Name: Hierarchiczna i programowalna jednoetapowa synteza oligosacharydów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj hierarchiczną syntezę oligosacharydów za pomocą oprogramowania Auto-CHO z algorytmami uczenia maszynowego. Metoda umożliwia programowalną jednoetapową glikozylację z selekcją bloków budulcowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Academia Sinica, w tym Summit Program, Ministerstwo Nauki i Technologii [MOST 104-0210-01-09-02, MOST 105-0210-01-13-01, MOST 106-0210-01-15-02] i NSF (1664283).

1. Manipulacja oprogramowaniem Auto-CHO
<ol>
	<li>Instalacja środowiska Java Runtime Environment: upewnij się, że w urządzeniu zostało zainstalowane środowisko Java Runtime Environment (JRE). Jeśli środowisko JRE zostało zainstalowane, przejdź do następnego kroku, "inicjalizacja oprogramowania"; W przeciwnym razie należy pobrać i zainstalować środowisko JRE zgodnie z systemem operacyjnym użytkownika, który można znaleźć pod adresem: <https://www.oracle.com/technetwork/java/javase/downloads/index.html>.</li>
	<li>Inicjalizacja oprogramowania: wejdź na stronę Auto-CHO pod adresem <https://sites.google.com/view/auto-cho/home> i pobierz oprogramowanie zgodnie z systemem operacyjnym. Obecnie Auto-CHO obsługuje systemy Windows, macOS i Ubuntu. Najnowsza instrukcja obsługi w formacie PDF jest dostępna na stronie internetowej Auto-CHO.
	<ol>
		<li>W przypadku użytkowników systemu Windows rozpakuj Auto-CHO_Windows.zip i kliknij dwukrotnie Auto-CHO.jar w folderze Auto-CHO_Windows, aby uruchomić program. 
		UWAGA: Aby rozpakować plik zip, użytkownik musi zainstalować oprogramowanie do rozpakowywania plików, takie jak 7-Zip, które można znaleźć na stronie <https://www.7-zip.org>. Użytkownik może również użyć polecenia java -jar Auto-CHO.jar, aby uruchomić program za pomocą wiersza polecenia systemu Windows.</li>
		<li>W przypadku użytkowników systemu macOS kliknij prawym przyciskiem myszy Auto-CHO.jar i wybierz Otwórz, aby uruchomić program.</li>
		<li>Dla użytkowników Ubuntu:
		<ol>
			<li>Zainstaluj libcanberra-gtk za pomocą następującego polecenia: 
			$ sudo apt-get install libcanberra-gtk*</li>
			<li>Zmień uprawnienia dostępu do Auto-CHO_Ubuntu.sh: 
			$ chmod 755 Auto-CHO_Ubuntu.sh</li>
			<li>Uruchom program Auto-CHO: 
			$ ./Auto-CHO_Ubuntu.sh</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadź żądaną strukturę glikanów. Wybierz, czy chcesz narysować strukturę glikanu, czy odczytać istniejący plik struktury.
	<ol>
		<li>Wprowadzanie przez rysunek:
		<ol>
			<li>Kliknij na Edit Glycan by GlycanBuilder9,10 (Rysunek 1, btn1; <silna klasa="xfig">Rysunek 2A) lub obszar Kliknij tutaj, aby edytować syntetyczny element docelowy, aby narysować i edytować strukturę zapytania przez GlycanBuilder. Nie należy ignorować informacji o powiązaniach i chiralności. Kliknij na przyciski Globo-H, SSEA-4 lub OligoLacNAc (Rysunek 1, przykłady), aby wyświetlić przykłady.</li>
			<li>Wybierz punkt menu Plik | Eksport do formatów sekwencji | Eksport do GlycoCT skondensowany, aby zapisać edytowaną strukturę (opcjonalnie).</li>
			<li>Zamknij okno dialogowe GlycanBuilder, aby zakończyć edycję.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dane wejściowe poprzez odczyt pliku:
		<ol>
			<li>Kliknij na Edit Glycan by GlycanBuilder (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, btn1; <silna klasa="xfig">Rysunek 2A) lub obszar Kliknij tutaj, aby edytować syntetyczny element docelowy, aby edytować strukturę zapytania.</li>
			<li>Wybierz punkt menu Plik | Importuj z formatów sekwencji, aby wybrać plik struktury zapytania z odpowiednim formatem.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawienia parametrów wyszukiwania (opcjonalnie).
	<ol>
		<li>Zdefiniuj parametry wyszukiwania w zakładce "Ustawienia parametrów" (Rysunek 1, zakładka2), aby uzyskać rozsądne wyniki wyszukiwania. 
		UWAGA: 
		Próg wysokiej klasy RRV musi być liczbą rzeczywistą i ≥0, 
		Próg RRV klasy średniej musi być liczbą rzeczywistą i ≥0, 
		Próg RRV klasy wysokiej powinien wynosić >próg klasy średniej RRV. 
		>Maksymalna liczba fragmentów powinna być liczbą całkowitą i ≥1. 
		Minimalna liczba BBL we fragmencie musi być liczbą całkowitą i należeć do zakresu od 1 do 3, 
		Maksymalna liczba BBL we fragmencie musi być liczbą całkowitą i należeć do zakresu od 1 do 3, 
		Maksymalna liczba BBL we fragmencie musi wynosić ≥Min BBL Number in a Fragment. 
		Minimalna różnica RRV dawcy/akceptora musi być dodatnią liczbą rzeczywistą. 
		Minimalny stosunek RRV donora/akceptora musi być dodatnią liczbą rzeczywistą. 
		Maksymalny stosunek RRV dawcy do akceptora musi być dodatnią liczbą rzeczywistą. 
		Maksymalny stosunek RRV dawcy/akceptora musi wynosić > min stosunek RRV dawcy/akceptora.</li>
