Name: Modulacja lokalizacji subkomórkowej Tau jako narzędzie do badania ekspresji genów związanych z chorobą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę izolacji jądrowego białka Tau bez zanieczyszczenia cytoplazmatycznego w liniach komórkowych SH-SY5Y. Technika ta umożliwia badanie roli Tau w modulacji ekspresji genów związanych z chorobą Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodowla komórek SH-SY5Y (ludzka linia komórkowa nerwiaka zarodkowego, CRL-2266) w kompletnej pożywce (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco: mieszanina składników odżywczych F12 [DMEM/F-12] uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą [FBS], 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Utrzymać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Hoduj komórki na 10-centymetrowych płytkach i dziel się, gdy się zlewają.</li>
</ol>
2. Różnicowanie komórek
<ol>
	<li>Aby zróżnicować komórki SH-SY5Y, dzień po posiewie dodaj 10 μM kwasu retinowego (RA) do kompletnej pożywki przez 5 dni.</li>
	<li>Szóstego dnia zastąp pożywkę pożywką różnicującą: DMEM/F-12 uzupełnioną 50 ng/ml BDNF, 2 mM L-glutaminą. Nie należy dodawać FBS ani antybiotyków.</li>
	<li>Hoduj komórki w pożywce różnicowej przez 3 dni.</li>
</ol>
3. Klonowanie konstrukcji chimerycznych
<ol>
	<li>Wygeneruj konstrukt Tau-NLS przez klonowanie przez trawienie enzymem restrykcyjnym w ramce na końcu 3' sekwencji Tau 0N4R (383aa) 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAGAAGAAGAAAGGTAGATCCAAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAGGTA-3'. 
	nuta: 3xNLS na końcu 3' Tau jest klonowany do plazmidu pCMV-Tau w celu ekspresji ssaków, wykorzystując miejsca restrykcyjne XhoI i BamHI do miejsca multiklonowania (MCS).</li>
	<li>Wygeneruj konstrukt Tau-NES przez klonowanie przez trawienie enzymem restrykcyjnym w ramce na końcu 3' sekwencji Tau 0N4R (383aa) sekwencji NES: 5'-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATGGACTCGTACAA-3'. 
	nuta: NES na końcu 3' Tau jest klonowany do plazmidu pCMV-Tau w celu ekspresji ssaków, wykorzystując miejsca restrykcyjne EcoRI i BamHI do MCS.</li>
	<li>Przekształć szczep DH5alpha E.coli ze 100 ng DNA z kroku 3.1 lub 3.2 i płytkować komórki na płytkach LB-Agar za pomocą ampicyliny 100 mg / ml. Pozostawić na noc do wyrośnięcia w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz pojedynczą kolonię i wstrzyknij komórki do 5 ml LB z ampicyliną. Pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 37 °C w mieszaniu przez noc.</li>
	<li>Ekstrahuj plazmid za pomocą miniprepu DNA (tabela materiałów) i sekwencji, aby zweryfikować konstrukty.</li>
	<li>Przekształć szczep DH5alpha E. coli za pomocą zweryfikowanych konstruktów sekwencyjnych i komórek płytki na płytkach LB-Agar z ampicyliną. Pozostawić na noc do wyrośnięcia w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz pojedynczą kolonię i wstrzyknij komórki do 5 ml LB z ampicyliną. Pozostawić komórki do wzrostu w temperaturze 37 °C w mieszaniu przez 2 godziny.</li>
	<li>Umieść komórki z kroku 3.7 w 200 ml LB z ampicyliną. Pozostawić na noc do wyrośnięcia w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Granulować komórki w temperaturze 3 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ekstrahuj plazmid za pomocą maxiprep DNA (tabela materiałów).</li>
</ol>
4. Transfekcja komórkowa
<ol>
	<li>Wysiewaj 400 000 komórek z kroku 1.1 na płytkach 6-dołkowych lub 20 000 komórek na szkiełkach 8-dołkowych. Umieścić na płytce cztery próbki: komórki kontrolne do transfekcji pustym wektorem, komórki do transfekcji nieoznakowanym Tau, komórki do transfekcji Tau-NLS i komórki do transfekcji Tau-NES.</li>
	<li>Dzień po wysianiu transfekcji 400 ng DNA dla każdego dołka przy użyciu lipidów kationowych (Tabela materiałów) w płytkach 6-dołkowych lub 200 ng DNA dla każdej studzienki dla szkiełek 8-dołkowych, zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Inkubować DNA i lipidy kationowe oddzielnie w 250 μl (dla płytek 6-dołkowych) lub 25 μl (dla szkiełek 8-dołkowych) zredukowanej pożywki surowicy przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie połącz je, aby wytworzyć kompleks DNA-lipid i inkubuj przez 20 minut.</li>
		<li>Zastąp pożywkę hodowlaną 2 ml (w przypadku płytek 6-dołkowych) lub 250 μl (w przypadku szkiełek 8-dołkowych) świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej. Dodać kompleks DNA-lipid do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, transfekcja DNA za pomocą odczynnika kationowego polietyleniminy (PEI).
	<ol>
		<li>Zmieszać 2 μg DNA i 6 μl PEI z 200 μl kompletnej pożywki hodowlanej (dla każdego dołka na płytkach 6-dołkowych) lub 1 μg DNA i 3 μl PEI ze 100 μl kompletnej pożywki hodowlanej (dla każdej studzienki w szkiełkach 8-dołkowych), wirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać mieszaninę do komórek i dodać 1,8 ml kompletnej pożywki hodowlanej na basenie na płytkach 6-dołkowych lub 150 μl kompletnej pożywki hodowlanej na basenie w 8-dołkowych szkiełkach komorowych, aby osiągnąć objętość posiewu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmienić pożywkę następnego dnia po transfekcji i dodać pożywkę różnicującą zgodnie z opisem w kroku 2.2.</li>
</ol>
5. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Usuń pożywkę hodowlaną i przepłucz komórki 1x PBS. Napraw komórki 100% lodowatym metanolem przez 3 minuty bez wstrząsania. Usuń roztwór utrwalający i krótko przemyj 1x PBS.</li>
	<li>Przepuszczalność 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Krótko umyć 1x PBS, 3 razy.</li>
	<li>Inkubować komórki z buforem blokującym (0,1% Tween 20 i 1% BSA w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Inkubować z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi (np. mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-Tau13) rozcieńczonymi w stosunku 1:500 w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej. Usunąć roztwór przeciwciał i krótko przemyć 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem (np. przeciwciałami przeciwko kozom i mysim przeciwciałami sprzężonymi z Alexa Fluor 633) rozcieńczonymi w stosunku 1:500 w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór przeciwciała i krótko przemyć 1x PBS 3 razy.</li>
