Identyfikacja kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA
14 listopada 2019
Koliste RNA (circRNA) to niekodujące RNA, które mogą odgrywać rolę w regulacji transkrypcji i pośredniczeniu w interakcjach między białkami. Po dokonaniu oceny różnych parametrów budowy bibliotek sekwencjonowania circRNA, opracowano protokół wykorzystujący przygotowanie biblioteki nici całkowitego RNA ze wstępną obróbką RNazy R i przedstawiono go tutaj.
Protokół ten jest wynikiem oceny kluczowych aspektów przygotowania biblioteki circRNA, takich jak typ zestawu, leczenie RNazą R, ilości wejściowe i ich wpływ na wykrywanie circRNA. Umożliwia optymalną detekcję circRNA i dostarcza danych o regulowanych parametrach w zależności od potrzeb użytkownika. Identyfikacja circRNA w różnych typach próbek pomoże nam lepiej zrozumieć rozkład ich ekspresji i przygotuje grunt pod określenie funkcjonalnej roli tych cząsteczek.
Metodę tę można zastosować do dowolnej próbki całkowitego RNA. Ważne jest, aby przed rozpoczęciem protokołu przechowywać próbki RNA na lodzie. Oceń wartości RIN i DV200 w bioanalizatorze Agilent lub TapeStation przed przygotowaniem i postępuj zgodnie z odpowiednimi procedurami podczas pracy z RNA.
Zacznij od rozcieńczenia całkowitego RNA do czterech mikrogramów w 39 mikrolitrach wody wolnej od RNaz i pipetowania w górę iw dół w celu wymieszania. W osobnej probówce użyj 1x bufor RNazy R, aby rozcieńczyć RNazę R do stężenia roboczego dwóch jednostek na mikrolitr. Odpipetować 39 mikrolitrów całkowitego RNA i pięć mikrolitrów 10x buforu reakcyjnego RNazy R do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 mikrolitra i wymieszać.
Dodać sześć mikrolitrów rozcieńczonej RNazy R. Następnie ustawić pipetę na pełną objętość reakcyjną i wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół 10 razy. Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut, upewniając się, że cała objętość reakcji jest zanurzona w łaźni wodnej. Następnie umieść probówkę na lodzie i natychmiast przystąp do oczyszczania i koncentracji RNA.
Przed rozpoczęciem należy przygotować bufor do płukania RNA, mieszając koncentrat z 48 mililitrami 100% etanolu i umieścić kolumny oczyszczające w probówkach zbiorczych. Gdy będziesz gotowy, dodaj dwie objętości buforu wiążącego RNA do próbki poddanej działaniu RNazy R i dobrze wymieszaj. Dodaj 150 mikrolitrów 100% etanolu do mieszaniny, co daje w sumie 300 mikrolitrów, przenieś całą objętość do kolumny i wiruj przez 30 sekund.
Usuń przepływ i dodaj 400 mikrolitrów buforu przygotowawczego RNA bezpośrednio do kolumny. Wirować przez 30 sekund i wylać przepływ. Następnie dodaj 700 mikrolitrów buforu do płukania RNA do kolumny, odwiruj przez 30 sekund i odrzuć przepływ.
Dodaj kolejne 400 mikrolitrów buforu do mycia, wiruj przez dwie minuty i przenieś kolumnę do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra wolnej od RNaz. Ostrożnie dodaj 11 mikrolitrów wody wolnej od RNaz bezpośrednio do kolumny, trzymając końcówkę pipety tuż nad filtrem kolumny. Pozostaw próbkę na minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odwiruj ją przez jedną minutę.
Upewnij się, że w 1.5-mililitrowej rurce jest przepływ i wyrzuć kolumnę. Oczyszczoną próbkę RNA można przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza lub natychmiast wykorzystać do przygotowania biblioteki. Przenieś 10 mikrolitrów oczyszczonego całkowitego RNA do czystej studzienki na 96-dołkowej płytce PCR.
Dodaj pięć mikrolitrów buforu wiążącego rRNA, a następnie pięć mikrolitrów mieszanki do usuwania rRNA, a następnie delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać odczynniki. Uszczelnij płytkę i inkubuj ją przez pięć minut w temperaturze 68 stopni Celsjusza na zaprogramowanym i podgrzanym bloku termocyklera. Po inkubacji pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na jedną minutę.
Usuń uszczelkę z płytki i dodaj do próbki 35 mikrolitrów wirowych kulek usuwających rRNA o temperaturze pokojowej. Ustaw pipetę na 45 mikrolitrów, a następnie pipetuj w górę i w dół 10 do 20 razy, aby dokładnie wymieszać. Pozostaw talerz w temperaturze pokojowej na minutę.
