Name: Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Poznaj metodę generowania limfocytów T CD8αβ specyficznych dla antygenu nowotworowego z ludzkich iPSC przy użyciu systemu współkultury OP9/DLL1. Technika ta umożliwia badania w zakresie medycyny regeneracyjnej i terapii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Alanowi B. Hoofringowi i Erinie H. On za pomoc graficzną. Badania te były wspierane przez Intramural Research Program Narodowego Instytutu Raka (ZIA BC010763) oraz Intramural NCI Cancer Moonshot Initiative for Cell-based Cancer Immunotherapy.

1. Hodowla ludzkich iPSC (hiPSC) na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF)
UWAGA: Alternatywne metody hodowli hiPSC mogą być również stosowane, w tym, ale nie ograniczając się do: wysiewu na 6-dołkową płytkę wstępnie pokrytą żelatyną, galaretowatą mieszanką białek, rekombinowaną lamininą 511 lub jakąkolwiek inną macierzą zewnątrzkomórkową używaną do ekspansji hiPSC, i hodowaną przy użyciu zdefiniowanych pożywek specjalnie opracowanych dla hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.
<ol>
	<li>Hodowla MEF
	<ol>
		<li>Pokryć 10-centymetrową szalkę Petriego z hodowli komórkowej 4 ml 0,1% żelatyny i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Fiolkę z 4 x 106 napromieniowanymi MEF szybko rozmrozić w 10 ml pożywki MEF o temperaturze 37 °C (DMEM + 10% FBS + 1x penicylina-streptomycyna + 1x suplement L-glutaminy). Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 9 ml pożywki MEF.</li>
		<li>Wyjąć naczynie pokryte żelatyną z inkubatora. Odessać żelatynę i dodać 7 ml pożywki MEF. Umieścić 3 ml zawiesiny MEF (od kroku 1.1.2) na szalce pokrytej żelatyną. Kołysz naczyniem na boki i od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie MEF na naczyniu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 8-36 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejście hiPSC na MEF 
	UWAGA: Dane zostały wygenerowane przy użyciu MART-1 iPSC pochodzącego z długotrwałej hodowli czerniaka TIL, które w szczególności rozpoznają peptyd MART-1 w kontekście HLA-A*02:01, jak opisano wcześniej18.
	<ol>
		<li>Przejście hiPSC, gdy kolonie mają średnicę od 0,8 do 1,2 mm. Przed pasażowaniem należy sprawdzić kolonie hiPSC w stereomikroskopie i usunąć wszelkie obszary różnicowania z kultury za pomocą plastikowej krawędzi końcówki o pojemności 200 μl.</li>
		<li>Odessać zużyte pożywki i dodać 10 ml pożywki hiPSC (pożywki hodowlane dla ludzi ES [tabela materiałów] + 10 ng/ml ludzkiego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów [hbFGF]) uzupełnionych inhibitorem 10 μM ROCK.</li>
		<li>Trzymaj naczynie do hodowli komórkowej w jednej ręce i przetocz jednorazowe narzędzie do pasowania komórek po całym naczyniu w jednym kierunku. Zastosuj wystarczający nacisk, aby całe ostrze rolki dotykało naczynia hodowlanego i utrzymywało równomierny nacisk podczas toczenia.</li>
		<li>Obrócić naczynie hodowlane o 90° i powtórzyć krok 1.2.3. Zobacz płytkę w mikroskopie, aby wizualnie potwierdzić prawidłowe cięcie kolonii, które powinny wyglądać na w kratkę. Odłącz pocięte kolonie poprzez delikatne płukanie mechaniczne za pomocą pipety o pojemności 200 μl. 
		nuta: Odrywanie pociętych kolonii przez mechaniczne spłukiwanie należy wykonać natychmiast po przecięciu kolonii wałkiem, ponieważ po 3 minutach pocięte kolonie zaczną ponownie przyczepiać się do szalki, a oderwanie kolonii o jednorodnej wielkości przez spłukiwanie stanie się trudne.</li>
		<li>Przenieść 350 - 600 kęp pociętych kolonii na nową 10-centymetrową szalkę MEF (posianą 8 - 36 godzin przed pasażką hiPSC) z 10 ml świeżej pożywki hiPSC uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK. Inkubować w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: 600 grudek reprezentuje około 1,0 x 106 MART-1 iPSC i da 0,5-1,0 x 106 komórek DP w 35 dniu. Jednak oczekiwane liczby będą się różnić w zależności od siły wyjściowej linii komórkowej i warunków hodowli.</li>
		<li>Następnego dnia odessać zużytą pożywkę i dodać 10 ml świeżej pożywki hiPSC. Zmieniaj pożywkę hiPSC co 1-2 dni w zależności od tempa wzrostu hiPSC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek OP9/DLL1 do kohodowli z hiPSC
<ol>
	<li>Hodowla komórek OP9/DLL1 w pożywce OP9 [α-minimum pożywka niezbędna (α-MEM) + 20% płodowa surowica bydlęca (FBS) + 1x penicylina-streptomycyna] w temperaturze 37 °C. Gdy komórki OP9 / DLL1 osiągną zbieg, odessać pożywkę i przemyć raz 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) bez magnezu, wapnia i fenolu.</li>
	<li>Odessać PBS i dodać 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie dodaj 4 ml pożywki OP9 i mechanicznie zdysocjuj warstwę komórkową przez pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko o wielkości 100 μm, aby uniknąć zbrylania komórek. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 12 ml pożywki OP9. </li>
	<li>Dodać 8 ml pożywki OP9 do każdej z sześciu nowych 10-centymetrowych szalek Petriego do hodowli komórkowych. Płytkę 2 ml zawiesiny komórek OP9/DLL1 z kroku 2.3 na każdą nową 10-centymetrową szalkę. Kołysz naczyniem na boki, a następnie od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie OP9/DLL1 na talerzu.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C. Powtarzać pasaż co 2-3 dni, gdy komórki osiągną zlew. 
	nuta: Ważne jest, aby przygotować wystarczającą ilość zamrożonych ogniw OP9/DLL1 i rozmrażać nowy zapas co 4-6 tygodni.</li>
</ol>
3. Różnicowanie in vitro hiPSC na pojedyncze dodatnie (SP) limfocyty T CD8αβ+
<ol>
	<li>Przygotuj zżelatynizowane naczynia OP9/DLL1 na tydzień przed współhodowlą z hiPSC. Aby przygotować 0,1% roztwór żelatyny, dodaj 5 ml podstawowego roztworu żelatyny o temperaturze pokojowej (RT) do 500 ml PBS.
	<ol>
		<li>Pokryć 3 nowe 10-centymetrowe płytki Petriego z hodowlą komórkową, dodając 4 ml na szalkę 0,1% żelatyny. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. </li>
		<li>Odessać żelatynę i dodać 8 ml pożywki OP9 do każdej potrawy. Przełóż jedno zlejące się naczynie OP9/DLL1 (jak to zrobiono w sekcji 2 powyżej) do trzech wstępnie pokrytych żelatyną naczyń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 4 dniach dodaj 10 ml pożywki OP9 do każdej 10 cm pożywki OP9/DLL1 na żelatynie, co daje w sumie 20 ml pożywki na miskę.</li>
	<li>Po 7 - 8 dniach rozpocznij kohodowlę hiPSC na zlewających się naczyniach OP9/DLL1 (dzień różnicowania 0).
	<ol>
		<li>Odessać zużyte pożywki z konfluentnego 10-centymetrowego naczynia hiPSC na MEF. Dodać 10 ml pożywki OP9. Wyciąć i odłączyć kolonie hiPSC za pomocą jednorazowego narzędzia do pasażowania komórek, jak to opisano w krokach 1.2.3 i 1.2.4.</li>
		<li>Przenieść 350 - 600 grudek pociętych kolonii na 10 cm wstępnie zżelowane naczynie OP9/DLL1 (krok 3.1) z 10 ml świeżej pożywki OP9 za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Rozbujaj naczynie hodowlane na boki, a następnie od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie kolonii. 