	<li>Aby wybarwić jądra, inkubować z DAPI rozcieńczonym w stosunku 1:20 000 w buforze blokującym przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć 1x PBS 3 razy. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.</li>
</ol>
6. Western Blot
<ol>
	<li>Aby zebrać osad komórek z kroku 4.4, usuń pożywkę i umyj komórki PBS. Inkubować z 500 μl 0,1% trypsyny przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Dodać równą objętość kompletnego podłoża i ponownie zawiesić komórki.</li>
	<li>Zebrać komórki do probówki i odwirować przy 500 x g przez 5 minut. Pod koniec wirowania ostrożnie usunąć supernatant. Dodać 1 ml PBS, odwirować przy 500 x g przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant. Przechowuj granulki komórkowe na lodzie do natychmiastowego użycia lub zamroź w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>W przypadku ekstraktów białkowych ogółem inkubować osad komórkowy przez 30 minut na lodzie w buforze do lizy (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glicerol, 1% oktylofenoksy poli(etylenoksy)etanol, rozgałęziony (tabela materiałów), 10 mM EDTA) uzupełniony inhibitorami proteazy i fosfatazy. W zależności od obfitości osadu należy użyć od 50 μl do 100 μl buforu do lizy.
	<ol>
		<li>Odwirować ekstrakt przy 16 000 x g przez 15 minut. Zebrać supernatant i określić ilościowo stężenie białka za pomocą dowolnego wzorcowego testu ilościowego. Przygotować próbki białek do SDS-PAGE, mieszając 20 μg białek z 5 μl 4x buforu Laemmli w całkowitej objętości 20 μl i gotować w temperaturze 100 °C przez 5 min. 
		nuta: Próbka może być przechowywana w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku frakcjonowania subkomórkowego ponownie zawieś komórki z kroku 6.2 w kompletnym pożywce i zbierz 1 x 106 komórek na każdą próbkę. Wirować przy 500 x g przez 10 minut, aby uzyskać granulki komórek do kolejnych etapów.
	<ol>
		<li>Aby wyizolować przedziały subkomórkowe, frakcjonuj zgodnie ze specyfikacją zestawu. Aby wyizolować każdą frakcję, inkubować osad komórkowy z etapu 6.4 z odpowiednim buforem, odwirować, zebrać supernatant i dodać następny bufor do osadu, jak opisano w 6.4.1.1-6.4.1.5. Dodać kolejno bufor do ekstrakcji cytoplazmatycznej, bufor do ekstrakcji błonowej, bufor do ekstrakcji jądrowej, bufor do ekstrakcji jądrowej uzupełniony 5 mM CaCl2 i 3 U / μL nukleazy mikrokokowej i bufor do ekstrakcji cytoszkieletu. 
		nuta: Wszystkie muszą być uzupełnione inhibitorami proteazy. Skaluj objętości bufora zgodnie z objętością osadu komórki.
		<ol>
			<li>W celu wyizolowania frakcji cytozolowej należy inkubować osady komórkowe w 100 μl lodowatego buforu do ekstrakcji cytoplazmatycznej uzupełnionego inhibitorami proteazy w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem przez 10 min. Wirować przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i przenieść supernatant do wstępnie schłodzonych probówek.</li>
			<li>Dodać 100 μl lodowatego buforu do ekstrakcji membranowej uzupełnionego inhibitorami proteazy do osadu z kroku 6.4.1.1 i inkubować w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem przez 10 minut. Odwirować przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i zebrać supernatant.</li>
			<li>Dla rozpuszczalnej frakcji jądrowej dodać 50 μl buforu do ekstrakcji jądrowej uzupełnionego inhibitorami proteazy do osadu z kroku 6.4.1.2 i odwirować. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut, odwirowywać w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i zebrać supernatant.</li>
			<li>Dla nierozpuszczalnej frakcji jądrowej dodać 50 μl buforu do ekstrakcji jądrowej uzupełnionego inhibitorami proteazy, CaCl2 i nukleazą mikrokokową do osadu z kroku 6.4.1.3 i wirować. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, a następnie ponownie wirować. Odwirować przy 16 000 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i zebrać supernatant.</li>
			<li>W przypadku frakcji cytoszkieletu dodać 50 μl buforu do ekstrakcji cytoszkieletu uzupełnionego inhibitorami proteazy do osadu z kroku 6.4.1.4 i odwirować. Inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować probówkę o stężeniu 16 000 x g przez 5 minut, zebrać supernatant i wyrzucić osad. 
			nuta: Skaluj woluminy buforu zgodnie z woluminem komórki, jak wskazano w protokole zestawu. Więcej informacji na temat czasu i temperatury inkubacji i wirowania można znaleźć w protokole zestawu22,23,24,25,26,27,28,29. Alternatywnie, użyj dowolnej standardowej metody30, która za pomocą detergentów oraz poprzez zwiększenie siły jonowej i prędkości wirowania, oddziela frakcję cytozolową, związaną z błoną, cytoszkieletową i jądrową. Oddzielić rozpuszczalną frakcję jądrową od nierozpuszczalnej frakcji jądrowej, wykorzystując standardowe do ekstrakcji jądrowej. Próbka może być przechowywana w temperaturze -20 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dla SDS-PAGE dodać 7 μl 4x buforu Laemmli do 20 μl frakcji subkomórkowych otrzymanych z kroków 6.4.1.1−6.4.1.5, gotować w temperaturze 100 °C przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załadować próbki do żelu akrylowego i przeprowadzić elektroforezę przy stałym napięciu 120 V. Przenieść białka do membrany nitrocelulozowej pod ciśnieniem 250 mA przez 90 minut.</li>
	<li>Sprawdź prawidłową elektroforezę żelu białkowego i skuteczne blotting, inkubując membranę przez 5 minut w roztworze barwiącym Ponceau. Opłucz membranę w wodzie destylowanej, aż tło będzie czyste. Usuń plamę, kontynuując mycie buforem soli fizjologicznej Tris z Tween 20 (TBST) przez 10 minut na shakerze.</li>
	<li>Inkubować błonę z roztworem blokującym (5% mleka w TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce. Umyć 3 razy łyżką łyżkową przez 5 minut.</li>
	<li>Hybrydyzować błonę z przeciwciałem pierwszorzędowym w roztworze blokującym (1% mleka w TBST) przez noc w temperaturze 4 °C. Myć 3 razy TBST przez 5 minut.</li>
	<li>Zhybrydyzować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć 3 razy TBST przez 5 min.</li>
	<li>Wykryj prążek białkowy za pomocą chemiluminescencji. Określ ilościowo intensywność pasm Western Blot za pomocą ImageJ. Normalizuj ekspresję białka na produkcie genu porządkowego: histon H2B dla frakcji rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej w jądrach, GAPDH dla frakcji cytoplazmatycznej i dla ekstraktów całkowitych.</li>
</ol>

