Name: Wywoływanie ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydów dotchawiczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj metodę wywoływania ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez dotchawiczne wkroplenie lipopolisacharydów. Technika ta umożliwia analizę FACS próbek krwi, płynu oskrzelowo-pęcherzykowego i tkanki płucnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Janowi Kleinerowi i Susanne Schulz za udzielenie wsparcia technicznego. Autorzy doceniają doskonałe wsparcie ze strony głównego ośrodka cytometrii przepływowej na wydziale medycznym Uniwersytetu w Bonn. Autorzy nie otrzymali żadnego dofinansowania od żadnej organizacji zewnętrznej. Część danych podanych w sekcji wyników i przedstawionych w Rysunek 3 została już pokazana w poprzedniej publikacji8.

Ten protokół dla zwierząt został zatwierdzony przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami (LANUV, Recklinghausen, Niemcy; nr protokołu 84-02.04.2015) i został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi wykorzystania żywych zwierząt (publikacja NIH nr 85-23, poprawiona w 1996 roku).
1. Indukcja ALI
<ol>
	<li>Używaj dorosłych myszy C57BL/6 w wieku około 10-12 tygodni. Zwierzęta trzymane są w indywidualnie wentylowanych klatkach ze swobodnym dostępem do wody i standardową karmą dla gryzoni. Możliwe jest jednak zastosowanie tego podejścia na młodszych zwierzętach i innych szczepach myszy.</li>
	<li>Przechowywać LPS (Escherichia coli O111:B4) w podwielokrotnościach w stężeniach 5 mg/ml w temperaturze -20 °C. W przypadku wkraplania dotchawiczego należy rozcieńczyć LPS w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 2 000 μg/ml.</li>
	<li>Zważ mysz. Wstrzyknąć ketaminę [120 mg/kg masy ciała myszy (BW)] i ksylazynę (16 mg/kg m.c.) dootrzewnowo (dolna jedna trzecia brzucha, przyśrodkowa) i poczekać do początku znieczulenia.</li>
	<li>Sprawdź głębokość znieczulenia, wywołując bodziec dotykowy. W przypadku niedostatecznego znieczulenia należy powtórzyć wstrzyknięcie z ketaminą (30 mg/kg m.c.) i ksylazyną (4 mg/kg m.c.).</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na stole o kontrolowanej temperaturze, aby utrzymać temperaturę ciała 37 °C.</li>
	<li>Zastosuj sterylny lubrykant okulistyczny, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w znieczuleniu.</li>
	<li>Podnieś głowę i zaczep siekacze o poziomą belkę umieszczoną około 5 cm nad stołem, podczas gdy przednie łapy pozostają w bliskim kontakcie ze stołem. Mocno wysuń szyjkę pod kątem 90° w stosunku do stołu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Przytrzymaj język kleszczami, aby wyprostować gardło i ułatwić warunki intubacji.</li>
	<li>Wyciąć cewnik żylny 22G (G) na długość 20 mm. Delikatnie wprowadzić cewnik w kierunku pionowym wzdłuż nasady języka. Umieść źródło zimnego światła na skórze nad krtanią, aby pomóc uwidocznić struny głosowe i skierować się w stronę tchawicy. Jeśli wystąpi opór krtani, cofnij cewnik o kilka milimetrów przed ponownym postępem.</li>
	<li>Wprowadzić cewnik na około 10 mm do tchawicy. Upewnij się, że wkłucie nie jest zbyt głębokie, ponieważ spowoduje to jednostronne wkroplenie płynu do prawego lub lewego oskrzela głównego.</li>
	<li>Wstrzyknąć LPS (5 μg/g masy ciała) rozcieńczony w PBS za pomocą pipety [objętość wstrzykniętej dawki zależy od masy ciała myszy (np. 20 g masy ciała → użyć 50 μl roztworu LPS). 
	UWAGA: Mysz zazwyczaj reaguje kaszlem lub sapaniem na prawidłowe wkroplenie płynu do tchawicy.</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę i dodać bolus 50 μl powietrza, aby upewnić się, że cała objętość płynu została rozprowadzona w płucach. Powoli wyjmij cewnik.</li>
	<li>Utrzymuj górną część ciała myszy w pozycji pionowej przez 30 sekund, aby uniknąć wycieku płynu z tchawicy.</li>
	<li>U zwierząt operowanych pozorowo należy wstrzyknąć dotchwiactwo 50 μl sterylnego PBS zamiast LPS.</li>
	<li>Chlorowodorek buprenorfiny w dawce 0,08 mg/kg mc. wstrzyknąć podskórnie w luźną skórę na szyi bezpośrednio po indukcji ALI, a następnie co 12 godzin przez pierwsze 48 godzin.</li>
	<li>Utrzymuj temperaturę ciała 37 °C do momentu odzyskania pełnej świadomości, trzymając mysz na podkładce rozgrzewającej.</li>
	<li>Przenieś mysz do indywidualnie wentylowanej klatki ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody. Regularnie monitoruj mysz. Obniżająca się temperatura ciała i depresja oddechowa wskazują na prawidłową indukcję ALI. </li>
</ol>
2. Pobieranie krwi, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, pobieranie narządów
UWAGA: Czas eutanazji zależy od poruszanego zagadnienia naukowego. Zwykle wykonuje się go 12-72 godziny po wkropleniu LPS3,4,9,10. Nasilenie ALI można określić klinicznie poprzez regularną obserwację temperatury ciała i objawów niewydolności oddechowej11.
<ol>
	<li>Wywołaj znieczulenie, umieszczając mysz w komorze zalanej izofluranem. Użyć 3% obj. izofluranu o przepływie tlenu 1 l/min. Zapewnij głęboką narkozę poprzez wywołanie bodźca dotykowego. W przypadku niedostatecznej głębokości znieczulenia należy zwiększyć stężenie izofluranu do 5% obj.</li>
	<li>Poświęć mysz w głębokim znieczuleniu przez zwichnięcie atlantyczno-potyliczne.</li>
	<li>Przymocuj mysz taśmą do stołu operacyjnego i krótko zdezynfekuj sierść na brzuchu 70% etanolem. Ostrożnie otwórz jamę brzuszną w linii środkowej za pomocą nożyczek i pęsety. Usuń części jelita, aby uzyskać dostęp do żyły głównej dolnej (IVC) bezpośrednio do kręgosłupa i aorty brzusznej.</li>
	<li>Zlokalizuj żyły nerkowe i włóż wygiętą kaniulę 23 G połączoną ze strzykawką o pojemności 1 ml do IVC bezpośrednio pod zbiegiem żył. Odessać 250 μl krwi i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 20 μl 0,5 M roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Wstrząśnij delikatnie, aby ułatwić mieszanie EDTA i umieść probówkę na lodzie.</li>
	<li>W przypadku płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) należy przygotować trzy strzykawki o pojemności 1 ml z 0,5 ml jałowego PBS i 0,1 ml powietrza każda. Krótko zdezynfekuj sierść gardła 70% etanolem i ostrożnie odsłoń tchawicę nożyczkami i pęsetą. Zmobilizuj tchawicę i owiń wokół szwu.</li>