		UWAGA: Alternatywnie można użyć wstępnie uformowanych ciał zarodkowych hiPSC (EBs) lub zawiesiny o małych grudkach. Jednak w celu wytworzenia grudek hiPSC o jednolitej wielkości preferowane jest użycie jednorazowego narzędzia do pasażowania komórek lub systemu tworzenia EB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W pierwszym dniu odessać zużytą pożywkę i zastąpić ją 20 ml świeżej pożywki OP9. Grudki hiPSC współhodowane na OP9 / DLL1 przez 1 dzień pojawią się jako małe okrągłe kolonie jednowarstwowe (ryc. 1).</li>
	<li>W 5 dniu odessać 10 ml zużytej pożywki i dodać 10 ml świeżej pożywki OP9. Kolonie hiPSC zaczną różnicować się w prymitywną mezodermę, która charakteryzuje się wielowarstwowym ciemnym środkiem.</li>
	<li>W dniu 9 odessać 10 ml zużytej pożywki i dodać 10 ml świeżej pożywki OP9. W tym momencie wielowarstwowe struktury centralne przekształcą się w kształty przypominające kopułę, a obszar przypominający sieć peryferyjną zacznie być widoczny.</li>
	<li>W 13 dniu należy pobrać krwiotwórcze komórki progenitorowe (HPC) (ryc. 1). Struktury pochodzące z hiPSC w dniu 13 charakteryzują się ciemnym centralnym organoidem otoczonym siecią obszarów przypominających kopułę, reprezentatywnych dla stref krwiotwórczych (HZ), o których wcześniej informowano, że otaczają ludzkich embrionalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych krwiotwórczych<klasa sup="xref">21. 
	UWAGA: Obecność struktur przypominających kopułę wskazuje na udany proces nawet przy braku ciemnych centrów. Niezdolność do wytwarzania HPC może być spowodowana niską jakością OP9/DLL1, jakością partii FBS, zbiegiem grudek iPSC wysianych na OP9/DLL1 (optymalna jest 350-600 grudek) i/lub różnicami w potencji linii iPSC do produkcji prekursorów krwiotwórczych.
	<ol>
		<li>Odessać zużyte podłoże i przemyć 1x 5 ml 1x fenolowego roztworu soli Hanksa bez czerwieni modyfikowanego wapniem i magnezem (HBSS). </li>
		<li>Odessać HBSS i dodać 250 μl 5000 jednostek/ml kolagenazy IV w 10 ml HBSS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Odessać HBSS kolagenazą dożylnie i przemyć raz 5 ml PBS.</li>
		<li>Odessać PBS i dodać 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie dodaj 4 ml pożywki OP9 i zdysocjuj warstwę komórkową przez pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko do komórek o pojemności 100 μm. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki OP9. </li>
		<li>Zawiesinę komórek płytki na nowej, zżelowanej, 10 cm szalce Petriego do hodowli komórkowej (patrz kroki 3.1.1 i 3.1.2). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Następnie należy zebrać nieprzylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę pobranych komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko do komórek o pojemności 100 μm. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki różnicującej [pożywka OP9 z czynnikiem ludzkich komórek macierzystych 5 ng/ml (hSCF), 5 ng/ml ludzki ligand Flt3 (hFLT3L), i 5 ng/ml ludzkiej interleukiny 7 (hIL-7)].</li>
		<li>Umieść zawiesinę komórek na nowej 10-centymetrowej naczyniu zlewającej się OP9/DLL1. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>W dniu 16 przejdź przez komórki. 
	<ol>
		<li>Mechanicznie odłącz nieprzylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania i przefiltruj przez sitko o wielkości 100 μm. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml pożywki różnicującej.</li>
		<li>Umieść zawiesinę komórek na nowej 10-centymetrowej naczyniu zlewającej się OP9/DLL1. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj pasażowanie nieprzylegających komórek co 5-7 dni, powtarzając krok 3.8.</li>
	<li>W 35 dniu wzbogać podwójnie dodatnią populację CD4 + CD8 + (DP) i stymulować do produkcji limfocytów T CD8αβ + SP (Figura 2).
	<ol>
		<li>Mechanicznie odłącz nieprzylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania i przefiltruj przez sitko o wielkości 100 μm, aby usunąć grudki komórek. Wzbogać populację komórek CD4+ poprzez izolację kulek magnetycznych CD4 zgodnie z protokołem producenta. 
		UWAGA: Uzasadnieniem dla stosowania kulek magnetycznych CD4 jest usunięcie komórek CD4-CD8-DN z hodowli, ponieważ wykazano, że powodują one bezpośrednie zabijanie komórek CD4 + CD8 + DP po stymulacji22.</li>
		<li>Policz żywe komórki wzbogacone w CD4 za pomocą hemocytometru Neubauera i niebieskiego barwnika trypanowego. Zawiesić w pożywce OP9 o całkowitym stężeniu 0,5 x 106 komórek/ml. Podwielokrotność 1 ml zawiesiny komórkowej (0,5 x 106 komórek) do każdej studzienki 24-dołkowej płytki z płaskim dnem 24-dołkowym zlewającej się OP9/DLL1.</li>
		<li>Dodać 100 j.m. ludzkiej interleukiny 2 (hIL-2), 5 ng/ml hIL-7, 500 ng/ml przeciwciała anty-ludzkiego CD3 i 2 μg/ml przeciwciała anty-ludzkiego CD28, a następnie posiewać w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>W dniach 4 - 7 po stymulacji zbierz komórki do analizy molekularnej (ryc. 3) lub wspólnej hodowli z komórkami prezentującymi antygen impulsowy peptydowo (APC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiar swoistości antygenowej limfocytów T CD8αβ+ SP pochodzących z hiPSC
UWAGA: Rodzaj APC, które mają być użyte do tego doświadczenia, zależy od ograniczenia MHC limfocytów T pochodzących z hiPSC. Tutaj wykorzystywana jest linia komórkowa T2, która jest hybrydą linii komórkowych limfoblastoidów T i B. Komórki T2 wyrażają HLA-A*02:0123, który jest rozpoznawany przez komórki JKF6, z których wyprowadzono MART1-iPSC18. Ta linia komórkowa T2 może być rozwijana w RPMI 1640 + 20% FBS + 1x penicylina-streptomycyna i ulega pasażowaniu, gdy komórki osiągną gęstość 5 x 105 komórek / ml.
<ol>
	<li>Policz żywe komórki hybrydowe limfoblastoidalne T2 HLA-A*02:01+ T-B za pomocą hemocytometru Neubauera i niebieskiego barwnika trypana. Inkubować APC na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z 1 μg/ml peptydu MART-1 przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. 
	nuta: Optymalne stężenie peptydów jest zmienne, w zależności od specyficzności linii komórkowej i antygenu.</li>
	<li>Zbierz APC i przemyj 2x 10 ml PBS, aby usunąć nadmiar peptydu.</li>
	<li>Policz APC i zawiesij w 2 – 5 x 105 komórek/ml w pożywce OP9 ze 100 IU IL-2 i 5 ng / ml IL-7. Porcję 100 μl zawiesiny komórek (2-5 x 104 komórki) do każdego dołka na 96-dołkowej płytce o bardzo niskim przyłączeniu U lub bezpośrednio do wstępnie powlekanej płytki ELISpot.</li>
	<li>Sortuj limfocyty T CD8αβ + SP pochodzące z hiPSC (1 tydzień po stymulacji przeciwciałami anty-ludzkimi CD3 / CD28) za pomocą sortera komórek i zawieś w pożywce 1 x 106 komórek / ml w pożywce OP9 ze 100 IU IL-2 i 5 ng / ml IL-7. Porcję 100 μl zawiesiny komórkowej (1 x 105 komórek) do każdej studzienki APC i hodowli przez 16-20 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 16 - 20 godzinach przeanalizuj profil wydzielania cytokin za pomocą testu ELISpot zgodnie z protokołem producenta (ryc. 4).</li>
</ol>