<ol><li>Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+evidences+on+Tau-DNA+interactions+and+relevance+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration.</a> Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).</li>
<li>Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+tau+in+isolated+nuclei+from+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Presence of tau in isolated nuclei from human brain.</a> Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).</li>
<li>Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+binds+single-stranded+DNA+sequence+specifically+-+The+proof+obtained+in+vitro+with+non-equilibrium+capillary+electrophoresis+of+equilibrium+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures.</a> FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).</li>
<li>Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+evidence+on+%CE%B1-synuclein+and+Tau+binding+to+conformation+and+sequence+specific+GC%2A+rich+DNA%3A+Relevance+to+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+%26+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders.</a> Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+to+the+minor+groove+of+the+double-strand%2C+Tau+protein+prevents+DNA+damage+by+peroxidation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation.</a> PLoS ONE. 3 (7), (2008).</li>
<li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+Characterization+of+Interaction+of+Tau+with+DNA+and+Its+Regulation+by+Phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation.</a> Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).</li>
<li>Benhelli-Mokrani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+genic+and+intergenic+neuronal+DNA+regions+bound+by+Tau+protein+under+physiological+and+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions.</a> Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).</li>
<li>Sotiropoulos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical%2C+non-standard+functions+of+the+microtubule+associated+Tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91(2017).</li>
<li>Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+microtubule-associated+protein+tau+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus.</a> Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).</li>
<li>Sultan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Tau%2C+a+key+player+in+neuronal+DNA+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).</li>
<li>Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+binds+to+pericentromeric+DNA%3A+a+putative+role+for+nuclear+tau+in+nucleolar+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization.</a> Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).</li>
<li>Violet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+role+for+Tau+in+neuronal+DNA+and+RNA+protection+in+vivo+under+physiological+and+hyperthermic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).</li>
<li>Hua, Q., He, R. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+could+protect+DNA+double+helix+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Tau could protect DNA double helix structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+function+of+microtubule-associated+protein+tau%3A+Involvement+in+chromosome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability.</a> Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+MAPT+gene+cause+chromosome+instability+and+introduce+copy+number+variations+widely+in+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).</li>
<li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+MAPT+give+rise+to+aneuploidy+in+animal+models+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy.</a> neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).</li>
<li>Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+tau-induced+piRNA+depletion+promotes+neuronal+death+through+transposable+element+dysregulation+in+neurodegenerative+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies.</a> Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+Activates+Transposable+Elements+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease.</a> Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).</li>
<li>Maina, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+tau+in+nucleolar+transcription+and+the+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70(2018).</li>
<li>Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+and+prognostic+value+of+the+Tau+protein+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer.</a> Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).</li>
<li>Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+specific+tau+exons+in+normal+and+tumoral+pancreatic+acinar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells.</a> Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).</li>
<li>Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+efficacy+of+FTY720+in+a+rat+model+of+NK-cell+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia.</a> Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).</li>
<li>Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUC1+protein+expression+in+tumor+cells+regulates+transcription+of+proinflammatory+cytokines+by+forming+a+complex+with+nuclear+factor-%CE%BAB+p65+and+binding+to+cytokine+promoters%3A+Importance+of+extracellular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).</li>
<li>Costello, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Term+Potentiation+Is+Impaired+in+Membrane+Glycoprotein+CD200-deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).</li>
<li>Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApoB-100-containing+lipoproteins+are+major+carriers+of+3-iodothyronamine+in+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).</li>
<li>Loo, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+physiological+states+and+pharmacological+responses+of+differentiating+3T3-L1+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes.</a> Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).</li>
<li>Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP10+deubiquitylates+the+histone+variant+H2A.Z+and+both+are+required+for+androgen+receptor-mediated+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation.</a> Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).</li>
<li>Richard, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSSB1+rapidly+binds+at+the+sites+of+DNA+double-strand+breaks+and+is+required+for+the+efficient+recruitment+of+the+MRN+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex.</a> Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).</li>
<li>Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+of+oncogenic+function+of+p53+mutants+regulates+E-cadherin+expression+uncoupled+from+cell+invasion+in+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells.</a> Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).</li>
<li>ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aten+Have%2C+S+%22Functional+Genomics%22">Functional Genomics</a>. , Intechopen. (2012).</li>
<li>Siano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+Modulates+VGluT1+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tau Modulates VGluT1 Expression.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).</li>
<li>Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+Medium+and+Ingredients+Provide+Better+Morphological+Differentiation+of+SH-SY5Y+Cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings%22%5BJournal%5D)">Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?</a> Proceedings. 2 (25), 1577(2018).</li>
<li>Forster, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+differentiated+SH-SY5Y+as+neuronal+screening+model+reveals+increased+oxidative+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability.</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).</li>
<li>Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+parameters+for+the+differentiation+of+SH-SY5Y+cells+to+study+cell+adhesion+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration.</a> BMC Research Notes. 6 (1), 1(2013).</li>
<li>Encinas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Treatment+of+SH-SY5Y+Cells+with+Retinoic+Acid+and+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Gives+Rise+to+Fully+Differentiated%2C+Neurotrophic+Factor-Dependent%2C+Human+Neuron-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells.</a> Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy metodę pomiaru wpływu jądrowego białka Tau na ekspresję genów. W przypadku tego protokołu udział cytoplazmatycznego Tau jest silnie ograniczony. Kluczowymi etapami tego protokołu są: różnicowanie ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y, frakcjonowanie subkomórkowe i lokalizacja białka Tau w przedziale jądrowym.
Po pierwsze, jak pokazano w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych, różnicowanie komórek SH-SY5Y przez dodanie RA i BDNF ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrego...

