Name: Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Poznaj metodę optycznego oczyszczania tkanki nerki z immunoznakowaniem do trójwymiarowej analizy struktur. Technika umożliwia wizualizację i ilościowe określenie wielokomórkowych formacji w przezroczystych narządach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

T. S. jest wspierany przez granty z DFG Niemieckiej Fundacji Badawczej (332853055), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197) oraz Wydziału Medycznego RWTH Aachen (RWTH Returner Program). V. G. P. jest wspierany przez stypendia naukowe Deutsche Gesellschaft für Nephrologie, Fundacji Alexandra von Humboldta oraz Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii. D. H. E jest wspierany przez Fundację LeDucq. R. K. jest wspierany przez granty z DFG (KR-4073/3-1, SCHN1188/5-1, SFB/TRR57, SFB/TRR219), kraj związkowy Nadrenia Północna-Westfalia (MIWF-NRW) oraz Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych Uniwersytetu RWTH w Akwizgranie (O3-11).

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Zdrowia i Nauki w Oregonie, Portland, Oregon, USA, oraz odpowiednie władze lokalne w Akwizgranie, Niemcy.
1. Wsteczna perfuzja aorty brzusznej i fiksacja nerek myszy
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory tego samego dnia lub wieczorem wcześniej i przechowuj w lodówce na noc. Ciepłe roztwory do temperatury pokojowej (RT) przed użyciem.</li>
	<li>Przygotuj świeżą partię 3% paraformaldehydu (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Na jedną mysz potrzeba około 50-100 ml PFA.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 1 l 3% PFA: Zważ 30 g PFA i dodaj 800 ml wody destylowanej do dygestorium. Wymieszać i podgrzać do temperatury 50-60 °C. Nie podgrzewać powyżej 70 °C. 
		UWAGA: PFA jest toksyczny. Przygotuj PFA w dygestorium.</li>
		<li>Powoli dodawać kilka kropli 2N NaOH. Odczekaj kilka minut, aż PFA dostanie się do roztworu lub dodaj jeszcze kilka kropli. Niektóre małe kawałki się nie rozpuszczą.</li>
		<li>Usuń roztwór z ognia. Dodaj 50 ml 20x PBS. Schładzanie na lodzie do RT.</li>
		<li>Dostosuj pH do 7,3-7,4 za pomocą HCl. Dodaj wodę destylowaną do 1 l.</li>
		<li>Usuń wszelkie nierozpuszczone cząstki, filtrując 1x PBS i 3% PFA z filtrem 0,22 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 1,000 jednostek heparyny do 1 L 1x PBS. Przenieść 1x PBS zawierający heparynę i 3% PFA w 1x PBS do oddzielnych plastikowych strzykawek o pojemności 50 ml. 
	nuta: Jeśli to możliwe, do perfuzji nerek można użyć pompy o regulowanym ciśnieniu 80-100 mmHg lub ciśnieniu hydrostatycznym (metoda kroplowa, wysokość roztworów perfuzyjnych: 160-200 cm nad zwierzęciem).</li>
	<li>Podłączyć PBS, PFA i igłę motylkową 21 G do trójdrożnego kranu. Upewnij się, że w całym systemie nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Oznacz stożkową probówkę o pojemności 15 ml i wlej do niej 10 ml PFA.</li>
	<li>Głęboko znieczulij samca lub samicę myszy C57BL/6 w wieku 12-24 tygodni, używając 120 mg/kg ketaminy i 16 mg/kg ksylazyny. Przed przystąpieniem do zabiegu należy sprawdzić, czy zwierzę nie wykazuje całkowitego braku reakcji poprzez uszczypnięcie odruchów (np. odruch szczypania palców u stóp).</li>
	<li>Gdy zwierzę osiągnie chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia, umieść je na plecach pod mikroskopem preparacyjnym. Chirurgicznie otwórz jamę brzuszną z nacięciem brzucha w linii środkowej za pomocą nożyczek operacyjnych i odsłoń aortę brzuszną.</li>
	<li>Zacisnąć aortę brzuszną tuż nad rozgałęzieniem do tętnicy biodrowej za pomocą zakrzywionego hemostatu. Następnie zaciśnij aortę brzuszną tuż pod tętnicami nerkowymi za pomocą mikro serrefine. Wykonaj małe nacięcie (1 mm) na aorcie brzusznej między dwoma zaciskami za pomocą nożyczek vannas. Powoli wprowadzaj igłę motylkową do nacięcia i uważając, aby nie rozerwać aorty brzusznej.</li>
	<li>Podwiązać prawą tętnicę nerkową za pomocą jedwabnego szwu 5-0 i usunąć prawą nerkę do innej analizy, jeśli do perfuzji i zespolenia potrzebna jest tylko jedna nerka.</li>
