Name: Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Odkryj metodę enzymatycznej produkcji i oczyszczania diterpenoidów w Escherichia coli oraz Nicotiana benthamiana. Protokół umożliwia uzyskanie miligramowych ilości czystych metabolitów do badań strukturalnych i oceny aktywności biologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy Dr. Reubenowi Petersowi (Iowa State University, USA) za dostarczenie konstruktów pIRS i pGGxZmAN2. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe dla tej pracy przez NSF Plant-Biotic Interactions Program (grant # 1758976 dla P.Z.), DOE Early Career Research Program (grant# DE-SC0019178 dla P.Z.), DOE Joint Genome Institute Community Science Program (grant# CSP2568 dla P.Z.), NSF Graduate Research Fellowship Program (dla K.M.M.) oraz stypendium UC Davis Dean's Mentorship Award (dla K.M.M.).

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Szersze badania i zastosowanie naturalnych produktów diterpenoidowych wymaga prostych, niedrogich protokołów syntezy i oczyszczania wystarczających ilości pożądanych związków. Szybki wzrost liczby dostępnych enzymów metabolicznych diterpenoidów z szerokiego zakresu gatunków zapewnia obecnie ekspansywny inwentarz dla enzymatycznej produkcji diterpenoidów przy użyciu mikrobiologicznych i roślinnych systemów gospodarzy. Ponadto modułowa architektura wielu szlaków diterpenoidowych umożliwia wykorzystanie enzymów z tego samego lub różnych gatunków w podejściach inżynierii kombinatorycznej "plug & play" w celu wygenerowania szeregu naturalnych i nowych naturalnych produktów diterpenoidowych podobnych do natury 2,14,26,35.
E. coli jest preferowanym gospodarzem mikrobiologicznym do biosyntezy produktów naturalnych ze względu na swoją solidność, łatwość skalowania, ograniczoną złożoność chemiczną w celu zmniejszenia zanieczyszczenia produktami ubocznymi oraz bogactwo dostępnych narzędzi do optymalizacji składania i ekspresji DNA. Z naszego doświadczenia wynika, że opisana tutaj platforma doskonale nadaje się do wytwarzania produktów o wydajności do kilkuset mg olefin diterpenowych i alkoholi, co nadaje się do wielu dalszych zastosowań, w tym tych proponowanych tutaj. Chociaż opisana tutaj platforma produkcyjna nie spełnia wymogów skali przemysłowej, może służyć jako podstawa do dalszej optymalizacji szlaku, gospodarza i fermentacji, co z powodzeniem wykazano w przypadku pokrewnych diterpenoidów, takich jak taksadien i sclareol33,34. Nadmierna ekspresja ograniczających szybkość genów szlaku MVA lub MEP została z powodzeniem ustalona, aby przezwyciężyć czynniki ograniczające wydajność biosyntezy diterpenoidów, takie jak niewystarczająca podaż prekursorów i przepływ prekursorów do konkurencyjnych szlaków 13,32,33,39. Chociaż udowodniono sukces w kilku badaniach, słaba ekspresja i aktywność katalityczna terpenoidowo-metabolicznych eukariotycznych P450 i innych enzymów związanych z błoną w E. coli jest prawdopodobnym czynnikiem ograniczającym 33,39,48,49,50,51,52. Zastosowanie sekwencji zoptymalizowanych pod kątem kodonów i modyfikacji białek, takich jak usunięcie peptydu sygnałowego retikulum endoplazmatycznego lub wprowadzenie plastydialnego peptydu sygnałowego, okazało się przydatne w zwiększaniu rozpuszczalnej ekspresji P450 14,38,49,50,53. Takie modyfikacje zastosowano również do koekspresji mikrobiologicznej kukurydzyCYP71Z18 39 wykorzystanej jako przykładowa ścieżka w tym badaniu. Opisane protokoły opierają się na wykorzystaniu plazmidów przenoszących jeden lub dwa geny na konstrukt, wszystkie pod tym samym indukowalnym promotorem. Tam, gdzie pożądane są kombinacje genów na większą skalę, zaleca się stosowanie różnych dostępnych kaset wielogenowych lub systemów układania genów w celu złagodzenia zmniejszonej wydajności transformacji i wzrostu kultur z powodu stosowania wielu plazmidów i antybiotyków13.
Wraz z szerszą dostępnością zasobów genetycznych i genomicznych, systemy gospodarzy roślin stają się również coraz bardziej odpowiednie do wytwarzania produktów naturalnych. Do zalet należy zdolność roślin do wytwarzania wymaganych naturalnych prekursorów zasilanych przez fotosyntezę, umożliwiając w ten sposób tworzenie produktu bez konieczności uzupełniania cząsteczek prekursorowych54,55. N. benthamiana jest już szeroko stosowana do charakterystyki funkcjonalnej in vivo i kombinatorycznej ekspresji terpenoidów i innych naturalnych szlaków produktów 14,35,36,40. Godne uwagi zalety stosowania N. benthamiana jako systemu gospodarza obejmują endogenną produkcję prekursorów diterpenoidów, wykorzystanie natywnych sekwencji genów, uproszczoną