Funkcje białka Tau w jądrze zyskały w ostatnich latach znaczne zainteresowanie, ponieważ wykazano, że jest ono ściśle związane z kwasami nukleinowymi1,2,3,4,5,6. Rzeczywiście, niedawne badanie całego genomu wykazało, że Tau wiąże genowe i międzygenowe sekwencje DNA in vivo7. Zasugerowano rolę w organizacji jąder8,9,10,11. Co więcej, zaproponowano, że Tau jest zaangażowane w ochronę DNA przed stresem oksydacyjnym i hipertermicznym5,10,12,13, podczas gdy zmutowane Tau zostało powiązane z niestabilnością chromosomów i aneuploidią14,15,16.
Do tej pory wyzwania związane z badaniem funkcji Tau w komorze jądrowej pozostawały prawie nierozwiązane z powodu trudności w odróżnieniu specyficznego udziału jądrowego Tau od wkładu cytoplazmatycznego Tau. Co więcej, funkcje przypisywane cząsteczkom Tau w przedziale jądrowym, jak dotąd, są skorelowane tylko dlatego, że brakuje jednoznacznego dowodu na bezpośrednie zaangażowanie jądrowych białek Tau. Rzeczywiście, udział Tau w ruchliwości retrotranspozonów lub w transkrypcji rRNA lub w ochronie DNA11,12,17,18,19 można również wyjaśnić wkładem cytoplazmatycznego Tau lub wpływem innych czynników niezwiązanych z jądrowym Tau.
Tutaj oferujemy metodę, która może rozwiązać ten problem, wykorzystując klasyczną procedurę izolacji przedziału jądrowego w połączeniu z użyciem konstruktów Tau 0N4R oznaczonych lokalizacją jądrową (NLS) lub sygnałami eksportu jądrowego (NES). Takie podejście eliminuje złożone problemy związane z możliwymi artefaktami spowodowanymi rozlaniem się cząsteczek Tau z przedziału cytoplazmatycznego. Co więcej, konstrukty Tau-NLS i Tau-NES indukują odpowiednio wzbogacanie lub wykluczanie cząsteczek Tau z przedziału jądrowego, zapewniając pozytywną i ujemną kontrolę udziału jądrowych cząsteczek Tau w określonej funkcji. Protokół jest technicznie prosty i składa się z klasycznych i niezawodnych metod, które mają szerokie zastosowanie do badania funkcji jądrowej Tau w innych typach komórek, zróżnicowanych lub nie, takich jak komórki rakowe, które reaktywują ekspresję Tau20,21. Co więcej, może być również stosowany do innych białek, które są obecne zarówno w cytoplazmie, jak i w jądrze, w celu przeanalizowania funkcji biologicznych związanych z różnymi przedziałami.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 633 kozia przeciwciało anty-mysie IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21050</td><td>IF 1:500</td></tr><tr><td>przeciwciało anty aktynowe</td><td>BETHYL LABORATORIE</td><td>A300-485A</td><td>anty-królik WB 1:10 000</td></tr><tr><td>anty GAPDH Przeciwciało</td><td>Fitzgerald Industries International</td><td>10R-G109a</td><td>anty-mysie WB 1:10 000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty H2B</td><td>Abcam</td><td>ab1790</td><td>anty-królik WB 1:15 000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty Tau-13</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21796</td><td>anty-mysie WB 1:1,000; IF 1:500</td></tr><tr><td>przeciwciało antytubulinowe alfa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-16891</td><td>przeciwciało przeciw myszom WB 1:5,000</td></tr><tr><td>anty VGluT1 Przeciwciało</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMAb91041</td><td>anty-mysie WB 1:500</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Euroclone</td><td>EMPO14500</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>B-250</td><td></td></tr><tr><td>Blotting-Grade Blocker</td><td>Biorad</td><td>1706404</td><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td></tr><tr><td>BOVIN SUROWICA ALBUMINA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50g</td><td></td></tr><tr><td>cKompletne Mini</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Kryterium TGX 4-20% Bez plam, 10 dołków</td><td>Biorad</td><td>5678093</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany orzeł Dulbecco's Medium Low Glucose</td><td>Euroclone</td><td>ECM0060L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0390-100ml</td><td>pH = 8,5 M</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Euroclone</td><td>EC50182L</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG-HPR</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>WB 1:1,000</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG-HPR</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td>WB 1:1,000</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-50ml</td><td>Oktylofenoksy poli(etylenoksy)etanol</td></tr><tr><td>Immobilon Western</td><td>MERCK</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tech Szkiełko komorowe 8-dołkowe szkiełko</td><td>nunc</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td>100X</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12566014</td><td>kationowy lipid</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-6X1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM zredukowana surowica pożywka</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40,872-7</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>10 000 U/mL, 100 ml</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (Dulbecco A)</td><td>OXOID</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop</td><td>Inhibitor fosfatazy</td><td></td><td>4906837001</td></tr><tr><td>Roche QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Krok 3.10</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do subkomórkowego frakcjonowania białek do hodowanych komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78840</td><td></td></tr><tr><td>Wspierany Membrana nitrocelulozowa</td><td>Biorad</td><td>1620097</td><td></td></tr><tr><td>TC-Plate 6well</td><td>SARSTEDT</td><td>833,920</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2 laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ml</td><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td>0,50%</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD antifade Medium montażowe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps Systemy</td> <td>oczyszczania DNAPromega</td><td>A1330</td><td>Krok 3.5</td></tr></tbody></table>