	<li>Usunąć mikro ząbk, przeciąć żyłę wrotną nożyczkami vannas i natychmiast wykonać perfuzję z 50 ml PBS zawierającego heparynę, a następnie zamienić i wykonać perfuzję z 50 ml 3% PFA. 
	nuta: Wysokie ciśnienie perfuzji przez aortę brzuszną jest wymagane do otwarcia kanalików nerkowych w celu lepszej dyfuzji przeciwciał przez tkankę. Perfuzja przez serce może nie otwierać kanalików nerkowych.</li>
	<li>Ostrożnie pobrać perfundowaną nerkę i unikać nakłuwania lub ściskania tkanki.</li>
	<li>Wyjmij kapsułkę i pokrój nerkę na plastry koronalne o grubości 1 mm. Użyj macierzy fragmentatora (Tabela materiałów), aby ustandaryzować grubość warstwy. 
	nuta: Alternatywnie rozważ użycie wibratomu.</li>
	<li>Zanurz plastry nerki z przygotowanym PFA w oznakowanej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dozuj 10 ml PFA do innej oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przepłucz trójdrożny kran i igłę motylkową za pomocą PBS przed przejściem do następnej myszy.</li>
	<li>Przeprowadzić utrwalenie po utrwaleniu przez noc w RT chronionym przed światłem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek i barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Po utrwaleniu należy dwukrotnie przepłukać plaster nerki 1x buforem do płukania (tabela materiałów) przez 1 godzinę na poziomym bujaku w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wykonaj pobieranie antygenu. Podgrzać 300 ml 1x roztworu demaskującego antygen (Table materiałów) w zlewce o pojemności 500 ml do temperatury 92-98 °C. Umieścić plaster w kasecie do zatapiania przepuszczalnej dla podgrzanego buforu, mieszając przez 1 godzinę w temperaturze 92-98 °C. Zdjąć zlewkę z ognia i pozostawić do ostygnięcia do RT. 
	nuta: Niektórzy dostawcy testują swoje przeciwciała pod kątem zastosowania immunohistochemicznego i dołączają sugerowaną metodę pobierania antygenu do arkusza danych. Dlatego niektóre epitopy mogą wymagać bardziej podstawowego buforu (np. pH 9).</li>
	<li>Przenieś plasterek do 10 ml 1x buforu do płukania z 0,1% Triton X-100 i kołysz przez noc w temperaturze pokojowej. Umyj plastry 2x 10 ml świeżego 1x buforu do płukania przez 1 godzinę następnego dnia.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w 500 μl normalnego rozcieńczalnika do przeciwciał (tabela materiałów). Zacznij od stężenia 1:50-1:100. Delikatnie kołysać wycinek nerki w rozcieńczonym przeciwciałie pierwszorzędowym przez 4 dni w temperaturze 37 °C. 
	nuta: Ponieważ każde przeciwciało ma unikalne właściwości, temperatura podczas inkubacji przeciwciał i rozcieńczania przeciwciał muszą być zoptymalizowane dla poszczególnych sond. W przypadku kontroli opartych tylko na przeciwciałach wtórnych należy inkubować tkankę nerkową w rozcieńczalniku bez przeciwciała pierwszorzędowego. Zamiast komercyjnego rozcieńczalnika do przeciwciał można zastosować 1x PBS z 0,1% Triton X-100 i 0,01% azydkiem sodu.</li>
	<li>Umyj plaster nerki w 10 ml 1x buforu do płukania przez noc w temperaturze pokojowej z jedną zmianą buforu do przemywania po 8 godzinach.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (np. 1:100 dla przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z fluorem Alexa) w 500 μl normalnego rozcieńczalnika przeciwciał. Inkubować plastry nerki w rozcieńczonym przeciwciałie drugorzędowym przez 4 dni w temperaturze 37 °C. Począwszy od tego etapu, chroń plastry nerki przed światłem.</li>
	<li>Plastry nerki umyć w 10 ml 1x buforu do przemywania przez noc w temperaturze pokojowej z jedną zmianą buforu do przemywania po 8 godzinach.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie tkanek
<ol>
	<li>Przenieś plasterek nerki do 5 ml wysokiej jakości 100% etanolu (tabela materiałów) na 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem (z jedną zmianą na świeży etanol po 1 godzinie). Ten krok jest przeznaczony do odwodnienia tkanek. 
	nuta: Wysokiej jakości etanol jest wymagany, aby osiągnąć wysoką przezierność tkanek w następnym kroku. Metanol lub tetrahydrofuran są alternatywnymi odczynnikami odwadniającymi o wysokim potencjale delipidacji.</li>
