Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Przedstawiamy metodę generowania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nowotworowych pochodzących z komórek macierzystych specyficznych dla pojedynczego dodatniego antygenu nowotworowego CD8 alfa beta przy użyciu systemu kohodowli OP9-Delta-1. Metoda ta jest potężnym narzędziem do generowania limfocytów T in vitro i ułatwi rozwój limfocytów T pochodzących z in vitro do zastosowania w medycynie regeneracyjnej i terapiach komórkowych. Może być również przystosowany do wytwarzania innych limfocytów, takich jak komórki NK.

Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby wstępnie ocenić partię komórek FBS i konsekwentnie pasować OP9-Delta-1, gdy kontakt cytoplazmatyczny między komórkami zaczyna zapobiegać różnicowaniu się komórek i starzeniu. Procedurę zademonstruje dr Meghan Good, specjalistka od chirurgii onkologicznej z mojego zespołu. Zacznij od sprawdzenia ludzkich kolonii iPSC w stereomikroskopie i usuń wszelkie obszary różnicowania z hodowli za pomocą plastikowej krawędzi końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Kiedy kolonie osiągną średnicę od 0,8 do 1,2 milimetra, przechodzą ludzkie iPSC. Odessać zużytą pożywkę i dodać 10 mililitrów ludzkiej pożywki iPSC uzupełnionej 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Przetoczyć jednorazowe narzędzie do pasowania komórek po całej naczyniu w jednym kierunku, upewniając się, że utrzymuje równomierny nacisk i że całe ostrze rolki dotyka naczynia hodowlanego.

Obróć naczynie hodowlane o 90 stopni i powtórz zwijanie. Wizualnie potwierdź prawidłowe cięcie kolonii za pomocą mikroskopu. Powinny wyglądać na w kratkę.

Następnie odłącz pocięte kolonie poprzez delikatne mechaniczne spłukiwanie pipetą o pojemności 200 mikrolitrów. Oszacuj wizualnie liczbę grudek kolonii i przenieś od 350 do 600 grudek do nowej 10-centymetrowej szalki z mysimi fibroblastami embrionalnymi z 10 mililitrami świeżej ludzkiej pożywki iPSC uzupełnionej inhibitorem ROCK. Inkubuj danie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia odessaj zużytą pożywkę i dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki iPSC dla ludzi. Zmieniaj pożywkę co jeden lub dwa dni, w zależności od tempa wzrostu komórek. Hoduj komórki OP9-Delta-1 w pożywce OP9 w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Kiedy osiągną zbieg, odessać pożywkę i umyć komórki raz pięcioma mililitrami 1x PBS bez czerwieni magnezu, wapnia i fenolu. Odessać PBS, dodać dwa mililitry 05% trypsyny-EDTA i inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki OP9 i mechanicznie zdysocjuj warstwę komórek przez pipetowanie.

Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki przez sitko do komórek o średnicy 100 mikrometrów i odwiruj przy 300 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 12 mililitrach pożywki OP9. Dodaj osiem mililitrów pożywki OP9 do każdej z sześciu nowych naczyń do hodowli komórkowych i umieść dwa mililitry zawiesiny komórek OP9-delta-1 na każdej szalce.

Kołysz naczyniem na boki i od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i powtórz pasaż, gdy komórki osiągną zbieg. Przygotuj zżelowane szalki OP9-Delta-1 na tydzień przed wspólną hodowlą z ludzkimi iPSC.

Dodaj cztery mililitry 0,1% żelatyny do trzech nowych naczyń do hodowli komórkowych i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji odessać żelatynę i dodać osiem mililitrów pożywki OP9 do każdej potrawy. Przejść przez jedno zlejące się naczynie komórek OP9-Delta-1 do trzech naczyń pokrytych żelatyną.

Po czterech dniach dodaj 10 mililitrów pożywki OP9 do każdej płytki komórek, co daje w sumie 20 mililitrów pożywki na miskę. Rozpocznij kohodowlę ludzkich iPSC na zlewających się naczyniach OP9-Delta-1 siedem do ośmiu dni po pasażowaniu komórek. Odessać pożywkę z konfluentnego naczynia z ludzkimi iPSC i dodać 10 mililitrów pożywki OP9.

Wytnij i odłącz kolonie komórek za pomocą jednorazowego narzędzia do pasażowania komórek i przenieś od 350 do 600 grudek pociętych kolonii na wstępnie zżelowaną szalkę OP9-Delta-1 z 10 mililitrami świeżej pożywki OP9. Kołysz naczyniem hodowlanym na boki i od przodu do tyłu, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie kolonii. Następnego dnia odessaj zużytą pożywkę i zastąp ją 20 mililitrami świeżej pożywki OP9.

Ludzkie skupiska iPSC hodowane wspólnie na OP9-Delta-1 przez jeden dzień powinny wyglądać jak małe, okrągłe, jednowarstwowe kolonie. Piątego dnia odessaj 10 mililitrów zużytej pożywki i dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki OP9. Kolonie zaczną różnicować się w prymitywną mezodermę, która charakteryzuje się wielowarstwowym ciemnym środkiem.