		<li>Kliknij przycisk OK, aby włączyć nowe ustawienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz bibliotekę bloków konstrukcyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, tab5). Ustawieniem domyślnym jest przeszukiwanie tylko biblioteki eksperymentalnej. Jeśli chcesz przeszukać zarówno biblioteki eksperymentalne, jak i wirtualne, sprawdź następujące kroki.
	<ol>
		<li>Wybierz kartę Virtual Building Block Library (Biblioteka wirtualnych bloków konstrukcyjnych) (Rysunek 2C, karta 5). Eksperymentalne i wirtualne bloki konstrukcyjne mogą współpracować ze sobą w celu zwiększenia możliwości wyszukiwania Auto-CHO. Obecnie Auto-CHO zapewnia ponad 50 000 wirtualnych bloków konstrukcyjnych z przewidywanymi RRV w bibliotece.</li>
		<li>Wybierz opcję Użyj bibliotek eksperymentalnych i wirtualnych, a następnie zastosuj filtrowanie, aby wyświetlić wirtualne bloki konstrukcyjne z określonymi kryteriami. Kliknij przycisk Pokaż wybrane wirtualne BBL(s) (Rysunek 2C, btn5), aby wyświetlić tylko wybrane wirtualne bloki konstrukcyjne.</li>
		<li>Kliknij przycisk Pokaż filtrowane wirtualne BBL(s) (Rysunek 2C, btn6), aby wyświetlić tylko wirtualne bloki konstrukcyjne z określonymi kryteriami zdefiniowanymi przez użytkownika.</li>
		<li>Kliknij przycisk Pokaż wszystkie wirtualne BBL(s) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C, btn7), aby wyświetlić wszystkie dostępne wirtualne bloki konstrukcyjne i zresetować filtr.</li>
		<li>Zaznacz jeden lub wiele żądanych wirtualnych bloków konstrukcyjnych, których użytkownik chciałby użyć do wyszukiwania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz kartę Struktura zapytania (Rysunek 1, tab1) i kliknij przycisk Przeszukaj bibliotekę bloków konstrukcyjnych (Rysunek 1, btn2), aby znaleźć jednogarnkowe rozwiązania syntetyczne dla struktury zapytania. Następnie potwierdź ustawienia parametrów.</li>
	<li>Wyszukaj w przeglądarce wyników. 
	UWAGA: Wynik wyszukiwania jest wyświetlany w zakładce Wizualizacja wyników (Rysunek 1, zakładka 6). Akceptory końcowe redukcyjne o różnych numerach reszt są wyświetlane w kolumnie Akceptor końca redukcyjnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, przeglądarka 1).
	<ol>
		<li>Wybierz akceptor końca redukcyjnego, a rozwiązania zostaną wyświetlone na liście rozwiązań syntetycznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, przeglądarka 2). Fragmenty są pokazane na Liście Fragmentów (Rysunek 1, przeglądarka 3), aby zasugerować, ile fragmentów powinno być użytych w syntezie. 
		UWAGA: System dostarcza szczegółowych informacji o każdym fragmencie, w tym RRV fragmentu, wydajności obliczeniowej, a także o tym, która grupa ochronna powinna zostać zdezaktywowana w celu późniejszego wykorzystania fragmentu w reakcji jednodoniczkowej. Elementy składowe użyte do złożenia wybranego fragmentu są pokazane w przeglądarce4 Rysunek 1. Przeglądarka 5 Rysunek 1 również wyświetla informacje o połączeniu fragmentu.</li>
		<li>Przeglądaj i sprawdzaj struktury chemiczne oraz szczegółowe informacje o wybranych blokach składowych w regionach Struktura chemiczna bloku konstrukcyjnego i Przeglądarka bloków konstrukcyjnych, odpowiednio, dla eksperymentalnych bloków konstrukcyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, tab4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyprowadzanie wyniku wyszukiwania na tekst (opcjonalnie).
	<ol>
		<li>Wybierz zakładkę Tekst wynikowy (Rysunek 1, tab7).</li>
		<li>Kliknij Zapisz tekst wyniku (Rysunek 2B, btn4) i wybierz miejsce docelowe pliku tekstowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Informacje zwrotne dotyczące wirtualnych bloków konstrukcyjnych (opcjonalnie). 
	UWAGA: Informacje zwrotne na temat wirtualnych bloków konstrukcyjnych można przekazywać za pośrednictwem kwestionariusza online. Informacje zwrotne mogą pomóc społeczności w utrzymaniu użytecznych wirtualnych bloków konstrukcyjnych i usunięciu nieskutecznych.
	<ol>
		<li>Wybierz zakładkę Virtual Building Block (Wirtualny blok konstrukcyjny) (Rysunek 1, zakładka5).</li>
		<li>Kliknij link Oceniać wirtualny blok konstrukcyjny, którego chcesz ocenić lub skomentować w kolumnie Opinie.</li>
		<li>Wypełnij formularz opinii po otwarciu strony internetowej przez system i prześlij go. 
		UWAGA: Nie zmieniaj wirtualnego identyfikatora BBL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Eksperymenty z wyznaczaniem RRV
<ol>
