Name: Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj technikę karmienia przeciwciałami do badania transportu receptorów glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Ta metoda pozwala analizować mechanizmy regulacji ekspresji powierzchniowej receptorów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Northwestern Center for Advanced Microscopy za korzystanie z mikroskopu konfokalnego Nikon A1 i pomoc w planowaniu i analizie eksperymentów. Badania te były wspierane przez NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.) i NIA (R00AG041225) oraz NARSAD Young Investigator Grant z Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.).

<ol><li>Enns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+protein+trafficking+in+the+secretory+and+endocytic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Overview of protein trafficking in the secretory and endocytic pathways.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15, Unit 15 11 (2001).</li>
<li>Bedford, F. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBedford%2C+FK+%22Encyclopedia+of+Neuroscience%22">Encyclopedia of Neuroscience</a>. Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U. , Springer Berlin Heidelberg. 3385-3389 (2009).</li>
<li>Diering, G. H., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPA+Receptor+Code+of+Synaptic+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The AMPA Receptor Code of Synaptic Plasticity.</a> Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).</li>
<li>Lussier, M. P., Sanz-Clemente, A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Regulation+of+N-Methyl-d-aspartate+%28NMDA%29+and+alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+Acid+%28AMPA%29+Receptors+by+Posttranslational+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic Regulation of N-Methyl-d-aspartate (NMDA) and alpha-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Acid (AMPA) Receptors by Posttranslational Modifications.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28596-28603 (2015).</li>
<li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+ion+channels%3A+structure%2C+regulation%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li>
<li>Molnar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+in+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).</li>
<li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Culture+of+Hippocampal+Neurons+from+P0+Newborn+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (19), (2008).</li>
<li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+synaptic+NMDA+receptors+induces+membrane+insertion+of+new+AMPA+receptors+and+LTP+in+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activation of synaptic NMDA receptors induces membrane insertion of new AMPA receptors and LTP in cultured hippocampal neurons.</a> Neuron. 29 (1), 243-254 (2001).</li>
<li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+NMDA+Receptor+Composition%3A+Many+Regulators%2C+Many+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist%3A+A+Review+Journal+Bringing+Neurobiology%2C+Neurology+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Diversity in NMDA Receptor Composition: Many Regulators, Many Consequences.</a> The Neuroscientist: A Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry. 19 (1), 62-75 (2013).</li>
<li>Tham, D. K. L., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Cell-surface+Expression+and+Endocytic+Rate+of+Proteins+in+Primary+Astrocyte+Cultures+Using+Biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li>
<li>Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Synaptic+Plasma+Membrane+and+Postsynaptic+Density+Proteins+Using+a+Discontinuous+Sucrose+Gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51896(2014).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP%3A+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64 (3), 381-390 (2009).</li>
<li>Bailey, D. M., Kovtun, O., Rosenthal, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Conjugated+Single+Quantum+Dot+Tracking+of+Membrane+Neurotransmitter+Transporters+in+Primary+Neuronal+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Antibody-Conjugated Single Quantum Dot Tracking of Membrane Neurotransmitter Transporters in Primary Neuronal Cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1570, 165-177 (2017).</li>
<li>Trussell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+and+analyzing+synaptic+currents+and+synaptic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience.+Chapter+6%2C+Unit%22%5BJournal%5D)">Recording and analyzing synaptic currents and synaptic potentials.</a> Current Protocols in Neuroscience. Chapter 6, Unit. , Chapter 6, Unit 6 10 (2001).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Imaging+of+Cortical+Neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1067(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Interakcja między komórką a jej środowiskiem (np. komunikacja z innymi komórkami, reakcja na różne bodźce itp.) w dużym stopniu zależy od prawidłowej ekspresji receptorów na powierzchni komórki. Szybka i precyzyjnie dostrojona regulacja zawartości receptorów wyrażanych powierzchniowo umożliwia prawidłową odpowiedź komórkową na stale zmieniające się środowisko. W szczególnym przypadku neuronów zmiany w liczbie, lokalizacji i składzie podjednostek receptorów o ekspresji synaptycznej silnie wpływają na komunikację synaptycz...