ekspresję eukariotycznych P450, łatwość kombinatorycznej transformacji genów (ponieważ oddzielne antybiotyki nie są wymagane do przejściowej kotransformacji) oraz prostą ekstrakcję produktów docelowych z materiału liściowego. W razie potrzeby produkcja diterpenoidów może zostać zwiększona poprzez koekspresję kluczowych genów szlaku MEP w celu zwiększenia podaży prekursorów36,41. Ograniczenia dla skalowalnej produkcji diterpenoidów u N. benthamiana są bardziej złożone w porównaniu z płynnymi kulturami drobnoustrojów ze względu na potrzebę wytworzenia wystarczającej ilości biomasy roślinnej, bardziej pracochłonne oczyszczanie produktu z chemicznie złożonej tkanki roślinnej oraz możliwe niepożądane metabolizowanie produktów docelowych poprzez na przykład utlenianie, glikozylację lub defosforylację przez enzymy endogenne 36,43,44,45Rozdział 46,47. Procedurę tę można jednak zwiększyć do ilości mg produktu poprzez zwiększenie liczby roślin wykorzystywanych do agroinfiltracji56.
Opisane tutaj protokoły ekstrakcji i oczyszczania produktu są kompatybilne z E. coli i N. benthamiana, a także S. cerevisiae i innymi roślinnymi lub mikrobiologicznymi systemami gospodarza i zapewniają ekonomiczne podejście, które jest łatwe do skonfigurowania zarówno w laboratoriach biologicznych, jak i chemicznych i nie wymaga drogiego sprzętu do oczyszczania. Ekstrakcja metabolitów za pomocą lejka separacyjnego doskonale nadaje się do wydajnej ekstrakcji i separacji faz przed oczyszczaniem chromatograficznym. Rozmiary lejków można łatwo dostosować, aby umożliwić większe objętości hodowli i skrócić czas eksperymentu potrzebny do ekstrakcji z dużych kultur. Stwierdziliśmy, że zastosowanie gradientu heksanu/octanu etylu jest idealne do ekstrakcji diterpenoidów o różnej polarności, jak pokazano tutaj dla grupy dolabraleksyn, które obejmują zarówno związki węglowodorowe, jak i utlenione (ryc. 3). W zależności od właściwości produktów docelowych korzystne mogą być inne mieszaniny rozpuszczalników. Rozpuszczalniki nie mogą jednak mieszać się z wodą, aby zapewnić pomyślną ekstrakcję i separację faz przy użyciu techniki rozdzielacza rozdzielającego. Ponadto przy stosowaniu tego podejścia do wytwarzania lotnych związków organicznych (LZO), takich jak mono- i seskwiterpenoidy o niższej masie cząsteczkowej oraz inne LZO, należy wziąć pod uwagę straty produktu w wyniku parowania. Chromatograficzne rozdzielanie diterpenoidów o różnym stopniu natlenienia przy użyciu kolumny krzemionkowej na większą skalę (~ 2 l) było korzystne z naszego doświadczenia, ponieważ zapewnia lepszą separację produktów i minimalizuje potrzebę iteracyjnych etapów oczyszczania przy użyciu mniejszych objętości kolumn. Objętości kolumn i matryce można dostosować w zależności od potrzeb do żądanej objętości kultury i rodzaju produktu naturalnego. Czystość produktów docelowych, którą można osiągnąć za pomocą tego protokołu, jest odpowiednia dla wielu dalszych zastosowań, takich jak testy bioaktywności lub do wykorzystania w analizach aktywności enzymów. Jednak tam, gdzie wymagane są wyższe poziomy czystości, takie jak analizy strukturalne za pomocą NMR, czystość produktu można skutecznie zwiększyć poprzez dodatkowe oczyszczanie za pomocą (pół)preparatywnej HPLC.
Ten opisany tutaj protokół został zoptymalizowany pod kątem produkcji naturalnych produktów diterpenoidowych, ale można go również łatwo dostosować do pokrewnych mono-, sesqui- i tri-terpenoidów, a także innych naturalnych klas produktów po prostu poprzez wygenerowanie pożądanych modułów enzymatycznych do ekspresji kombinatorycznej14,57. Należy jednak wziąć pod uwagę modyfikacje procedur ekstrakcji i oczyszczania produktów w przypadku związków o wyższej lotności, takich jak mono- i seskwiterpenoidy, lub o wyższej polarności i modyfikacji funkcjonalnej, czego przykładem jest glikozylacja wielu triterpenoidów, fenylopropanoidów i innych klas produktów naturalnych.
Chociaż dostępne są platformy na skalę przemysłową do wytwarzania produktów naturalnych, opisane tutaj protokoły oferują niedrogie, konfigurowalne narzędzie, które można łatwo skonfigurować w większości laboratoriów. Jak wykazano na przykładzie produkcji dolabraleksyn kukurydzianych w tym kraju i gdzie indziej39 , ilości i czystość produktu, które można osiągnąć przy zastosowaniu tego podejścia, są zazwyczaj wystarczające, aby ułatwić różne dalsze analizy i zastosowania, w tym między innymi różne badania bioaktywności, analizę interakcji między organizmami, a także do wykorzystania jako substraty enzymatyczne lub jako materiał wyjściowy w metodach półsyntezy.