	<li>W kolbie okrągłodennej o pojemności 10 ml połączyć dwa donory tioglikozydów (po 0,02 mmol z każdego: Dr4 jest donorem odniesienia ze znanym RRV; Dx1 jest cząsteczką donorową nieznanego RRV), metanolu absolutnego (0,10 mmol) i drierytu w dichlorometanie (DCM, 1,0 ml), a następnie mieszać w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność tej mieszaniny (30 μl) i wstrzyknąć mieszaninę do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w trzech oddzielnych wstrzyknięciach (10 μl na każde wstrzyknięcie). Zmierzyć współczynnik (a) między absorpcją (A) a stężeniem cząsteczki donorowej [D] w podstawowych warunkach separacji (octan eteru/n-heksan = 20/80).</li>
	<li>Dodać roztwór 0,5 M N-jodosukcynimidu (NIS) w acetonitrylu (40 μl, 0,02 mmol) do mieszaniny reakcyjnej, a następnie dodać 0,1 M roztwór kwasu trifluorometanosulfonowego (TfOH) (20 μl, 0,002 mmol) i mieszać mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną DCM (4,0 ml), przefiltrować i przemyć nasyconym wodnym roztworem tiosiarczanu sodu zawierającym 10% wodorowęglanu sodu (2x po 5 ml objętości). Ekstrahować warstwę wodną za pomocą DCM (3x z 5 ml). Połącz wszystkie warstwy organiczne, umyj je 5 ml solanki i osusz około 200 mg bezwodnego siarczanu magnezu.</li>
	<li>Potrząsać mieszaniną delikatnie przez 30 s, przefiltrować ją przez lejek z karbowaną bibułą filtracyjną w celu usunięcia siarczanu magnezu, a następnie zebrać filtrat do kolby okrągłodennej o pojemności 25 ml. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej.</li>
	<li>Rozpuścić pozostałość w DCM (1,0 ml). Pobrać porcję tej mieszaniny (30 μl) i wstrzyknąć ją do HPLC w trzech oddzielnych wstrzyknięciach (10 μl na każde wstrzyknięcie). Zmierzyć stężenia pozostałych donorów ([Dx] i [Dref]) za pomocą HPLC w tych samych warunkach separacji (octan eteru/n-heksan = 20/80) (Aref) t = 24417,0, (Ax) t = 23546,3.</li>
	<li>Zmierz względną reaktywność między Dx1 a Dr4, kx1/kr4 = 0,0932. W oparciu o względną wartość reaktywności Dr4, względna wartość reaktywności Dx1 wynosi 3. 
	UWAGA: A = A/[D], (Aref)0 = 74530.1, (Ax)0 = 26143.0. kx/kref = (ln[Dx]t - ln[Dx]0)/(ln[Dref]t - ln[Dref]0) = (ln[Ax]t - ln[Ax]0)/(ln[Aref]t - ln[Aref]0) = 0,0932.</li>
</ol>
3. Jednogarnkowa glikozylacja SSEA-4
<ol>
	<li>Umieścić kolbę okrągłodenną o pojemności 10 ml pod próżnią, wysuszyć na płomieniu i pozostawić kolbę do ostygnięcia do temperatury RT, nadal będąc w próżni. Usunąć gumową przegrodę, aby dodać do kolby mieszaninę donora disacharydu 1 (38 mg, 1,1 eq., 0,057 mmol), pierwszego akceptora 2 (40 mg, 1,0 eq., 0,053 mmol) i mieszadła magnetycznego pokrytego teflonem.</li>
	<li>Przenieść 100 mg sproszkowanych sit molekularnych 4 A do kolby okrągłodennej o pojemności 5 ml. Trzymaj tę kolbę w próżni, wysusz ją na płomieniu i pozwól kolbie ostygnąć do temperatury rzeczywistej, nadal będąc w próżni. Przenieść świeżo wysuszone sita molekularne 4 A do pierwszej kolby zawierającej materiał wyjściowy.</li>
	<li>Przenieść 1 ml świeżo suszonego DCM do kolby. Mieszać mieszaninę reakcyjną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić ją w temperaturze -40 °C. Przenieść NIS (13 mg, 1,1 eq, 0,057 mmol) do kolby.</li>
	<li>Wstrzyknąć TfOH (34 μl, 0,3 eq., 0,017 mmol, 0,5 M w eterze) do kolby przez przegrodę za pomocą strzykawki o małej objętości w temperaturze -40 °C. Mieszać w temperaturze -40 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Po prawie całkowitym zużyciu pierwszego akceptora 2 wstrzyknąć roztwór akceptora 3 w DCM do kolby przez przegrodę.</li>
	<li>Podgrzać mieszaninę reakcyjną do temperatury -20 °C i przenieść NIS (19 mg, 1,6 eq., 0,083 mmol) do kolby. Wstrzyknąć TfOH (34 μl, 0,3 eq, 0,017 mmol, 0,5 M w eterze) do kolby przez przegrodę w temperaturze -20 °C. Mieszać w temperaturze -20 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Po spożyciu produktu reakcji pierwszego etapu należy wygasić reakcję poprzez wstrzyknięcie dwóch odpowiedników trietyloaminy. Wyjąć sita molekularne przez lejek filtracyjny wypełniony Celite, zebrać filtrat do kolby okrągłodennej o pojemności 25 ml i dalej przemyć filtr 10 ml DCM.</li>
	<li>Przenieść filtrat do rozdzielacza rozdzielającego i przemyć go nasyconym wodnym roztworem tiosiarczanu sodu zawierającym 10%NaHCO3 (2x po 10 ml każdy). Ekstrahować warstwę wodną za pomocą DCM (3x z 10 ml). Połącz warstwy organiczne i przemyj mieszaninę solanką (10 ml) i wysusz ją, dodając bezwodnyMgSO4. Przefiltrować go i zebrać filtrat do kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml.</li>
	<li>Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej. Rozpuść surową mieszaninę w około 1 ml DCM i załaduj ją na wierzch złoża krzemionki. Eluować produkt mieszaniną octanu etylu i toluenu (EtOAc/toluen, 1/4 do 1/2) i zebrać frakcje.</li>
	<li>Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej. Wysuszyć pozostałość pod zmniejszonym ciśnieniem, aby uzyskać w pełni chronioną pochodną SSEA-4 4 (74 mg, 50% w oparciu o akceptor 2) w postaci białej piany.</li>
</ol>