Przenieś płytkę na stojak magnetyczny i inkubuj ją tam przez minutę lub do momentu, gdy roztwór się zklaruje. Przenieść supernatant do nowego dołka na płytce. Następnie przenieś płytkę ze stojaka magnetycznego na stojak na talerze.
Wiruj kulki czyszczące RNA, aż będą dobrze rozproszone, i dodaj 99 mikrolitrów kulek do próbki. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, i inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przenieś płytkę na stojak magnetyczny i pozostaw ją tam na pięć minut lub do momentu, gdy roztwór się klaruje, a następnie usuń i wyrzuć cały supernatant ze studzienki.
Trzymając talerz nadal na stojaku magnetycznym, dodaj 200 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu do studzienki, nie naruszając kulek. Pozostaw etanol w studzience na 30 sekund, a następnie wyjmij go i wyrzuć. Dodaj 11 mikrolitrów buforu elucyjnego do studzienki i pipetuj go w górę iw dół, aby wymieszać.
Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, a następnie przenieś ją z powrotem do stojaka magnetycznego i trzymaj tam, aż roztwór się klaruje. Przenieść 8,5 mikrolitra supernatantu do nowej studzienki na tej samej płytce i dodać 8,5 mikrolitra Elute, Primer, Fragment High Mix do każdej studzienki zawierającej próbkę. Pipetować w górę i w dół 10 razy, aby dokładnie wymieszać, uszczelnić płytkę i inkubować ją przez osiem minut w termocyklerze nagrzanym do 94 stopni Celsjusza.
Schłodzić próbkę do czterech stopni Celsjusza, wyjąć płytkę z termocyklera i krótko odwirować. Dwa zestawy do przygotowania biblioteki, TruSeq i KAPA, zostały ocenione pod kątem tego protokołu. Ogólnie rzecz biorąc, podczas korzystania z zestawu TruSeq wykryto większą liczbę kolistych RNA i niższy procent rybosomalnego RNA, dlatego wybrano TruSeq do dalszych eksperymentów.
Znaczenie wstępnego traktowania RNazy R oceniano, porównując dane wygenerowane z bibliotek wstępnie poddanych i niepoddanych obróbce. Zgodnie z oczekiwaniami, większa liczba kolistych RNA była konsekwentnie identyfikowana w bibliotekach poddanych obróbce w porównaniu z bibliotekami niepoddanymi obróbce. Ilość wejściowego RNA została zoptymalizowana pod kątem wykrywania większej różnorodności kolistych RNA.
Biblioteki przygotowano przy użyciu jednego, dwóch i czterech mikrogramów wejściowego RNA, a największą różnorodność kolistych gatunków RNA zaobserwowano przy użyciu czterech mikrogramów całkowitego RNA. Zoptymalizowany protokół wykorzystano do porównania kolistych obfitości RNA w pięciu regionach mózgu od czterech zdrowych dawców oraz dla innych typów tkanek od sześciu zdrowych dawców. Ogólnie rzecz biorąc, w mózgu zaobserwowano większą obfitość kolistej RNazy w porównaniu z innymi typami tkanek.
Ważne jest, aby pamiętać o przestrzeganiu odpowiednich procedur podczas pracy z RNA, w tym o noszeniu rękawiczek, dokładnym czyszczeniu stołu i pipet chusteczkami lub sprayem RNazy przed rozpoczęciem protokołu oraz wcześniejszym utrzymywaniu RNA na lodzie. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić walidację ortogonalną, taką jak sekwencjonowanie Sangera zidentyfikowanych połączeń circRNA. Odkrycie nowych circRNA i dalsze dowody na ich obecność wyznaczają nowy obszar badań nad ich funkcjami biologicznymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania kolistej RNA (circRNA), kładąc nacisk na ocenę różnych parametrów w celu optymalnego wykrywania circRNA. Przedstawia on analizę wpływu traktowania RNase R oraz ilości materiału wejściowego na identyfikację circRNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia RNA
- Genomika
Wstęp
- Kółkowe RNA (circRNA) to niekodujące cząsteczki RNA uczestniczące w regulacji transkrypcyjnej.
- Zrozumienie ekspresji circRNA jest kluczowe dla wyjaśnienia ich ról funkcjonalnych.
- Techniki przygotowania bibliotek mogą znacząco wpływać na wykrywanie circRNA.
- Prawidłowe obchodzenie się z próbkami RNA jest niezbędne dla powodzenia eksperymentów.