Diterpenoidy stanowią chemicznie zróżnicowaną grupę ponad 12 000 głównie policyklicznych 20-węglowych naturalnych produktów, które odgrywają kluczową rolę w wielu organizmach1. Grzyby i rośliny wytwarzają największą różnorodność diterpenoidów, ale wykazano również, że bakterie tworzą bioaktywne diterpenoidy (patrz recenzje2,3,4,5). Zakorzenione w ogromnej różnorodności strukturalnej, diterpenoidy pełnią wiele funkcji biologicznych. Niektóre diterpenoidy, takie jak hormony wzrostu gibereliny, pełnią podstawowe funkcje w procesach rozwojowych5. Jednak większość diterpenoidów służy jako mediatory obrony chemicznej i interakcji międzyorganizmowych. Wśród nich najszerzej zbadano kwasy żywicy diterpenowej w ochronie przed szkodnikami i patogenami drzew iglastych oraz specyficzne dla gatunku mieszanki przeciwdrobnoustrojowych diterpenoidów w głównych uprawach spożywczych, takich jak kukurydza (Zea mays) i ryż (Oryza sativa)6,7. Te bioaktywności stanowią bogate repozytorium chemiczne do zastosowań komercyjnych, a wybrane diterpenoidy są używane jako ważne farmaceutyki, dodatki do żywności, kleje i inne bioprodukty codziennego współczesnego życia8,9,10. Aby posunąć naprzód badania nad naturalną różnorodnością i biologicznymi funkcjami diterpenoidów, a ostatecznie promować szersze zastosowania komercyjne, potrzebne są narzędzia do opłacalnego przygotowywania czystych związków. Izolacja na dużą skalę od materiału roślinnego została ustalona dla kilku bioproduktów diterpenoidowych, takich jak kwasy żywicy diterpenowej, które są wytwarzane jako produkt uboczny przemysłu celulozowo-papierniczego8. Jednak akumulacja diterpenoidów tylko w określonych tkankach i pod ścisłą regulacją przez bodźce środowiskowe często ogranicza izolację wystarczających ilości produktu od naturalnego producenta2. Ponadto złożoność strukturalna diterpenoidów utrudnia ich produkcję poprzez syntezę chemiczną, chociaż takie podejścia okazały się skuteczne w kilku przypadkach11,12. Wraz z dostępnością zaawansowanych technologii genomicznych i biochemicznych, platformy produkcji enzymatycznej zyskują coraz większą uwagę na wytwarzaniu szeregu związków diterpenoidowych (patrz recenzje13,14,15,16,17,18).
Wszystkie terpenoidy, w tym diterpenoidy, pochodzą z dwóch izomerycznych prekursorów izoprenoidów, difosforanu izopentenylu (IPP) i difosforanu dimetyloallilu (DMAPP)19, które z kolei powstają poprzez szlak mewalonianu (MVA) lub metylerytrytolu-5-fosforanu (MEP). Biosynteza terpenoidów przebiega przez szlak MEP u bakterii i szlak MVA u grzybów, podczas gdy rośliny posiadają cytozolowy szlak MVA i plastydialny szlak MEP, przy czym ten ostatni jest główną drogą do tworzenia diterpenoidów20. Kondensacja IPP i DMAPP przez transferazy prenylowe daje centralny 20-węglowy prekursor wszystkich diterpenoidów, difosforan geranylgeranylu (GGPP)20. Po powstaniu GGPP dwie rodziny enzymów, syntazy terpenów (TPS) i monooksygenazy cytochromu P450 (P450), w dużej mierze kontrolują powstawanie ogromnej różnorodności chemicznej metabolizmu terpenoidów21,22. Syntazy diterpenowe (diTPS) katalizują zaangażowaną cyklizację i rearanżację GGPP napędzaną karbokationem, tworząc różne stereospecyficzne bi-, poli- lub makrocykliczne rusztowania diterpenowe1,3,23,24. Natlenienie i dalsza funkcjonalna dekoracja tych rusztowań jest następnie ułatwiona przez enzymy P450 i wybrane inne rodziny enzymów22,25. TPS i P450 powszechnie występują jako specyficzne dla gatunku, wielogenowe rodziny, które mogą tworzyć modułowe sieci biosyntetyczne, w których połączenie różnych modułów enzymatycznych wzdłuż wspólnego schematu umożliwia tworzenie szerokiej gamy związków2,26. Szybkie odkrycie w ostatnich latach funkcjonalnie odrębnych enzymów działających w modułowych szlakach terpenoidowych stworzyło rozszerzające się możliwości ich wykorzystania jako wszechstronnej listy części do inżynierii metabolicznej częściowych lub całkowitych szlaków zarówno w mikrobiologicznych, jak i roślinnych platformach produkcyjnych. Na przykład drożdże (Saccharomyces cerevisiae) zostały z powodzeniem zastosowane do inżynierii wieloenzymatycznych szlaków do wytwarzania bioproduktów terpenoidowych, takich jak lek przeciwmalaryczny artemizynina27, biopaliwa seskwiterpenoidowe bisabolen i farnesene28, ale także wybierz diterpenoidy29,30,31. Podobnie, stworzono zmodyfikowane platformy Escherichia coli do produkcji na skalę przemysłową dla kilku metabolitów diterpenoidowych, w tym taksadenu prekursora Taxol stosowanego jako lek przeciwnowotworowy oraz alkoholu diterpenowego, sclareolu, stosowanego w przemyśle perfumeryjnym13,32,33,34. Postępy w inżynierii genetycznej i technologiach transformacji sprawiły również, że systemy gospodarzy roślin stają się coraz bardziej opłacalne w wytwarzaniu naturalnych produktów roślinnych9,14,35,36. W szczególności bliski krewny tytoniu, Nicotiana benthamiana, stał się szeroko stosowanym podwoziem do analizy i inżynierii szlaków terpenoidowych, ze względu na łatwość transformacji wielu kombinacji genów za pośrednictwem Agrobacterium, wydajną biosyntezę endogennych prekursorów i wysoką biomasę14,35,36.
Opierając się na tych uznanych platformach biosyntezy terpenoidów, opisujemy tutaj łatwe w użyciu i opłacalne metody enzymatycznej produkcji diterpenoidów i oczyszczania pojedynczych związków. Przedstawione protokoły ilustrują, w jaki sposób platformy E. coli i N. benthamiana zaprojektowane do zwiększonej biosyntezy prekursorów diterpenoidów mogą być wykorzystane do kombinatorycznej ekspresji różnych enzymów diTPS i P450 w celu wytworzenia pożądanych związków diterpenoidowych. Zastosowanie tego protokołu do produkcji i oczyszczania strukturalnie różnych diterpenoidów pokazuje przykład wyspecjalizowanych diterpenoidów z kukurydzy (Zea mays), zwanych dolabraleksinami, których endogenna biosynteza rekrutuje dwa diTPS i jeden enzym P450. Oczyszczanie różnych dolabraleksin, od olefin po utlenione pochodne, uzyskuje się następnie poprzez połączenie ekstrakcji w lejku separacyjnym z wielkoskalową chromatografią kolumnową krzemionki i preparatywną chromatografią cieczową pod wysokim ciśnieniem (HPLC). Opisane protokoły są zoptymalizowane pod kątem produkcji diterpenoidów, ale można je również łatwo dostosować do pokrewnych klas terpenoidów, a także innych produktów naturalnych, dla których dostępne są zasoby enzymatyczne. Związki wytwarzane przy użyciu tego podejścia nadają się do różnych dalszych zastosowań, w tym między innymi do charakterystyki strukturalnej za pomocą analizy magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), wykorzystania jako substraty do badań funkcjonalnych enzymów oraz szeregu testów bioaktywności.