	<li>Zanurz plasterek nerki w 2 ml ECi (tabela materiałów) z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej (z jedną zmianą na świeże ECi po 2 godzinach) na noc. 
	nuta: Temperatura zamarzania/topnienia ECi wynosi 6-8 °C. Dlatego nie przechowuj próbek w lodówce. Zanurz się w odpowiednio wentylowanym dygestorium i unikaj bezpośredniego kontaktu z ubraniem i skórą (ECi jest nietoksycznym związkiem zatwierdzonym przez Agencję ds. Żywności i Leków, ale ma silny zapach). Używaj zwykłych probówek Eppendorf lub szklanych naczyń (nie naczyń polistyrenowych).</li>
	<li>Przezierność tkanek można osiągnąć po zanurzeniu w ECi i gdy wycinki nerki są gotowe do obrazowania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie konfokalne i analiza obrazu
UWAGA: Do obrazowania można stosować inne techniki mikroskopowe, o ile roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła jest kompatybilny z soczewką obiektywu. W protokole tym wykorzystuje się odwrócony mikroskop konfokalny.
<ol>
	<li>Dodać 600-1,000 μL ECi do naczynia ze szklanym dnem (tabela materiałów). 
	nuta: Unikaj używania zwykłych naczyń do hodowli komórkowych, ponieważ ECi jest rozpuszczalnikiem organicznym, który rozpuszcza plastikowe naczynia. Podobnie ECi może atakować plastikowe części/pierścienie izolacyjne na soczewkach obiektywu. Zapoznaj się z odpowiednimi raportami, aby zapoznać się z przeglądem kompatybilnych naczyń do obrazowania30 i samodzielnie wykonanych komór drukowanych w 3D28.</li>
	<li>Przenieś półprzezroczysty plasterek nerki do naczynia. Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe na plastrze nerki, aby lekko docisnąć w kierunku szklanego dna. Uszczelnij naczynie folią parafinową (tabela materiałów), aby uniknąć wycieku ECi. 
	nuta: Całe narządy lub kilkumilimetrowe wycinki tkanek mogą wymagać obramowania (cement dentystyczny lub elastomer silikonowy; patrz Tabela materiałów) wokół tkanki w celu utworzenia puli ECi dla próbki.</li>
	<li>Umieść naczynie na platformie obrazowania mikroskopu.</li>
	<li>Weź kilka stosów z i wykonaj szycie. Zacznij od kroku Z o rozmiarze 5 μm. 
	nuta: Rozważ użycie obiektywów o dużej odległości roboczej (>5 mm) i dużej aperturze numerycznej (>0,9) do obrazowania bardzo grubych wycinków tkanek lub narządów. Po obrazowaniu przenieś tkankę z powrotem do etanolu i przechowuj w buforze do przemywania lub PBS z 0,02% azydkiem sodu.</li>
	<li>Przeanalizuj obraz za pomocą renderingu 3D za pomocą oprogramowania (Tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Zhai, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+reconstruction+of+the+mouse+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">3-D reconstruction of the mouse nephron.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).</li>
<li>Nyengaard, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereologic+methods+and+their+application+in+kidney+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Stereologic methods and their application in kidney research.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).</li>
<li>Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+podocyte+depletion%3A+theoretical+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations.</a> Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).</li>
<li>Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+can+see+clearly+now%3A+optical+clearing+and+kidney+morphometrics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).</li>
<li>Ariel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to tissue clearing.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Lee, E., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+Biological+Tissue+Clearing+and+Immunolabeling+Methods+for+Volume+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+3-D+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3-DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PloS One. 7 (3), e33916(2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C2%27-thiodiethanol%3A+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+denaturation+by+stronger+dispersion+interactions+with+proteins+than+water+implies+a+2-stage+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).</li>
