Wywoływanie ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydów dotchawiczych

Wiarygodne modele zwierzęce są kluczowymi elementami badań podstawowych. Nasze mysie podejście pozwala odpowiedzieć na pytania immunologiczne dotyczące mechanistyki i kinetyki rozwoju ostrego uszkodzenia płuc u ssaków. Minimalna inwazyjność, prosta obsługa, a także dobra powtarzalność to główne zalety tej techniki.

Ponadto, dzięki miareczkowaniu dawki, możemy modulować efekt kliniczny. Technika ta odzwierciedla sytuację kliniczną pacjentów z ciężkim uszkodzeniem płuc i pozwala na zbadanie mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska. Przechowywać lipopolisacharyd lub LPS w podwielokrotnościach w stężeniu pięciu miligramów na mililitr w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Do wkraplania dotchawiczego rozcieńczyć rozmrożony LPS w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do końcowego stężenia 2 000 mikrogramów na mililitr. Wytnij cewnik żylny o rozmiarze 22 na długość 20 milimetrów. Umieść mysz w pozycji leżącej na stole o kontrolowanej temperaturze, aby utrzymać temperaturę ciała 37 stopni Celsjusza.

Po znieczuleniu zgodnie z opisem w protokole tekstowym nałóż sterylny lubrykant okulistyczny, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w znieczuleniu. Podnieś głowę i zaczep siekacze na poziomym drążku umieszczonym około pięciu centymetrów nad stołem, podczas gdy przednie łapy pozostają w bliskim kontakcie ze stołem. Super wyprostuj szyjkę pod kątem 90 stopni w stosunku do stołu.

Umieść zimne źródło światła na skórze nad krtanią, aby pomóc uwidocznić struny głosowe i celować w tchawicę. Przytrzymaj język kleszczami, aby wyprostować gardło i ułatwić warunki intubacji. Właściwa wizualizacja i identyfikacja krtani mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia prawidłowego umieszczenia cewnika w tchawicy tchawiczej.

Na tym etapie pomaga zewnętrzne źródło zimnego światła. Wprowadzić cewnik na około 10 milimetrów do tchawicy. Upewnij się, że wkłucie nie jest zbyt głębokie, ponieważ spowoduje to jednostronne wkroplenie płynu do prawego lub lewego oskrzela głównego.

Jeśli wystąpi opór krtani, cofnij cewnik o kilka milimetrów przed ponownym postępem. Teraz wstrzyknąć rozcieńczony LPS MPBS za pomocą pipety. Wstrzyknięta objętość zależy od masy ciała myszy.

Podłącz strzykawkę i dodaj bolus 50 mikrolitrów powietrza, aby upewnić się, że cała objętość płynu jest rozprowadzana w płucach. Powoli wyjmij cewnik. Utrzymuj górną część ciała myszy w pozycji pionowej przez 30 sekund, aby uniknąć wycieku płynu z tchawicy.

Przymocuj uśpioną mysz taśmą do stołu operacyjnego i krótko zdezynfekuj futro na brzuchu 70% etanolem. Ostrożnie otwórz jamę brzuszną w linii środkowej za pomocą nożyczek i pęsety. Usuń części jelita, aby uzyskać dostęp do żyły głównej dolnej prawej strony kręgosłupa w aorcie brzusznej.

Zlokalizuj żyły nerkowe i włóż wygiętą kaniulę o rozmiarze 23 połączonym ze strzykawką o pojemności jednego mililitra do żyły głównej dolnej, bezpośrednio poniżej zbiegu żył. Odessać 250 mikrolitrów krwi i przenieść do 1,5 mililitrowej probówki wypełnionej 20 mikrolitrami 0,5-molowego roztworu EDTA. Wstrząśnij delikatnie, aby ułatwić mieszanie EDTA i umieść probówkę na lodzie.

Do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego należy przygotować trzy jednomililitrowe strzykawki, każda zawierająca 0,5 mililitra sterylnego PBS i 0,1 mililitra powietrza. Zdezynfekuj sierść gardła 70% etanolem i ostrożnie odsłoń tchawicę nożyczkami i pęsetą. Zmobilizuj tchawicę i owiń wokół niej szew.

Nakłuć tchawicę za pomocą mikronożyczek i wprowadzić cewnik żylny o rozmiarze 22, przycięty na długość 20 milimetrów. Zamocuj cewnik za pomocą szwu i wkropl 0,5 mililitra sterylnego PBS i 0,1 mililitra powietrza. Zassać płyn po 60 sekundach.

Powtórz procedurę z dodatkowymi dwiema strzykawkami i zbierz cały aspirat do 15-mililitrowej probówki na lodzie. Ostrożnie otwórz klatkę piersiową nożyczkami i pęsetą, aby pobrać płuca. Przetnij przeponę wzdłuż brzegu żebrowego i przetnij żebra dwoma bocznymi nacięciami.

Ostrożnie unikaj przebijania płuc. Podnieś mostek czaszki i napraw go lub usuń. Przygotuj dwie 10-mililitrowe strzykawki z ciepłym PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wykonaj małe nacięcie w lewej komorze. Nakłuć prawą komorę kaniulą o rozmiarze 26. Następnie przepłucz krążenie płucne wstępnie podgrzanym PBS.