<ol><li>Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+of+protein+glycosylation%2C+as+deduced+from+analysis+of+the+SWISS-PROT+database%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).</li>
<li>Sears, P., Wong, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Automated+Synthesis+of+Oligosaccharides+and+Glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward Automated Synthesis of Oligosaccharides and Glycoproteins.</a> Science. 291 (5512), 2344-2350 (2001).</li>
<li>Kulkarni, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%9COne-Pot%E2%80%9D+Protection%2C+Glycosylation%2C+and+Protection-Glycosylation+Strategies+of+Carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">“One-Pot” Protection, Glycosylation, and Protection-Glycosylation Strategies of Carbohydrates.</a> Chemical Reviews. 118 (17), 8025-8104 (2018).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+One-Pot+Oligosaccharide+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Programmable One-Pot Oligosaccharide Synthesis.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (4), 734-753 (1999).</li>
<li>Cheng, C. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+and+programmable+one-pot+synthesis+of+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hierarchical and programmable one-pot synthesis of oligosaccharides.</a> Nature Communications. 9 (1), 5202(2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ChemDraw%22">ChemDraw</a>. , PerkinElmer Informatics. (2019).</li>
<li>Cheeseman, J. R., Frisch, Æ <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCheeseman%2C+JR+%22Predicting+magnetic+properties+with+chemdraw+and+gaussian%22">Predicting magnetic properties with chemdraw and gaussian</a>. , (2000).</li>
<li>Yap, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PaDEL-descriptor%3A+An+open+source+software+to+calculate+molecular+descriptors+and+fingerprints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PaDEL-descriptor: An open source software to calculate molecular descriptors and fingerprints.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (7), 1466-1474 (2011).</li>
<li>Ceroni, A., Dell, A., Haslam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GlycanBuilder%3A+a+fast%2C+intuitive+and+flexible+software+tool+for+building+and+displaying+glycan+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+for+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The GlycanBuilder: a fast, intuitive and flexible software tool for building and displaying glycan structures.</a> Source Code for Biology and Medicine. 2, 3(2007).</li>
<li>Damerell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GlycanBuilder+and+GlycoWorkbench+glycoinformatics+tools%3A+updates+and+new+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The GlycanBuilder and GlycoWorkbench glycoinformatics tools: updates and new developments.</a> Biological Chemistry. 393 (11), 1357-1362 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oprogramowanie Auto-CHO zostało opracowane w celu wspomagania chemików w przeprowadzaniu hierarchicznej i programowalnej jednoetapowej syntezy oligosacharydów5. Auto-CHO został zbudowany przez język programowania Java. Jest to oprogramowanie z graficznym interfejsem użytkownika i wieloplatformowe, które obecnie obsługuje systemy Windows, macOS i Ubuntu. Oprogramowanie można pobrać bezpłatnie ze strony Auto-CHO pod adresem <https://sites.google.com/view/auto-cho/home>, a jego kod źródłowy z licencj...