<li>Wan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+seven+optical+clearing+methods+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain.</a> Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).</li>
<li>Puelles, V. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+3-D+Method+for+Counting+and+Sizing+Podocytes+in+Whole+Glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).</li>
<li>Puelles, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3-D+analysis+using+optical+tissue+clearing+documents+the+evolution+of+murine+rapidly+progressive+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+%28in+press%29%22%5BJournal%5D)">Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis.</a> Kidney International (in press). , (2019).</li>
<li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Clearing+in+the+Kidney+Reveals+Potassium-Mediated+Tubule+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling.</a> Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).</li>
<li>Masselink, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+applicability+of+a+streamlined+ethyl+cinnamate-based+clearing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure.</a> Development. 146 (3), (2019).</li>
<li>Clark, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representation+and+relative+abundance+of+cell-type+selective+markers+in+whole-kidney+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data.</a> Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5 (1), eaau8355(2019).</li>
<li>Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Intact-Tissue+Transcriptional+Analysis+at+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.</a> Cell. 164 (4), 792-804 (2016).</li>
<li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li>
<li>Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+3-D+immunostaining+and+optical+imaging+of+the+mouse+brain+demonstrated+in+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells.</a> PLoS ONE. 8 (8), e72039(2013).</li>
<li>Saritas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+CUL3-mediated+ubiquitination+causes+proximal+tubule+injury+and+kidney+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4596(2019).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Holliger, P., Hudson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antibody+fragments+and+the+rise+of+single+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered antibody fragments and the rise of single domains.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).</li>
<li>Bunka, D. H., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+come+of+age+-+at+last%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aptamers come of age - at last.</a> Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).</li>
<li>Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li>
<li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+%28SDS%29-based+tissue+clearing+%28FASTClear%29%3A+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+3-D+visualization+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li>
<li>Xu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+free-of-acrylamide+clearing+tissue+%28FACT%29-an+optimized+new+protocol+for+rapid%2C+high-resolution+imaging+of+3-D+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue.</a> Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+perfusion-based+CUBIC+protocol+for+the+efficient+whole-body+clearing+and+imaging+of+rat+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs.</a> Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Techniki optycznego oczyszczania spotkały się z dużym zainteresowaniem w zakresie wizualizacji 3D i kwantyfikacji mikroanatomii w różnych narządach. W tym przypadku metodę oczyszczania opartą na rozpuszczalniku (ECi) połączono z immunoznakowaniem w celu obrazowania 3D całych kanalików w wycinkach nerki. Ta metoda jest prosta, niedroga i szybka. Jednak na inne pytania badawcze można najlepiej odpowiedzieć za pomocą innych protokołów rozliczeniowych5. Należy również pamiętać, że metody oparte na roz...