<ol><li>Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+Genesis%3A+In+Vitro+Veritas+Est%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est.</a> Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).</li>
<li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+as+personalized+immunotherapy+for+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.</a> Science. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T-cell+transfer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li>
<li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+of+CD8%28%2B%29+T+cell+subsets+is+revealed+by+progressive+changes+in+the+epigenetic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape.</a> Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).</li>
<li>Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+stemness+in+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Silencing stemness in T cell differentiation.</a> Science. 359 (6372), 163-164 (2018).</li>
<li>Henning, A. N., Roychoudhuri, R., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+CD8%28%2B%29+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of CD8(+) T cell differentiation.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (5), 340-356 (2018).</li>
<li>Vodnala, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+stemness+and+dysfunction+in+tumors+are+triggered+by+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell stemness and dysfunction in tumors are triggered by a common mechanism.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
<li>Restifo, N. P., Gattinoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+relationship+of+effector+and+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lineage relationship of effector and memory T cells.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (5), 556-563 (2013).</li>
<li>Tran, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+based+on+mutation-specific+CD4%2B+T+cells+in+a+patient+with+epithelial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer.</a> Science. 344 (6184), 641-645 (2014).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8%2B+memory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li>
<li>Gautam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+c-Myb+regulates+CD8%28%2B%29+T+cell+stemness+and+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor c-Myb regulates CD8(+) T cell stemness and antitumor immunity.</a> Nature Immunology. 20 (3), 337-349 (2019).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+successful+CD8%2B+T-cell+adoptive+immunotherapy+for+large+established+tumors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Determinants of successful CD8+ T-cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice.</a> Clinical Cancer Research. 17 (16), 5343-5352 (2011).</li>
<li>Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+through+subsets%3A+which+T-cell+populations+mediate+highly+effective+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Sorting through subsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptive immunotherapy.</a> Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).</li>
<li>Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Reprogramming antitumor immunity.</a> Trends in Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).</li>
<li>Crompton, J. G., Rao, M., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memoirs+of+a+reincarnated+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Memoirs of a reincarnated T cell.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 6-8 (2013).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2 (6), 1722-1735 (2012).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+tumor+antigen-specific+T+cells+from+iPSCs+derived+from+mature+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).</li>
<li>Lo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+recognition+of+a+shared+p53+mutated+neoantigen+in+a+patient+with+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Immunologic recognition of a shared p53 mutated neoantigen in a patient with metastatic colorectal cancer.</a> Cancer Immunology Research. , (2019).</li>
<li>Timmermans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T+cells+from+human+embryonic+stem+cell-derived+hematopoietic+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones.</a> Journal of Immunology. 182 (11), 6879-6888 (2009).</li>
<li>Maeda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+CD8alphabeta+T+Cells+from+T-cell-Derived+iPSC+Imparts+Potent+Tumor+Antigen-Specific+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity.</a> Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).</li>
<li>Salter, R. D., Howell, D. N., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+HLA+class+I+antigen+expression+in+T-B+lymphoblast+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids.</a> Immunogenetics. 21 (3), 235-246 (1985).</li>
<li>Snauwaert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+mature%2C+naive+antigen-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+with+a+single+T-cell+receptor+by+agonist+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of mature, naive antigen-specific CD8(+) T cells with a single T-cell receptor by agonist selection.</a> Leukemia. 28 (4), 830-841 (2014).</li>
<li>Takahama, Y., Suzuki, H., Katz, K. S., Grusby, M. J., Singer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+selection+of+CD4%2B+T+cells+by+TCR+ligation+without+aggregation+even+in+the+absence+of+MHC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC.</a> Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 23, Unit 23, 26 (2007).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor+Antigen-Specific+iPSC-Derived+Thymic+Emigrants+Using+a+3D+Thymic+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System.</a> Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).</li>
<li>McNicol, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8alpha%2Falpha+homodimers+fail+to+function+as+co-receptor+for+a+CD8-dependent+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR.</a> European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).</li>
<li>Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+sources+for+T+cell+engineering+and+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).</li>
<li>Minagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+T+Cell+Receptor+Stability+in+Rejuvenated+iPSC-Derived+T+Cells+Improves+Their+Use+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).</li>
<li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid-Induced+Differentiation+of+Conventional+T+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).</li>
<li>Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Peptides+That+Promote+Positive+Selection+in+the+Thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus.</a> Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).</li>
<li>Takada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR+affinity+for+thymoproteasome-dependent+positively+selecting+peptides+conditions+antigen+responsiveness+in+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells.</a> Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Three-dimensional+Thymic+Culture+System+to+Generate+Murine+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-derived+Tumor+Antigen-specific+Thymic+Emigrants%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants.</a> JoVE. , https://www.jove.com/video/58672/a-three-dimensional-thymic-culture-system-to-generate-murine-induced e58672(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Kohodowla mysich komórek zrębowych OP9 jest dobrze ugruntowanym systemem do generowania in vitro limfocytów (tj. komórek NK, B i T) z HSPC i pluripotencjalnych komórek macierzystych. Sygnalizacja Notch jest wymagana do indukowania zaangażowania linii T i może być osiągnięta przez ektopową ekspresję liganda Notch DLL1 lub DLL4, które mają porównywalną skuteczność dla generacji limfocytów T1. W związku z tym system kohodowli OP9/DLL1 stał się szeroko stosowaną metodą wytwarzania limfocytów T in vitro. Ponadto metoda ta ma zastosowanie do stosowania z kilkoma typami i źródłami komórek ludzkich, w tym z krwią pępowinową, HSPC szpiku kostnego i ESC. Jednak wytwarzanie limfocytów T z tych źródeł jest ograniczone albo przez niewystarczające pobieranie komórek źródłowych, albo przez nieefektywne różnicowanie do limfocytów T1. Ponadto produkt limfocytów T z pojedynczą rekombinacją TCR nie może być wygenerowany z tych otwartych źródeł repertuarowych. Dzięki zastosowaniu technik medycyny regeneracyjnej, a mianowicie technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), możliwe jest wyprodukowanie ogromnej liczby limfocytów T specyficznych dla antygenu do wykorzystania w terapiach opartych na komórkach15.
hiPSC są podobne do pluripotencjalnych ESC pod względem zdolności do samoodnawiania, nieograniczonej ekspansji i potencjału do różnicowania się do dowolnego typu komórki somatycznej w organizmie; Brakuje w nich jednak obaw etycznych związanych z wykorzystywaniem produktów pochodzenia embrionalnego do zastosowań klinicznych. Co więcej, hiPSC mogą być wytwarzane z dowolnej komórki somatycznej, co pozwala na rozwój produktów komórkowych dla medycyny spersonalizowanej. W poprzednich doniesieniach hiPSC były wytwarzane z ludzkich limfocytów T przy użyciu całych obwodowych komórek jednojądrzastych, komórek CD3 + lub izolowanych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) jako źródła 18,19,22,26. Kiedy hiPSC są generowane ze źródła limfocytów T (T-iPSC), dziedziczona jest pierwotna rearanżacja genu TCR. W związku z tym limfocyty T pochodzące z T-iPSC pacjenta mogą stanowić model spersonalizowanego leczenia ACT poprzez celowanie w odrębne antygeny nowotworowe pacjenta.
Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki linii T dzieli się na dwa etapy: wytwarzanie hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC)27 i ich dalsze różnicowanie w komórki linii T21. Oba etapy można wykonać za pomocą systemu kohodowli OP9/DLL1. Co ważne, jakość komórek zasilających OP9/DLL1 ma kluczowe znaczenie dla powodzenia różnicowania limfocytów T. Ponieważ komórki OP9 / DLL1 nie są nieunieśmiertelnioną jednorodną linią komórkową, jakość FBS i warunki hodowli mają kluczowe znaczenie dla utrzymania ich ekspansji bez utraty zdolności do wspierania różnicowania hiPSC. Dlatego zaleca się wstępną ocenę partii FBS i konsekwentne przechodzenie, gdy zaczyna dochodzić do kontaktu cytoplazmatycznego między komórkami, aby zapobiec różnicowaniu się i starzeniu komórek. Jedną z kwestii, którą należy wziąć pod uwagę, jest to, że kontakt między komórkami może wydawać się nie do odróżnienia od tła w zależności od kontrastu fazowego i powiększenia mikroskopu. Z naszego doświadczenia wynika, że większość potraw OP9/DLL1 wydaje się być w 80% zlewna, gdy jest gotowa do przejścia.
Wykazano, że zróżnicowane komórki linii T wygenerowane z T-iPSC przez kokulturę OP9 / DLL1 mogą wytwarzać limfocyty T CD8 + SP po stymulacji18,19. Jednak zregenerowane limfocyty T CD8 + SP uzyskują wrodzony homodimer CD8αα22,28, który jest nieskutecznym koreceptorem dla sygnalizacji TCR29. Dodatkowo, te zregenerowane limfocyty T CD8 + SP wykazały silną cytotoksyczność niezależną od TCR, co czyni te komórki niekorzystnymi do użytku klinicznego30. Protokół ten opisuje najnowszą metodę polegającą na stymulacji oczyszczonych komórek DP CD4 + CD8 + w celu wytworzenia limfocytów T CD8αβ + SP o bardziej konwencjonalnym fenotypie i ulepszonej cytotoksyczności specyficznej dla antygenu22. Chociaż utrata swoistości antygenu spowodowana wtórnym przegrupowaniem alleli TCRα występuje w stadium DP po długotrwałej hodowli, można to przezwyciężyć poprzez edycję genomu w T-iPSC31. Z naszego doświadczenia wynika, że komórki DP pochodzące z hiPSC zaczynają pojawiać się w 30-35 dniu hodowli, a te nowo wygenerowane komórki DP nie przeszły jeszcze wtórnej rearanżacji TCRα. Dlatego większość komórek DP w 35 dniu zachowuje swoistość antygenową i może być wykorzystana do generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8αβ + SP.  
Przed ludzką stymulacją anty-CD3 i anty-CD28 w 35 dniu, komórki CD4-CD8-DN muszą zostać usunięte z hodowli, ponieważ wykazano, że powodują one bezpośrednie zabijanie komórek CD4 + CD8 + DP po stymulacji22. Zastosowanie wzbogacenia kulek magnetycznych CD4 (krok 3.10) wzbogaci zarówno DP, jak i CD4 + CD8 - pośrednie pojedyncze dodatnie komórki (ISP)1, które, jak wykazano, nie mają negatywnych skutków22. Alternatywnie można przeprowadzić sortowanie komórek aktywowane fluorescencją za pomocą cytometrii przepływowej w celu wyizolowania komórek DP. Jednak preferowana jest separacja kulek magnetycznych, ponieważ pozwala uniknąć naprężeń mechanicznych wywołanych cytometrią przepływową.
Wytwarzanie limfocytów T CD8αβ + SP z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych bez selekcji agonistycznej za pośrednictwem aktywacji zostało następnie wykazane przy użyciu hodowli mysich komórek zrębowych3D 32. Jednak fizjologiczna selekcja pozytywna zależy od interakcji TCR z kompleksami samopeptyd-MHC, które są unikalnie przetwarzane i prezentowaneprzez komórki nabłonka kory grasicy33. Ponadto wykazano, że powinowactwo TCR do peptydów selekcyjnych określa późniejsze zdolności funkcjonalne dojrzałych limfocytów T CD8αβ + SP34. Obecnie nie ma dowodów sugerujących, że system kohodowli oparty na komórkach zrębu Notch może zapewnić zdefiniowany peptyd selekcyjny i kompleks MHC wymagany do fizjologicznej selekcji pozytywnej.
Wcześniej donoszono w modelu mysim, że komórki linii T wygenerowane z hiPSC pochodzących z limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego przy użyciu samego OP9 / DLL1 nie doświadczają konwencjonalnego dojrzewania. Jednak niedojrzałe limfocyty T pochodzące z iPSC generowane przez system OP9 / DLL1 mogą dojrzewać do naiwnych limfocytów T poprzez dalszą fizjologiczną edukację grasicy w systemie hodowli 3D 28,35. Dlatego przedstawiony tutaj protokół wytwarzania niedojrzałych limfocytów T pochodzących z iPSC generowanych przez system OP9 / DLL1 jest niezbędny dla dalszych prób wygenerowania prawdziwych ludzkich komórek T post-grasiczych specyficznych dla antygenu nowotworowego, zdolnych do długotrwałego utrzymywania się in vivo ze skutecznością w leczeniu ustalonych unaczynionych guzów.