<table><tbody><tr><td>1020 tacek</td><td>Szklarnia Megastore</td><td>CN-FLHD</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy</td><td>Sigma</td><td>M8250-500g</td><td>MES</td></tr><tr><td>4 "Tech Square Pot</td><td>McConkey Hurtownia dostaw dla hodowców</td><td>JMCTS4</td><td></td></tr><tr><td>5977 Ekstraktor XL MS</td> Agilent-7890B <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC</td><td>Agilent-Acetonitryl</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży bakteryjnych</td><td>Fisher</td><td>BP9727-2</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka</td><td>CTechGlass</td><td>BK-2001-015B</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka, śruba niebieska 9 mm, PFTE</td><td>Agilent</td><td>5185-5820</td><td>GC Nasadka na fiolkę</td></tr><tr><td>Karbenicylina</td><td>Genesee</td><td>25-532</td><td>Carb</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Fisher</td><td>50247423</td><td>Kolumna</td></tr><tr><td>chromatografii</td> chlorowej <td>CTechGlass</td><td>CL-0015-022</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta kopuła wilgotności</td><td>Szklarnia Megastore</td><td>CN-DOME</td><td></td></tr><tr><td>ColiRollers Koraliki galwaniczne</td><td>Sigma</td><td>71013</td><td>Koraliki szklane</td></tr><tr><td>CoorsTek Moździerze porcelanowe</td><td>Zaprawa Fisher</td><td>12-961A</td><td></td></tr><tr><td>CoorsTek Porcelana Tłuczki</td><td>Fisher</td><td>12-961-5A</td><td>Tłuczek</td></tr><tr><td>Chlorowodorek kwasu delta-aminolewulinowego</td><td>Sigma</td><td>50981039</td><td>Kwas aminoleuwolinowy</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>A962-4</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Fisher</td><td>E1454</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>Probówki Falcon</td></tr><tr><td>Fisherbrand Jednorazowe Kuwety Kuwety</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego Fisherbrand z przezroczystą pokrywką</td> Fisher <td>FB0875713</td><td>szalka Petriego</td><td>Fisherbrand</td></tr><tr><td>Polipropylenowe stojaki do przechowywania mikroprobówek Fisher</td><td>05-541</td> stojak na <td>mikroprobówki</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>Heksany</td><td>Fisher</td><td>H292-4 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>HP-5MS</td><td>Agilent</td><td>19091S-433</td><td>GC kolumna</td></tr><tr><td>Adapter wlotowy</td><td>CTechGlass</td><td>AD-0006-003</td><td>szklany adapter wlotowy</td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd</td><td>Fisher</td><td>BP1755-100</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td></td><td>Fisher BP9065</td><td>Kan</td></tr><tr><td>KIM-KAP Czapki, jednorazowe, polipropylen, Kimble Chase</td><td>VWR</td><td>60825-798</td><td>oddychające pokrywki do probówek</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Acros</td><td>223210010</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma</td><td>M7506-500g</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>Miracle-Gro Rozpuszczalny w wodzie uniwersalny pokarm roślinny</td><td>Miracle-Gro</td><td>2756810</td><td></td></tr><tr><td>Młyn mieszający MM 200</td><td>Retsch</td><td>20.746.0001</td><td>tkanka młyn</td></tr><tr><td>Kolba hodowlana Nalgene Fernbach Kolba</td><td>Sigma</td><td>Z360236</td><td>2,8 l</td></tr><tr><td>New Brunswick I26</td><td>Eppendorf</td><td>M1324-0000</td><td>Inkubator z wytrząsaniem</td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seed</td><td>USDA Repozytorium plazmy zarodkowej</td><td>Akcesja TW16</td><td>N. benthamiana</td></tr><tr><td>OverExpress C41(DE3) Chemicznie kompetentne komórki</td><td>Lucigen</td><td>60442</td><td>Ogniwa C41-DE3</td></tr><tr><td>Folia do owijania Parafilm M</td><td>Fisher</td><td>S37440</td><td>Parafilm</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy bezwodny</td><td>Fisher</td><td>P288-3</td><td>Fosforan dipotasowy</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td></td><td></td><td>Fosforan monopotasowy</td></tr><tr><td>Jednorazowe probówki hodowlane Pyrex, bez oprawki</td><td>Sigma</td><td>CLS9944516</td><td>probówki</td></tr><tr><td>Kwas pirogroniany Sól sodowa</td><td>Fisher</td><td>501368477</td> Stojaki na pierścienie retortowe <td>pirogronianu sodu</td></tr><tr><td></td><td>CTechGlass</td><td>ST00</td><td>stojak na pierścienie</td></tr><tr><td>Ryboflawina</td><td>Amresco</td><td>0744-250g</td><td></td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Sigma</td><td>R7382</td><td>Rif</td></tr><tr><td>Rotovap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sand, rozmiar cząstek oczek 50-70</td><td>Sigma</td><td>274739-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Krzemionka</td><td>Fisher</td><td>AC241660010</td><td>żel krzemionkowy</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>5271-3</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH Spectinomycin</td><td>Fisher</td><td>501368607</td><td>Spec</td></tr><tr><td>Squibb Lejek separatorowy</td><td>CTechGlass</td><td>FN-1060-006</td><td>Lejek separacyjny</td></tr><tr><td>Sunshine Mix #1</td><td>Sungro Horticulture</td><td></td><td>Ziemia doniczkowa</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Snap Cap Probówki do mikrowirówek o niskiej retencji</td><td>Fisher</td><td>21-402-902</td><td>mikroprobówka</td></tr><tr><td>Lejek trójkątny</td><td>CTechGlass</td><td>FN-0035</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher</td><td>BP14212</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka, śruba, 2 mL, bursztynowa, WrtOn</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td>GC fiolka</td></tr><tr><td>widoczna spektrofotometr, spektrofotometr V-1200</td><td>VWR</td><td>634-6000P</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna HPLC ZORBAX Eclipse XDB-C18</td><td>Agilent</td><td>990967-202</td><td>Kolumna HPLC</td></tr><tr><td>ZORBAX Eclipse XDB-CN</td><td>Agilent</td><td>990967-905</td><td>Kolumna HPLC</td></tr></tbody></table>

indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoidy tworzą różnorodną klasę małych cząsteczek naturalnych produktów, które są szeroko rozpowszechnione w królestwach życia i pełnią kluczowe funkcje biologiczne w procesach rozwojowych, interakcjach międzyorganizmowych i adaptacji do środowiska. Ze względu na te różne bioaktywności wiele diterpenoidów ma również znaczenie gospodarcze jako farmaceutyki, dodatki do żywności, biopaliwa i inne bioprodukty. Zaawansowana genomika i podejścia biochemiczne umożliwiły szybki wzrost wiedzy na temat genów, enzymów i szlaków metabolicznych diterpenoidów. Jednak złożoność strukturalna diterpenoidów i wąski rozkład taksonomiczny poszczególnych związków w często tylko jednym gatunku pozostają czynnikami ograniczającymi ich wydajną produkcję. Dostępność szerszego zakresu enzymów metabolicznych zapewnia obecnie zasoby do produkcji diterpenoidów o wystarczającym mianie i czystości, aby ułatwić dokładniejsze badanie tej ważnej grupy metabolitów. Opierając się na uznanych narzędziach do koekspresji enzymów mikrobiologicznych i roślinnych, przedstawiamy łatwy w obsłudze i konfigurowalny protokół enzymatycznego wytwarzania diterpenoidów w Escherichia coli lub Nicotiana benthamiana oraz oczyszczania pożądanych produktów za pomocą chromatografii krzemionkowej i półpreparatywnej HPLC. Na przykładzie grupy diterpenoidów dolabraleksyny kukurydzy (Zea mays) podkreślamy, w jaki sposób modularne kombinacje syntazy diterpenowej (diTPS) i enzymów monooksygenazy cytochromu P450 (P450) można wykorzystać do generowania różnych rusztowań diterpenoidowych. Oczyszczone związki mogą być wykorzystywane w różnych dalszych zastosowaniach, takich jak analizy strukturalne metabolitów, badania struktury i funkcji enzymów oraz eksperymenty bioaktywności in vitro i in planta.

