Modulacja lokalizacji subkomórkowej Tau jako narzędzie do badania ekspresji genów związanych z chorobą

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące bezpośredniej roli tau w kompartmencie jądrowym, wykluczając jednocześnie potencjalne zanieczyszczenie cytoplazmatyczne tau. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma ona szerokie zastosowanie w badaniach nad funkcją jądrową tau w innych typach komórek i w różnych warunkach komórkowych. Procedurę zademonstruje Giacomo Siano, post-doc z mojego laboratorium.

Rozpocznij od posiewu cztery razy 10 do pięciu komórek linii komórkowej ludzkiego nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y, które mają być transfekowane pustym wektorem kontrolnym, cztery razy 10 do pięciu komórek, które mają być transfekowane nieoznakowanym tau, cztery razy 10 do pięciu komórek, które mają być transfekowane tau-NLS i cztery razy 10 do pięciu komórek, które mają być transfekowane tau-NES do pojedynczych dołków sześciodołkowej płytki. Dzień po posiewie oddzielnie inkubować 400 nanogramów DNA i odpowiednią objętość lipidów kationowych w jednej probówce zawierającej 250 mikrolitrów zredukowanej surowicy na studzienkę. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej połącz każdy wektor z jedną objętością lipidu kationowego i inkubuj kompleksy lipidowe DNA przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji zastąpić supernatanty w każdym dołku dwoma mililitrami świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej i transfekować każdą studzienkę odpowiednim roztworem kompleksu lipidowego DNA do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia zastąpić supernatanty świeżą pożywką różnicującą. W przypadku analizy Western Blot przemyj transfekowane i zróżnicowane komórki w każdym dołku PBS i inkubuj komórki z 500 mikrolitrami 0,1% trypsyny na studzienkę przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Gdy komórki się odłączą, należy przerwać reakcję z równą objętością kompletnej pożywki i przenieść zawiesinę komórkową z każdej studzienki do oddzielnych probówek w celu odwirowania. Po ostrożnym usunięciu supernatantów, ponownie zawiesić granulki w jednym mililitrze PBS na probówkę do drugiego odwirowania i ponownie usunąć supernatanty. W przypadku całkowitych ekstraktów białkowych inkubować granulki przez 30 minut na lodzie w 50 do 100 mikrolitrach buforu do lizy uzupełnionego inhibitorami proteazy i fosfatazy.

Pod koniec inkubacji odwirować ekstrakt w ilości 16 000 g przez 15 minut i określić ilościowo stężenie białka za pomocą dowolnego standardowego testu ilościowego. Następnie zmieszać 20 mikrogramów każdej próbki białka z pięcioma mikrolitrami buforu 4X Laemmli do całkowitej objętości 20 mikrolitrów i gotować próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. W przypadku frakcjonowania subkomórkowego ponownie zawieś komórki w kompletnym podłożu w celu zliczenia i odwiruj jeden razy 10 do sześciu komórek na próbkę.

Aby wyizolować frakcję cytozolową, inkubuj osadki w 100 mikrolitrach lodowatego cytoplazmatycznego buforu ekstrakcyjnego uzupełnionego inhibitorami proteazy w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając przez 10 minut. Pod koniec inkubacji zebrać próbki przez odwirowanie i przenieść supernatanty do wstępnie schłodzonych probówek. Dodaj 100 mikrolitrów lodowatego buforu ekstrakcyjnego z membraną uzupełnionego inhibitorami proteazy do osadu na 10-minutową inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem.

Następnie odwirować granulki przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 3 000 razy g i zebrać supernatanty do nowych probówek. Aby zebrać rozpuszczalną frakcję jądrową, dodaj 50 mikrolitrów buforu do ekstrakcji jądrowej uzupełnionego inhibitorami proteazy do granulek z wirowaniem przed inkubacją próbek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Pod koniec inkubacji odwirować próbki i zebrać supernatanty.

Aby zebrać nierozpuszczalną frakcję jądrową, dodaj 50 mikrolitrów buforu do ekstrakcji jądrowej uzupełnionego inhibitorami proteazy, chlorkiem wapnia i nukleazą mikrokokową do granulek z wirowaniem. Inkubować próbki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed wirowaniem i odwirowaniem. Następnie zbierz supernatanty.