Rosnące zainteresowanie badaniem całych organów lub dużych struktur wielokomórkowych doprowadziło do opracowania metod optycznego oczyszczania, które polegają na obrazowaniu przezroczystej tkanki w trzech wymiarach. Do niedawna najlepszymi metodami szacowania liczby komórek, długości lub objętości całych struktur była stereologia lub wyczerpujące cięcie szeregowe, które opiera się na systemowym pobieraniu próbek tkanek do późniejszej analizy w dwóch wymiarach1,2,3. Metody te są jednak czasochłonne i wymagają wysokiego poziomu szkolenia oraz wiedzy specjalistycznej4. Metody optycznego oczyszczania rozwiązują te problemy, równoważąc współczynnik załamania światła w całej próbce, aby tkanka stała się przezroczysta do obrazowania 3D5,6,7.
Opracowano kilka metod optycznego oczyszczania, które dzielą się na dwie główne kategorie: metody oparte na rozpuszczalniku i na bazie wody. Metody oparte na wodzie można dalej podzielić na proste zanurzenie8,9, hyperhydration10,11, oraz hydrogel embedding12,13. Metody oparte na rozpuszczalnikach odwadniają tkankę, usuwają lipidy i normalizują współczynnik załamania światła do wartości około 1,55. Ograniczeniami większości metod opartych na rozpuszczalnikach są: wygaszanie endogennej fluorescencji powszechnie stosowanych białek reporterowych, takich jak GFP, toksyczność rozpuszczalników, zdolność do rozpuszczania klejów stosowanych w niektórych komorach obrazowania lub soczewkach obiektywowych oraz kurczenie się tkanki podczas odwadniania14,15,16,17,18,19,20,21. Jednak metody oparte na rozpuszczalnikach są proste, efektywne czasowo i mogą działać w wielu różnych typach tkanek.
Metody oparte na wodzie polegają na zanurzeniu tkanki w roztworach wodnych, które mają współczynniki załamania światła w zakresie 1,38-1,528,11,12,22,23,24. Metody te zostały opracowane w celu zachowania endogennej fluorescencyjnej emisji białka reporterowego i zapobiegania skurczowi wywołanemu odwodnieniem, ale ograniczenia większości metod oczyszczania opartych na wodzie obejmują dłuższy czas trwania protokołu, ekspansję tkanek i modyfikację białek (tj. częściową denaturację białek przez mocznik w protokołach hiperhydratacji, takich jak ScaleA2)7,11,23,25. ScaleS zajęła się ekspansją tkanek poprzez połączenie mocznika z sorbitolem, który równoważy poprzez odwodnienie indukowaną mocznikiem ekspansję tkanek i zachował ultrastrukturę tkanki ocenianą za pomocą mikroskopii elektronowej10. Kurczenie się lub rozszerzanie tkanek wpływa na bezwzględne rozmiary struktur, odległości między obiektami lub gęstość komórek na objętość; W związku z tym pomiar zmian wielkości po oczyszczeniu tkanki może pomóc w interpretacji uzyskanych wyników7,26.
Ogólnie, protokół oczyszczania optycznego składa się z wielu etapów, w tym wstępnej obróbki, permeabilizacji, immunoznakowania (jeśli jest to wymagane), dopasowywania indeksu refrakcji i obrazowania za pomocą zaawansowanej mikroskopii świetlnej (np. mikroskopia fluorescencyjna dwufotonowa, konfokalna lub świetlna). Większość podejść do oczyszczania została opracowana w celu wizualizacji tkanki neuronalnej, a nowe badania potwierdziły ich zastosowanie w innych narządach5. Wykazano wcześniej, że to kompleksowe narzędzie umożliwia wiarygodną i wydajną analizę struktur nerek, w tym kłębuszków nerkowych27,28, nacieków immunologicznych28, vasculature28 i segmentów kanalików29, i jest to idealne podejście do lepszego zrozumienia funkcji kłębuszków nerkowych i przebudowy kanalików w zdrowiu i chorobie.
Podsumowując, tutaj jest metoda oparta na rozpuszczalniku, która łączy barwienie immunologiczne kanalików nerkowych; optyczne oczyszczanie z tanim, nietoksycznym i gotowym do użycia chemicznym cynamonianem etylu (ECi); oraz obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej, które pozwala na pełną wizualizację i kwantyfikację kanalików. Metoda ta jest prosta, łączy w sobie pobieranie antygenu z wycinków nerki z barwieniem dostępnych na rynku przeciwciał i nie wymaga specjalistycznego sprzętu, co sprawia, że jest dostępna dla większości laboratoriów.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; Filtr m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-112</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>21 G igła motylkowa</td><td>Braun</td><td>Venofix</td><td></td></tr><tr><td>3-drogowy</td><td>kran Fisher Scientific</td><td>K420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy 3D</td><td>Bitplane AG</td><td>IMARIS</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy 3D</td><td>Cellprofiler</td><td></td><td>darmowe oprogramowanie open-source</td></tr><tr><td>5-0 jedwabny szew</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>50 ml plastikowe strzykawki</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-57</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-BrdU</td><td>Roche</td><td>11296736001</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Dako</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>CD31-647</td><td>BioLegend</td><td>102516</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania antygenu na bazie cytrynianu</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywiony hemostat</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-14</td><td></td></tr><tr><td>Dako Wash Buffer</td><td>Agilent</td><td>S3006</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Motic</td><td>DSK-500</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do zatapiania</td><td>Carl Roth</td><td>E478.1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td></td><td></td>100983</tr><tr><td>Cynamonian etylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112372</td><td></td></tr><tr><td>Elastyczna folia/Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-AQP2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9882</td><td></td></tr><tr><td>Świnka morska anty-NKCC2</td><td>N</td><td>/A N/A</td><td>DOI: 10.1681/ASN.2012040404</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth</td><td>P074.1</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>401-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Agnthos</td><td>312-471-140</td><td></td></tr><tr><td>Pozioma kołyska</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>Antena do obrazowania</td><td>Ibidi</td><td>81218</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>MWI Zdrowie zwierząt</td><td>501090</td><td></td></tr><tr><td>Micro serrefine</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne</td><td>Merit</td><td>97-272</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-phoshoThr53-NCC</td><td>PhosphoSolutions</td><td>p1311-53</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer</td><td>silikonowy World Precision Instruments Kwik-Sil</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>Azydek</td> <td>soduSigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Krajalnica do tkanek</td><td>Zivic Instruments</td><td>HSRA001-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>AC215682500</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Vannas</td><td>Narzędzia do nauki o naprawie</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Lancer</td><td>Series 1000</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>MWI Zdrowie zwierząt</td><td>AnaSed Inj SA (Ksylazyna)</td><td></td></tr></tbody></table>

optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Optical Clearing and Imaging of Immunolabeled Kidney Tissue

Techniki optycznego oczyszczania sprawiają, że tkanka staje się przezroczysta, równoważąc współczynnik załamania światła w próbce dla kolejnego trójwymiarowego (3-D) obrazowania. Spotkały się one z dużym zainteresowaniem we wszystkich obszarach badawczych ze względu na potencjał do analizy mikroskopijnych struktur wielokomórkowych, które rozciągają się na makroskopowe odległości. Biorąc pod uwagę, że kanaliki nerkowe, naczynia krwionośne, nerwy i kłębuszki nerkowe rozciągają się w wielu kierunkach, które do tej pory były tylko częściowo uchwycone za pomocą tradycyjnych technik dwuwymiarowych, oczyszczanie tkanek otworzyło również wiele nowych obszarów badań nad nerkami. Lista metod clearingu optycznego szybko się powiększa, ale początkującym w tej dziedzinie wciąż trudno jest wybrać najlepszą metodę dla danego pytania badawczego. Podano tutaj prostą metodę, która łączy znakowanie przeciwciałami grubych plastrów nerki myszy; czyszczenie optyczne tanim, nietoksycznym i gotowym do użycia chemicznym cynamonianem etylu; i obrazowanie konfokalne. Protokół ten opisuje, w jaki sposób perfuzja nerek i zastosowanie etapu odzyskiwania antygenu w celu zwiększenia wiązania przeciwciał bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Jego zastosowanie przedstawiono w obrazowaniu różnych struktur wielokomórkowych w nerce oraz omówiono sposoby rozwiązywania problemów ze słabą penetracją przeciwciał do tkanki. Omawiamy również potencjalne trudności związane z obrazowaniem endogennych fluoroforów i pozyskiwaniem bardzo dużych próbek oraz sposobami ich przezwyciężenia. Ten prosty protokół zapewnia łatwe w konfiguracji i kompleksowe narzędzie do badania tkanek w trzech wymiarach.