	<li>Wykonaj BAL: Nakłuj tchawicę za pomocą mikronożyczek i wprowadź cewnik żylny 22 G przycięty na długość 20 mm. Zamocuj cewnik za pomocą szwu i wkropl 0,5 ml sterylnego PBS i 0,1 ml powietrza. Zassać płyn po 60 s. Powtórzyć procedurę z dodatkowymi dwiema strzykawkami i zebrać cały aspirat do probówki o pojemności 15 ml na lodzie.</li>
	<li>Ostrożnie otwórz klatkę piersiową nożyczkami i pęsetą, aby pobrać płuca. Przetnij przeponę wzdłuż brzegu żebrowego i przetnij żebra dwoma bocznymi nacięciami. Ostrożnie unikaj przebijania płuc. Podnieś mostek czaszki i napraw go lub usuń.</li>
	<li>Przygotować dwie strzykawki o pojemności 10 ml z ciepłym PBS o temperaturze 37 °C (bez wapnia i magnezu). Wykonaj małe nacięcie w lewej komorze. Nakłuć prawą komorę kaniulą 26 G i przepłukać krążenie płucne podgrzanym PBS. Należy pamiętać, że podczas zabiegu płuca bledną. </li>
	<li>Usuń prawy płat płuc i przetnij go na dwie połowy. Zamroź je w ciekłym azocie, a następnie długotrwale przechowuj w temperaturze -80 °C w celu dalszej ekspresji genów i analizy białek.</li>
	<li>Usuń całe lewe płuco i homogenizuj je na płytce 48-dołkowej, rozdrabniając tkankę nożyczkami i pęsetą. Inkubować tkankę w 2 ml buforu do wytrawiania [RPMI 1640 z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i 0,1% NaN3, kolagenazą I (1 mg/ml) i DNazą II (7 mg/ml)] w temperaturze 37 °C przez 60 min. Przeprowadzić dalszą homogenizację poprzez staranne pipetowanie fragmentów tkanki płucnej w górę i w dół.</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanek do analizy FACS
<ol>
	<li>Przygotuj świeży bufor FACS (Tabela 1): zawsze używaj PBS wolnego od wapnia i magnezu, aby zmniejszyć zależną od kationów adhezję komórkową i zapobiec zbrylaniu. Uzupełnij FCS (1%) w celu ochrony komórek przed apoptozą, zapobiegania niespecyficznemu barwieniu i zapobieganiu przywieraniu komórek do probówek FACS. Dołącz EDTA (0,5 mM), aby zapobiec adhezji komórek na bazie kationów podczas pracy z lepkimi i przylegającymi komórkami, takimi jak makrofagi. Dodaj azydek sodu (0,1%), ponieważ zapobiega on skażeniu bakteryjnemu i fotowybielaniu fluorochromów oraz blokuje wydalanie przeciwciał.</li>
	<li>Przenieść próbki krwi (krok 2.4) do probówek FACS o pojemności 5 ml i delikatnie wymieszać krew z 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Umieść probówki na lodzie i zakończ reakcję po 2 minutach, dodając 2 ml lodowatego PBS. Odwirować próbki przez 5 minut przy 400 x g i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 60 μl buforu FACS i poddać procesowi do późniejszego barwienia FACS zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami12. 
	UWAGA: Czas eutanazji myszy wpływa na liczbę leukocytów jako część ogólnoustrojowego stanu zapalnego. Dlatego na tym etapie zaleca się dostosowanie liczby komórek do 1 x 106 komórek/60 μl, aby uzyskać najlepsze wyniki barwienia do analizy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Odwirować płyn BAL (krok 2.6) przez 5 minut przy 400 x g. Odessać supernatant i zamrozić go w ciekłym azocie, a następnie długotrwale przechowywać w temperaturze -80 °C w celu dalszej analizy białka. Ponownie zawiesić osad komórek BAL z 2 ml zimnego buforu FACS, a następnie przenieść zawiesinę do probówki FACS o pojemności 5 ml za pomocą filtra siatkowego 100 μm w celu zatrzymania włosów.</li>
	<li>Ponownie odwirować próbkę przez 5 minut przy 400 x g. Zawiesić osad z 60 μl buforu FACS i poddać procesowi do późniejszego barwienia FACS zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami12. 
	UWAGA: Czas eutanazji myszy wpływa na liczbę leukocytów w BAL jako część stanu zapalnego. Dlatego na tym etapie zaleca się dostosowanie liczby komórek do 1 x 106 komórek/60 μl, aby uzyskać najlepsze wyniki barwienia do analizy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Przenieść strawioną tkankę lewego płuca (krok 2.10) do probówki FACS o pojemności 5 ml za pomocą filtra siatkowego o pojemności 100 μl w celu ekstrakcji grudek i zakończenia procesu trawienia poprzez dodanie 2 ml lodowatego buforu FACS. Odwirować próbkę przez 5 minut przy 400 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 60 μl buforu FACS i poddać procesowi do późniejszego barwienia FACS zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami12. 
	UWAGA: Czas eutanazji myszy wpływa na liczbę leukocytów w tkance płucnej jako część stanu zapalnego. Dlatego zaleca się dostosowanie liczby komórek do 1 x 106 komórek/60 μl, aby uzyskać najlepsze wyniki barwienia do analizy cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Do analizy FACS należy inkubować komórki z przeciwciałem CD16/CD32 w temperaturze 4 °C przez 15 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie immunoglobuliny z receptorami Fc. Dodaj 20 μl roztworu blokującego do 1 x 106 komórek w 60 μl w probówce o pojemności 5 ml.</li>
	<li>W międzyczasie należy przygotować mieszaninę wzorcową z buforem FACS i przeciwciałami, jak opisano w Tabeli 2.</li>
	<li>Po zablokowaniu nie myj komórek. Dodać 20 μl głównej mieszanki przeciwciał na próbkę, aby uzyskać końcową objętość 100 μl. Inkubować próbki przez 20 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć każdą próbkę 1 ml buforu FACS i odwirować przez 5 minut przy 400 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z buforem FACS do odpowiedniego stężenia ogniwa do pomiarów FACS. 
	UWAGA: Sugeruje się, aby liczba komórek 1 x 106 komórek/500 μl osiągnęła najlepsze wyniki fenotypowania immunologicznego w analizie FACS za pomocą tego protokołu. Zaleca się jednak, aby przeciwciała były miareczkowane indywidualnie.</li>
	<li>W razie potrzeby dodaj barwienie żywe/martwe przed barwieniem powierzchni, korzystając z określonych dostępnych na rynku zestawów8.</li>
	<li>Na koniec dodaj stałą liczbę dostępnych na rynku kulek kalibracyjnych sprzężonych z fluorochromem (3 x 105 kulek w 20 μl buforu FACS) do każdej próbki, aby określić bezwzględną liczbę komórek12. Strategia bramkowania dla komórek krwi, BAL i tkanek jest pokazana w Rysunek 2.</li>
</ol>