Oprócz fizjologicznych zalet, limfocyty T mają wiele potencjalnych zastosowań terapeutycznych. Wytwarzanie i namnażanie limfocytów T in vitro może być wykorzystywane do modelowania chorób i walidacji terapeutycznej, a także jako źródło leczenia dziedzicznych i nabytych stanów niedoboru odporności (tj. wirusowych niedoborów odporności i limfodeplecji wtórnej do chemioterapii lub przeszczepu) oraz do zwalczania raka. Ta ostatnia cecha doprowadziła do opracowania adoptywnego transferu limfocytów T (ACT) do leczenia pacjentów z zaawansowanym rakiem1. 
ACT polega na wycięciu guza pacjenta, ekstrakcji limfocytów naciekających nowotwór (TIL), ekspansji TIL ex vivo, a następnie ponownym wprowadzeniu rozszerzonych komórek do pacjenta2. Wykazano, że jest to skuteczna metoda leczenia u niektórych pacjentów z rakiem z przerzutami. Niestety, nie wszyscy pacjenci reagują na tę terapię. Poprzednie raporty wykazały, że stan różnicowania przenoszonych komórek3,4,5,6,7,8,9, wykorzystanie dużej liczby wysoce wzbogaconych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego10 oraz trwałość limfocytów T po transferze11,12 są skorelowane z bardziej trwałymi odpowiedziami13,14. Dlatego, gdy ACT nie wywołuje odpowiedzi przeciwnowotworowej, może to być częściowo spowodowane niską wydajnością limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego, nieefektywną ekspansją ex vivo prowadzącą do wyczerpania i utraty reaktywnych klonów lub brakiem trwałości po transferze4. Postuluje się, że przeszkody te mogą zostać pokonane poprzez generowanie dużej liczby mniej zróżnicowanych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego in vitro15,16. 
Hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe (HSPCs) są konwencjonalnym źródłem do generowania limfocytów T in vitro, chociaż ta metoda jest ograniczona przez małą liczbę komórek, które można odzyskać od jednego dawcy1. Wykazano również, że embrionalne komórki macierzyste (ESC) wytwarzają limfocyty T, ale z niską wydajnością17, co czyni je nieefektywnymi w zastosowaniach klinicznych. Ponadto, ponieważ komórki linii T doświadczają stochastycznej rekombinacji genetycznej receptorów komórek T (TCR) we wczesnych stadiach rozwoju, nie jest możliwe użycie HSPC lub ESC do wygenerowania czystej populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu bez dalszych modyfikacji genomowych, takich jak transdukcja genu TCR.
Jednym z podejść do przezwyciężenia tych zastrzeżeń jest przeprogramowanie TIL na ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), które mogą stanowić nieograniczone źródło do generowania komórek T in vitro. Wykazano, że TIL specyficzne dla antygenu nowotworowego mogą być przeprogramowane w hiPSC i ponownie różnicowane do linii limfocytów T, która zachowuje tę samą rearanżację genu receptora limfocytów T (TCR) co oryginalna limfocyt T18,19. Ten szczegół jest ważny dla ACT, ponieważ poszczególne guzy pacjentów mają unikalne profile mutacji i wykazano, że bardzo niewiele antygenów nowotworowych jest wspólnych dla pacjentów20. W związku z tym wykorzystanie specyficznych dla antygenu nowotworowego TIL jako źródła do wytwarzania in vitro limfocytów T pochodzących z hiPSC może zapewnić nową strategię spersonalizowanego leczenia pacjentów z rakiem z przerzutami.
Szczegółowo przedstawiony jest tutaj protokół różnicowania komórek linii T pochodzących z hiPSC na funkcjonalne specyficzne dla antygenu pojedyncze dodatnie (SP) limfocyty T CD8αβ+ przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1. Metoda ta jest potężnym narzędziem do różnicowania in vitro limfocytów T hiPSC, krwiotwórczych komórek progenitorowych i embrionalnych komórek macierzystych, a także ich dalszych zastosowań w medycynie regeneracyjnej i terapiach komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Naczynie 10 cm</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>Anti-CD3, człowiek</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 561812, RRID:AB_1089628</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD34, człowiek</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 348791, RRID:AB_400381</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4, ludzka</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 344612, RRID:AB_2028479</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD43, człowiek</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 560198, RRID:AB_1645460</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD7, człowiek</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555361, RRID:AB_395764</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8a, ludzki</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555369, RRID:AB_398595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8b, ludzki</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 641057, RRID:AB_1645747</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCRb, ludzki</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 555548, RRID:AB_395932</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało monoklonalne CD28 (15E8), czysto funkcyjne</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-375</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało monoklonalne CD3 (OKT3), czysto funkcjonalne</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-387</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Mikrogranulki, ludzkie</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-045-101</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 100 um</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100-500</td><td></td></tr><tr><td>Ligand Flt-3</td><td>R& D Systems</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór żelatyny 2%&nbsp;</td><td>SIGMA-Aldritch</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>Suplement L-Glutaminy</td></tr><tr><td>HBSS Mg+Ca+ Bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Interleukina-2</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL</td><td></td></tr><tr><td>Interleukina-7</td><td>R& D Systems</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV</td><td>MBL</td><td>Cat#TB-0009-2</td><td></td></tr><tr><td>Mart1-hiPSC</td><td>Vizcardo et al., Komórka macierzysta 2013</td><td>RIKEN-IMS</td><td></td></tr><tr><td>Melan-A, MART 1 (26-35)</td><td>InnoPep</td><td>3146-0100</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM w proszku</td><td>Gibco</td><td>61100061</td><td></td></tr><tr><td>Mysie fibroblasty embrionalne (MEF)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M KAŻDY; A34962</td><td></td></tr><tr><td>OP9/N-DLL1</td><td>Centrum zasobów biologicznych Riken</td><td>Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220</td><td>OP9 / DLL1</td></tr><tr><td>Penicylina / streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4 (1x)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka</td><td>reprokomórkowa</td> ES naczelnych <td>RCHEMD001</td><td>Ludzkie podłoże hodowlane ESC</td></tr><tr><td>Inhibitor Rhok (dichlorowodorek Y-27632)</td> <td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik komórek macierzystych (SCF)</td><td>R& D Systems</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>StemPro</td><td>EZPassage</td><td>23181-010</td><td></td></tr><tr><td>T2-guz</td><td>ATCC</td><td>T2 (174 x CEM. T2) (ATCC&reg; CRL-1992&handel ;)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>U Dolna 96-dołkowa płytka</td><td>Corning, Inc.&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 3799</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów t specyficznych dla antygenu nowotworowego

