołu przechowywać próbki RNA na lodzie. Oceń wartości RIN i DV200 w bioanalizatorze Agilent lub TapeStation przed przygotowaniem i postępuj zgodnie z odpowiednimi procedurami podczas pracy z RNA.Zacznij od rozcieńczenia całkowitego RNA do czterech mikrogramów w 39 mikrolitrach wody wolnej od RNaz i pipetowania w górę iw dół w celu wymieszania. W osobnej probówce użyj 1x bufor RNazy R, aby rozcieńczyć RNazę R do stężenia roboczego dwóch jednostek na mikrolitr. Odpipetować 39 mikrolitrów całkowitego RNA i pięć mikrolitrów 10x buforu reakcyjnego RNazy R do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mikrolitra i wymieszać.Dodać sześć mikrolitrów rozcieńczonej RNazy R. Następnie ustawić pipetę na pełną objętość reakcyjną i wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół 10 razy. Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut, upewniając się, że cała objętość reakcji jest zanurzona w łaźni wodnej. Następnie umieść probówkę na lodzie i natychmiast przystąp do oczyszczania i koncentracji RNA.Przed rozpoczęciem należy przygotować bufor do płukania RNA, mieszając koncentrat z 48 mililitrami 100% etanolu i umieścić kolumny oczyszczające w probówkach zbiorczych. Gdy będziesz gotowy, dodaj dwie objętości buforu wiążącego RNA do próbki poddanej działaniu RNazy R i dobrze wymieszaj. Dodaj 150 mikrolitrów 100% etanolu do mieszaniny, co daje w sumie 300 mikrolitrów, przenieś całą objętość do kolumny i wiruj przez 30 sekund.Usuń przepływ i dodaj 400 mikrolitrów buforu przygotowawczego RNA bezpośrednio do kolumny. Wirować przez 30 sekund i wylać przepływ. Następnie dodaj 700 mikrolitrów buforu do płukania RNA do kolumny, odwiruj przez 30 sekund i odrzuć przepływ.Dodaj kolejne 400 mikrolitrów buforu do mycia, wiruj przez dwie minuty i przenieś kolumnę do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra wolnej od RNaz. Ostrożnie dodaj 11 mikrolitrów wody wolnej od RNaz bezpośrednio do kolumny, trzymając końcówkę pipety tuż nad filtrem kolumny. Pozostaw próbkę na minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj ją przez jedną minutę.Upewnij się, że w 1.5-mililitrowej rurce jest przepływ i wyrzuć kolumnę. Oczyszczoną próbkę RNA można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub natychmiast wykorzystać do przygotowania biblioteki. Przenieś 10 mikrolitrów oczyszczonego całkowitego RNA do czystej studzienki na 96-dołkowej płytce PCR.Dodaj pięć mikrolitrów buforu wiążącego rRNA, a następnie pięć mikrolitrów mieszanki do usuwania rRNA, a następnie delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać odczynniki. Uszczelnij płytkę i inkubuj ją przez pięć minut w temperaturze 68 stopni Celsjusza na zaprogramowanym i podgrzanym bloku termocyklera. Po inkubacji pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na jedną minutę.Usuń uszczelkę z płytki i dodaj do próbki 35 mikrolitrów wirowych kulek usuwających rRNA o temperaturze pokojowej. Ustaw pipetę na 45 mikrolitrów, a następnie pipetuj w górę i w dół 10 do 20 razy, aby dokładnie wymieszać. Pozostaw talerz w temperaturze pokojowej na minutę.Przenieś płytkę na stojak magnetyczny i inkubuj ją tam przez minutę lub do momentu, gdy roztwór się zklaruje. Przenieść supernatant do nowego dołka na płytce. Następnie przenieś płytkę ze stojaka magnetycznego na stojak na talerze.Wiruj kulki czyszczące RNA, aż będą dobrze rozproszone, i dodaj 99 mikrolitrów kulek do próbki. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przenieś płytkę na stojak magnetyczny i pozostaw ją tam na pięć minut lub do momentu, gdy roztwór się klaruje, a następnie usuń i wyrzuć cały supernatant ze studzienki.Trzymając talerz nadal na stojaku magnetycznym, dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu do studzienki, nie naruszając kulek. Pozostaw etanol w studzience na 30 sekund, a następnie wyjmij go i wyrzuć. Dodaj 11 mikrolitrów buforu elucyjnego do studzienki i pipetuj go w górę iw dół, aby wymieszać.Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, a następnie przenieś ją z powrotem do stojaka magnetycznego i trzymaj tam, aż roztwór się klaruje. Przenieść 8,5 mikrolitra supernatantu do nowej studzienki na tej samej płytce i dodać 8,5 mikrolitra Elute, Primer, Fragment High Mix do każdej studzienki zawierającej próbkę. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać, uszczelnić płytkę i inkubować ją przez osiem minut w termocyklerze nagrzanym do 94 stopni Celsjusza.Schłodzić próbkę do czterech stopni Celsjusza, wyjąć płytkę z termocyklera i krótko odwirować. Dwa zestawy do przygotowania biblioteki, TruSeq i KAPA, zostały ocenione pod kątem tego protokołu. Ogólnie rzecz biorąc, podczas korzystania z zestawu TruSeq wykryto większą liczbę kolistych RNA i niższy procent rybosomalnego RNA, dlatego wybrano TruSeq do dalszych eksperymentów.Znaczenie wstępnego traktowania RNazy R oceniano, porównując dane wygenerowane z bibliotek wstępnie poddanych i niepoddanych obróbce. Zgodnie z oczekiwaniami, większa liczba kolistych RNA była konsekwentnie identyfikowana w bibliotekach poddanych obróbce w porównaniu z bibliotekami niepoddanymi obróbce. Ilość wejściowego RNA została zoptymalizowana pod kątem wykrywania większej różnorodności kolistych RNA.Biblioteki przygotowano przy użyciu jednego, dwóch i czterech mikrogramów wejściowego RNA, a największą różnorodność kolistych gatunków RNA zaobserwowano przy użyciu czterech mikrogramów całkowitego RNA. Zoptymalizowany protokół wykorzystano do porównania kolistych obfitości RNA w pięciu regionach mózgu od czterech zdrowych dawców oraz dla innych typów tkanek od sześciu zdrowych dawców. Ogólnie rzecz biorąc, w mózgu zaobserwowano większą obfitość kolistej RNazy w porównaniu z innymi typami tkanek.Ważne jest, aby pamiętać o przestrzeganiu odpowiednich procedur podczas pracy z RNA, w tym o noszeniu rękawiczek, dokładnym czyszczeniu stołu i pipet chusteczkami lub sprayem RNazy przed rozpoczęciem protokołu oraz wcześniejszym utrzymywaniu RNA na lodzie. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić walidację ortogonalną, taką jak sekwencjonowanie Sangera zidentyfikowanych połączeń circRNA. Odkrycie nowych circRNA i dalsze dowody na ich obecność wyznaczają nowy obszar badań nad ich funkcjami biologicznymi.