Węglowodany są wszechobecne w przyrodzie1,2, ale ich obecność i sposób działania pozostają niezbadanym terytorium, głównie ze względu na trudny dostęp do tej klasy molekuł3. W przeciwieństwie do zautomatyzowanej syntezy oligopeptydów i oligonukleotydów, rozwój automatycznej syntezy oligosacharydów pozostaje ogromnym zadaniem, a postęp jest stosunkowo powolny.
Aby rozwiązać ten problem, Wong i in. opracowali pierwszą zautomatyzowaną metodę syntezy oligosacharydów za pomocą programowalnego programu o nazwie Optimer4, który kieruje wyborem BBL z biblioteki ~50 BBL dla sekwencyjnych reakcji jednogarnkowych. Każdy BBL został zaprojektowany i zsyntetyzowany z dobrze zdefiniowaną reaktywnością dostrojoną przez różne grupy ochronne. Dzięki takiemu podejściu można zminimalizować złożoność ochrony manipulacji i oczyszczania pośredniego podczas syntezy, które zostały uznane za najtrudniejsze do pokonania kwestie w rozwoju syntezy automatycznej. Pomimo tego postępu, metoda jest nadal dość ograniczona, ponieważ liczba BBL jest zbyt mała, a program Optimer może obsługiwać tylko niektóre małe oligosacharydy. Dla bardziej złożonych oligosacharydów, które wymagają większej liczby BBL i wielu przejść reakcji jednogarnkowych i kondensacji fragmentów, opracowano ulepszoną wersję oprogramowania, Auto-CHO5.
W Auto-CHO dodano ponad 50 000 BBL ze zdefiniowaną reaktywnością do biblioteki BBL, w tym 154 syntetyczne i 50 000 wirtualnych. Te BBL zostały zaprojektowane przez uczenie maszynowe w oparciu o podstawowe właściwości, obliczone przesunięcia chemiczne NMR6, 7 i deskryptory molekularne8, które wpływają na strukturę i reaktywność BBL. Dzięki temu ulepszonemu programowi i nowemu zestawowi dostępnych BBL, zdolność syntezy zostaje rozszerzona i, jak wykazano, można szybko przygotować kilka interesujących oligosacharydów. Uważa się, że to nowe osiągnięcie ułatwi syntezę oligosacharydów w celu badania ich roli w różnych procesach biologicznych oraz ich wpływu na struktury i funkcje glikoprotein i glikolipidów. Uważa się również, że prace te przyniosą znaczne korzyści społeczności glikologicznej, biorąc pod uwagę, że metoda ta jest dostępna dla społeczności badawczej bezpłatnie. W pracy zademonstrowano syntezę niezbędnego markera ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, SSEA-45.