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Generowanie i rozszerzanie funkcjonalnych limfocytów T in vitro może prowadzić do szerokiego zakresu zastosowań klinicznych. Jednym z takich zastosowań jest leczenie pacjentów z zaawansowanym rakiem. Wykazano, że adoptywny transfer limfocytów T (ACT) wysoce wzbogaconych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego powoduje trwałą regresję raka z przerzutami u niektórych pacjentów. Jednak podczas ekspansji komórki te mogą ulec wyczerpaniu lub starzeniu się, co ogranicza ich funkcję efektorową i trwałość in vivo. Technologia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) może przezwyciężyć te przeszkody, prowadząc do generowania in vitro dużej liczby mniej zróżnicowanych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego. Ludzkie iPSC (hiPSC) mają zdolność różnicowania się w dowolny typ komórki somatycznej, w tym limfocyty, które zachowują pierwotną rearanżację genomową receptora komórek T (TCR), gdy komórka T jest używana jako komórka wyjściowa. Dlatego przeprogramowanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego na hiPSC, a następnie redyferencjacja do linii limfocytów T ma potencjał do wytworzenia odmłodzonych limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego. Opisano tutaj metodę generowania specyficznych dla antygenu nowotworowego pojedynczych dodatnich (SP) limfocytów T CD8αβ + z hiPSC przy użyciu systemu kohodowli OP9 / DLL1. Metoda ta jest potężnym narzędziem do generowania linii limfocytów T in vitro i ułatwi rozwój limfocytów T pochodzących z in vitro do zastosowania w medycynie regeneracyjnej i terapiach komórkowych.