identification-of-circular-rnas-using-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Klonujemy i analizujemy geny reporterowe generujące koliste RNA. Te geny reporterowe są większe niż konstrukty do analizy splicingu liniowego i zawierają elementy Alu. Aby zbadać koliste RNA, konstrukty są transfekowane do komórek, a otrzymany RNA jest analizowany za pomocą RT-PCR po usunięciu liniowego RNA.

Wykorzystanie pierwiastka aluminiowego zawierającego minigeny do analizy kolistych RNA

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania endogennych miejsc wiązania RNA lub "śladów" kompleksów RNA:białko (RNP) z komórek ssaków. Podejście to obejmuje dwie immunoprecypitacje podjednostek RNP i dlatego nazywa się immunoprecypitacją RNA w tandemie (RIPiT).

Identyfikacja śladów RNA:Kompleksy białkowe poprzez immunoprecypitację RNA w tandemie, a następnie sekwencjonowanie (RIPiT-Seq)

Prezentujemy strategię opartą na cyrkularnym RT-PCR, łączącą cyrkularny RT-PCR, ilościowy RT-PCR, leczenie polifosfatazą 5' RNA i Northern blot. Protokół ten obejmuje etap normalizacji w celu zminimalizowania wpływu niestabilnego trifosforanu 5' i nadaje się do rozróżniania i mapowania pierwotnych i przetworzonych transkryptów stabilnie zgromadzonych w mitochondrium kukurydzy.

Rozróżnianie i mapowanie pierwotnych i przetworzonych transkryptów w mitochondrium kukurydzy przy użyciu cyrkularnej strategii opartej na RT-PCR

Ten protokół opisuje szczegółową metodę cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) do precyzyjnej kwantyfikacji kolistych poziomów RNA (circRNA) w komórkach przy użyciu rozbieżnych starterów.

Kwantyfikacja kolistych RNA za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego

Przesłany tutaj protokół wyjaśnia kompletny proces in silico potrzebny do przewidywania i funkcjonalnego charakteryzowania circRNA na podstawie danych transkryptomu sekwencjonowania RNA, badających interakcje gospodarz-patogen.

In Silico Identyfikacja i charakterystyka circRNA podczas interakcji gospodarz-patogen

Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest coraz bardziej popularnym i dostępnym narzędziem do rozwiązywania problemów związanych ze zmianami genomowymi w wysokiej rozdzielczości. Udostępniamy protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie pojedynczych komórek do identyfikacji zmian liczby kopii w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę sekwencjonowania Susieciowanych, Ligowanych i Swybranych Hybridów (SPLASH), która umożliwia mapowanie całego genomu wewnątrzcząsteczkowych i międzycząsteczkowych interakcji RNA-RNA in vivo. SPLASH może być stosowany do badania interakcji RNA w organizmach, w tym drożdżach, bakteriach i ludziach.

Mapowanie interakcji RNA-RNA na całym świecie przy użyciu biotynylowanego psoralenu

Galaxy i DAVID stały się popularnymi narzędziami, które pozwalają badaczom bez wykształcenia bioinformatycznego analizować i interpretować dane RNA-Seq. Opisujemy protokół dla badaczy C. elegans do przeprowadzania eksperymentów RNA-Seq, uzyskiwania dostępu i przetwarzania zestawu danych za pomocą Galaxy oraz uzyskiwania znaczących informacji biologicznych z list genów za pomocą DAVID.

Analiza transkryptomiczna C. elegans powiedział: Dane sekwencjonowania RNA za pośrednictwem pakietu Tuxedo Suite w projekcie Galaxy

Opisujemy oryginalną platformę do analizy transferowego RNA o nazwie SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt jednocześnie mierzy poziomy komórkowe wszystkich tRNA w próbkach biologicznych, w zaledwie trzech krokach i w czasie krótszym niż 24 godziny.

Znakowanie metaboliczne i profilowanie transferowych RNA za pomocą płaszczek Macroarray

Poznaj metodę identyfikacji kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA z wykorzystaniem traktowania RNase R. Protokół ten optymalizuje przygotowanie bibliotek i umożliwia badanie ekspresji circRNA w różnych typach próbek.

Identyfikacja kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA

Przeglądaj więcej filmów