modulacja lokalizacji subkomórkowej tau jako narzędzie do badania ekspresji genów związanych z chorobą

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Tau jest białkiem wiążącym mikrotubule wyrażanym w neuronach, a jego główna znana funkcja jest związana z utrzymaniem stabilności cytoszkieletu. Jednak ostatnie dowody wskazują, że Tau jest również obecne w innych przedziałach subkomórkowych, w tym w jądrze, gdzie jest zaangażowane w ochronę DNA, transkrypcję rRNA, ruchliwość retrotranspozonów i organizację strukturalną jąderka. Niedawno wykazaliśmy, że jądrowy Tau jest zaangażowany w ekspresję genu VGluT1, co sugeruje mechanizm molekularny, który może wyjaśnić patologiczny wzrost uwalniania glutaminianu we wczesnych stadiach choroby Alzheimera. Do niedawna udział jądrowego Tau w modulowaniu ekspresji docelowych genów był stosunkowo niepewny i niejednoznaczny ze względu na ograniczenia techniczne, które uniemożliwiały wykluczenie udziału cytoplazmatycznego Tau lub wpływu innych dalszych czynników niezwiązanych z jądrowym Tau. Aby przezwyciężyć tę niepewność, opracowaliśmy metodę badania ekspresji docelowych genów specyficznie modulowanych przez jądrowe białko Tau. Zastosowaliśmy protokół, który łączy wykorzystanie sygnałów lokalizacyjnych i frakcjonowania subkomórkowego, co pozwala na wykluczenie interferencji z cytoplazmatycznych cząsteczek Tau. Przede wszystkim protokół jest prosty i składa się z klasycznych i niezawodnych metod, które mają szerokie zastosowanie do badania funkcji jądrowej Tau w innych typach komórek i warunkach komórkowych.