<ol><li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li>
<li>Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2FTLR4+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li>
<li>Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (3), 379-399 (2008).</li>
<li>Rabelo, M. A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Lung+Injury+in+Response+to+Intratracheal+Instillation+of+Lipopolysaccharide+in+an+Animal+Model+of+Emphysema+Induced+by+Elastase%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation%22%5BJournal%5D)">Acute Lung Injury in Response to Intratracheal Instillation of Lipopolysaccharide in an Animal Model of Emphysema Induced by Elastase.</a> Inflammation. 41 (1), 174-182 (2018).</li>
<li>Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+acute+lung+injury+in+rats%3A+comparative+assessment+of+intratracheal+instillation+and+aerosol+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation.</a> Toxicology. 304, 158-166 (2013).</li>
<li>Rittirsch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Lung+Injury+Induced+by+Lipopolysaccharide+Is+Independent+of+Complement+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide Is Independent of Complement Activation.</a> Journal of Immunology. 180 (11), Baltimore, Md. 7664-7672 (2008).</li>
<li>D'Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li>
<li>Ehrentraut, H., Weisheit, C., Scheck, M., Frede, S., Hilbert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+murine+acute+lung+injury+induces+increase+of+pulmonary+TIE2-expressing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Experimental murine acute lung injury induces increase of pulmonary TIE2-expressing macrophages.</a> Journal of Inflammation. 15, 12(2018).</li>
<li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li>
<li>Reutershan, J., Basit, A., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+recruitment+of+neutrophils+into+lung+and+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+LPS-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sequential recruitment of neutrophils into lung and bronchoalveolar lavage fluid in LPS-induced acute lung injury.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 289 (5), 807-815 (2005).</li>
<li>Hoegl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+multifactorial+nature+of+ARDS+-+approach+to+model+murine+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Capturing the multifactorial nature of ARDS - approach to model murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 6 (6), (2018).</li>
<li>Weisheit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6Clow+and+Not+Ly6Chigh+Macrophages+Accumulate+First+in+the+Heart+in+a+Model+of+Murine+Pressure-Overload%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Ly6Clow and Not Ly6Chigh Macrophages Accumulate First in the Heart in a Model of Murine Pressure-Overload.</a> PLoS ONE. 9 (11), (2014).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Neutrophils+to+Acute+Lung+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Contribution of Neutrophils to Acute Lung Injury.</a> Molecular Medicine. 17 (3-4), 293-307 (2011).</li>
<li>Müller-Redetzky, H. C., Suttorp, N., Witzenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+pulmonary+endothelial+barrier+function+in+acute+inflammation%3A+mechanisms+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamics of pulmonary endothelial barrier function in acute inflammation: mechanisms and therapeutic perspectives.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 657-673 (2014).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+apoptosis+in+lipopolysaccharide-induced+lung+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Archives+of+Allergy+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury in mice.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 117 (3), 202-208 (1998).</li>
<li>Doyen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+induced+by+inhaled+lipopolysaccharide+depends+on+particle+size+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inflammation induced by inhaled lipopolysaccharide depends on particle size in healthy volunteers.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 82 (5), 1371-1381 (2016).</li>
<li>Stephens, R. S., Johnston, L., Servinsky, L., Kim, B. S., Damarla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+kinase+inhibitor+imatinib+prevents+lung+injury+and+death+after+intravenous+LPS+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">The tyrosine kinase inhibitor imatinib prevents lung injury and death after intravenous LPS in mice.</a> Physiological Reports. 3 (11), (2015).</li>
<li>Yu, Y., Jing, L., Zhang, X., Gao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simvastatin+Attenuates+Acute+Lung+Injury+via+Regulating+CDC42-PAK4+and+Endothelial+Microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Simvastatin Attenuates Acute Lung Injury via Regulating CDC42-PAK4 and Endothelial Microparticles.</a> Shock. 47 (3), Augusta, Ga. 378-384 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Minimalna inwazyjność, prosta obsługa i dobra odtwarzalność to kluczowe cechy przedstawionego podejścia do indukcji ALI w modelu małego gryzonia. Zastosowanie LPS zamiast całych bakterii w modelach zwierzęcych ma zalety. Jest to stabilny i czysty związek, który może być przechowywany w postaci liofilizowanej do czasu użycia. Jest silnym stymulantem wrodzonej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem szlaku TLR4, a jego aktywność biologiczną można łatwo określić ilościowo, ułatwiając miareczkowanie ciężkości choroby z d...