Komórki wykorzystują aktywny proces transportu do mobilizacji białek do określonych lokalizacji subkomórkowych i wywierają ścisłą czasoprzestrzenną regulację nad swoją funkcją1. Proces ten jest szczególnie ważny dla receptorów transbłonowych, ponieważ odpowiedzi komórkowe na różne bodźce środowiskowe opierają się na kaskadach wewnątrzkomórkowych wyzwalanych przez aktywację receptora. Komórki są w stanie modyfikować te odpowiedzi poprzez zmianę gęstości, lokalizacji i składu podjednostek receptorów wyrażających się na powierzchni komórki poprzez regulację transportu subkomórkowego receptora2. Wprowadzenie nowo zsyntetyzowanych receptorów do błony plazmatycznej, wraz z endocytozą i recyklingiem istniejących receptorów, to przykłady procesów transportowych, które określają pulę netto receptorów wyrażonych powierzchniowo2. Wiele mechanizmów molekularnych współpracuje w celu regulacji transportu białek, w tym interakcji białko-białko i modyfikacje potranslacyjne, takie jak fosforylacja, ubikwitynacja lub palmitoilacja2.
Regulacja transportu receptorów jest szczególnie wymagana w silnie spolaryzowanych komórkach o wysoce wyspecjalizowanych strukturach. Przykładem paradygmatycznym jest kontrola funkcji neuronów poprzez regulowany transport receptorów glutaminianu (GluRs)3,4. Glutaminian, główny neuroprzekaźnik pobudzający, wiąże i aktywuje GluR wyrażane powierzchniowo w celu kontrolowania podstawowych fizjologicznych funkcji neuronalnych, takich jak neurotransmisja synaptyczna i plastyczność synaptyczna. Fakt, że zmieniony transport GluR zaobserwowano w szerokim spektrum neuropatii, od zaburzeń neurorozwojowych po choroby neurodegeneracyjne, podkreśla znaczenie tego procesu5. W związku z tym zrozumienie zdarzeń molekularnych, które kontrolują transport GluR, jest interesujące w wielu obszarach badań.
W tym protokole, metoda oparta na podawaniu przeciwciał jest używana do ilościowego określenia poziomu GluR wyrażanych powierzchniowo w pierwotnych neuronach hipokampa, a także do oceny, jak zmiany w internalizacji i recyklingu skutkują obserwowaną ekspresją powierzchniową netto. Zastosowanie farmakologii i/lub nadekspresji receptorów egzogennych zawierających określone mutacje sprawia, że protokół ten jest szczególnie skutecznym podejściem do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw adaptacji neuronów do różnych bodźców środowiskowych. Ostatnim przykładem użyteczności tego protokołu jest badanie, w jaki sposób wieloczynnikowe zmiany w środowisku (np. w modelach chorobowych) wpływają na transport GluR poprzez badanie ekspresji powierzchniowej w takich modelach.
Na konkretnych przykładach, początkowo pokazano, jak manipulacja farmakologiczna naśladująca fizjologiczną stymulację synaptyczną [chemiczną LTP (cLTP)] zwiększa powierzchniową ekspresję endogennej podjednostki GluA1 typu AMPA GluRs (AMPARs)6. Transportowanie nadeksprymowanej fosfo-mimetycznej formy podjednostki GluN2B GluR typu NMDA (NMDAR) jest również analizowane w celu zilustrowania, w jaki sposób protokół ten może być wykorzystany do badania regulacji transportu GluR przez określone modyfikacje potranslacyjne. Chociaż te konkretne przykłady są używane, protokół ten można łatwo zastosować do innych GluR oraz innych receptorów i białek, które posiadają antygenowe domeny zewnątrzkomórkowe. W przypadku, gdy nie ma dostępnych przeciwciał dla domen zewnątrzkomórkowych, nadekspresja białek znakowanych epitopami zewnątrzkomórkowymi (np. Flaga, Myc, GFP itp.) może pomóc w znakowaniu białek.