Aby zebrać frakcję cytoszkieletu, dodaj 50 mikrolitrów buforu do ekstrakcji cytoszkieletu uzupełnionego inhibitorami proteazy do granulek z wirowaniem. Po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować próbki i zebrać supernatanty. Do analizy SDS-PAGE dodaj siedem mikrolitrów buforu 4X Laemmli do 20 mikrolitrów każdej z pobranych próbek frakcji subkomórkowej i gotuj próbki w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Pod koniec inkubacji załadować próbki do żelu akrylowo-amidowego i przeprowadzić elektroforezę przy stałym napięciu 120 woltów. Następnie przenieś białka do membrany nitrocelulozowej o natężeniu 250 miliamperów przez 90 minut. Inkubuj membranę przez pięć minut w roztworze barwiącym Ponceau, aby sprawdzić, czy elektroforeza w żelu białkowym jest prawidłowa i czy osuszanie jest udane.

Pod koniec inkubacji przepłukać membranę w wodzie destylowanej, aż tło będzie czyste i usunąć plamę poprzez ciągłe przemywanie solą fizjologiczną buforowaną Tris uzupełnioną Tween 20 przez 10 minut na wytrząsarce. Następnie inkubować membranę z roztworem blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem, a następnie trzykrotnie przemyć solą fizjologiczną buforowaną Tris plus Tween 20 przez pięć minut na pranie. Po ostatnim płukaniu zhybrydyzuj błonę z głównym przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania w roztworze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie trzykrotnie przepłucz solą fizjologiczną buforowaną Tris plus Tween 20 przez pięć minut.

Po ostatnim płukaniu należy zhybrydyzować membranę z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć membranę solą fizjologiczną buforowaną Tris plus Tween 20 trzy razy przez pięć minut na mycie. Po ostatnim przepłukaniu wykryj prążek białkowy za pomocą chemiluminescencji i określ ilościowo intensywność prążków Western Blot za pomocą ImageJ. Przy braku kwasu retinowego i neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego niezróżnicowane komórki SH-SY5Y przyjmują bardziej okrągłą morfologię i tworzą skupiska komórek.

Zgodnie z oczekiwaniami, po pięciu dniach leczenia kwasem retinowym grudki rozwijają się, a komórki rozprzestrzeniają się. Po trzech dodatkowych dniach leczenia neurotroficznym czynnikiem pochodzenia mózgowego komórki wydają się równomiernie rozmieszczone i połączone siecią rozgałęzionych neurytów. Po transfekcji tau-NLS lub tau-NES subkomórkową lokalizację tau można wykryć za pomocą immunofluorescencji z przeciwciałami anty-tau.

W zależności od skuteczności transfekcji, komórki wykazują silne barwienie jądrowe łączące się z sygnałem DAPI po transfekcji tau-NLS lub barwienie cytoplazmatyczne z pustymi jądrami po tau-NES. Analiza Western Blot ujawnia wzbogacenie aktyny we frakcji cytoszkieletu, tubuliny we frakcji cytoplazmatycznej i cytoszkieletowej oraz H2B we frakcjach jądrowych. Analiza Western Blot potwierdza również ekspresję znakowanego i nieoznakowanego tau w przedziale jądrowym oraz pęcherzykowego transportera glutaminianu o jednej ekspresji w ekstrakcie całkowitym.

Rzeczywiście, stosunek tau w rozpuszczalnych frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych podkreśla fakt, że tau-NLS jest wysoce wzbogacony w rozpuszczalną frakcję jądrową, podczas gdy tau-NES jest zmniejszony. Ponadto tau-NLS jest wzbogacony we frakcję związaną z chromatyną w stosunku do frakcji cytoplazmatycznej, podczas gdy tau-NES jest zmniejszony. Należy dokładnie sprawdzić liczbę komórek użytych do frakcjonowania każdej próbki i zweryfikować wzbogacenie genów porządkowych w odpowiednie frakcje.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wyizolować przedziały komórkowe i ocenić funkcjonalną rolę tau w jądrze.