Eksperymentalne modele zwierzęce są niezbędne w podstawowych badaniach immunologicznych. Podawanie całych bakterii lub składników mikrobiologicznych było często stosowane w małych modelach zwierzęcych w celu wywołania miejscowego lub ogólnoustrojowego stanu zapalnego1. Lipopolisacharyd (LPS lub endotoksyna bakteryjna) jest składnikiem ściany komórkowej i antygenem powierzchniowym bakterii Gram-ujemnych (np. Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp. lub Legionella spp.). Termostabilna i duża cząsteczka (masa cząsteczkowa 1-4 x 106 kDa) składa się z ugrupowania lipidowego (lipid A), regionu rdzenia (oligosacharydu) i polisacharydu O (lub antygenu O). Lipid A, ze swoimi hydrofobowymi łańcuchami kwasów tłuszczowych, zakotwicza cząsteczkę w błonie bakteryjnej i pośredniczy (po degradacji bakterii) w aktywności immunologicznej i toksyczności LPS. Po związaniu się z białkiem wiążącym LPS (LBP), kompleksy LPS:LBP zligują kompleks receptorów CD14/TLR4/MD2 zlokalizowany na powierzchni wielu typów komórek, wywołując silną reakcję prozapalną z translokacją jądrową NF-κB, a następnie regulację w górę ekspresji cytokin2.
Ostre uszkodzenie płuc (ALI) definiuje się jako ostrą hipoksemiczną niewydolność oddechową z obustronnym obrzękiem płuc przy braku niewydolności serca3. Podawanie LPS w drogach oddechowych jest powszechnym sposobem wywoływania zapalenia płuc i ALI4,5,6,7. Chociaż sterylna substancja nie nadaje się do badania interwencji farmakologicznych w chorobach zakaźnych, można odpowiedzieć z odpowiednią precyzją, aby odpowiedzieć na mechanistyczne pytania immunologiczne. Wkroplenie LPS do tchawicy indukuje silną reakcję zapalną z inwazją leukocytów, regulacją w górę cytokin prozapalnych i przerwaniem bariery pęcherzykowo-kapilarnej w ciągu kilku godzin do dni, w zależności od dawki LPS3,6,7.
Prezentowany protokół opisuje szczegółową procedurę krok po kroku do wywołania ALI u myszy poprzez dotchawiczą inkraplację LPS. Model został zweryfikowany poprzez ocenę ekspresji cytokin, inwazji granulocytów neutrofilowych i wycieku albuminy wewnątrzpęcherzykowej, jak opisano wcześniej8.