Strategia zastosowana w celu przeanalizowania wpływu jądrowego białka Tau na ekspresję genów, przy jednoczesnym wyeliminowaniu wpływu cytoplazmatycznych białek Tau, została przedstawiona na Rysunku 1. W skrócie, białka Tau znakowane sygnałem NLS lub NES są odpowiednio akumulowane w przedziale jądrowym lub z niego usuwane. Funkcjonalnym efektem tej nierównowagi jest zmiana ekspresji genów, mierzona jako produkt genu VGluT1.
<p class="jove_content" fo:keep-...

Tau jest białkiem neuronalnym obecnym zarówno w cytoplazmie, gdzie wiąże mikrotubule, jak i w jądrze, gdzie pełni niekonwencjonalne funkcje, w tym modulację genów związanych z chorobą Alzheimera. W tym miejscu opisujemy metodę badania funkcji jądrowego Tau przy jednoczesnym wykluczeniu wszelkich zakłóceń pochodzących z cytoplazmatycznego Tau.

Modulacja lokalizacji subkomórkowej Tau jako narzędzie do badania ekspresji genów związanych z chorobą

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące bezpośredniej roli tau w kompartmencie jądrowym, wykluczając jednocześnie potencjalne zanieczyszczenie cytoplazmatyczne tau. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma ona szerokie zastosowanie w badaniach nad funkcją jądrową tau w innych typach komórek i w różnych warunkach komórkowych. Procedurę zademonstruje Giacomo Siano, post-doc z mojego laboratorium.Rozpocznij od posiewu cztery razy 10 do pięciu komórek linii komórkowej ludzkiego nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y, które mają być transfekowane pustym wektorem kontrolnym, cztery razy 10 do pięciu komórek, które mają być transfekowane nieoznakowanym tau, cztery razy 10 do pięciu komórek, które mają być transfekowane tau-NLS i cztery razy 10 do pięciu komórek, które mają być transfekowane tau-NES do pojedynczych dołków sześciodołkowej płytki. Dzień po posiewie oddzielnie inkubować 400 nanogramów DNA i odpowiednią objętość lipidów kationowych w jednej probówce zawierającej 250 mikrolitrów zredukowanej surowicy na studzienkę. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej połącz każdy wektor z jedną objętością lipidu kationowego i inkubuj kompleksy lipidowe DNA przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty w każdym dołku dwoma mililitrami świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej i transfekować każdą studzienkę odpowiednim roztworem kompleksu lipidowego DNA do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zastąpić supernatanty świeżą pożywką różnicującą. W przypadku analizy Western Blot przemyj transfekowane i zróżnicowane komórki w każdym dołku PBS i inkubuj komórki z 500 mikrolitrami 0,1% trypsyny na studzienkę przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Gdy komórki się odłączą, należy przerwać reakcję z równą objętością kompletnej pożywki i przenieść zawiesinę komórkową z każdej studzienki do oddzielnych probówek w celu odwirowania. Po ostrożnym usunięciu supernatantów, ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze PBS na probówkę do drugiego odwirowania i ponownie usunąć supernatanty. W przypadku całkowitych ekstraktów białkowych inkubować granulki przez 30 minut na lodzie w 50 do 100 mikrolitrach buforu do lizy uzupełnionego inhibitorami proteazy i fosfatazy.Pod koniec inkubacji odwirować ekstrakt w ilości 16 000 g przez 15 minut i określić ilościowo stężenie białka za pomocą dowolnego standardowego testu ilościowego. Następnie zmieszać 20 mikrogramów każdej próbki białka z pięcioma mikrolitrami buforu 4X Laemmli do całkowitej objętości 20 mikrolitrów i gotować próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. W przypadku frakcjonowania subkomórkowego ponownie zawieś komórki w kompletnym podłożu w celu zliczenia i odwiruj jeden razy 10 do sześciu komórek na próbkę.Aby wyizolować frakcję cytozolową, inkubuj osadki w 100 mikrolitrach lodowatego cytoplazmatycznego buforu ekstrakcyjnego uzupełnionego inhibitorami proteazy w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając przez 10 minut. Pod koniec inkubacji zebrać próbki przez odwirowanie i przenieść supernatanty do wstępnie schłodzonych probówek. Dodaj 100 mikrolitrów lodowatego buforu ekstrakcyjnego z membraną uzupełnionego inhibitorami proteazy do osadu na 10-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem.Następnie odwirować granulki przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 