Nerki są złożonymi organami składającymi się z 43 różnych typów komórek31. Większość z tych komórek tworzy duże struktury wielokomórkowe, takie jak kłębki nerkowe i kanaliki, a ich funkcja jest w dużym stopniu zależna od wzajemnych oddziaływań. Klasyczne techniki histologiczne 2-D częściowo obrazują te duże struktury i mogą pomijać zmiany ogniskowe w obrębie nienaruszonych struktur31. Dlatego analiza 3-D z wykorzystaniem technik klarowania optycznego pomaga zrozumieć, jak f...

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Optical clearing techniques render tissue transparent by equilibrating the refractive index throughout a sample for subsequent three-dimensional (3-D) ...

Rosnące zainteresowanie badaniem dużych, wielokomórkowych struktur doprowadziło do opracowania tej techniki oczyszczania optycznego, która pozwala na trójwymiarową wizualizację i kwantyfikację dużych struktur w przezroczystych narządach. Protokół ten zapewnia proste, tanie, łatwe w konfiguracji i kompleksowe narzędzie do badania tkanek w trzech wymiarach. Wielowarstwowy charakter choroby nie zawsze może być symulowany za pomocą tradycyjnych technik dwuwymiarowych.Trójwymiarowa analiza tkanki może pomóc w lepszym diagnozowaniu i monitorowaniu choroby. Ta metoda nie jest ograniczona do tkanki nerkowej i może być stosowana do każdej normalnej i chorej tkanki. Ten prosty protokół jest łatwy do naśladowania dla każdego naukowca z pewnym doświadczeniem w obchodzeniu się ze zwierzętami.Ważne jest, aby testować różne przeciwciała w przypadku słabego znakowania przeciwciał i przeprowadzać kontrole tylko z przeciwciałami drugorzędowymi. Zacznij od przygotowania heparyny zawierającej PBS i 3,0% paraformaldehydu w 1X PBS zgodnie ze wskazówkami manuskryptu i przeniesienia roztworów do oddzielnych plastikowych strzykawek o pojemności 50 ml. Paraformaldehyd jest toksyczny i powinien być przygotowany w dygestorium.Zbierz i obficie obficie nerkę zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Następnie wyjmij kapsułkę i pokrój nerkę na plastry koronalne o grubości jednego mm. Zanurz plastry nerki z przygotowanym roztworem paraformaldehydu w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.Po utrwaleniu przemyj wycinek nerki dwukrotnie buforem do płukania 1X przez godzinę na poziomym wahaczu, a następnie przystąp do pobierania antygenu. Podgrzej 300 ml roztworu demaskującego antygen 1X w zlewce o pojemności 500 ml. Następnie zamknij plasterek nerki w kasecie do zatapiania przepuszczalnej dla podgrzanego buforu i mieszaj go przez godzinę w temperaturze od 92 do 98 stopni Celsjusza.Ważne jest, aby utrzymać stabilną temperaturę w zakresie od 92 do 98 stopni Celsjusza na tym etapie pobierania antygenu. Następnie przenieś plasterek do 10 ml buforu do mycia 1X z 0,1%Triton X-100 i kołysz go przez noc. Następnego dnia umyj plasterek dwukrotnie 10 ml świeżego buforu do mycia 1X przez godzinę.Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w 500 mikrolitrach normalnego rozcieńczalnika do przeciwciał. Delikatnie kołysz wycinkiem nerki w rozcieńczonym przeciwciałie pierwszorzędowym przez cztery dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji przemyć plaster nerki w 10 ml 1X buforu do przemywania przez noc w temperaturze pokojowej, zmieniając bufor raz po ośmiu godzinach.Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w 500 mikrolitrach normalnego rozcieńczalnika przeciwciał i inkubować z plastrem nerki przez cztery dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Należy pamiętać, że od tego kroku naprzód plasterek nerki powinien być chroniony przed światłem. Po inkubacji z przeciwciałami drugorzędowymi umyj plasterek nerki w 10 ml buforu 1X do przemywania przez noc w temperaturze pokojowej.Aby odwodnić plasterek nerki, przenieś go do pięciu ml wysokiej jakości 100% etanolu i kołysz przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, odświeżając etanol po godzinie. Zanurz plasterek nerki w dwóch ml cynamonianu etylu i delikatnie rozdrabniaj przez noc. Gdy będziesz gotowy do zobrazowania tkanki, dodaj od 600 do 1000 mikrolitrów cynamonianu etylu do naczynia ze szklanym dnem i przenieś plasterek nerki do naczynia.Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe na plastrze nerki i uszczelnij naczynie folią parafinową. Umieść naczynie na platformie obrazowania mikroskopu i zobrazuj tkankę zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Protokół ten został wykorzystany do pomyślnego przeprowadzenia analizy 3D tkanki nerkowej oraz oceny funkcji i interakcji komórek.Metoda może powodować wygaszanie fluorescencyjnego reportera, ale inne silne białka fluorescencyjne mogą być odporne na wygaszanie sygnału. Obfitość aorty brzusznej może poprawić dyfuzję przeciwciał. W niektórych przypadkach słaba penetracja przeciwciał powoduje powierzchowny sygnał.Można to skorygować za pomocą wyższych stężeń lub uzupełnienia przeciwciał. Należy rozważyć podanie donaczyniowe, jeśli antygen będący przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji w unaczynieniu nerek. Jednak przeciwciała skierowane przeciwko białkom w błonie wierzchołkowej komórek nabłonka kanalików nie przekraczają bariery filtracji kłębuszkowej i powodują niespecyficzne sygnały.Tkanka może być znakowana przeciwciałami w celu wykrycia określonej populacji komórek lub wizualizacji całych segmentów kanalików. Co więcej, kolokalizację białek w 3D można osiągnąć poprzez połączenie wielu przeciwciał. Ważne jest, aby pamiętać, że znakowanie przeciwciał można poprawić dzięki dobrej obfitości nerek, zastosowaniu etapu pobierania antygenu i wysokiemu stężeniu przeciwciał.Niektóre silne białka reporterowe mogą być odporne na wygaszanie sygnału fluorescencyjnego zgodnie z tym protokołem. Aby to przetestować, pomiń etapy pobierania antygenu i znakowania przeciwciał. Technika ta szanuje trójwymiarowy charakter struktur i otwiera wiele nowych obszarów do badań.Eliminuje to wymagane założenia i zakłócenia związane z tradycyjną analizą dwuwymiarową.

