Bezpośrednia i prosta metoda oceny żywotności Drosophila melanogaster od zarodka do dorosłego osobnika
27 sierpnia 2019
Ten protokół ma na celu ocenę żywotności Drosophila na każdym etapie rozwoju, od zarodka do dorosłego osobnika. Metoda ta może być stosowana do określania i porównywania żywotności różnych genotypów lub warunków wzrostu.
Podstawową zaletą tego testu jest prostota i dokładność, ponieważ nie wymaga on płukania zarodków w celu przeniesienia do fiolki z żywnością, co pozwala uniknąć strat spowodowanych błędami technicznymi. Protokół ten nie wymaga specjalistycznych umiejętności technicznych. Jednak właściwe wyczucie czasu i staranny transfer wody są ważne dla jego dokładności i odtwarzalności.
Tę procedurę zademonstruje Antonio Rockwell, świeżo upieczony doktorant z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury wlej agar winogronowy do 35-milimetrowej szalki Petriego do połowy i pozwól agarowi zastygnąć przez godzinę. Gdy agar zastygnie, użyj małego plastikowego noża, aby delikatnie podrapać powierzchnię agaru na zewnątrz płytki, pozostawiając środek płytki wolny od zadrapań.
Następnie umieść niewielką ilość świeżo przygotowanej pasty drożdżowej na środku naczynia i umieść naczynie w mini klatce do pobierania zarodków. W celu pobrania zarodków należy najpierw umieścić dwie dziewicze samice Drosophila i jednego młodego samca w klatce do pobrania na 24 godziny. Następnego dnia sprawdź spód płytki agarowej w poszukiwaniu zarodków.
Jeśli zarodki zostały złożone, przenieś płytkę agarową do wilgotnej komory i przykryj płytkę pokrywką, aby uniknąć odwodnienia. Jeśli ma być nacięte kilka dni nieśności, umieścić nową płytkę agarową w klatce zbiorczej. Za pomocą mikroskopu określić liczbę wyklutych zarodków i larw L1, a następnie umieścić zarodki z powrotem w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej, aż wszystkie zarodki wyklują się i rozwiną w larwy L1.
Po 48 godzinach policz liczbę wyklutych zarodków i larw L1 i za pomocą szpatułki ostrożnie wyjmij krążek agaru winogronowego z szalki Petriego, kładąc krążek L1 do dołu na pokarmie w fiolce z żywnością wystarczająco dużą, aby pomieścić krążek. Następnie dokładnie sprawdź szalkę Petriego pod kątem pozostałych larw. Monitoruj fiolkę z jedzeniem codziennie mniej więcej o tej samej porze każdego dnia, aby potwierdzić, że larwy L2 i L3 mogą być obserwowane w drodze do żywności.
Zapisz liczbę poczwarek i dorosłych Drosophila, kontynuując liczenie do momentu, gdy nie zaobserwuje się więcej dorosłych osobników i unikając liczenia następnego pokolenia. Następnie wykonaj analizę chi-kwadrat. Hipoteza zerowa zakłada 100% żywotność, tak że liczba dorosłych osobników będzie równa liczbie wyklutych zarodków i L1 pierwotnie zarejestrowanych i przeniesionych do fiolek z żywnością.
Kiedy agar jest umieszczany z boku fiolki, wiele zarodków i larw nie dojrzewa do wieku dorosłego, prawdopodobnie z powodu odwodnienia krążka agaru winogronowego. Gdy agar winogronowy jest umieszczany twarzą do dołu wewnątrz fiolki w bezpośrednim kontakcie z powierzchnią żywności, zwykle traci się mniej niż 6% potomstwa, ponieważ agar pozostaje uwodniony w kontakcie z wilgocią żywności instant wewnątrz fiolki. W tym reprezentatywnym eksperymencie porównującym rozwój potomstwa typu dzikiego i zmutowanego, około 91% zmutowanego potomstwa dojrzało do dorosłości przy użyciu tej metody, w porównaniu z 94% potomstwa much typu dzikiego.
Należy pamiętać, aby przenieść krążek agarowy stroną z zarodkiem w dół do fiolki z jedzeniem, a następnie sprawdzić, czy na pustej szalce Petriego nie ma pozostałych larw, które nie zostały przeniesione. Kolejnym ważnym krokiem jest przeniesienie krążka agarowego do fiolki z żywnością nie później niż 48 godzin po wyjęciu płytki z agarem winogronowym z mini klatek do pobierania zarodków, aby zapobiec odwodnieniu.
Przegląd
Niniejszy protokół służy do oceny żywotności Drosophila na wszystkich etapach rozwoju, od embrionu po stadium dorosłe. Umożliwia on porównanie żywotności w zależności od różnych genotypów lub warunków hodowli.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia rozwoju
- genetyka
Wstęp
- Test jest prosty i dokładny, a pominięcie płukania zarodków pozwala zminimalizować błędy techniczne.