3 000 razy g i zebrać supernatanty do nowych probówek. Aby zebrać rozpuszczalną frakcję jądrową, dodaj 50 mikrolitrów buforu do ekstrakcji jądrowej uzupełnionego inhibitorami proteazy do granulek z wirowaniem przed inkubacją próbek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Pod koniec inkubacji odwirować próbki i zebrać supernatanty.Aby zebrać nierozpuszczalną frakcję jądrową, dodaj 50 mikrolitrów buforu do ekstrakcji jądrowej uzupełnionego inhibitorami proteazy, chlorkiem wapnia i nukleazą mikrokokową do granulek z wirowaniem. Inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed wirowaniem i odwirowaniem. Następnie zbierz supernatanty.Aby zebrać frakcję cytoszkieletu, dodaj 50 mikrolitrów buforu do ekstrakcji cytoszkieletu uzupełnionego inhibitorami proteazy do granulek z wirowaniem. Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować próbki i zebrać supernatanty. Do analizy SDS-PAGE dodaj siedem mikrolitrów buforu 4X Laemmli do 20 mikrolitrów każdej z pobranych próbek frakcji subkomórkowej i gotuj próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut.Pod koniec inkubacji załadować próbki do żelu akrylowo-amidowego i przeprowadzić elektroforezę przy stałym napięciu 120 woltów. Następnie przenieś białka do membrany nitrocelulozowej o natężeniu 250 miliamperów przez 90 minut. Inkubuj membranę przez pięć minut w roztworze barwiącym Ponceau, aby sprawdzić, czy elektroforeza w żelu białkowym jest prawidłowa i czy osuszanie jest udane.Pod koniec inkubacji przepłukać membranę w wodzie destylowanej, aż tło będzie czyste i usunąć plamę poprzez ciągłe przemywanie solą fizjologiczną buforowaną Tris uzupełnioną Tween 20 przez 10 minut na wytrząsarce. Następnie inkubować membranę z roztworem blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem, a następnie trzykrotnie przemyć solą fizjologiczną buforowaną Tris plus Tween 20 przez pięć minut na pranie. Po ostatnim płukaniu zhybrydyzuj błonę z głównym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania w roztworze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie trzykrotnie przepłucz solą fizjologiczną buforowaną Tris plus Tween 20 przez pięć minut.Po ostatnim płukaniu należy zhybrydyzować membranę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć membranę solą fizjologiczną buforowaną Tris plus Tween 20 trzy razy przez pięć minut na mycie. Po ostatnim przepłukaniu wykryj prążek białkowy za pomocą chemiluminescencji i określ ilościowo intensywność prążków Western Blot za pomocą ImageJ. Przy braku kwasu retinowego i neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego niezróżnicowane komórki SH-SY5Y przyjmują bardziej okrągłą morfologię i tworzą skupiska komórek.Zgodnie z oczekiwaniami, po pięciu dniach leczenia kwasem retinowym grudki rozwijają się, a komórki rozprzestrzeniają się. Po trzech dodatkowych dniach leczenia neurotroficznym czynnikiem pochodzenia mózgowego komórki wydają się równomiernie rozmieszczone i połączone siecią rozgałęzionych neurytów. Po transfekcji tau-NLS lub tau-NES subkomórkową lokalizację tau można wykryć za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami anty-tau.W zależności od skuteczności transfekcji, komórki wykazują silne barwienie jądrowe łączące się z sygnałem DAPI po transfekcji tau-NLS lub barwienie cytoplazmatyczne z pustymi jądrami po tau-NES. Analiza Western Blot ujawnia wzbogacenie aktyny we frakcji cytoszkieletu, tubuliny we frakcji cytoplazmatycznej i cytoszkieletowej oraz H2B we frakcjach jądrowych. Analiza Western Blot potwierdza również ekspresję znakowanego i nieoznakowanego tau w przedziale jądrowym oraz pęcherzykowego transportera glutaminianu o jednej ekspresji w ekstrakcie całkowitym.Rzeczywiście, stosunek tau w rozpuszczalnych frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych podkreśla fakt, że tau-NLS jest wysoce wzbogacony w rozpuszczalną frakcję jądrową, podczas gdy tau-NES jest zmniejszony. Ponadto tau-NLS jest wzbogacony we frakcję związaną z chromatyną w stosunku do frakcji cytoplazmatycznej, podczas gdy tau-NES jest zmniejszony. Należy dokładnie sprawdzić liczbę komórek użytych do frakcjonowania każdej próbki i zweryfikować wzbogacenie genów porządkowych w odpowiednie frakcje.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyizolować przedziały komórkowe i ocenić funkcjonalną rolę tau w jądrze.