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Molibdenian ceru amonowego</td><td>TCI</td><td>C1794</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75-09-2</td><td></td></tr><tr><td>Drierite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-18-9</td><td></td></tr><tr><td>Octan</td> <td>etyluSigma-Aldrich</td><td>141-78-6</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Sita molekularne 4 i Aring;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-54-3</td><td></td></tr><tr><td>N-Jodosukcynimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10102-17-7</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108-88-3</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorometanosulfonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1493-13-6</td><td></td></tr></tbody></table>

hierarchiczna i programowalna jednoetapowa synteza oligosacharydów

Hierarchical and Programmable One-Pot Oligosaccharide Synthesis

Ten artykuł przedstawia ogólny protokół eksperymentalny dla programowalnej jednogarnkowej syntezy oligosacharydów i pokazuje, jak używać oprogramowania Auto-CHO do generowania potencjalnych syntetycznych rozwiązań. Programowalna jednogarnkowa synteza oligosacharydów została zaprojektowana w celu umożliwienia szybkiej syntezy oligosacharydów w dużych ilościach przy użyciu tioglikozydowych bloków budulcowych (BBL) o odpowiedniej kolejności sekwencyjnej względnych wartości reaktywności (RRV). Auto-CHO to wieloplatformowe oprogramowanie z graficznym interfejsem użytkownika, które zapewnia możliwe syntetyczne rozwiązania dla programowalnej jednogarnkowej syntezy oligosacharydów poprzez przeszukiwanie biblioteki BBL (zawierającej około 150 zwalidowanych i >50 000 wirtualnych BBL) z dokładnie przewidywanymi RRV za pomocą regresji wektora nośnego. Algorytm hierarchicznej syntezy jednodoniczkowej został zaimplementowany w Auto-CHO i wykorzystuje fragmenty generowane w reakcjach jednodoniczkowych jako nowe BBL. Ponadto Auto-CHO umożliwia użytkownikom przekazywanie informacji zwrotnych na temat wirtualnych BBL, aby zachować cenne wartości do dalszego wykorzystania. W pracy zademonstrowano jednoetapową syntezę specyficznego dla stadium antygenu embrionalnego 4 (SSEA-4), który jest pluripotencjalnym markerem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Wynik wyszukiwania w programie Auto-CHO przy domyślnych ustawieniach parametrów wskazuje, że SSEA-4 może zostać zsyntetyzowany w reakcji typu one-pot [2 + 1 + 3]. Rysunek 3 przedstawia zrzut ekranu z oprogramowania z wynikiem wyszukiwania SSEA-4. Po wybraniu akceptora redukującego końca trisacharydu (Rysunek 3, etykieta 1), program wyświetla cztery potencjalne rozwiązania dla zapytania. Pierwsze rozwiązanie zawiera jeden fragment...

Ten protokół pokazuje, jak używać oprogramowania Auto-CHO do hierarchicznej i programowalnej jednogarnkowej syntezy oligosacharydów. Opisano w nim również ogólną procedurę eksperymentów z oznaczaniem RRV i jednogarnkową glikozylacją SSEA-4.

Hierarchiczna i programowalna jednoetapowa synteza oligosacharydów

This article presents a general experimental protocol for programmable one-pot oligosaccharide synthesis and demonstrates how to use Auto-CHO software for ...