Po 13 dniach kokultury hiPSC z OP9/DLL1 pojawiły się komórki progenitorowe krwiotwórcze CD34+CD43+ (Rysunek 1). Po kolejnych 22 dniach hodowli na nieżelatynizowanych OP9/DLL1 w obecności hSCF, hFLT3L oraz hIL-7, progenitorzy krwiotwórczy zróżnicowali się w podwójnie dodatnie (DP) komórki linii T CD3+CD7+CD4+CD8+, z których większość wykazywała ekspresję TCR specyficznego dla epitopu MART-1 (tetramer) (Rysunek 2).
Wcześniej wykazano, że limfocyty T CD8+ SP mogą być indukowane z limfocytów T CD4+CD8+ DP poprzez sygnalizację TCR za pomocą peptydów agonistycznych lub stymulację TCR indukowaną przeciwciałami24,25. W związku z tym, w 35. dniu hodowli, pochodne z hiPSC limfocyty T CD4+CD8+ DP stymulowano przeciwciałami anty-ludzkimi CD3 i CD28 w obecności hIL-7 i hIL-2. Cztery dni po stymulacji liczba komórek CD3+CD8αβ+ SP gwałtownie wzrosła i zachowała swoistość względem epitopu MART-1, co potwierdziło utrzymanie ich odziedziczonej swoistości antygenowej (Rysunek 3).
Aby określić właściwości funkcjonalne komórek T CD8αβ+ SP pochodzących z hiPSC, przeanalizowano zależną od antygenu aktywację oraz sekrecję interferonu gamma (IFN-γ). Po stymulacji przeciwciałami anty-ludzkimi CD3 i CD28 przez 1 tydzień, komórki T CD8αβ+ SP pochodzące z hiPSC wyizolowano za pomocą sortera komórkowego i hodowano wspólnie z linią komórkową T2 wykazującą ekspresję HLA-A*02:01, z dodatkiem lub bez dodatku kognatywnego peptydu MART1 przez 16 - 20 h. Test ELISpot wykazał, że komórki T CD8αβ+ SP pochodzące z hiPSC wydzielają większe ilości IFN-γ w porównaniu z komórkami T CD8αα+ SP, gdy są hodowane w obecności peptydu MART-1. Ekspresja IFN-γ była zerowa w przypadku samych komórek T oraz APC, co dowodzi, że ludzkie komórki T pochodzące z T-iPSC są antygenowo swoiste i funkcjonalne (Rysunek 4).
<img alt="Oś czasu różnicowania iPSC; obrazy mikroskopowe pokazują dni 1-13; cytometria przepływowa dla poziomów CD34/CD43." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Generowanie komórek progenitorowych krwi pochodzących z hiPSC. (A) Schematyczny przegląd różnicowania hiPSC w kierunku linii krwiotwórczej z wykorzystaniem kokultury OP9/DLL1. (B) Wygląd struktur pochodzących z hiPSC w dniach 1 (lewy górny róg), 3 (prawy górny róg), 7 (lewy dolny róg) i 13 (prawy dolny róg). Paski skali = 100 µm. (C) Analiza cytometryczna komórek progenitorowych krwi CD34+CD43+ pochodzących z hiPSC w dniu 13. Dane są reprezentatywne dla sześciu niezależnych eksperymentów (n = 1 do 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu różnicowania komórek, wykresy analizy cytometrii przepływowej, dysocjacja pojedynczych komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Różnicowanie hiPSC w komórki T DP Mart1+ CD4+CD8αβ+. (A) Schematyczny przegląd różnicowania linii krwiotwórczej pochodzącej z hiPSC w niedojrzałe komórki T z wykorzystaniem kokultury OP9/DLL1. (B) Analiza cytometrii przepływowej ekspresji CD4 vs. CD8α, CD3 vs. CD8β oraz tetrameru MART-1 w komórkach T pochodzących z hiPSC w dniu 35. Bramkowanie na limfocyty, pojedyncze komórki, PI negatywne. Dane są reprezentatywne dla trzech niezależnych eksperymentów (n = 3 - 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej; ekspresja CD4, CD8, CD3; profilowanie populacji komórek odpornościowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Indukcja fenotypu komórek T SP CD8αβ+. Analiza cytometryczna komórek T pochodzących z hiPSC CD4- 4 dni po stymulacji przeciwciałami ludzkimi anty-CD3 oraz anty-CD28. Bramkowanie na limfocyty, pojedyncze komórki, PI negatywne (n = 4).   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki testu aktywacji limfocytów T; limfocyty T CD8; analiza ELISpot (enzyme-linked immunospot); odpowiedź immunologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59997/59997fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Specyficzność antygenowa limfocytów CD8αβ+ SP T pochodzących z hiPSC. Sekrecja IFN-γ w teście ELISpot z wykorzystaniem limfocytów CD8αβ+ SP, CD8αα+ SP oraz populacji T pochodzących z hiPSC po 20 h kokultury z komórkami T2 pulsującymi (lub nie) peptydem MART-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59997/59997fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Przedstawiamy metodę generowania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nowotworowych pochodzących z komórek macierzystych specyficznych dla pojedynczego dodatniego antygenu nowotworowego CD8 alfa beta przy użyciu systemu kohodowli OP9-Delta-1. Metoda ta jest potężnym narzędziem do generowania limfocytów T in vitro i ułatwi rozwój limfocytów T pochodzących z in vitro do zastosowania w medycynie regeneracyjnej i terapiach komórkowych. Może być również przystosowany do wytwarzania innych limfocytów, takich jak komórki NK.Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby wstępnie ocenić partię komórek FBS i konsekwentnie pasować OP9-Delta-1, gdy kontakt cytoplazmatyczny między komórkami zaczyna zapobiegać różnicowaniu się komórek i starzeniu. Procedurę zademonstruje dr Meghan Good, specjalistka od chirurgii onkologicznej z mojego zespołu. Zacznij od sprawdzenia ludzkich kolonii iPSC w stereomikroskopie i usuń wszelkie obszary różnicowania z hodowli za pomocą plastikowej krawędzi końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.Kiedy kolonie osiągną średnicę od 0,8 do 1,2 milimetra, przechodzą ludzkie iPSC. Odessać zużytą pożywkę i dodać 10 mililitrów ludzkiej pożywki iPSC uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Przetoczyć jednorazowe narzędzie do pasowania komórek po całej naczyniu w jednym kierunku, upewniając się, że utrzymuje równomierny nacisk i że całe ostrze rolki dotyka naczynia hodowlanego.Obróć naczynie hodowlane o 90 stopni i powtórz zwijanie. Wizualnie potwierdź prawidłowe cięcie kolonii za pomocą mikroskopu. Powinny wyglądać na w kratkę.Następnie odłącz pocięte kolonie poprzez delikatne mechaniczne spłukiwanie pipetą o pojemności 200 mikrolitrów. Oszacuj wizualnie liczbę grudek kolonii i przenieś od 350 do 600 grudek do nowej 10-centymetrowej szalki z mysimi fibroblastami embrionalnymi z 10 mililitrami świeżej ludzkiej pożywki iPSC uzupełnionej inhibitorem ROCK. Inkubuj danie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia odessaj zużytą pożywkę i dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki iPSC dla ludzi. Zmieniaj pożywkę co jeden lub dwa dni, w zależności od tempa wzrostu komórek. Hoduj komórki OP9-Delta-1 w pożywce OP9 w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Kiedy osiągną zbieg, odessać pożywkę i umyć komórki raz pięcioma mililitrami 1x PBS bez czerwieni magnezu, wapnia i fenolu. Odessać PBS, dodać dwa mililitry 05% trypsyny-EDTA i inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki OP9 i mechanicznie zdysocjuj warstwę komórek przez pipetowanie.Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki przez sitko do komórek o średnicy 100 mikrometrów i odwiruj przy 300 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 12 mililitrach pożywki OP9. Dodaj osiem mililitrów pożywki OP9 do każdej z sześciu nowych naczyń do hodowli komórkowych i umieść dwa mililitry zawiesiny komórek OP9-delta-1 na każdej szalce.Kołysz naczyniem na boki i od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i powtórz pasaż, gdy komórki osiągną zbieg. Przygotuj zżelowane szalki OP9-Delta-1 na tydzień przed wspólną hodowlą z ludzkimi iPSC.Dodaj cztery mililitry 0,1% żelatyny do trzech nowych naczyń do hodowli komórkowych i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji odessać żelatynę i dodać osiem mililitrów pożywki OP9 do każdej potrawy. Przejść przez jedno zlejące się naczynie komórek OP9-Delta-1 do trzech naczyń pokrytych żelatyną.Po czterech dniach dodaj 10 mililitrów pożywki OP9 do każdej płytki komórek, co daje w sumie 20 mililitrów pożywki na miskę. Rozpocznij kohodowlę ludzkich iPSC na zlewających się naczyniach OP9-Delta-1 siedem do ośmiu dni po pasażowaniu komórek. Odessać pożywkę z konfluentnego naczynia z ludzkimi iPSC i dodać 10 mililitrów pożywki OP9.Wytnij i odłącz kolonie komórek za pomocą jednorazowego narzędzia do pasażowania komórek i przenieś od 350 do 600 grudek pociętych kolonii na wstępnie zżelowaną szalkę OP9-Delta-1 z 10 mililitrami świeżej pożywki OP9. Kołysz naczyniem hodowlanym na boki i od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie kolonii. Następnego dnia odessaj zużytą pożywkę i zastąp ją 20 mililitrami świeżej pożywki OP9.Ludzkie skupiska iPSC hodowane wspólnie na OP9-Delta-1 przez jeden dzień powinny wyglądać jak małe, okrągłe, jednowarstwowe kolonie. Piątego dnia odessaj 10 mililitrów zużytej pożywki i dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki OP9. Kolonie zaczną różnicować się w prymitywną mezodermę, która charakteryzuje się wielowarstwowym ciemnym środkiem.Powtórz ten proces w dziewiątym dniu, kiedy to wielowarstwowe struktury środkowe przekształcą się w kształty przypominające kopułę. Zbierz hematopoetyczne komórki progenitorowe w 13 dniu, w którym to momencie struktury składają się z ciemnego centralnego organoidu otoczonego siecią obszarów przypominających kopułę. Odessać pożywkę i przemyć komórki raz pięcioma mililitrami 1x fenolowego roztworu soli Hanksa z wapniem i magnezem lub HBSS.Po umyciu dodaj 250 mikrolitrów 5 000 jednostek na mililitr kolagenazy IV do 10 mililitrów HBSS. Dodaj mieszaninę do komórek i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Odessać mieszaninę HBSS i kolagenazy i umyć komórki raz pięcioma mililitrami PBS.Po umyciu PBS dodaj pięć mililitrów 0,25% trypsyny-EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki OP9 i zdysocjuj warstwę komórkową przez pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i odwiruj probówkę przy 300 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki OP9. Zawiesinę komórek umieścić na nowej, zżelatynizowanej 10-centymetrowej naczyniu do hodowli komórkowych i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Następnie należy zebrać wszystkie nieprzylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania.Przenieś zawiesinę komórkową do 50-mililitrowej stożkowej probówki przez sitko i odwiruj zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki różnicowej. Umieść zawiesinę komórek na nowej naczyniu zlewającej się OP9-Delta-1.Przejdź komórki w dniu 16 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie kontynuuj przechodzenie komórek nieprzylegających co pięć do siedmiu dni. Po 35 dniach różnicowania należy wzbogacić populację komórek CD4-dodatnich o izolację kulek magnetycznych CD4 zgodnie z protokołem producenta. Następnie ponownie zawieś komórki w pożywce OP9 i umieść jeden mililitr zawiesiny komórkowej w każdym dołku hodowli tkankowej, płaskodennej, 24-dołkowej płytki z konfluentem OP9-Delta-1.Stymuluj komórki, dodając 100 jednostek międzynarodowych ludzkiej IL-2, pięć nanogramów ludzkiej IL-7, 500 nanogramów przeciwciała anty-ludzkiego CD3 i dwa mikrogramy przeciwciała anty-ludzkiego CD28 do każdej studzienki. Po czterech do siedmiu dniach można pobrać komórki do dalszej analizy. Po hodowli na nieżelatynizowanym OP9-Delta-1 w obecności ludzkiego czynnika komórek macierzystych, ludzkiego liganda FLT3 i ludzkiej interleukiny-7, hematopoetyczne komórki progenitorowe różnicowały się w podwójnie dodatnie komórki linii T CD3, CD7, CD4 i CD8, z których większość wyrażała receptory limfocytów T specyficzne dla epitopu MART1.Gdy podwójnie dodatnie limfocyty T CD4, CD8 były stymulowane przeciwciałami anty-ludzkimi CD3 i CD28 w obecności ludzkiej interleukiny-7 i 2, liczba CD3-dodatnich komórek pojedynczych dodatnich CD8 alfa beta wzrosła i pozostała swoista dla epitopu MART1, potwierdzając zachowanie ich dziedzicznej swoistości antygenowej. Test ELISpot wykazał, że podczas hodowli w obecności peptydu MART1 ludzkie limfocyty T CD8 alfa beta pochodzące z iPSC wydzielają większe ilości interferonu gamma w porównaniu z pojedynczymi dodatnimi limfocytami T alfa alfa CD8 pochodzącymi z iPSC w porównaniu z pojedynczymi dodatnimi limfocytami T CD8 alfa alfa. Nie wykryto ekspresji interferonu gamma dla samych limfocytów T i komórek prezentujących antygen, co pokazuje, że ludzkie limfocyty T pochodzące z T-iPSC są specyficzne dla antygenu i funkcjonalne.Ważnym krokiem w tej metodzie jest wzbogacanie kulek magnetycznych CD4 w celu wyeliminowania podwójnie ujemnych komórek CD4-ujemnych, CD8-ujemnych, które mogą powodować bezpośrednie zabijanie komórek podwójnie dodatnich po stymulacji. Technika ta ma zastosowanie do stosowania z kilkoma źródłami komórek ludzkich, w tym hematopoetycznymi komórkami macierzystymi i embrionalnymi komórkami macierzystymi. Niedojrzałe limfocyty T pochodzące z iPSC generowane tą metodą mogą być dalej ulepszane w celu generowania dojrzałych, naiwnych limfocytów T specyficznych dla ludzkiego antygenu nowotworowego do przyszłego zastosowania terapeutycznego.Po obejrzeniu tego filmu widz powinien zrozumieć, jak generować ludzkie pojedyncze dodatnie limfocyty T CD8 alfa beta pochodzące z iPSC przy użyciu systemu kohodowli OP9-Delta-1.