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 1 ml</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 10 ml</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD115 (c-fms) APC</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>17-1152-80</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (M1/70) - FITC</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td><td>11-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anty-CD45 (30-F11) - eF450</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>48-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (BM-8) - PE Cy7</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>25-4801-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Gr1 (RB6-8C5)</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone</td><td>552093</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td><td>45-5932-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (1A8) APC/Cy7</td><td>Bio Legend, San Diego, CA</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek buprenorfiny</td><td>Indivior UK Limited, Berkshire, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 myszy, samica, 10 - 12 tygodni</td><td>Charles River, Wilmongton, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kulki APC CaliBRITE (6&mikro; m)</td> <td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>340487</td><td></td></tr><tr><td>Canula 23 gauge 1''</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>Canula 26 gauge 1/2''</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>Sitko komórkowe 70 &micro; m</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza Typ I</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>1148089</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza II</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D8764&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (PBS), sterylna</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, sterylna</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>probówki FACS, 5 ml</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>551579</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter, Unterschlei&szlig; heim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy (LPS) z Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Green Kit</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td><td>L23101</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony szczur Anti-Mouse CD16/CD32 (mysz BD Fc Block&trade;), klon 2.4G2</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA, USA</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640, z L-glutaminą i wodorowęglanem sodu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do tkanek</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Niemcy</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>Probówki</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>30125150</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik dożylny, rozmiar 22</td><td>B.Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>4268091B</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna chlorowodorek</td><td>Serumwerk Bernburg, Bernburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wywoływanie ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydów dotchawiczych

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Podawanie lipopolisacharydu (LPS) drogą oddechową jest powszechnym sposobem badania zapalenia płuc i ostrego uszkodzenia płuc (ALI) na małych modelach zwierzęcych. Opisano różne podejścia, takie jak wdychanie LPS w aerozolu, a także wkraplanie do nosa lub dotchawicze. Przedstawiony protokół opisuje szczegółową procedurę krok po kroku indukcji ALI u myszy poprzez bezpośrednie wkroplenie LPS dotchawiczego i wykonanie analizy FACS próbek krwi, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) i tkanki płucnej. Po sedacji dootrzewnowej tchawica jest odsłaniana, a LPS jest podawany przez cewnik żylny 22 G. Silna i powtarzalna reakcja zapalna z inwazją leukocytów, zwiększeniem poziomu cytokin prozapalnych i przerwaniem bariery pęcherzykowo-kapilarnej jest indukowana w ciągu kilku godzin do kilku dni, w zależności od zastosowanej dawki LPS. Pobieranie próbek krwi, płyn BAL i pobieranie płuc, a także przetwarzanie do analizy FACS są szczegółowo opisane w protokole. Chociaż stosowanie sterylnego LPS nie jest odpowiednie do badania interwencji farmakologicznych w chorobach zakaźnych, opisane podejście oferuje minimalną inwazyjność, prostą obsługę i dobrą odtwarzalność odpowiedzi na mechanistyczne pytania immunologiczne. Ponadto zwiększenie dawki, jak również stosowanie alternatywnych preparatów LPS lub szczepów myszy, pozwala na modulację efektów klinicznych, które mogą wykazywać różne stopnie nasilenia ALI lub wczesny i późny początek objawów choroby.

Opisane podejście do indukowania ALI u myszy zostało zwalidowane poprzez ocenę ekspresji cytokin, nacieku granulocytów neutrofilnych oraz przerwania bariery pęcherzykowo-włośniczkowej 24 h i 72 h po podaniu LPS. Jako grupę kontrolną posłużyły zwierzęta wstrzyknięte PBS. Dostarczanie LPS drogą dokanałową wywołało silną prozapalną odpowiedź płucną. Ekspresja TNF-α w tkance płuc była znacząco podwyższona, osiągając trwały i ponad 50-krotny wzrost w porównaniu z zwierzętami kontrolnymi [RQ (TNF-α/18s); 24 h: 53,7 (SD = 1,6);...

Przedstawiona tutaj jest procedura krok po kroku do wywołania ostrego uszkodzenia płuc u myszy poprzez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydu dotchawiczego i przeprowadzenie analizy FACS próbek krwi, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i tkanki płucnej. Minimalna inwazyjność, prosta obsługa, dobra odtwarzalność i miareczkowanie ciężkości choroby to zalety tego podejścia.