Pokazujemy, jak korzystać z naszego nowo opracowanego oprogramowania, Auto-CHO, do hierarchicznej i programowalnej jednogarnkowej syntezy oligosacharydów. Auto-CHO obejmuje algorytmy na rozszerzonych blokach konstrukcyjnych, z względnymi wartościami reaktywności przewidywanymi przez uczenie maszynowe. Oprogramowanie Auto-CHO stanowi cenną wskazówkę dla wyboru bloków budulcowych oraz hierarchiczny plan wielokrotnej jednoetapowej syntezy bardziej złożonych glikanów poprzez kompozycję fragmentów.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii nowotworów lub chorób zakaźnych za pomocą środków terapeutycznych opartych na węglowodanach. Przed użyciem funkcji Auto-CHO upewnij się, że środowisko Java Runtime Environment zostało zainstalowane na komputerze PC lub Mac. Wizualna demonstracja manipulacji oprogramowaniem Auto-CHO i związanego z tym eksperymentu określania wartości reaktywności pomoże chemikom postępować zgodnie z protokołem i szybko przystąpić do eksperymentu.Aby przeprowadzić inicjalizację oprogramowania Java Runtime Environment, należy wejść na stronę Auto-CHO i pobrać oprogramowanie zgodnie z systemem operacyjnym. Obecnie Auto-CHO obsługuje systemy Windows, macOS i Ubuntu. Najnowsza instrukcja obsługi w formacie PDF jest dostępna na stronie internetowej Auto-CHO.W przypadku użytkowników systemu Windows rozpakuj Windows. zip Auto-CHO i kliknij dwukrotnie Auto-CHO. jar w folderze Auto-CHO Windows, aby uruchomić program.Wprowadź żądaną strukturę glikanów. Wybierz, czy chcesz narysować strukturę glikanu, czy odczytać istniejący plik struktury. Aby wprowadzić dane przez rysunek, kliknij edytuj glycan przez GlycanBuilder lub obszar kliknij tutaj, aby edytować syntetyczny cel, aby narysować i edytować strukturę zapytania przez GlycanBuilder.Nie należy ignorować informacji o powiązaniach i chiralności. Kliknij przyciski Globo-H, SSEA-4 lub OligoLacNAc, aby wyświetlić przykłady. Zamknij okno dialogowe GlycanBuilder, aby zakończyć edycję.Zdefiniuj parametry wyszukiwania na karcie ustawień parametrów, aby uzyskać rozsądne wyniki wyszukiwania. Kliknij przycisk OK, aby włączyć nowe ustawienia. Ustawieniem domyślnym jest przeszukiwanie tylko biblioteki eksperymentalnej.Jeśli chcesz przeszukać zarówno biblioteki eksperymentalne, jak i wirtualne, wybierz kartę biblioteki wirtualnych bloków konstrukcyjnych. Wybierz opcję Użyj bibliotek eksperymentalnych i wirtualnych, a następnie zastosuj filtrowanie, aby wyświetlić wirtualne bloki konstrukcyjne z określonymi kryteriami. Eksperymentalne i wirtualne bloki konstrukcyjne mogą współpracować ze sobą w celu zwiększenia możliwości wyszukiwania Auto-CHO.Obecnie Auto-CHO zapewnia ponad 50 000 wirtualnych bloków konstrukcyjnych z przewidywanymi RRV w bibliotece. Zaznacz jeden lub wiele żądanych wirtualnych bloków konstrukcyjnych, których użytkownik chciałby użyć do wyszukiwania. Kliknij przycisk pokaż wybrane wirtualne bloki konstrukcyjne, aby wyświetlić tylko wybrane wirtualne bloki konstrukcyjne.Kliknij przycisk pokaż przefiltrowane wirtualne bloki konstrukcyjne, aby wyświetlić tylko wirtualne bloki konstrukcyjne z określonymi kryteriami zdefiniowanymi przez użytkownika. Kliknij przycisk pokaż wszystkie wirtualne bloki konstrukcyjne, aby wyświetlić wszystkie dostępne wirtualne bloki konstrukcyjne, a następnie zresetuj filtr. Wybierz kartę struktury zapytania i kliknij przycisk wyszukiwania biblioteki bloków konstrukcyjnych, aby znaleźć jednogarnkowe rozwiązania syntetyczne dla struktury zapytań.Następnie potwierdź ustawienia parametrów. Wyszukaj przeglądarkę wyników. Wynik wyszukiwania jest wyświetlany w zakładce wizualizacji wyników.Redukcyjne akceptory końcowe o różnych numerach pozostałości są wyświetlane w kolumnie redukcyjnego akceptora końcowego. Następnie wybierz redukcyjny akceptor końcowy. Rozwiązania są wyświetlane na liście roztworów syntetycznych.Fragmenty są pokazane na liście fragmentów, aby zasugerować, ile fragmentów należy użyć w syntezie. System dostarcza szczegółowych informacji o każdym fragmencie, w tym RRV fragmentu, wydajności obliczeniowej, a także o tym, która grupa ochronna powinna zostać odbezpieczona przed użyciem fragmentu w reakcji jednogarnkowej. Wyświetlane są również bloki konstrukcyjne użyte do złożenia wybranego fragmentu oraz informacje o połączeniu fragmentu.W przypadku eksperymentalnych bloków konstrukcyjnych wyświetl i sprawdź struktury chemiczne wybranych bloków konstrukcyjnych w obszarze Struktura chemiczna bloku konstrukcyjnego i zapoznaj się z przeglądarką szczegółowych informacji na temat bloków konstrukcyjnych. W 10-mililitrowej kolbie okrągłodennej połącz dwa donory tioglikozydów, metanol absolutny i drieryt w DCM. Następnie mieszaj w temperaturze pokojowej przez godzinę.Weź 30-mikrolitrową porcję tej mieszaniny i wstrzyknij mieszaninę do wysokosprawnej chromatografii cieczowej w trzech oddzielnych wstrzyknięciach. Zmierzyć współczynnik między absorpcją a stężeniem cząsteczki donorowej w podstawowych warunkach separacji. Do mieszaniny reakcyjnej dodać roztwór 0,5 molowego N-jodosukcynimidu w acetonitrylu, a następnie dodać 0,1 molowy roztwór kwasu trifluorometanosulfonowego.Mieszaj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną czterema mililitrami DCM. Przefiltrować i przepłukać reakcję nasyconym wodnym tiosiarczanem sodu, zawierającym 10% wodorowęglanu sodu.Teraz ekstrahuj warstwę wodną trzykrotnie pięcioma mililitrami DCM. Połącz wszystkie warstwy organiczne i umyj pięcioma mililitrami solanki. Następnie wysusz połączone warstwy około 200 miligramami bezwodnego siarczanu magnezu.Potrząsaj mieszaniną delikatnie przez 30 sekund i przefiltruj ją przez lejek z karbowaną bibułą filtracyjną w celu usunięcia siarczanu magnezu. Następnie zebrać filtrat w kolbie okrągłodennej o pojemności 25 mililitrów. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej.Rozpuść pozostałość w jednym mililitrze DCM. Weź 30-mikrolitrową porcję tej mieszaniny i wstrzyknij ją do wysokosprawnej chromatografii cieczowej w trzech oddzielnych wstrzyknięciach. Zmierzyć stężenia pozostałych donorów za pomocą HPLC, w tych samych warunkach separacji.Zmierz względną reaktywność. W oparciu o względną wartość reaktywności DR4, względna wartość reaktywności DX1 wynosi trzy. Wynik wyszukiwania Auto-CHO oparty na domyślnych ustawieniach parametrów wskazuje, że SSEA-4 może być syntetyzowany przez reakcję dwa plus jeden plus trzy jeden garnek.Po wybraniu akceptora końcowego redukującego trisacharydy program pokazuje cztery potencjalne rozwiązania zapytania. Pierwsze rozwiązanie ma jeden fragment, a jego obliczona wydajność wynosi około 94%Fragment można zsyntetyzować za pomocą dwóch bloków budulcowych. RRV pierwszego bloku budulcowego disacharydu wynosi 1462, a RRV drugiego monosacharydu wynosi 32,0.Pokazano również strukturę chemiczną pierwszego sugerowanego bloku budulcowego użytego w reakcji jednogarnkowej. Eksperyment z jedną doniczką pokazuje, że SSEA-4 może być z powodzeniem syntetyzowany w 43% wydajności dzięki tej sugestii. SSEA-4 może być syntetyzowany przez trzy jednostki sugerowane przez Auto-CHO.Jednostki te obejmują pierwszy blok budulcowy disacharydu silele, drugi blok budulcowy monosacharydów i trzeci akceptor końcowy redukcyjny. W przypadku ustawień parametrów sugerujemy, aby na początku ustawić parametry z bardziej rygorystycznymi kryteriami. W celu wyboru biblioteki bloków konstrukcyjnych sugerujemy najpierw przeszukanie biblioteki eksperymentalnej.Mamy nadzieję, że dzięki tej demonstracji więcej ważnych glikanów, takich jak antygeny węglowodanowe związane z nowotworem, będzie można zsyntetyzować za pomocą podejścia jednogarnkowego do dalszych badań. Po tej procedurze można przeprowadzić syntezę wszystkich takich antygenów w celu zaprojektowania szczepionek przeciwnowotworowych opartych na węglowodanach. Mamy również nadzieję, że sztuczna inteligencja i algorytmy komputerowe mogą ułatwić zautomatyzowaną syntezę glikanów, co przyniesie korzyści w leczeniu i profilaktyce chorób.