Powtórz ten proces w dziewiątym dniu, kiedy to wielowarstwowe struktury środkowe przekształcą się w kształty przypominające kopułę. Zbierz hematopoetyczne komórki progenitorowe w 13 dniu, w którym to momencie struktury składają się z ciemnego centralnego organoidu otoczonego siecią obszarów przypominających kopułę. Odessać pożywkę i przemyć komórki raz pięcioma mililitrami 1x fenolowego roztworu soli Hanksa z wapniem i magnezem lub HBSS.

Po umyciu dodaj 250 mikrolitrów 5 000 jednostek na mililitr kolagenazy IV do 10 mililitrów HBSS. Dodaj mieszaninę do komórek i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Odessać mieszaninę HBSS i kolagenazy i umyć komórki raz pięcioma mililitrami PBS.

Po umyciu PBS dodaj pięć mililitrów 0,25% trypsyny-EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie dodaj cztery mililitry pożywki OP9 i zdysocjuj warstwę komórkową przez pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Przenieś zawiesinę komórek do 50-mililitrowej stożkowej probówki przez sitko o średnicy 100 mikrometrów i odwiruj probówkę przy 300 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki OP9. Zawiesinę komórek umieścić na nowej, zżelatynizowanej 10-centymetrowej naczyniu do hodowli komórkowych i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut. Następnie należy zebrać wszystkie nieprzylegające komórki za pomocą delikatnego pipetowania.

Przenieś zawiesinę komórkową do 50-mililitrowej stożkowej probówki przez sitko i odwiruj zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki różnicowej. Umieść zawiesinę komórek na nowej naczyniu zlewającej się OP9-Delta-1.

Przejdź komórki w dniu 16 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie kontynuuj przechodzenie komórek nieprzylegających co pięć do siedmiu dni. Po 35 dniach różnicowania należy wzbogacić populację komórek CD4-dodatnich o izolację kulek magnetycznych CD4 zgodnie z protokołem producenta. Następnie ponownie zawieś komórki w pożywce OP9 i umieść jeden mililitr zawiesiny komórkowej w każdym dołku hodowli tkankowej, płaskodennej, 24-dołkowej płytki z konfluentem OP9-Delta-1.

Stymuluj komórki, dodając 100 jednostek międzynarodowych ludzkiej IL-2, pięć nanogramów ludzkiej IL-7, 500 nanogramów przeciwciała anty-ludzkiego CD3 i dwa mikrogramy przeciwciała anty-ludzkiego CD28 do każdej studzienki. Po czterech do siedmiu dniach można pobrać komórki do dalszej analizy. Po hodowli na nieżelatynizowanym OP9-Delta-1 w obecności ludzkiego czynnika komórek macierzystych, ludzkiego liganda FLT3 i ludzkiej interleukiny-7, hematopoetyczne komórki progenitorowe różnicowały się w podwójnie dodatnie komórki linii T CD3, CD7, CD4 i CD8, z których większość wyrażała receptory limfocytów T specyficzne dla epitopu MART1.

Gdy podwójnie dodatnie limfocyty T CD4, CD8 były stymulowane przeciwciałami anty-ludzkimi CD3 i CD28 w obecności ludzkiej interleukiny-7 i 2, liczba CD3-dodatnich komórek pojedynczych dodatnich CD8 alfa beta wzrosła i pozostała swoista dla epitopu MART1, potwierdzając zachowanie ich dziedzicznej swoistości antygenowej. Test ELISpot wykazał, że podczas hodowli w obecności peptydu MART1 ludzkie limfocyty T CD8 alfa beta pochodzące z iPSC wydzielają większe ilości interferonu gamma w porównaniu z pojedynczymi dodatnimi limfocytami T alfa alfa CD8 pochodzącymi z iPSC w porównaniu z pojedynczymi dodatnimi limfocytami T CD8 alfa alfa. Nie wykryto ekspresji interferonu gamma dla samych limfocytów T i komórek prezentujących antygen, co pokazuje, że ludzkie limfocyty T pochodzące z T-iPSC są specyficzne dla antygenu i funkcjonalne.

Ważnym krokiem w tej metodzie jest wzbogacanie kulek magnetycznych CD4 w celu wyeliminowania podwójnie ujemnych komórek CD4-ujemnych, CD8-ujemnych, które mogą powodować bezpośrednie zabijanie komórek podwójnie dodatnich po stymulacji. Technika ta ma zastosowanie do stosowania z kilkoma źródłami komórek ludzkich, w tym hematopoetycznymi komórkami macierzystymi i embrionalnymi komórkami macierzystymi. Niedojrzałe limfocyty T pochodzące z iPSC generowane tą metodą mogą być dalej ulepszane w celu generowania dojrzałych, naiwnych limfocytów T specyficznych dla ludzkiego antygenu nowotworowego do przyszłego zastosowania terapeutycznego.

Po obejrzeniu tego filmu widz powinien zrozumieć, jak generować ludzkie pojedyncze dodatnie limfocyty T CD8 alfa beta pochodzące z iPSC przy użyciu systemu kohodowli OP9-Delta-1.