Mysi model przeszczepu aorty szyjnej przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietu bez szwów
2 listopada 2019
Tutaj prezentujemy protokół heterotopowego przeszczepu aorty u myszy przy użyciu techniki mankietu bez szwów w mysim modelu szyjki macicy. Model ten może być wykorzystany do badania patologii leżącej u podstaw przewlekłej waskulopatii przeszczepu allogenicznego (CAV) i może pomóc w ocenie nowych środków terapeutycznych w celu zapobiegania jej powstawaniu.
Nazywam się Martin Ryll i pracuję w laboratoriach badawczych Oddziału Chirurgii Ogólnej, Wisceralnej i Transplantacyjnej LMU w Monachium. Dzisiaj pokażemy Ci mysi heterotopowy model przeszczepu aorty przy użyciu zmodyfikowanej techniki mankietu bez szwów. Najpierw znieczulij zwierzę biorcy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia midazolamu, medetomidyny i fentanylu.
Przytnij wszystkie włosy z bocznej części szyjki macicy za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia włosów dla małych zwierząt i nałóż maść okulistyczną z wacikami, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na poduszce grzewczej pod mikroskopem i delikatnie przyklej jego nogi do stołu operacyjnego za pomocą wrażliwych na skórę pasków plastrowych. Odchyl głowę do tyłu i kilkakrotnie wyszoruj pole operacyjne alkoholem.
Wykonaj nacięcie skóry od nacięcia szyjnego do prawej dolnej żuchwy małymi nożyczkami. Usuń prawy dolny płat gruczołu podżuchwowego poprzez dwubiegunową kauteryzację szypułki naczynia, a następnie wycięcie mikronożyczkami. Usuń prawy mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy poprzez dwubiegunową kauteryzację górnej i dolnej części, a następnie wycięcie mikronożyczkami, aby uzyskać dostęp do tętnicy szyjnej wspólnej.
Zmobilizuj wspólną tętnicę szyjną jak najdalej dystalnie i proksymalnie, rozsuwając otaczającą tkankę łączną za pomocą cienkich kleszczy. Zawiąż dwie jedwabne ligatury 7-0 w minimalnej odległości między sobą wokół środka wspólnej tętnicy szyjnej i przeciąć wspólną tętnicę szyjną cienkimi mikronożyczkami między ligaturami. Przełóż bliższy podwiązany koniec przez mankiet i przymocuj go za pomocą małego zacisku tętniczego.
Usuń ligaturę cienkimi mikronożyczkami jak najbliżej ligatury i przepłucz światło solą fizjologiczną heparynizowaną igłą o rozmiarze 30, uważając, aby nie uszkodzić ścianek naczynia. Rozciągnij otwarte światło za pomocą drobnych rozszerzaczy naczyń krwionośnych i odwróć kikut szyjny nad mankietem, delikatnie przeciągając go po rurce poliamidowej. Natychmiast przymocuj odwróconą tętnicę szyjną za pomocą luźno zawiązanej jedwabnej pętli 7-0.
Wykonaj tę samą procedurę na drugim końcu tętnicy szyjnej z drugim mankietem. Przełóż dystalny podwiązany koniec przez mankiet i przymocuj go za pomocą małego zacisku tętniczego. Usuń ligaturę cienkimi mikronożyczkami jak najbliżej ligatury i przepłucz światło solą fizjologiczną heparynizowaną igłą o rozmiarze 30, uważając, aby nie uszkodzić ścianek naczynia.
Rozciągnij otwarte światło za pomocą drobnych rozszerzaczy naczyń krwionośnych i odwróć kikut szyjny nad mankietem, delikatnie przeciągając go po rurce poliamidowej. Natychmiast przymocuj odwróconą tętnicę szyjną za pomocą luźno zawiązanej jedwabnej pętli 7-0. Odłóż zwierzę biorcy na bok i nawilż górne dwie trzecie solą fizjologiczną, aż segment aorty zostanie usunięty.
Znieczulij mysz dawcę w taki sam sposób, jak zwierzę biorcy. Przytnij wszystkie włosy w okolicy brzucha i klatki piersiowej za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia włosów dla małych zwierząt i nałóż maść okulistyczną z wacikami, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na poduszce grzewczej pod mikroskopem i delikatnie przyklej jego nogi do stołu operacyjnego za pomocą wrażliwych na skórę pasków plastrowych.
Kilkakrotnie wyszoruj pole operacyjne alkoholem. Wykonaj laparotomię brzucha w linii środkowej małymi nożyczkami i popchnij jelita lekko do góry, aby odsłonić żyłę główną dolną. Wstrzyknąć do IVC jedną szklaną warstwę heparynizowanej soli fizjologicznej za pomocą igły o rozmiarze 30.