Obecny protokół zawiera instrukcje dotyczące ilościowego określania gęstości określonego podtypu GluR i transportu za pomocą specyficznych przeciwciał. Protokół ten można wykorzystać do badania 1) całkowitej ekspresji powierzchni GluR, 2) internalizacji GluR i 3) recyklingu GluR. Aby przestudiować każdy proces indywidualnie, zaleca się rozpoczęcie od sekcji 1 i 2, a następnie kontynuowanie w sekcji 3, 4 lub 5. We wszystkich przypadkach zakończ sekcjami 6 i 8 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm o grubości #1,5</td><td>Neuvitro</td><td>GG181.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-sprzężona koza anty-mysz wtórne</td> Life <td>Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-sprzężona koza anty-królik wtórne</td> Life <td>Technologies</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-sprzężona koza anty-mysz wtórne</td> Life <td>Technologies</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 647-sprzężona koza anty-królik wtórne</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Płaskie płytki do hodowli komórkowych Corning</td><td></td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Dynasore</td><td>Tocris</td><td>2897</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Tocris</td><td>0219</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza fragmenty Fab</td><td>Sigma</td><td>SAB3700970</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mouse przeciwciało anty-GluA1</td><td>Millipore</td><td>MAB2263</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>Neurobaseal Media</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>Abcam</td><td>Ab7481</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pelco BioWave</td><td>Ted Pella</td><td>36500</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Pikrotoksyna</td><td>Tocris</td><td>1128</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Anti-Blaknięcie</td><td>Mocowanie Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-PSD-95</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2507</td><td></td></tr><tr><td>Strychnina</td><td>Tocris</td><td>2785</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost plus</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Odpowiedzi komórkowe na bodźce zewnętrzne w dużej mierze zależą od zestawu receptorów wyrażonych na powierzchni komórki w danym momencie. W związku z tym populacja receptorów o ekspresji powierzchniowej stale się dostosowuje i podlega ścisłym mechanizmom regulacji. Paradygmatycznym przykładem i jednym z najczęściej badanych zdarzeń związanych z handlem w biologii jest regulowana kontrola synaptycznej ekspresji receptorów glutaminianu (GluR). GluR pośredniczą w zdecydowanej większości neurotransmisji pobudzającej w ośrodkowym układzie nerwowym i kontrolują zależne od aktywności fizjologicznej zmiany funkcjonalne i strukturalne na poziomie synaptycznym i neuronalnym (np. plastyczność synaptyczną). Modyfikacje liczby, lokalizacji i składu podjednostek GluR wyrażanych na powierzchni głęboko wpływają na funkcję neuronów, a w rzeczywistości zmiany w tych czynnikach są związane z różnymi neuropatiami. Przedstawiono metodę badania transportu GluR w zdysocjowanych neuronach pierwotnych hipokampa. Podejście "oparte na karmieniu przeciwciałami" jest stosowane do zróżnicowanej wizualizacji populacji GluR wyrażanych na powierzchni i błonach wewnętrznych. Poprzez znakowanie receptorów powierzchniowych na żywych komórkach i utrwalanie ich w różnym czasie, aby umożliwić endocytozę receptorów i/lub recykling, te procesy transportu mogą być oceniane i selektywnie badane. Jest to wszechstronny protokół, który może być stosowany w połączeniu z podejściami farmakologicznymi lub nadekspresją zmienionych receptorów w celu uzyskania cennych informacji na temat bodźców i mechanizmów molekularnych wpływających na transport GluR. Podobnie, można go łatwo dostosować do badania innych receptorów lub białek o ekspresji powierzchniowej.