Cel badania
- Optymalizacja protokołów przygotowania bibliotek circRNA.
- Ocena wpływu różnych parametrów na detekcję circRNA.
- Ułatwienie identyfikacji circRNA w różnych typach próbek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie biblioteki całkowitego RNA z zachowaniem orientacji nici.
- Obróbka wstępna RNazą R w celu wzbogacenia circRNA.
- Ocena typów zestawów i ilości materiału wejściowego.
- Ocena integralności RNA za pomocą Agilent Bioanalyzer lub TapeStation.
Główne wyniki
- Ustalono optymalne warunki detekcji circRNA.
- Dla większej elastyczności użytkownika przedstawiono dane dotyczące parametrów regulowanych.
- Identyfikacja circRNA pozwala na lepsze zrozumienie rozkładu ich ekspresji.
- Metoda ta jest możliwa do zastosowania w przypadku każdej próbki całkowitego RNA.
Wnioski
- Niniejszy protokół wspomaga efektywne przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania circRNA.
- Stanowi on podstawę dla przyszłych badań nad funkcjami circRNA.
- Prawidłowe obchodzenie się z RNA oraz jego odpowiednie przygotowanie są kluczowe dla uzyskania pomyślnych wyników.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Wykrywanie kolistych RNA umożliwia walidację celów w biologii niekodujących RNA, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć. Zoptymalizowane przygotowanie bibliotek zwiększa pewność predykcyjną identyfikacji biomarkerów circRNA w różnych typach tkanek. Ten schemat postępowania usprawnia opracowywanie testów dla modeli chorób neurologicznych i obwodowych, w których wzbogacenie circRNA koreluje z istotnością biologiczną.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie sieci regulacji miRNA za pośrednictwem circRNA oraz interakcji białko-białko.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany schemat postępowania w celu funkcjonalnej walidacji docelowych kandydatów z grupy niekodujących RNA.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wyjaśnienie wzorców ekspresji circRNA w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane o ekspresji circRNA w celu standaryzacji i powtarzalności testów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia tworzenie skalowalnych platform przesiewowych z wykorzystaniem całkowitego RNA z nićmi (stranded total RNA) po wstępnej obróbce RNase R.
- Wartość naukowa: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszych badań przesiewowych związków oraz badań zaangażowania celu (target engagement).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje przydatność systemu w kontekście chorobowym poprzez profilowanie zawartości circRNA w różnych tkankach.
- Wartość operacyjna: Wspiera dopasowanie translacyjnych biomarkerów poprzez identyfikację tkankowo specyficznych sygnatur circRNA.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych dzięki wykrywaniu konserwowanych circRNA w różnych typach tkanek ludzkich.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania, wspierając weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych przed rozpoczęciem prac nad identyfikacją wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie detekcji circRNA zaangażowanych w regulację transkrypcyjną i wiązanie miRNA (tzw. sponging).
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy ilościowych pomiarów circRNA, umożliwiających powtarzalną ocenę związków.
- Analityka: Zapewnia znormalizowane liczby circRNA z wielu narzędzi detekcyjnych do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z ciągłością przedkliniczną dzięki zachowanym wzorcom ekspresji circRNA wzbogaconych w mózgu.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia protokół przygotowania bibliotek wielokrotnego użytku, który można zastosować w różnych typach próbek całkowitego RNA.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez poprawę czułości i swoistości detekcji circRNA.
- Wartość operacyjna: Zwiększa powtarzalność i standaryzację dzięki optymalizacji traktowania RNase R oraz kwantyfikacji RNA wejściowego.
- Wartość strategiczna: Redukuje ryzyko biologiczne przy wyborze celu poprzez umożliwienie kompleksowej oceny krajobrazu niekodującego RNA.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów związanych z circRNA z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o dowody dotyczące ekspresji specyficznej dla tkanki.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z RNA, przygotowywaniu bibliotek oraz bioinformatycznej analizie circRNA.
- Zależne od dostępu do zestawów do przygotowania bibliotek z całkowitego RNA z zachowaniem orientacji nici (stranded), enzymu RNazy R oraz systemów oczyszczania opartych na kuleczkach magnetycznych.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji wskaźników jakości RNA (RIN, DV200) oraz miareczkowania ilości materiału wejściowego.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania procedur dla próbek o niskiej zawartości materiału lub próbek zdegradowanych, w zależności od zmienności źródła tkanki.
- Ograniczone przez zmienność narzędzi do detekcji circRNA oraz konieczność ortogonalnej walidacji domniemanych złączy.