Należy pamiętać, że podczas zabiegu płuca bledną. Usuń prawy płat płuc i przekrój go na pół. Zamroź je w ciekłym azocie, a następnie długotrwałe przechowywanie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu dalszej ekspresji genów i analizy białek.

Usuń całe lewe płuco i homogenizuj je na 48-dołkowej płytce, rozdrabniając tkankę nożyczkami i pęsetą. Inkubować tkankę w dwóch mililitrach buforu do wytrawiania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Przeprowadzić dalszą homogenizację, ostrożnie pipetując kawałki tkanki płucnej w górę i w dół.

Przenieś próbki krwi do pięciomililitrowych probówek FACS i delikatnie wymieszaj krew z dwoma mililitrami buforu do lizy czerwonych krwinek. Umieść probówki na lodzie i zakończ reakcję po dwóch minutach, dodając dwa mililitry lodowatego PBS. Odwirować próbkę przez pięć minut w temperaturze 400 razy g i odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 60 mikrolitrów buforu FACS i poddać procesowi późniejsze barwienie FACS zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami. Wirować płyn BAL przez pięć minut w temperaturze 400 razy g. Odessać supernatant i zamrozić go w ciekłym azocie, a następnie długotrwałe przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu dalszej analizy białka.

Po ponownym zawieszeniu osadu komórek BAL za pomocą dwóch mililitrów zimnego buforu FACS, przenieś zawiesinę do pięciomililitrowej rurki FACS za pomocą filtra siatkowego o grubości 100 mikronów, aby powstrzymać włosy. Po ponownym odwirowaniu próbki, ponownie zawiesić osad z 60 mikrolitrami buforu FACS i poddać procesowi do późniejszego barwienia FACS zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami. Teraz przenieś strawioną lewą tkankę płucną do pięciomililitrowej probówki FACS za pomocą filtra siatkowego o wielkości 100 mikronów, aby usunąć grudki.

Zakończyć proces trawienia, dodając dwa mililitry lodowatego buforu FACS przed odwirowaniem próbki przez pięć minut w temperaturze 400 razy g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 60 mikrolitrów buforu FACS i przeprowadzić do dalszego barwienia FACS zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami. Do analizy FACS dodaj 20 mikrolitrów roztworu blokującego przeciwciała CD16 / CD32 do 60 mikrolitrów komórek w pięciomililitrowej probówce.

Inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie immunoglobuliny z receptorami Fc. W międzyczasie przygotuj mieszankę wzorcową z buforem FACS i przeciwciałami, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zablokowaniu nie myj komórek.

Dodać 20 mikrolitrów głównej mieszanki przeciwciał na próbkę, aby uzyskać końcową objętość 100 mikrolitrów. Inkubować próbki przez 20 minut, w ciemności, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyć każdą próbkę jednym mililitrem buforu FACS i odwirować jak poprzednio.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z buforem FACS do odpowiedniego stężenia ogniwa do pomiarów FACS. Na koniec dodaj stałą liczbę dostępnych na rynku kulek kalibracyjnych sprzężonych z fluorochromem do każdej próbki, aby określić bezwzględną liczbę komórek. Wykonaj cytometrię przepływową przy użyciu strategii bramkowania przedstawionej w protokole tekstowym dla komórek krwi, BAL i tkanek.

24 jak również 72 godziny po wkropleniu dotchawiczym, ekspresja TNF-alfa w tkance płucnej była znacznie podwyższona, osiągając trwały i ponad 50-krotny wzrost w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Inwazja leukocytów do tkanek i przestrzeni pęcherzykowej jest cechą charakterystyczną i charakterystyczną dla rozwoju ostrego uszkodzenia płuc. Analiza FACS wykazała znaczną infiltrację granulocytów neutrofilowych do śródmiąższu płuc, przy czym bezwzględna liczba komórek wzrosła prawie dziewięciokrotnie w porównaniu z grupą kontrolną po 24 godzinach.

Bezwzględna liczba granulocytów obojętnochłonnych nieznacznie zmniejszyła się po 72 godzinach, jednak wzrost czynnika w porównaniu z grupą kontrolną pozostał. Zgodnie z infiltracją granulocytów śródmiąższowych neutrofilów, ekspresja MMP-9 w całej tkance płucnej była również znacznie zwiększona w całym okresie obserwacji. Granulocyty neutrofilowe były zwiększone nie tylko w tkance płucnej, ale także w płynie BAL.

Wzrost fałdowania w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi był wyraźniejszy niż w tkance płucnej. Obrzęk płuc spowodowany ciężkim upośledzeniem bariery pęcherzykowo-włosowatej jest patognomoniczny dla rozwoju ostrego uszkodzenia płuc. Analiza zawartości białka w płynie BAL za pomocą testu ELISA wykazała znaczną utratę funkcji bariery po 24 godzinach i 72 godzinach od wkroplenia LPS.

Prawidłowe umieszczenie cewnika ma kluczowe znaczenie dla obustronnego wkraplania LPS. Często zmiany we wzorcach oddechowych, takie jak kaszel lub sapanie, wskazują na prawidłowe wkraplanie płynu do tchawicy. Po indukcji ostrego uszkodzenia płuc można wykonać szereg kolejnych etapów, takich jak analiza FACS, PCR, wykrywanie białek, aby odpowiedzieć na odpowiednie pytania badawcze.