Niniejszy protokół badania transportu receptorów glutaminianu opiera się na różnicowym znakowaniu receptorów eksponowanych na powierzchni komórki oraz tych zlokalizowanych w błonach wewnętrznych. Separację osiąga się poprzez znakowanie receptorów przed i po permeabilizacji błony, wykorzystując to samo przeciwciało pierwotne, ale przeciwciało wtórne sprzężone z innym fluorophorem. Jak wskazano w opcjonalnych krokach zawartych w protokole, jest to bardzo wszechstronna metoda badania różnych...

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Reakcje komórkowe na bodźce zewnętrzne w dużym stopniu zależą od zestawu białek, które w danym momencie ulegają ekspresji na powierzchni komórki. W związku z tym liczba, lokalizacja subkomórkowa i skład podjednostek tych białek są dynamicznie kontrolowane. W tym przypadku zastosujemy podejście oparte na podawaniu przeciwciał, aby określić ilościowo poziom receptorów wyrażonych powierzchniowo w kulturach komórkowych, o ile wznowi się internalizacja i recykling.Jest to bardzo wszechstronny protokół, który dostarcza mechanistycznych informacji na temat regulacji białek o ekspresji powierzchniowej. W naszym przykładzie będziemy badać receptory glutaminy w pierwotnych neuronach hipokampa. Protokół ten można dostosować do dowolnego białka posiadającego anagenny epitop zewnątrzkomórkowy, jeśli przeciwciała nie są dostępne, transwekcja znakowanych konstruktów może być przydatna zarówno do znakowania, jak i badania określonych mutacji.W naszych przykładach używamy przeciwciał przeciwko endogennemu GluA1 i oznaczamy Glu12 B.To rozpocząć tę procedurę, przenieś stronę z komórkami szkiełek nakrywkowych do góry na tacę pokrytą folią parafinową, aby zaoszczędzić odczynniki i ułatwić manipulację. Przechowuj i utrzymuj kondycjonowane podłoże w temperaturze 37 stopni Celsjusza na etapie inkubacji i mycia. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w kondycjonowanej pożywce, w temperaturze pokojowej, przez 15 minut.Następnie za pomocą pipety próżniowej ostrożnie odessać pożywkę zawierającą przeciwciała i trzykrotnie umyć komórki kondycjonowaną pożywką. Jeśli badasz ekspresję receptora powierzchniowego w porównaniu z wewnątrzkomórkową, utrwal komórki paraformaldehydem po tym kroku, jak opisano w protokole tekstowym. Utrzymuj komórki w kondycjonowanym podłożu bez przeciwciał i zwróć je do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić internalizację.Jeśli badasz proces internalizacji, utrwal komórki paraformaldehydem po tym kroku, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zablokować epitopy na pierwotnym przeciwciałie przyczepionym do receptorów o ekspresji powierzchniowej, które nie zostały zinternalizowane, inkubuj komórki z niesprzężonymi fragmentami przeciwciała anty-IgG Fab rozcieńczonymi w kondycjonowanym pożywce przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki trzykrotnie kondycjonowanym podłożem.Inkubować umyte studzienki z kondycjonowaną pożywką zawierającą 80 mikromolowych Dynasore, w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić recykling zinternalizowanych receptorów. Po zakończeniu modyfikacji na żywych komórkach, umyj komórki raz za pomocą PBS plus. Dodać do komórek roztwór 4% paraformaldehydu i 4% sacharozy w PBS i inkubować w dygestorium w temperaturze pokojowej przez siedem do ośmiu minut, aby utrwalić komórki.Następnie umyj komórki trzykrotnie zwykłym PBS. Dodaj roztwór 10% normalnej surowicy koziej w PBS do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Następnie inkubuj komórki z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 3% NGS w PBS w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby oznaczyć receptory znakujące przeciwciało pierwotne.Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS. Aby rozpocząć znakowanie receptorów wewnątrzkomórkowych, dodaj roztwór 0,25% TritonX do PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć do 10 minut, aby przeniknąć komórki. Następnie blokuj 10% NGS w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Jeśli badasz powierzchnię w porównaniu z całością, inkubuj komórki z tym samym pierwotnym przeciwciałem, które użyto wcześniej, rozcieńczonym 3% NGS w PBS, w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby oznaczyć receptory wewnątrzkomórkowe. Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS. Oznaczyć drugim fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym, rozcieńczonym w 3% NGS w PBS, w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.Następnie umyj komórki trzykrotnie PBS. Najpierw delikatnie umieść szkiełka nakrywkowe, stroną z ogniwami do dołu, na 12 do 15 mikrolitrach odpowiedniego nośnika montażowego do zamontowania ogniw. Następnie zobrazuj komórki pod odpowiednim mikroskopem konfokalnym i przeanalizuj komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Ten protokół badania transportu receptorów glutaminianu opiera się na zróżnicowanym znakowaniu receptorów, wyrażanych na powierzchni komórki, i tych wyrażanych w błonach wewnętrznych. Po uzyskaniu obrazów konfokalnych sygnał fluorescencyjny można łatwo określić ilościowo, aby pokazać wzrost ekspresji powierzchniowej w stosunku do populacji wewnątrzkomórkowej, po chemicznym LTP. W komórkach nieprzepuszczalnych nie można uzyskać sygnału PSD-95, co świadczy o integralności błony komórkowej.Wskazuje to, że sygnał uzyskany dla powierzchniowego GluA1 rzeczywiście odpowiada receptorom o ekspresji powierzchniowej. Co ważne, minimalny sygnał dla zinternalizowanego GluA1 można zaobserwować w warunkach nieprzepuszczalności, co pokazuje, że wszystkie epitopy powierzchniowe są zajęte przez początkową rundę znakowania przeciwciał. Receptory, które zostały zinternalizowane, są następnie identyfikowane.Ten przykład podkreśla, że fosforylacja GluN2B w S1480 sprzyja internalizacji receptora. Ponieważ mutant fosfomimetyczny S1480E wykazywał znacznie wyższy współczynnik internalizacji w porównaniu z receptorami typu dzikiego. Zgodnie z oczekiwaniami nie uzyskuje się sygnału dla zinternalizowanych receptorów w kontroli.Następnie identyfikowane są receptory z recyklingu i receptory zinternalizowane. Wygenerowany współczynnik recyklingu pokazuje, że GluN2B S1480E nie ma wpływu na recykling NMDAR. W kontroli można zaobserwować silny sygnał dla GluN2B wyrażonego powierzchniowo przy braku blokowania Fab.Sygnał ten znika w kulturach poddanych działaniu Fab, co pokazuje, że protokół blokowania jest wystarczający do całkowitego zablokowania epitopów wyrażanych na powierzchni i że sygnały powierzchniowe obserwowane po recyklingu rzeczywiście odpowiadają receptorom transportowanym z powrotem do błony plazmatycznej. Obecny protokół jest tylko jedną z dostępnych metod badania regulacji białek o ekspresji powierzchniowej. Można zastosować inne podejścia w celu rozszerzenia lub zweryfikowania uzyskanych tutaj danych.Należą do nich metody biochemiczne, takie jak biotynylacja, techniki obrazowania życia lub podejścia funkcjonalne, takie jak elektrofizjologia lub obrazowanie wapnia. Używamy PFA do zamrażania lokalizacji receptorów, jednak PFA jest znanym czynnikiem rakotwórczym, dlatego ważne jest, aby wykonywać czynności z użyciem PFA pod wyciągiem, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.