Wywoływanie ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydów dotchawiczych

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Wiarygodne modele zwierzęce są kluczowymi elementami badań podstawowych. Nasze mysie podejście pozwala odpowiedzieć na pytania immunologiczne dotyczące mechanistyki i kinetyki rozwoju ostrego uszkodzenia płuc u ssaków. Minimalna inwazyjność, prosta obsługa, a także dobra powtarzalność to główne zalety tej techniki.Ponadto, dzięki miareczkowaniu dawki, możemy modulować efekt kliniczny. Technika ta odzwierciedla sytuację kliniczną pacjentów z ciężkim uszkodzeniem płuc i pozwala na zbadanie mechanizmów leżących u podstaw tego zjawiska. Przechowywać lipopolisacharyd lub LPS w podwielokrotnościach w stężeniu pięciu miligramów na mililitr w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Do wkraplania dotchawiczego rozcieńczyć rozmrożony LPS w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do końcowego stężenia 2 000 mikrogramów na mililitr. Wytnij cewnik żylny o rozmiarze 22 na długość 20 milimetrów. Umieść mysz w pozycji leżącej na stole o kontrolowanej temperaturze, aby utrzymać temperaturę ciała 37 stopni Celsjusza.Po znieczuleniu zgodnie z opisem w protokole tekstowym nałóż sterylny lubrykant okulistyczny, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w znieczuleniu. Podnieś głowę i zaczep siekacze na poziomym drążku umieszczonym około pięciu centymetrów nad stołem, podczas gdy przednie łapy pozostają w bliskim kontakcie ze stołem. Super wyprostuj szyjkę pod kątem 90 stopni w stosunku do stołu.Umieść zimne źródło światła na skórze nad krtanią, aby pomóc uwidocznić struny głosowe i celować w tchawicę. Przytrzymaj język kleszczami, aby wyprostować gardło i ułatwić warunki intubacji. Właściwa wizualizacja i identyfikacja krtani mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia prawidłowego umieszczenia cewnika w tchawicy tchawiczej.Na tym etapie pomaga zewnętrzne źródło zimnego światła. Wprowadzić cewnik na około 10 milimetrów do tchawicy. Upewnij się, że wkłucie nie jest zbyt głębokie, ponieważ spowoduje to jednostronne wkroplenie płynu do prawego lub lewego oskrzela głównego.Jeśli wystąpi opór krtani, cofnij cewnik o kilka milimetrów przed ponownym postępem. Teraz wstrzyknąć rozcieńczony LPS MPBS za pomocą pipety. Wstrzyknięta objętość zależy od masy ciała myszy.Podłącz strzykawkę i dodaj bolus 50 mikrolitrów powietrza, aby upewnić się, że cała objętość płynu jest rozprowadzana w płucach. Powoli wyjmij cewnik. Utrzymuj górną część ciała myszy w pozycji pionowej przez 30 sekund, aby uniknąć wycieku płynu z tchawicy.Przymocuj uśpioną mysz taśmą do stołu operacyjnego i krótko zdezynfekuj futro na brzuchu 70% etanolem. Ostrożnie otwórz jamę brzuszną w linii środkowej za pomocą nożyczek i pęsety. Usuń części jelita, aby uzyskać dostęp do żyły głównej dolnej prawej strony kręgosłupa w aorcie brzusznej.Zlokalizuj żyły nerkowe i włóż wygiętą kaniulę o rozmiarze 23 połączonym ze strzykawką o pojemności jednego mililitra do żyły głównej dolnej, bezpośrednio poniżej zbiegu żył. Odessać 250 mikrolitrów krwi i przenieść do 1,5 mililitrowej probówki wypełnionej 20 mikrolitrami 0,5-molowego roztworu EDTA. Wstrząśnij delikatnie, aby ułatwić mieszanie EDTA i umieść probówkę na lodzie.Do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego należy przygotować trzy jednomililitrowe strzykawki, każda zawierająca 0,5 mililitra sterylnego PBS i 0,1 mililitra powietrza. Zdezynfekuj sierść gardła 70% etanolem i ostrożnie odsłoń tchawicę nożyczkami i pęsetą. Zmobilizuj tchawicę i owiń wokół niej szew.Nakłuć tchawicę za pomocą mikronożyczek i wprowadzić cewnik żylny o rozmiarze 22, przycięty na długość 20 milimetrów. Zamocuj cewnik za pomocą szwu i wkropl 0,5 mililitra sterylnego PBS i 0,1 mililitra powietrza. Zassać płyn po 60 sekundach.Powtórz procedurę z dodatkowymi dwiema strzykawkami i zbierz cały aspirat do 15-mililitrowej probówki na lodzie. Ostrożnie otwórz klatkę piersiową nożyczkami i pęsetą, aby pobrać płuca. Przetnij przeponę wzdłuż brzegu żebrowego i przetnij żebra dwoma bocznymi nacięciami.Ostrożnie unikaj przebijania płuc. Podnieś mostek czaszki i napraw go lub usuń. Przygotuj dwie 10-mililitrowe strzykawki z ciepłym PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wykonaj małe nacięcie w lewej komorze. Nakłuć prawą komorę kaniulą o rozmiarze 26. Następnie przepłucz krążenie płucne wstępnie podgrzanym PBS.Należy pamiętać, że podczas zabiegu płuca bledną. Usuń prawy płat płuc i przekrój go na pół. Zamroź je w ciekłym azocie, a następnie długotrwałe przechowywanie w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu dalszej ekspresji genów i analizy białek.Usuń całe lewe płuco i homogenizuj je