Schematyczny przebieg procesu produkcji diterpenoidów przy użyciu E. coli 
Rysunek 1 przedstawia opisany przebieg procesu produkcji diterpenoidów. Protokół opisany w niniejszym opracowaniu został zaadaptowany z wcześniej opisanej platformy E. coli do biosyntezy diterpenoidów13,32 w celu zastosowania kultur o większej objętości oraz oczyszczania pożądanych produktów diterpenoidowych za pomocą chromatografii na krzemionce. Aby zademonstrować zastosowanie tego protokołu, wykorzystano niedawno zidentyfikowany szlak dolabraleksyny z kukurydzy, który obejmuje dwie diTPS, ZmAN2 (Zm01d029648) i ZmKSL4 (Zm01d032858), wielofunkcyjną P450 (CYP71Z18, Zm01d014134) oraz reduktazę cytochromu P450 (ZmCPR2, Zm001d026483) (Rysunek 2). W skrócie, kompetentne komórki E. coli BL21DE3-C41 zostały uprzednio przekształcone plazmidami pCDFDuet:IRS oraz pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN213,32. Plazmid pCDFDuet:IRS zawiera kluczowe enzymy do produkcji prekursorów diterpenoidów, w tym syntazę 1-deoksy-D-ksylulozo-5-fosforanu (dxs), reduktazę 1-deoksy-D-ksylulozo-5-fosforanu (dxr) oraz izomerazę izopentenilodifosforanu (idi), i wykazano, że zwiększa on tworzenie diterpenoidów w E. coli13. Plazmid pACYC-Duet:GGPPS/ZmAN2 zawiera syntazę ent-kopalylodifosforanu ZmAN2 z kukurydzy oraz syntazę GGPP z Abies grandis. Następnie enzymy katalizujące reakcje swoiste dla biosyntezy dolabraleksyny zostały współprzekształcone jako plazmidy pET28b:ZmKSL4 oraz pETDUET:ZmCPR2/ZmCYP71Z18. Szczegółowe informacje na temat sekwencji i konstruktów plazmidowych znajdują się w pracy Mafu i wsp. 201839.
Chromatogram GC-MS ekstrahowanych produktów enzymatycznych przedstawiono na Rysunku 3A, obrazujący powstawanie trzech związków dolabraleksyn, mianowicie dolabradienu (1,2 ± 0,25 mg/L hodowli), epoksydolabrenu (0,65 ± 0,2 mg/L hodowli) oraz epoksydolabranolu (1,4 ± 1,1 mg/L hodowli), których ilość określono na podstawie krzywej wzorcowej z wykorzystaniem diterpenoidu sclareolu. Sclareol został zastosowany jako wzorzec odniesienia ze względu na podobną strukturę i właściwości chemiczne w porównaniu do dolabraleksyn. Typowo obserwowane produkty uboczne w niewielkich ilościach obejmują chloramfenikol, pochodne indolu: oksyindol i aldehyd indolowy-5 oraz prekursor geranylgeranylodifosforan (GGPP) (Rysunek 3). Indol zazwyczaj stanowi główny produkt uboczny, lecz nie został tutaj przedstawiony z powodu czasu retencji krótszego niż ustawiony 7-minutowy czas opóźnienia rozpuszczalnika, co ma na celu ochronę urządzenia GC-MS.
Schematyczny przebieg produkcji diterpenoidów z wykorzystaniem N. benthamiana 
Rysunek 4 przedstawia ogólny schemat ekspresji szlaku dolabraleksyny w N. benthamiana. W przypadku produktów opisanych w niniejszej pracy, do szczepu A. tumefaciens GV3101 oddzielnie wprowadzono następujące konstrukty: pLife3:p19 (wyrażający białko supresora wyciszania genów p19), pLife3:ZmCYP71Z18, pLife3:ZmAN2, pLife3:ZmKSL4. Pełnowymiarowe natywne sekwencje genów szlaku dolabraleksyny kukurydzy umieszczono w binarnym wektorze T-DNA pLife341 z opornością na kanamycynę w celu propagacji w E. coli i A. tumefaciens. Koekspresja genów górnego odcinka szlaku terpenoidowego jest opcjonalna, ponieważ prekursor, difosforan geranilgeranylu, jest tworzony endogennie w N. benthamiana. Niemniej jednak w kilku badaniach z sukcesem zastosowano takie podejście w celu zwiększenia syntezy diterpenoidów w N. benthamiana14,36,41. Jak pokazano na Rysunku 3, koekspresja doprowadziła do skutecznej produkcji dolabradienu i 15,16-epoksydolabrenu. W przeciwieństwie do koekspresji enzymów w E. coli, w ekstraktach metabolicznych nie wykryto 15,16-epoksydolabranolu.
Obecność 15,16-epoksydolabrenu w ekstraktach z liści wykazała aktywność CYP71Z18 w N. benthamiana. Ponieważ wykazano, że 15,16-epoksydolabranol jest stabilny po ekstrakcji z kultur drobnoustrojów (Ryc. 3), a także po izolacji z tkanek korzeni kukurydzy w poprzednich badaniach39, prawdopodobne jest, że produkt hydroksylowany ulega glikozylacji przez endogenne glikozylotransferazy, a następnie jest sekwestrowany w wakuoli, co czyni go niedostępnym dla ekstrakcji mieszaninami rozpuszczalników organicznych zastosowanych w niniejszej procedurze36,43,4,45,46. Podobne niepożądane modyfikacje produktów w kontekście inżynierii szlaków metabolicznych w N. benthamiana zgłaszano w poprzednich badaniach47. Podobnie jak w przypadku koekspresji w E. coli, ekspresja przejściowa in N. benthamiana skutkuje ekstrakcją kilku produktów ubocznych, w tym liniowych alkanów o różnej długości łańcucha, co ustalono na podstawie porównania z referencyjnymi bazami danych widm masowych. Stężenia związków wyekstrahowanych z materiału liściowego wyniosły średnio 2,4 +/- 0,5 mg dolabradienu i 0,9 +/- 0,3 mg 15,16-epoksydolabrenu na g suchej masy tkanki liścia. Wartości te nie mogą być bezpośrednio porównywane z systemem koekspresji w E. coli ze względu na różne układy doświadczalne.
Oczyszczanie diterpenoidów 
Oczyszczanie diterpenoidów przeprowadzono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, a następnie półpreparatywnej HPLC. Ekstrakty metabolitów z 12 L połączonych kultur E. coli oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym w celu wyseparowania trzech głównych związków dolabraleksyny (Rysunek 3A). Chromatografia na żelu krzemionkowym jest idealna do uzyskania wysokiej czystości docelowych związków, ponieważ umożliwia prostą separację olefin diterpenowych i pochodnych utlenionych, a także łatwo usuwa główny zanieczyszczający związek, oksydol, który jest zatrzymywany na matrycy krzemionkowej (Rysunek 3A).
<img alt="Schemat procesu hodowli E. coli z układem chromatograficznym; analiza i oczyszczanie metabolitów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1: Schemat produkcji diterpenoidów w *E. coli* oraz oczyszczanie metabolitów z płynnych kultur bakteryjnych. Przerywane ramki przedstawiają opcjonalne etapy, w których wymagane jest dodatkowe oczyszczanie. (A) Reprezentatywny obraz wyekstrahowanego E. coli hodowlę przy użyciu rozdzielacza. (B) Reprezentatywny obraz oczyszczania ekstraktu z metabolitów przy użyciu chromatografii na krzemionce.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat ścieżki reakcji chemicznych syntezy dolabradienu z GGPP poprzez etapy enzymatyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Szlak biosyntetyczny dolabraleksyny oraz konstrukty genowe wykorzystane w niniejszym badaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii; proces oczyszczania E. coli i N. benthamiana z wykorzystaniem krzemionki; całkowity chromatogram jonowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wyniki GC-MS. Przedstawiono reprezentatywne chromatogramy GC-MS oczyszczonych produktów diterpenoidowych, otrzymanych w badaniach koekspresji enzymów w (A) E. coli oraz (B) N. benthamianaIdentyfikacja produktów została przeprowadzona na podstawie porównań z autentycznymi wzorcami oraz referencyjnymi widmami mas z biblioteki widm masowych National Institute of Standards and Technology (NIST). 1, oksyindol; 2, indole-5-aldehyd; 3, pyrrolo[1,2-a]pirazyna-1,4-dion, heksahydro-3-(2-metylopropyl)-; 4, 6-O-acetylo-1-[[4-bromofenylo]tio]-$\alpha$-D-glukozyd S,S-dwutlenek; 5, dolabradien; 6, 15,16-epoksydolabren; 7, pyrrolo[1,2-a]pirazyna-1,4-dion, heksahydro-3-(fenylmetyl)-; 8, 15,16-epoksydolabranol; 9 i 12, nieznane; 10, chloramfenikol; 1, 3,7,1,15-tetrametyl-2-heksadecen-1-ol; 13-16, alkany. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Metoda biotechnologii roślin na schemacie z hodowlą N. benthamiana, transformacją i infiltracją strzykawkową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59992/59992fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Produkcja diterpenoidów w N. benthamiana. (A) Schemat produkcji diterpenoidów w N. benthamiana oraz oczyszczanie metabolitów z materiału liściowego. (B) Reprezentatywny obraz N. benthamiana rośliny przygotowane do eksperymentów z infiltracją, przed przycinaniem. (C) Reprezentatywne obrazy N. benthamiana rośliny po przycinaniu. (D) Obraz liści poddanych infiltracji za pomocą strzykawki. Ciemniejsze obszary zostały zinfiltrowane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59992/59992fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy łatwe w użyciu protokoły produkcji i oczyszczania metabolitów diterpenoidowych poprzez kombinatoryczną ekspresję enzymów biosyntetycznych w Escherichia coli lub Nicotiana benthamiana, a następnie chromatograficzne oczyszczanie produktu. Otrzymane metabolity nadają się do różnych badań, w tym charakterystyki struktury molekularnej, badań funkcjonalnych enzymów i testów bioaktywności.

Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Protokół ten jest odpowiedni do wytwarzania oczyszczonych diterpenoidów, które mogą być wykorzystywane do różnych analiz końcowych i mogą być dostosowane do szeregu różnych celów metabolitów. Główną zaletą tej metody jest to, że jest to prosta i niedroga metoda wytwarzania miligramowych ilości wyspecjalizowanych metabolitów. Poprzez wymianę genów i enzymów wykorzystywanych do koekspresji, metoda ta może być modyfikowana w celu wytworzenia innych terpenoidów, w tym monoterpenoidów i seskwiterpenoidów, a także innych klas metabolitów, takich jak flawonoidy.Aby uzyskać produkcję i przemianę metaboliczną diterpenoidów, zacznij od ogrzania chemicznie kompetentnych komórek E. coli na lodzie. Gdy kultura się rozmrozi, dodaj 25 mikrolitrów kompetentnych komórek na konstrukt do schłodzonej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra i dodaj 1 mikrolitr 100 nanogramów na mikrolitr roztworu każdego konstruktu użytego do koekspresji. Inkubować mieszaniny na lodzie przez 30 minut, delikatnie mieszając co 10 minut, zeskrobując probówki na stojaku na mikroprobówki.Pod koniec inkubacji należy poddać mieszaniny komórek szokowi cieplnemu w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez jedną minutę, a następnie umieścić komórki z powrotem na lodzie na co najmniej dwie minuty. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki SOC o temperaturze 37 stopni Celsjusza do probówek. I inkubuj kultury przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę.Pod koniec inkubacji dodać około 10 autoklawowanych szklanych kulek i 100 mikrolitrów komórek do jednej podgrzanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza płytki agarowej z bulionu lizogennego z odpowiednimi antybiotykami. I potrząśnij płytką poziomo z założoną pokrywką, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Następnie delikatnie wbij szklane kulki do pojemnika na odpady i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, powlekaną powierzchnią do dołu.Następnego dnia wyjmij płytkę z inkubatora. Dodaj 5 mililitrów świeżo przygotowanej pożywki bulionowej lizogennej z odpowiednimi antybiotykami do jednej 15-mililitrowej sterylnej szklanej probówki z plastikową, oddychającą nakrętką na planowaną 1 litrową kulturę i użyj końcówki pipety, aby wybrać pojedyncze przekształcone kolonie E.Coli z płytki agarowej. Dodaj jedną pobraną kolonię do każdej z przygotowanych 15-mililitrowych tubek i zakryj każdą tubkę dołączoną oddychającą plastikową nakrętką.Następnie umieść małe kultury E. coli w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 12 do 24 godzin. Następnego dnia dodaj 100 mililitrów 10x PBS do 900 mililitrów wspaniałego bulionu w 1-litrowej kolbie na małą kulturę z odpowiednimi antybiotykami. Kolby należy ustawić w temperaturze 37 stopni Celsjusza i wykonywać 140 obrotów na minutę przez około 30 minut.Gdy wspaniały bulion będzie ciepły, dodaj całą 5 mililitrów objętości każdej kultury inokulacji do jednej 1-litrowej kolby hodowlanej na kulturę. Umieścić kolby w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 140 obrotów na minutę przez około 3 godziny. Gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,6, obniż temperaturę inkubatora do 16 stopni Celsjusza.Po ostygnięciu inkubatora dodaj 1 mililitr jednego molowego IPTG, 1 mililitr świeżo przygotowanych 4 gramów na litr ryboflawiny i 1 mililitr świeżo przygotowanego kwasu aminolewulinowego 150 gramów na litr do każdej kultury. W celu produkcji diterpenoidów dodaj 25 mililitrów jednego molowego pirogronianu sodu do każdej kultury, aby zapewnić wystarczające tworzenie prekursora. Następnie inkubuj kultury w temperaturze 16 stopni Celsjusza i 140 obrotów na minutę przez 72 godziny, dodając codziennie 25 mililitrów pirogronianu sodu do odpowiednich kultur.W celu separacji i oczyszczenia metabolitów należy przymocować rozdzielacz do statywu pierścieniowego w dygestorium. I umieść pojemnik na odpady pod lejkiem. Wlać 500 mililitrów roztworu octanu etylu i heksanów w proporcji 50/50 do rozdzielacza separatora.I dodaj 500 mililitrów przekształconej kultury koekspresji E. coli, która nas interesuje, do lejka. Umieść szklany korek na lejku i potrząśnij lejkiem od 5 do 10 razy, aby wymieszać kulturę z rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym, często otwierając króciec, gdy lejek jest odwrócony do góry nogami i skieruj go do okapu wyciągowego, aby odgazować lejek. Po drugiej rundzie wstrząsania i odgazowania, jak właśnie pokazano, umieść lejek pionowo na stojaku pierścieniowym na około jedną minutę.Gdy górna warstwa rozpuszczalnika oddzieli się od warstwy kultury wodnej, usuń korek i odsącz warstwę E. coli do zlewki na odpady, zatrzymując warstwę rozpuszczalnika w lejku. Następnie powtórzyć ekstrakcję z pozostałymi 500 mililitrami kultury, używając tych samych 500 mililitrów rozpuszczalnika, które użyto do pierwszej ekstrakcji, przed odsączeniem rozpuszczalnika zawierającego wyekstrahowane metabolity do czystej kolby. Tutaj pokazany jest nasz reprezentatywny chromatogram chromatografii chromatografii gazowej ze spektrometrią mas typowych ekstrahowanych produktów enzymatycznych.Często obserwowane drobne produkty uboczne obejmują chloramfenikol i pochodne indolu oksyndol i indolowy aldehyd piwaldehyd. Po oczyszczeniu diterpenoidem za pomocą chromatografii kolumnowej krzemionki można otrzymać trzy związki dolabraleksyny, określone ilościowo na podstawie krzywej wzorcowej przy użyciu sklarareolu diterpenoidowego. Chromatografia krzemionkowa jest idealna do osiągnięcia wysokiej czystości związków docelowych.Ponieważ umożliwia proste przygotowanie olefin diterpenowych i utlenionych pochodnych oraz łatwo usuwa główne zanieczyszczenie oksydol, który jest zatrzymywany na matrycy krzemionkowej. Co więcej, koekspresja genów szlaku terpenoidowego może być wykorzystana do produkcji diterpenoidów w N. Benthamiana, co skutkuje produkcją dolabradienu i 15, 16 epoksydolabrenu. Rozpuszczalniki stosowane podczas ekstrakcji powinny być zoptymalizowane pod kątem właściwości fizykochemicznych metabolitów będących przedmiotem zainteresowania i nie mogą być mieszane z wodą w celu utrzymania dwóch odrębnych warstw.Po tej procedurze oczyszczone metabolity mogą być wykorzystywane do dalszej analizy, w tym analizy strukturalnej i kwasów antybiotykowych. Technika ta umożliwiła odkrycie nowych diterpenoidów, w tym tych pokazanych tutaj, co pozwoliło na analizę tych metabolitów pod kątem ich struktury chemicznej i nowych biaktywów. Należy zachować ostrożność podczas stosowania rozpuszczalników organicznych w rozdzielaczu.Zawsze należy utylizować odpady biologiczne zgodnie z normami bezpieczeństwa obowiązującymi w laboratorium.

