Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

Protokół ten jest odpowiedni do wytwarzania oczyszczonych diterpenoidów, które mogą być wykorzystywane do różnych analiz końcowych i mogą być dostosowane do szeregu różnych celów metabolitów. Główną zaletą tej metody jest to, że jest to prosta i niedroga metoda wytwarzania miligramowych ilości wyspecjalizowanych metabolitów. Poprzez wymianę genów i enzymów wykorzystywanych do koekspresji, metoda ta może być modyfikowana w celu wytworzenia innych terpenoidów, w tym monoterpenoidów i seskwiterpenoidów, a także innych klas metabolitów, takich jak flawonoidy.

Aby uzyskać produkcję i przemianę metaboliczną diterpenoidów, zacznij od ogrzania chemicznie kompetentnych komórek E. coli na lodzie. Gdy kultura się rozmrozi, dodaj 25 mikrolitrów kompetentnych komórek na konstrukt do schłodzonej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 1 mikrolitr 100 nanogramów na mikrolitr roztworu każdego konstruktu użytego do koekspresji. Inkubować mieszaniny na lodzie przez 30 minut, delikatnie mieszając co 10 minut, zeskrobując probówki na stojaku na mikroprobówki.

Pod koniec inkubacji należy poddać mieszaniny komórek szokowi cieplnemu w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez jedną minutę, a następnie umieścić komórki z powrotem na lodzie na co najmniej dwie minuty. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki SOC o temperaturze 37 stopni Celsjusza do probówek. I inkubuj kultury przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę.

Pod koniec inkubacji dodać około 10 autoklawowanych szklanych kulek i 100 mikrolitrów komórek do jednej podgrzanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza płytki agarowej z bulionu lizogennego z odpowiednimi antybiotykami. I potrząśnij płytką poziomo z założoną pokrywką, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Następnie delikatnie wbij szklane kulki do pojemnika na odpady i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, powlekaną powierzchnią do dołu.

Następnego dnia wyjmij płytkę z inkubatora. Dodaj 5 mililitrów świeżo przygotowanej pożywki bulionowej lizogennej z odpowiednimi antybiotykami do jednej 15-mililitrowej sterylnej szklanej probówki z plastikową, oddychającą nakrętką na planowaną 1 litrową kulturę i użyj końcówki pipety, aby wybrać pojedyncze przekształcone kolonie E.Coli z płytki agarowej. Dodaj jedną pobraną kolonię do każdej z przygotowanych 15-mililitrowych tubek i zakryj każdą tubkę dołączoną oddychającą plastikową nakrętką.

Następnie umieść małe kultury E. coli w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 12 do 24 godzin. Następnego dnia dodaj 100 mililitrów 10x PBS do 900 mililitrów wspaniałego bulionu w 1-litrowej kolbie na małą kulturę z odpowiednimi antybiotykami. Kolby należy ustawić w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wykonywać 140 obrotów na minutę przez około 30 minut.

Gdy wspaniały bulion będzie ciepły, dodaj całą 5 mililitrów objętości każdej kultury inokulacji do jednej 1-litrowej kolby hodowlanej na kulturę. Umieścić kolby w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 140 obrotów na minutę przez około 3 godziny. Gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,6, obniż temperaturę inkubatora do 16 stopni Celsjusza.

Po ostygnięciu inkubatora dodaj 1 mililitr jednego molowego IPTG, 1 mililitr świeżo przygotowanych 4 gramów na litr ryboflawiny i 1 mililitr świeżo przygotowanego kwasu aminolewulinowego 150 gramów na litr do każdej kultury. W celu produkcji diterpenoidów dodaj 25 mililitrów jednego molowego pirogronianu sodu do każdej kultury, aby zapewnić wystarczające tworzenie prekursora. Następnie inkubuj kultury w temperaturze 16 stopni Celsjusza i 140 obrotów na minutę przez 72 godziny, dodając codziennie 25 mililitrów pirogronianu sodu do odpowiednich kultur.

W celu separacji i oczyszczenia metabolitów należy przymocować rozdzielacz do statywu pierścieniowego w dygestorium. I umieść pojemnik na odpady pod lejkiem. Wlać 500 mililitrów roztworu octanu etylu i heksanów w proporcji 50/50 do rozdzielacza separatora.

I dodaj 500 mililitrów przekształconej kultury koekspresji E. coli, która nas interesuje, do lejka. Umieść szklany korek na lejku i potrząśnij lejkiem od 5 do 10 razy, aby wymieszać kulturę z rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym, często otwierając króciec, gdy lejek jest odwrócony do góry nogami i skieruj go do okapu wyciągowego, aby odgazować lejek. Po drugiej rundzie wstrząsania i odgazowania, jak właśnie pokazano, umieść lejek pionowo na stojaku pierścieniowym na około jedną minutę.

Gdy górna warstwa rozpuszczalnika oddzieli się od warstwy kultury wodnej, usuń korek i odsącz warstwę E. coli do zlewki na odpady, zatrzymując warstwę rozpuszczalnika w lejku. Następnie powtórzyć ekstrakcję z pozostałymi 500 mililitrami kultury, używając tych samych 500 mililitrów rozpuszczalnika, które użyto do pierwszej ekstrakcji, przed odsączeniem rozpuszczalnika zawierającego wyekstrahowane metabolity do czystej kolby. Tutaj pokazany jest nasz reprezentatywny chromatogram chromatografii chromatografii gazowej ze spektrometrią mas typowych ekstrahowanych produktów enzymatycznych.

Często obserwowane drobne produkty uboczne obejmują chloramfenikol i pochodne indolu oksyndol i indolowy aldehyd piwaldehyd. Po oczyszczeniu diterpenoidem za pomocą chromatografii kolumnowej krzemionki można otrzymać trzy związki dolabraleksyny, określone ilościowo na podstawie krzywej wzorcowej przy użyciu sklarareolu diterpenoidowego. Chromatografia krzemionkowa jest idealna do osiągnięcia wysokiej czystości związków docelowych.

Ponieważ umożliwia proste przygotowanie olefin diterpenowych i utlenionych pochodnych oraz łatwo usuwa główne zanieczyszczenie oksydol, który jest zatrzymywany na matrycy krzemionkowej. Co więcej, koekspresja genów szlaku terpenoidowego może być wykorzystana do produkcji diterpenoidów w N. Benthamiana, co skutkuje produkcją dolabradienu i 15, 16 epoksydolabrenu. Rozpuszczalniki stosowane podczas ekstrakcji powinny być zoptymalizowane pod kątem właściwości fizykochemicznych metabolitów będących przedmiotem zainteresowania i nie mogą być mieszane z wodą w celu utrzymania dwóch odrębnych warstw.

Po tej procedurze oczyszczone metabolity mogą być wykorzystywane do dalszej analizy, w tym analizy strukturalnej i kwasów antybiotykowych. Technika ta umożliwiła odkrycie nowych diterpenoidów, w tym tych pokazanych tutaj, co pozwoliło na analizę tych metabolitów pod kątem ich struktury chemicznej i nowych biaktywów. Należy zachować ostrożność podczas stosowania rozpuszczalników organicznych w rozdzielaczu.

Zawsze należy utylizować odpady biologiczne zgodnie z normami bezpieczeństwa obowiązującymi w laboratorium.