optical-clearing-and-imaging-of-immunolabeled-kidney-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Źródło: Behera, R. K. i in. Metoda oparta na fluorescencji do badania regulacji genów bakteryjnych w tkankach zakażonych. J. Vis. Exp. (2019)Ten film pokazuje metodę przygotowania zakażonej tkanki nerki myszy, barwienia DNA oraz wykrywania ekspresji genów bakterii za pomocą dwóch fluorescencyjnych reporterów. Czerwony oznacza wszystkie bakterie, a zielony podkreśla komórki reagujące na infekcje.

Obrazowanie fluorescencyjne kolonizacji bakteryjnej w tkance nerek myszy

Ten film demonstruje test do barwienia mysich nerek metodą całościową przy użyciu metody oczyszczania tkanek zwanej CUBIC (clear, unstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis) i barwienia immunofluorescencyjnego. Nerka jest poddawana oczyszczaniu tkanek, w którym nerka jest odlipidowana, odbarwiana i traktowana roztworem dopasowującym współczynnik załamania światła, aby tkanka była przezroczysta dla optymalnego obrazowania trójwymiarowego. Tkanka jest barwiona...

Technika barwienia całego narządu do trójwymiarowego obrazowania nerki

ACT-PRESTO (technika aktywnej przejrzystości - efektywny i stabilny transfer makrocząsteczek do organów związany z ciśnieniem) umożliwia szybkie, skuteczne, ale niedrogie oczyszczanie tkanek i szybką penetrację przeciwciał do oczyszczonych tkanek poprzez pasywną dyfuzję lub dostarczanie wspomagane ciśnieniem. Za pomocą tej metody można oczyścić szeroki zakres tkanek, znakować immunologicznie wieloma przeciwciałami i obrazować objętość.

ACT-PRESTO: Biologiczne metody oczyszczania tkanek i znakowania immunologicznego w obrazowaniu objętościowym

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45+ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Opisujemy protokół laserowej mikrodysekcji podsegmentów ludzkiej nerki, w tym kłębuszka nerkowego, kanalika proksymalnego, grubej kończyny wstępującej, przewodu zbiorczego i śródmiąższu. RNA jest następnie izolowane z uzyskanych przedziałów i przeprowadza się sekwencjonowanie RNA w celu określenia zmian w sygnaturze transkryptomicznej w każdym podsegmencie.

Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Celem tego protokołu jest wyizolowanie nienaruszonych obszarów rozrusznika miednicy nerkowej myszy za pomocą sekcji wibratomowej. Skrawki te można następnie wykorzystać do obrazowania Ca2 + in situ w celu wyjaśnienia przejściowych właściwości Ca2 + komórek rozrusznika serca i innych komórek śródmiąższowych w warstwach wibratomu.

Izolowanie i obrazowanie żywych, nienaruszonych obszarów rozrusznika serca miednicy nerkowej myszy poprzez wycięcie wibratomem

Tutaj prezentujemy protokół adaptacji metody CLARITY tkanek mózgowych do całych siatkówek, aby poprawić jakość standardowego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych.

Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing

Identyfikacja typu komórki odpowiedzialnej za wydzielanie cytokin jest niezbędna do zrozumienia patobiologii choroby nerek. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego barwienia tkanki nerkowej pod kątem cytokin wytwarzanych przez komórki nabłonka nerki lub śródmiąższu przy użyciu brefeldyny A, inhibitora wydzielania i markerów specyficznych dla typu komórkowego.

Identyfikacja źródła wydzielanych białek w nerkach za pomocą wstrzyknięcia Brefeldin A

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Obecny protokół opisuje metodę oczyszczania tkanek i barwienie immunofluorescencyjne w całości do trójwymiarowego (3D) obrazowania nerek. Technika ta może zaoferować makroskopowe perspektywy w patologii nerek, prowadząc do nowych odkryć biologicznych.

Trójwymiarowe barwienie całej nerki za pomocą CUBIC

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

Poznaj metodę optycznego oczyszczania tkanki nerki z immunoznakowaniem do trójwymiarowej analizy struktur. Technika umożliwia wizualizację i ilościowe określenie wielokomórkowych formacji w przezroczystych narządach.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Przeglądaj więcej filmów