modulation-tau-subcellular-localization-as-tool-to-investigate

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film prezentuje test komórkowy określający ilościowo wychwyt Tau przez mysi mikroglej przy użyciu wrażliwych na pH, fluorescencyjnie znakowanych agregatów Tau, analizowanych za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu oceny ilościowej.

Test komórkowy do oceny wychwytu białka tau przez mikroglej

Ten film pokazuje proces transdukcji ludzkich komórek nerwowych za pomocą lentiwirusa kodującego zmutowane ludzkie białko tau oznaczone żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP) w celu zbadania agregacji białek. Przedstawia etapy od wniknięcia wirusa do ekspresji zmutowanego tau, których kulminacją jest tworzenie widocznych cytoplazmatycznych agregatów tau w neuronach.

Transdukcja ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa do analizy agregacji białka Tau

Niezmodyfikowane i hiperfosforylowane białka tau zostały użyte w dwóch testach agregacji in vitro, aby ujawnić kinetykę szybkiej agregacji zależnej od hiperfosforylacji. Testy te torują drogę do przyszłych badań przesiewowych dla związków, które mogą modulować skłonność hiperfosforylowanego tau do tworzenia włókienek, które leżą u podstaw postępu choroby Alzheimera.

In vitro Testy agregacyjne z użyciem hiperfosforylowanego białka Tau

Transfer agregatów białkowych, czyli nasion proteopatycznych z komórki do komórki, może leżeć u podstaw postępu patologii w chorobach neurodegeneracyjnych. W tym miejscu opisano nowatorski test cytometrii przepływowej FRET, który umożliwia specyficzne i czułe wykrywanie aktywności wysiewu z próbek rekombinowanych lub biologicznych.

Czułe wykrywanie proteopatycznej aktywności wysiewu za pomocą cytometrii przepływowej FRET

Ten manuskrypt opisuje standardowe protokoły pomiaru hiperfosforylacji tau, pomiaru wiązania tau z mikrotubulami oraz lokalizacji wewnątrzkomórkowego tau po leczeniu farmakologicznym. Protokoły te mogą być stosowane wielokrotnie do badań przesiewowych leków lub innych związków, które są ukierunkowane na hiperfosforylację tau lub wiązanie mikrotubul.

Test fosforylacji i wiązania mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego

Mikrodializa in vivo umożliwiła pobranie cząsteczek obecnych w płynie śródmiąższowym mózgu (ISF) od obudzonych, swobodnie zachowujących się zwierząt. W celu analizy stosunkowo dużych cząsteczek w ISF, niniejszy artykuł koncentruje się w szczególności na protokole mikrodializy przy użyciu sond z membranami odcinającymi o dużej masie cząsteczkowej.

In vivo (in vivo) Metoda mikrodializy do zbierania dużych białek zewnątrzkomórkowych z płynu śródmiąższowego mózgu za pomocą sond odcinających o dużej masie cząsteczkowej

Tutaj opisujemy test komórkowy do ilościowej oceny wychwytu tau przez mikroglej w celu stworzenia narzędzia badawczego do lepszego scharakteryzowania mechanizmów działania przeciwciał anty-tau.

Test komórkowy do badania klirensu Tau za pośrednictwem przeciwciał przez mikroglej

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę, w której ludzkie kultury neuronalne są transdukowane za pomocą lentiwirusowych konstruktów kodujących zmutowane ludzkie tau. Transdukowane kultury wykazują agregaty tau i związane z nimi patologie.

Model in vitro do badania agregacji tau za pomocą transdukcji ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa

Klonujemy i analizujemy geny reporterowe generujące koliste RNA. Te geny reporterowe są większe niż konstrukty do analizy splicingu liniowego i zawierają elementy Alu. Aby zbadać koliste RNA, konstrukty są transfekowane do komórek, a otrzymany RNA jest analizowany za pomocą RT-PCR po usunięciu liniowego RNA.

Wykorzystanie pierwiastka aluminiowego zawierającego minigeny do analizy kolistych RNA

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Poznaj metodę izolacji jądrowego białka Tau bez zanieczyszczenia cytoplazmatycznego w liniach komórkowych SH-SY5Y. Technika ta umożliwia badanie roli Tau w modulacji ekspresji genów związanych z chorobą Alzheimera.

Modulacja lokalizacji subkomórkowej Tau jako narzędzie do badania ekspresji genów związanych z chorobą

Przeglądaj więcej filmów