na 48-dołkowej płytce, rozdrabniając tkankę nożyczkami i pęsetą. Inkubować tkankę w dwóch mililitrach buforu do wytrawiania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Przeprowadzić dalszą homogenizację, ostrożnie pipetując kawałki tkanki płucnej w górę i w dół.Przenieś próbki krwi do pięciomililitrowych probówek FACS i delikatnie wymieszaj krew z dwoma mililitrami buforu do lizy czerwonych krwinek. Umieść probówki na lodzie i zakończ reakcję po dwóch minutach, dodając dwa mililitry lodowatego PBS. Odwirować próbkę przez pięć minut w temperaturze 400 razy g i odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 60 mikrolitrów buforu FACS i poddać procesowi późniejsze barwienie FACS zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami. Wirować płyn BAL przez pięć minut w temperaturze 400 razy g. Odessać supernatant i zamrozić go w ciekłym azocie, a następnie długotrwałe przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w celu dalszej analizy białka.Po ponownym zawieszeniu osadu komórek BAL za pomocą dwóch mililitrów zimnego buforu FACS, przenieś zawiesinę do pięciomililitrowej rurki FACS za pomocą filtra siatkowego o grubości 100 mikronów, aby powstrzymać włosy. Po ponownym odwirowaniu próbki, ponownie zawiesić osad z 60 mikrolitrami buforu FACS i poddać procesowi do późniejszego barwienia FACS zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami. Teraz przenieś strawioną lewą tkankę płucną do pięciomililitrowej probówki FACS za pomocą filtra siatkowego o wielkości 100 mikronów, aby usunąć grudki.Zakończyć proces trawienia, dodając dwa mililitry lodowatego buforu FACS przed odwirowaniem próbki przez pięć minut w temperaturze 400 razy g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad za pomocą 60 mikrolitrów buforu FACS i przeprowadzić do dalszego barwienia FACS zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami. Do analizy FACS dodaj 20 mikrolitrów roztworu blokującego przeciwciała CD16 / CD32 do 60 mikrolitrów komórek w pięciomililitrowej probówce.Inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie immunoglobuliny z receptorami Fc. W międzyczasie przygotuj mieszankę wzorcową z buforem FACS i przeciwciałami, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po zablokowaniu nie myj komórek.Dodać 20 mikrolitrów głównej mieszanki przeciwciał na próbkę, aby uzyskać końcową objętość 100 mikrolitrów. Inkubować próbki przez 20 minut, w ciemności, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyć każdą próbkę jednym mililitrem buforu FACS i odwirować jak poprzednio.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z buforem FACS do odpowiedniego stężenia ogniwa do pomiarów FACS. Na koniec dodaj stałą liczbę dostępnych na rynku kulek kalibracyjnych sprzężonych z fluorochromem do każdej próbki, aby określić bezwzględną liczbę komórek. Wykonaj cytometrię przepływową przy użyciu strategii bramkowania przedstawionej w protokole tekstowym dla komórek krwi, BAL i tkanek.24 jak również 72 godziny po wkropleniu dotchawiczym, ekspresja TNF-alfa w tkance płucnej była znacznie podwyższona, osiągając trwały i ponad 50-krotny wzrost w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi. Inwazja leukocytów do tkanek i przestrzeni pęcherzykowej jest cechą charakterystyczną i charakterystyczną dla rozwoju ostrego uszkodzenia płuc. Analiza FACS wykazała znaczną infiltrację granulocytów neutrofilowych do śródmiąższu płuc, przy czym bezwzględna liczba komórek wzrosła prawie dziewięciokrotnie w porównaniu z grupą kontrolną po 24 godzinach.Bezwzględna liczba granulocytów obojętnochłonnych nieznacznie zmniejszyła się po 72 godzinach, jednak wzrost czynnika w porównaniu z grupą kontrolną pozostał. Zgodnie z infiltracją granulocytów śródmiąższowych neutrofilów, ekspresja MMP-9 w całej tkance płucnej była również znacznie zwiększona w całym okresie obserwacji. Granulocyty neutrofilowe były zwiększone nie tylko w tkance płucnej, ale także w płynie BAL.Wzrost fałdowania w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi był wyraźniejszy niż w tkance płucnej. Obrzęk płuc spowodowany ciężkim upośledzeniem bariery pęcherzykowo-włosowatej jest patognomoniczny dla rozwoju ostrego uszkodzenia płuc. Analiza zawartości białka w płynie BAL za pomocą testu ELISA wykazała znaczną utratę funkcji bariery po 24 godzinach i 72 godzinach od wkroplenia LPS.Prawidłowe umieszczenie cewnika ma kluczowe znaczenie dla obustronnego wkraplania LPS. Często zmiany we wzorcach oddechowych, takie jak kaszel lub sapanie, wskazują na prawidłowe wkraplanie płynu do tchawicy. Po indukcji ostrego uszkodzenia płuc można wykonać szereg kolejnych etapów, takich jak analiza FACS, PCR, wykrywanie białek, aby odpowiedzieć na odpowiednie pytania badawcze.