Przeciąć aortę brzuszną i IVC poniżej tętnic nerkowych małymi nożyczkami, aby wykrwawić zwierzę dawcy. Luźno umieść kompres w jamie brzusznej, aby wchłonąć krew. Wykonaj torakotomię poprzez obustronne przekierowanie żeber nożyczkami i przechyl przednią ścianę klatki piersiowej czaszkowo za pomocą zacisku chirurgicznego, aby odsłonić śródpiersie.
Przetnij IVC i przełyk bezpośrednio nad przeponą za pomocą mikronożyczek. Usuń serce i płuca, przesuwając je w górę kleszczami przytrzymującymi przecięte IVC i przełyk, a następnie wycinając je mikronożyczkami z podstawy, aby uzyskać dostęp do aorty piersiowej i grzbietowego śródpiersia. Zmobilizuj aortę piersiową od otaczającej ją tkanki, rozsuwając otaczającą tkankę łączną i tłuszcz za pomocą cienkich kleszczy, uważając, aby nie uszkodzić tętnic międzyżebrowych.
Kauteryzuj wszystkie gałęzie aorty piersiowej za pomocą dwubiegunowych kleszczy kauteryzacyjnych i wytnij odcinek aorty między przeponą a łukiem aorty za pomocą mikronożyczek. Przepłukać wycięty odcinek aorty heparynizowaną solą fizjologiczną za pomocą igły o rozmiarze 30, uważając, aby nie uszkodzić ścian naczynia w celu usunięcia pozostałej krwi lub skrzepów i przeniesienia przeszczepu do zwierzęcia biorcy. Przeciągnij bliższy koniec odcinka aorty dawcy przez mankiet proksymalny na szczycie odwróconej tętnicy szyjnej za pomocą cienkich kleszczyków i natychmiast przymocuj go luźno zawiązaną jedwabną pętlą 7-0.
Przytnij dystalny wolny koniec przeszczepu aorty za pomocą mikronożyczek, tak aby długość przeszczepu pasowała do odległości między dwoma mankietami. Przeciągnij dystalny koniec odcinka aorty dawcy nad dystalnym mankietem na szczycie odwróconej tętnicy szyjnej za pomocą cienkich kleszczyków i natychmiast przymocuj go luźno zawiązaną jedwabną pętlą 7-0. Najpierw usuń dystalny zacisk, aby umożliwić perfuzję wsteczną.
Po osiągnięciu hemostazy należy zdjąć zacisk proksymalny w celu zakończenia zespolenia. Na koniec zamknij ranę szwem ciągłym 6-0. Po 28 dniach zwierzęta są uśmiercane, a przeszczepy zakonserwowane do barwienia histologicznego.
Jak wykazano w tych zabarwieniach odcinków aorty Van-Giesona, w pełni MHC niedopasowane aorty przeszczepione allogenicznie od dawców Balb/c do czarnych sześciu biorców rozwinęło znaczny przerost neointimalny, powodujący zwężenie światła. Z drugiej strony, syngenne przeszczepy aorty od czarnych sześciu dawców do czarnych sześciu biorców rozwinęły tylko niewielki przerost neointimalny. Barwienie immunofluorescencyjne przeciwko SM22, markerowi komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, jak pokazano na tym rysunku w zielonej fluorescencji, pokazuje, że neointima składa się głównie z komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych.
Mysi przeszczep aorty służy jako model przewlekłej waskulopatii transplantacyjnej, która jest najczęstszą przyczyną późnego niepowodzenia przeszczepu. W porównaniu z ortotopowym modelem brzusznym, nasza zmodyfikowana technika mankietu jest mniej wymagająca mikrochirurgicznie, co prowadzi do wysokiego wskaźnika sukcesu. Ponadto, ze względu na stałą średnicę mankietu, można pominąć różnice w zespoleniu naczyniowym, które można zobaczyć w innych modelach przeszczepów mikrochirurgicznych.
Co więcej, ciepły czas niedokrwienia jest utrzymywany na stałym poziomie we wszystkich grupach eksperymentalnych, ponieważ zwierzę biorcy jest przygotowywane najpierw przed eksplantacją odcinka aorty. Nasz zmodyfikowany model powinien pomóc innym laboratoriom w ustaleniu przeszczepu mysiej aorty.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół heterotopowej transplantacji aortalnej u myszy z wykorzystaniem techniki mankietu bez szwów. Ten kręgowy model mysi jest zaprojektowany w celu badania przewlekłej choroby naczyń przeszczepowych (CAV) oraz oceny nowych środków terapeutycznych w celu zapobiegania jej powstawaniu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia transplantacji
- Biologia naczyń
- Eksperymentalna chirurgia
Tło
- Przewlekła choroba naczyń przeszczepowych (CAV) jest istotnym powikłaniem w transplantacji.
- Rozumienie CAV może prowadzić do lepszych strategii terapeutycznych.
- Modele zwierzęce są niezbędne do badania patologii związanych z przeszczepem.