using-human-induced-pluripotent-stem-cells-for-generation-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSCs) mają potencjał do leczenia wielu różnych chorób. Użyteczność tych komórek wynika z faktu, że mogą one różnicować się w każdy typ komórek w organizmie. W niniejszym materiale opisujemy test teratomiowy, który służy do wykazania pluripotencji hPSCs.

Generowanie potworniaków w torebce jądra

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

W niniejszym opracowaniu opisano generowanie i charakterystykę limfocytów T specyficznych dla nowotworu z wykorzystaniem myszy humanizowanych. Tkanka grasicy człowieka oraz genetycznie zmodyfikowane ludzkie komórki macierzyste krwi są przeszczepiane myszom z niedoborem odporności. Prowadzi to do rekonstrukcji zmodyfikowanego ludzkiego układu odpornościowego, co umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej in vivo.

Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

Ten film demonstruje test do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych CD8αβ+ pochodzących z indukowanych komórek macierzystych (iPSC) specyficznych dla antygenu nowotworowego. Specyficzne dla antygenu nowotworowego iPSC są hodowane na monowarstwie komórek zrębu i różnicowane w hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC). HPC są różnicowane w podwójnie dodatnie limfocyty T CD4 + CD8 + przy użyciu pożywki różnicowej. Komórki te są następnie stymulowane do generowania...

Generowanie pojedynczych dodatnich limfocytów T CD8 z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Celem tego protokołu jest pokazanie protokołu przeprogramowania limfocytów naciekających guzy czerniaka na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich limfocytów naciekających nowotwór czerniaka

Prezentujemy tutaj metodę rozwoju funkcjonalnych limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu (Ag) (Treg) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim.

Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Badania nad strategiami leczenia pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych są ważne dla klinicznego przełożenia terapii komórkami macierzystymi. W tym miejscu opisujemy protokół, aby najpierw wygenerować potworniaki pochodzące z komórek macierzystych u myszy, a następnie selektywnie celować i leczyć te nowotwory in vivo za pomocą napromieniacza dla małych zwierząt.

Celowane i selektywne leczenie pluripotencjalnych potworniaków pochodzących z komórek macierzystych z wykorzystaniem promieniowania wiązki zewnętrznej w modelu małego zwierzęcia

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Poznaj metodę generowania limfocytów T CD8αβ specyficznych dla antygenu nowotworowego z ludzkich iPSC przy użyciu systemu współkultury OP9/DLL1. Technika ta umożliwia badania w zakresie medycyny regeneracyjnej i terapii komórkowych.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Przeglądaj więcej filmów