hierarchical-and-programmable-one-pot-oligosaccharide-synthesis

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W niniejszym artykule przedstawiono wysokoprzepustową metodę syntezy oligosacharydów oraz ich przyłączania do powierzchni nanocząsteczek polianhydrydu w celu ich dalszego wykorzystania w celowaniu w specyficzne receptory na komórkach prezentujących antygen.

Wysokoprzepustowa synteza węglowodanów i funkcjonalizacja nanocząstek polianhydrydu

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Analogi trehalozy stają się ważnymi cząsteczkami do zastosowań bio(technicznych)logicznych i biomedycznych. Opisujemy zoptymalizowany protokół enzymatycznej syntezy i oczyszczania analogów trehalozy, który jest prosty, wydajny, szybki i przyjazny dla środowiska. Wykazano jego zastosowanie do szybkiej produkcji i podawania sondy do wykrywania prątków.

Szybka jednoetapowa synteza enzymatyczna i całkowicie wodne oczyszczanie analogów trehalozy

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA modyfikowanych w pozycji C2'-O. Analizy fotometryczne UV-vis i dichroizmu kołowego służą do ilościowego określania i charakteryzowania aspektów strukturalnych, tj. jednoniciowych lub dwuniciowych.

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Ester 2-azydo-1-azotanu może zostać przekształcony w odpowiadający mu 2-azydo-1-trichloroacetimidian w procedurze jednoetapowej. Celem pracy jest wykazanie przydatności reaktora mikrofalowego w syntezie węglowodanów.

Jednodomowa konwersja anomerycznych estrów azotanów do trichloroacetimidianów w jednym garnku wspomagana mikrofalami

Tutaj prezentujemy protokoły syntezy nukleozydów disacharydowych metodą regioselektywnej O-glikozylacji rybonukleozydów poprzez tymczasową ochronę ich ugrupowań 2',3'-diolu za pomocą cyklicznego estru boronowego. Metoda ta ma zastosowanie do kilku niezabezpieczonych nukleozydów, takich jak adenozyna, guanozyna, cytydyna, urydyna, 5-metylurydyna i 5-fluorourydyna, aby uzyskać odpowiednie nukleozydy disacharydowe.

Regioselektywna O-glikozylacja nukleozydów poprzez tymczasową ochronę 2',3'-diolem przez ester boronowy do syntezy nukleozydów disacharydowych

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Synteza, aktywacja i charakterystyka celowo zaprojektowanych metaloorganicznych materiałów szkieletowych jest wyzwaniem, zwłaszcza gdy bloki budulcowe są niekompatybilne lub niechciane polimorfy są termodynamicznie faworyzowane nad pożądanymi formami. Opisujemy, w jaki sposób zastosowania wspomaganej rozpuszczalnikiem wymiany łączników, dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego proszku w kapilarnach i aktywacji poprzez suszenie nadkrytycznym CO2 mogą rozwiązać niektóre z tych wyzwań.

Synteza i charakterystyka funkcjonalizowanych struktur metaloorganicznych

Poznaj hierarchiczną syntezę oligosacharydów za pomocą oprogramowania Auto-CHO z algorytmami uczenia maszynowego. Metoda umożliwia programowalną jednoetapową glikozylację z selekcją bloków budulcowych.

Hierarchiczna i programowalna jednoetapowa synteza oligosacharydów

Przeglądaj więcej filmów