- Technika mankietu bez szwów oferuje nowatorskie podejście do transplantacji aortalnej.
Cel badania
- Zaprezentowanie wiarygodnego mysiego modelu do badania CAV.
- Ocena skuteczności nowych środków terapeutycznych w zapobieganiu CAV.
- Udoskonalenie technik chirurgicznych w badaniach nad przeszczepieniem.
Stosowane metody
- Znieczulenie myszy biorących udział w badaniu za pomocą midazolamu, medetomidyny i fentanylu.
- Przygotowanie miejsca operacji przez ostrzyżenie włosów i nałożenie maści okulistycznej.
- Umieszczenie zwierzęcia na podgrzewanym podkładzie w celu zapewnienia optymalnych warunków chirurgicznych.
- Wykorzystanie techniki mankietu bez szwów do przeszczepiania aortalnego.
Główne wyniki
- Technika mankietu bez szwów skutecznie umożliwia przeszczepianie aortalne.
- Ten model pozwala na ocenę rozwoju CAV.
- Potencjalne środki terapeutyczne mogą być oceniane przy użyciu tego modelu.
- Poprawione zrozumienie patofizjologii CAV jest osiągalne dzięki temu podejściu.
Wnioski
- Przedstawiony model jest cennym narzędziem do badania CAV.
- Może prowadzić do postępu w strategiach terapeutycznych dla pacjentów po przeszczepie.
- Dalsze badania przy użyciu tego modelu mogą poprawić nasze rozumienie biologii przeszczepów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Chronic allograft vasculopathy (CAV) remains a leading cause of long-term graft failure in solid organ transplantation, with limited therapeutic options due to incomplete understanding of its pathophysiology. This murine cervical aortic transplantation model using a modified non-suture cuff technique provides a reproducible, minimally microsurgical platform to study CAV mechanisms and evaluate potential interventions. By enabling consistent vascular anastomosis and controlled warm ischemic time, the model supports preclinical de-risking of therapeutic strategies targeting vascular remodeling in transplantation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in vascular pathology by modeling human-relevant neointimal hyperplasia and luminal narrowing in allografted aortas.
- Operational Value: Offers a standardized, suture-free anastomosis that reduces technical variability and supports high success rates across experimental groups.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking of targets involved in smooth muscle cell-mediated vascular remodeling, as demonstrated by SM22-positive neointima formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantifiable output—neointimal hyperplasia and luminal stenosis—enabling dose-response assessment of candidate compounds in a disease-relevant system.
- Operational Value: Ensures assay readiness through constant cuff diameter and standardized surgical timing, minimizing anastomosis-related confounding variables.
- Translational Value: Supports screening readiness by using fully MHC-mismatched allografts to mimic human alloimmune responses in vascular graft failure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models chronic allograft vasculopathy as a progressive pathology, allowing longitudinal assessment of graft changes up to 28 days post-transplant.
- Operational Value: Enables histological and immunofluorescence analysis (e.g., Van-Gieson’s staining, SM22 detection) to validate target engagement and mechanism of action.
- Predictive Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by distinguishing between syngeneic (minimal hyperplasia) and allogeneic (significant hyperplasia) graft responses.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, particularly for therapies aimed at inhibiting vascular smooth muscle proliferation or modulating immune-mediated vascular injury in transplantation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pathways driving neointima formation, enabling mechanistic de-risking before lead optimization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative vascular outcomes suitable for compound library screening in a standardized surgical model.
- Analytics: Generates measurable endpoints—luminal area, neointimal thickness, smooth muscle marker expression—enabling comparative analysis across treatment groups.
- Translational Research: Mirrors human CAV pathophysiology, supporting continuity from discovery to preclinical validation of vascular-protective agents.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable surgical platform for multiple therapeutic modalities (small molecules, biologics, gene therapies) targeting vascular remodeling in transplant settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by modeling a clinically relevant cause of late graft loss with defined histological and functional readouts.
- Operational Value: Improves reproducibility and reduces inter-animal variability through standardized non-suture cuff technique and controlled operative conditions.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing early evidence of efficacy in preventing pathological vascular remodeling, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified prioritization of vascular-targeted candidates based on their ability to suppress neointimal hyperplasia in an immunocompetent allograft model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques, including vessel isolation, ligation, and inversion using fine forceps and micro scissors.
- Depends on specialized instrumentation such as vascular dilatators, heparinized saline flush systems, and stereomicroscopes for precise anastomosis.
- Necessitates standardized postoperative care and timed sacrifice (e.g., 28 days) to ensure consistent assessment of chronic vasculopathy development.
- Involves adaptation considerations when extending to different mouse strains or graft sizes, though cuff dimensions help maintain anastomotic consistency.
- Limited to modeling arterial vasculopathy; venous thrombosis or cardiac-specific pathologies require complementary models.