inducing-acute-lung-injury-mice-direct-intratracheal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Instylacje wewnątrzkrtaniowe pozwalają na dostarczanie substancji bezpośrednio do płuc. Procedura ta umożliwia wprowadzenie instylatu do dystalnych obszarów płuc, dlatego jest często stosowana w badaniach nad pęcherzykami pęcherzykowymi. Przedstawiamy szczegółowy protokół dla zwierząt przeżywalnych dotyczący wykonywania instylacji wewnątrzkrtaniowych u myszy.

Bezpośrednia instylacja substancji rozpuszczonych do tchawicy myszy w celu podania do płuc

Mysi model uszkodzenia płuc indukowanego przez respirator jest ważnym narzędziem do badania ostrego uszkodzenia płuc in vivo. W niniejszej pracy przedstawiamy łatwy w zastosowaniu model in situ ostrego uszkodzenia płuc, w którym do wywołania ostrej niewydolności płuc wykorzystano mechaniczną wentylację wysokociśnieniową.

Wentylacja z kontrolowanym ciśnieniem w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc u myszy

Źródło: Radulovic, K. i in. Wstrzykiwanie lipopolisacharydu u myszy w celu naśladowania wejścia produktów pochodzących od mikroorganizmów po przełamaniu bariery jelitowej. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje krok po kroku procedurę wstrzykiwania lipopolisacharydu (LPS) myszom wewnątrzotrzewnowkowo, aby wywołać stany ogólnoustrojowe.

Iniekcja do otrzewnewki bakteryjnego lipopolisacharydu u myszy w celu badania ogólnoustrojowych odpowiedzi immunologicznych

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

Odpowiedź immunologiczna gospodarza na infekcję patogenem jest ściśle regulowanym procesem. Wykorzystując model ekspozycji płuc na lipopolisacharydy u myszy, możliwe jest przeprowadzenie oceny w wysokiej rozdzielczości złożonych mechanizmów związanych z patogenezą choroby.

Wykorzystanie dotchawczego podawania PAMP w jamie ustnej i gardłowej oraz płukania oskrzeli i pęcherzyków płucnych w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza u myszy

Opisujemy metodę wywoływania neutrofilowego zapalenia płuc poprzez prowokację do aerozolowanego lipopolisacharydu za pomocą nebulizacji, do modelowania ostrego uszkodzenia płuc. Ponadto opisano podstawowe techniki operacyjne izolacji płuc, intubacji tchawicy i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego.

Metoda wytwarzania neutrofilii płucnej przy użyciu lipopolisacharydu w aerozolu

Intubacja-intubacja dotchawicza (IMIT) jest doskonałą, nieinwazyjną metodą badania chorób układu oddechowego, jak również metodą wkraplania odczynników terapeutycznych bezpośrednio do płuc. Jest to szybka i wysoce powtarzalna metoda, która nadaje się do badań przedklinicznych.

Wkraplanie dotchawicze za pośrednictwem intubacji (IMIT): nieinwazyjny, specyficzny dla płuc system dostarczania

Selektywne wkraplanie kwasu dooskrzelowego do lewego płuca u myszy powoduje jednostronne i samoograniczające się ostre uszkodzenie płuc, które modeluje ludzki zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) wywołany aspiracją kwasu żołądkowego.

Model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc przez jednostronne wkroplenie kwasu dooskrzelowego

Myszy narażone na działanie ozonu i endotoksyn bakteryjnych wykazują rozległą śmierć komórek, w tym neutrofili. Zaobserwowaliśmy adaptacje komórkowe, takie jak zakłócenie blaszek cytoszkieletu, zwiększona ekspresja komórkowa podjednostki syntazy ATP kompleksu V β i angiostatyny w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym, supresja odpowiedzi immunologicznej płuc i opóźniona rekrutacja neutrofili.

Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

Tutaj proponujemy protokół dostarczania lipopolisacharydów dotchawiczych (LPS) poprzez nieinwazyjną intubację dotchawiczą ustno-gardłową. Metoda ta minimalizuje uraz związany z zabiegiem chirurgicznym u zwierzęcia i dokładnie dostarcza LPS do tchawicy, a następnie do płuc.

Nieinwazyjne wkraplanie lipopolisacharydu dotchawiczego u myszy

W tym badaniu wykazano, że nieinwazyjna technika instylacji tchawicy pozwala na rozwój ALI u szczurów za pomocą podstawowego laryngoskopu, aby zapewnić precyzyjne dostarczanie LPS do płuc. LPS jest wprowadzany za pomocą rurki tchawicowej za pomocą laryngoskopu. Skala uszkodzenia płuc jest oceniana w wielu punktach czasowych.

Nieinwazyjne podanie lipopolisacharydu przez endotchawicę w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc u gryzoni

Poznaj metodę wywoływania ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez dotchawiczne wkroplenie lipopolisacharydów. Technika ta umożliwia analizę FACS próbek krwi, płynu oskrzelowo-pęcherzykowego i tkanki płucnej.

Wywoływanie ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydów dotchawiczych

Przeglądaj więcej filmów