- Kluczowe dla dokładności są odpowiedni czas oraz staranne przenoszenie wody.
- Metoda, zaprezentowana przez niedawnego absolwenta studiów doktoranckich, jest dostępna bez konieczności posiadania specjalistycznych umiejętności.
- Zbiór zarodków wymaga zachowania określonych warunków w celu uzyskania optymalnych wyników.
Cel badania
- Ocena przeżywalności Drosophila na różnych etapach rozwoju.
- Porównanie wpływu różnych genotypów na przeżywalność.
- Opracowanie wiarygodnej metody do przyszłych badań genetycznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie szalek z agarem winogronowym do zbierania embrionów.
- Użycie mini klatki do kontrolowanego składania jaj.
- Monitorowanie rozwoju larw i osobników dorosłych w fiolkach z pożywką.
- Analiza statystyczna z użyciem testu chi-kwadrat w celu oceny żywotności.
Główne wyniki
- Około 91% potomstwa zmutowanego i 94% potomstwa typu dzikiego osiągnęło wiek dojrzały.
- Prawidłowe rozmieszczenie agaru znacząco ogranicza ubytek potomstwa.
- Moment przeniesienia agaru jest kluczowy w celu zapobiegania odwodnieniu.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę oceny żywotności Drosophila.
- Wyniki wskazują na minimalną utratę potomstwa w przypadku prawidłowego umieszczenia agaru.
- Metoda ta może ułatwić dalsze badania genetyczne i rozwojowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena żywotności w różnych stadiach rozwojowych Drosophila umożliwia rzetelną ewaluację tła genetycznego oraz wczesne ograniczanie ryzyka biologicznego. Ten bezpośredni test od stadium embrionalnego do postaci dorosłej zapewnia pewność prognostyczną co do integralności systemu modelowego, co wspiera walidację celów i selekcję projektów w portfolio. Rutynowe monitorowanie żywotności minimalizuje ryzyko wystąpienia mutacji wtórnych wpływających na późniejsze analizy fenotypowe.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę sprawności genetycznej oraz wpływu alleli na żywotność organizmu.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez kwantyfikację punktów ubytku rozwojowego.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka w utrzymaniu linii mutantów i szczepów typu dzikiego.
- Zwiększa pewność prognostyczną co do niezawodności systemu modelowego w badaniach następczych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowany, powtarzalny schemat postępowania w celu ilościowego określenia żywotności dla różnych genotypów.
- Generuje dane ilościowe na każdym etapie rozwoju w celu przeprowadzenia analizy porównawczej.
- Ogranicza błąd techniczny poprzez wyeliminowanie płukania zarodków, co zwiększa niezawodność testu.
- Umożliwia skalowalną ocenę wielu wariantów genetycznych w sposób równoległy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia walidację systemu modelowego istotnego dla danej choroby poprzez gwarancję czystości genetycznej linii.
- Wspiera ciągłość procesu od wczesnych etapów odkrywania po wybór modelu przedklinicznego.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez identyfikację wąskich gardeł żywotności.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy letalności specyficznej dla konkretnego etapu rozwoju.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten test żywotności łączy w sobie etapy wczesnego odkrywania, walidacji celu oraz kwalifikacji modeli przedklinicznych, stanowiąc podstawę dla wiarygodnych badań genetycznych i przesiewów fenotypowych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie żywotności rozwojowej w celu wyjaśnienia efektów ścieżek genetycznych i zmniejszenia ryzyka hipotez biologicznych.
- Przesiewanie: Dostarczanie powtarzalnych danych o żywotności specyficznej dla danego etapu w celu wsparcia gotowości testów i oceny związków.
- Analityka: Wykorzystanie statystycznej analizy chi-kwadrat do porównania obserwowanego przeżycia z oczekiwanym na różnych etapach.
- Badania translacyjne: Zapewnienie wierności systemu modelowego dla badań translacyjnych poprzez rutynową ocenę zasobów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Opracowanie reużywalnego, niskozłożonego protokołu do bieżących badań genetycznych i fenotypowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w genetycznych systemach modelowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje ocenę żywotności, minimalizując zmienność techniczną i wymogi szkoleniowe.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój modeli genetycznych i celów terapeutycznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowych umiejętności laboratoryjnych oraz precyzyjnego odliczania czasu w celu uzyskania dokładnych wyników.
- Wymaga standardowego sprzętu do mikroskopii oraz podstawowej infrastruktury do przygotowania pożywek agarowych/pożywienia.
- Wymaga ścisłego przestrzegania protokołów transferu i liczenia przez wszystkie zespoły w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwość adaptacji do dodatkowych etapów rozwojowych przy niewielkich modyfikacjach protokołu.
- Dokładność zależy od terminowego transferu i kontroli nawodnienia, co potwierdzają dane źródłowe.