an-antibody-feeding-approach-to-study-glutamate-receptor-trafficking

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje podejście oparte na podawaniu przeciwciał do badania transportu receptorów glutaminianu w pierwotnych kulturach neuronów hipokampa. Takie podejście pozwala na obserwację populacji receptorów zarówno w plazmie, jak i błonach wewnętrznych. Dyskryminację między tymi podzbiorami uzyskuje się poprzez znakowanie receptorów przed i po przepuszczalności błony, przy użyciu tego samego przeciwciała pierwszorzędowego, ale przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z różnymi fluoroforami.

Technika in vitro do badania transportu receptorów glutaminianu w neuronach hipokampa

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Tutaj demonstrujemy użycie fluorescencyjnego barwnika Alexa sprzężonego z α-bungarotoksyną do pomiaru lokalizacji powierzchni receptora GABA A i endocytozy w neuronach hipokampa. Dzięki zastosowaniu konstruktów z krótkim znacznikiem zewnątrzkomórkowym, który wiąże α-bungarotoksynę, można uzyskać analizę transportu endocytarnego białek błony komórkowej.

Używanie znacznika miejsca wiązania α-bungarotoksyny do badania lokalizacji i transportu błony receptora GABA A

Mechanizmy molekularne, które koordynują powstawanie hamujących synaps GABA-ergicznych podczas ontogenezy, są w dużej mierze nieznane. Aby zbadać te procesy, opracowaliśmy system modelu kohodowli, który obejmuje embrionalne średnio kolczaste neurony GABA-ergiczne hodowane razem ze stabilnie transfekowanymi ludzkimi embrionalnymi komórkami nerkowymi 293 (HEK293) wyrażającymi funkcjonalne receptoryGABA A.

Hamujące tworzenie synaps w modelu kokultury obejmującym średnie neurony kolczaste GABA-ergiczne i komórki HEK293 stabilnie eksprymujące receptory GABAA

Kultury o niskiej gęstości pierwotnych neuronów hipokampa zazwyczaj wymagają warstwy zasilającej glej, aby dostarczyć czynników neurotroficznych i utrzymać długowieczność. Opisujemy tutaj uproszczoną metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości na szklanych szkiełkach nakrywkowych w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości, co ułatwia badanie specyficznych mechanizmów neuronalno-autonomicznych.

Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości

Ten artykuł ilustruje, jak można określić ilościowo ekspresję receptorów neuroprzekaźników i przeanalizować wzór w synapsach z zidentyfikowanymi elementami pre i postsynaptycznymi, wykorzystując kombinację transdukcji wirusa za pomocą narzędzi optogenetycznych i techniki immunoznakowania repliki zamrażania i złamania.

Połączone znakowanie immunologiczne repliki optogenetycznej i zamrażalniczo-łamliwej w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy

Tutaj opisujemy konfigurację, nawigację po oprogramowaniu i analizę danych dla przestrzennie i czasowo precyzyjnej metody pomiaru tonicznych i fazowych zmian zewnątrzkomórkowego glutaminianu in vivo za pomocą układów mikroelektrod połączonych enzymami (MEA).

Wykorzystanie bioczujników opartych na enzymach do pomiaru toniku i glutaminianu fazowego w mysich modelach choroby Alzheimera

Celem tego protokołu jest ułatwienie badania receptorów NMDA (NMDAR) na większą skalę i umożliwienie badania modulacyjnych efektów małych cząsteczek i ich zastosowań terapeutycznych.

Wysokoprzepustowy test strumienia wapnia do badania receptorów NMDA z wrażliwością na glicynę/D-serynę i glutaminian

Pobudliwość neuronów może być modulowana poprzez dynamiczny proces endo- i egzocytozy pobudzających jonotropowych receptorów glutaminianu. Opisany tutaj jest dostępny test o wysokiej zawartości do ilościowego określania puli populacji receptorów powierzchniowych i wewnętrznych.

Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

Autoimmunologiczne zapalenie mózgu to nowa kategoria chorób ośrodkowego układu nerwowego wywołanych przez przeciwciała. Neurony hipokampa mogą być wykorzystane do odkrycia i scharakteryzowania tych przeciwciał. W artykule przedstawiono protokół pierwotnej hodowli komórek i barwienia immunologicznego w celu określenia autoprzeciwciał w surowicy i płynie mózgowo-rdzeniowym pacjentów.

Hodowle neuronów hipokampa w celu wykrywania i badania nowych patogennych przeciwciał zaangażowanych w autoimmunologiczne zapalenie mózgu

Poznaj technikę karmienia przeciwciałami do badania transportu receptorów glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Ta metoda pozwala analizować mechanizmy regulacji ekspresji powierzchniowej receptorów.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa (Wideo) | JoVE Journal

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Przeglądaj więcej filmów