a-customizable-approach-for-enzymatic-production-purification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Heterologiczna biosynteza erytromycyny A w E. coli obejmuje następujące etapy eksperymentalne: 1) transfer genetyczny; 2) rekonstrukcję heterologiczną; oraz 3) analizę produktu. Każdy z tych etapów zostanie omówiony w kontekście motywacji, potencjału oraz wyzwań związanych z produkcją terapeutycznych produktów naturalnych z wykorzystaniem E. coli jako gospodarza zastępczego.

Logika, kroki eksperymentalne i potencjał heterologicznej biosyntezy produktów naturalnych na przykładzie złożonego antybiotyku erytromycyny A produkowanego przez E. coli

Kanały transportu cząsteczek wody w enzymach wpływają na solwatację i katalizę miejsca aktywnego. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół inżynierii tych dodatkowych motywów katalitycznych w oparciu o modelowanie komputerowe i eksperymenty in silico. Pozwoli to lepiej zrozumieć wpływ dynamiki rozpuszczalnika na katalizę enzymatyczną.

Odkrywanie przyspieszenia entropii wywołanego dynamiką rozpuszczalnika w enzymach błonowych

Analogi trehalozy stają się ważnymi cząsteczkami do zastosowań bio(technicznych)logicznych i biomedycznych. Opisujemy zoptymalizowany protokół enzymatycznej syntezy i oczyszczania analogów trehalozy, który jest prosty, wydajny, szybki i przyjazny dla środowiska. Wykazano jego zastosowanie do szybkiej produkcji i podawania sondy do wykrywania prątków.

Szybka jednoetapowa synteza enzymatyczna i całkowicie wodne oczyszczanie analogów trehalozy

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół (A) identyfikacji naturalnego produktu o aktywności antybiotykowej, (B) oczyszczania związku, (C) pierwszego modelu jego biosyntezy, (D) sekwencjonowania/-eksploracji genomu oraz (E) weryfikacji klastra genów biosyntetycznych.

Od produktu naturalnego do klastra genów biosyntezy: demonstracja z użyciem poliketomycyny ze Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Ten manuskrypt opisuje ogólne podejście do projektowania dostosowanych do potrzeb pożywek do uprawy mikrobiologicznej. Jest to możliwe dzięki iteracyjnemu procesowi pracy, łączącemu eksperymentalny projekt oparty na Krigingu i technologię mikrobioreaktorów w celu uzyskania wystarczającej przepustowości uprawy, która jest wspierana przez robotykę laboratoryjną w celu zwiększenia niezawodności i szybkości przygotowywania pożywek do pracy z cieczami.

Ogólny protokół optymalizacji produkcji białek heterologicznych przy użyciu technologii zautomatyzowanych mikrobioreaktorów

Przejściowa heterologiczna ekspresja enzymów biosyntetycznych w liściach Nicotiana benthamiana może przekierować endogenne dostawy 2,3-oksydoskwalenu na produkcję nowych produktów triterpenowych o wysokiej wartości. W niniejszym dokumencie opisano szczegółowy protokół szybkiej (5 dni) produkcji triterpenów i analogów na skalę preparatywną z wykorzystaniem tej potężnej platformy roślinnej.

Przejściowa ekspresja w liściach Nicotiana benthamiana do produkcji triterpenów w skali preparatywnej

Pochodzenie flawonolu jest kluczowe dla jego zastosowania w opiece zdrowotnej i przemyśle spożywczym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół biosyntezy flawonolu z flawanonu i omawiamy kluczowe etapy i jego zalety w porównaniu z innymi podejściami.

Biosynteza flawonolu z flawanonu poprzez utworzenie jednodoniczkowej kaskady bienzymatycznej

Prezentujemy metodę przydatną do syntezy enzymatycznej na dużą skalę i oczyszczania specyficznych enancjomerów i regioizomerów epoksydów kwasu arachidonowego (AA), kwasu dokozaheksaenowego (DHA) i kwasu eikozapentaenowego (EPA) za pomocą bakteryjnego enzymu cytochromu P450 (BM3).

Enzymatyczna synteza epoksydowanych metabolitów kwasów dokozaheksaenowego, eikozapentaenowego i arachidonowego

Ten protokół szczegółowo opisuje ulepszoną metodę syntezy wysokiej wydajności białek rekombinowanych z systemu transkrypcyjno-translacyjnego bezkomórkowego Streptomyces (TX-TL).

Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Odkryj metodę enzymatycznej produkcji i oczyszczania diterpenoidów w Escherichia coli oraz Nicotiana benthamiana. Protokół umożliwia uzyskanie miligramowych ilości czystych metabolitów do badań strukturalnych i oceny aktywności biologicznej.

Indywidualne podejście do enzymatycznej produkcji i oczyszczania naturalnych produktów diterpenoidowych

Przeglądaj więcej filmów