Litografia z użyciem skupionej wiązki jonów do wytrawiania nanoarchitektur w mikroelektrodach

Zastosowanie litografii skupionej wiązką jonów (FIB) pozwala naukowcom poprawić interakcję na powierzchni komórki poprzez projektowanie powierzchni materiałów, które mają zwiększoną biokompatybilność i integrację z tkanką natywną. Dzięki FIB cechy mogą być wytrawiane na różnych materiałach, takich jak krzem, metale i polimery. Można również stosować powierzchnie niepłaskie, a obróbkę końcową można wykonywać na poszczególnych urządzeniach.

Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może być stosowana w innych mikroskopach. Jednak różni producenci mikroskopów mają unikalne wersje oprogramowania do tworzenia wzorów, które muszą być zoptymalizowane dla każdego systemu. Procedurę zademonstruje pani Shreya Mahajan, doktorantka z mojego laboratorium.

Aby przygotować się do montażu, użyj kleszczyków próżniowych z drobną końcówką, aby ostrożnie podnieść czysty pasek sond silikonowych. Umieść je na czystym aluminiowym króćcu używanym do skaningowego mikroskopu elektronowego, obrazowania i trawienia FIB. Użyj wykałaczki, aby umieścić niewielką kroplę srebrnej farby na krawędzi silikonowego podłoża otaczającego sondę.

Zabezpiecz pasek, rozprowadzając srebrną farbę po bokach podłoża krzemowego otaczającego sondę. Poczekaj, aż srebrna farba całkowicie wyschnie przed umieszczeniem aluminiowego króćca w SEM FIB. Następnie kliknij przycisk Vent w zakładce Beam Control, aby odpowietrzyć komorę SEM FIB.

Naciśnij Shift F3, aby wykonać home stage. Potwierdź wybór, wybierając przycisk Home Stage w wyskakującym okienku. Po zakończeniu etapu domowego przesuń etap do współrzędnych X=70 milimetrów, Y=70 milimetrów, Z=0 milimetrów, T=0 stopni, R=0 stopni.

Po odpowietrzeniu komory załóż czyste rękawice nitrylowe i otwórz drzwi komory. Włóż aluminiowy króciec przytrzymujący sondy do górnej części stage adapter. Zabezpiecz aluminiowy króciec, dokręcając ustalającą z boku stage adapter.

Upewnij się, że wysokość jest odpowiednio wyregulowana. Do tego zadania użyj klucza imbusowego 1,5 milimetra. Ostrożnie odchyl ramię kamery nawigacyjnej, aż się zatrzyma.

Stolik mikroskopu automatycznie przesunie się do pozycji poniżej kamery. Obejrzyj obraz na żywo pokazany w trzeciej ćwiartce interfejsu użytkownika mikroskopu. Gdy poziom jasności automatycznie dostosuje się do odpowiedniego poziomu, uzyskaj obraz, naciskając przycisk w dół na wsporniku aparatu.

Trwa to około 10 sekund. Odchyl ramię kamery z powrotem do pozycji zamkniętej. Scena powróci do pierwotnej pozycji.

Ostrożnie zamknij drzwiczki komory mikroskopu. Obejrzyj obraz z kamery CCD w ćwiartce czwartej podczas zamykania drzwi. Upewnij się, że próbki i stolik znajdują się w bezpiecznej odległości od jakiegokolwiek krytycznego elementu w komorze mikroskopu.

Wybierz przycisk Pump with Sample Cleaning (Pompa z czyszczeniem próbki) w oprogramowaniu interfejsu użytkownika, aby uruchomić komorową pompę próżniową i wbudowaną myjkę plazmową. Odczekać około ośmiu minut, aż czas pompowania i cykl czyszczenia plazmowego komory mikroskopu zostaną zakończone. Gdy ikona w prawym dolnym rogu interfejsu użytkownika zmieni kolor na zielony, naciśnij przycisk Wake Up na karcie sterowania wiązką, który włącza wiązki elektronów i jonów.

Wybierz Kwadrant Pierwszy i ustaw sygnał wiązki na Wiązka elektronów. Następnie ustaw Ćwiartkę Drugą na Wiązka jonów. Teraz ustaw napięcie SEM na pięć kilowoltów, prąd wiązki SEM na 0,20 nanoampera, detektor SEM na ETD, a tryb detektora na elektrony wtórne.

Ustaw napięcie FIB na 30 kilowoltów, wiązkę FIB na 24 pikoampery, detektor FIB na detektor ICE, a tryb detektora na elektron wtórny. Kliknij dwukrotnie sondę krzemową na obrazie kamery nawigacyjnej, kwadrant trzeci, aby przesunąć stolik do przybliżonej lokalizacji sondy. Kliknij Ćwiartkę Pierwszą, aby wybrać ją jako aktywną ćwiartkę i naciśnij przycisk pauzy, aby rozpocząć skanowanie SEM.

Ustaw czas zatrzymania skanowania na 300 nanosekund i wyłącz Przeplot skanowania, Integrację linii i Uśrednianie klatek. Ustaw opcję Obrót skanowania na zero na karcie Beam Control (Sterowanie wiązką). Kliknij prawym przyciskiem myszy regulator 2D Beam Shift i wybierz zero.

Dostosuj powiększenie do wartości minimalnej, obracając pokrętło powiększenia w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara na panelu interfejsu użytkownika mikroskopu. Dostosuj jasność i kontrast obrazu za pomocą pokręteł na panelu interfejsu użytkownika lub ikony jasności automatycznego kontrastu na pasku narzędzi. Przesuń scenę, klikając dwukrotnie lewym przyciskiem myszy na obiekcie, aby go wyśrodkować.

Następnie przesuń żądaną sondę krzemową, która ma zostać wzorowana, do środka obrazu SEM. Zlokalizuj krawędź lub inny element, taki jak cząsteczka kurzu lub rysa. Zwiększ powiększenie do 2000x, obracając pokrętło powiększenia zgodnie z ruchem wskazówek zegara.

Dostosuj ostrość SEM, obracając pokrętła zgrubnego i precyzyjnego ustawiania ostrości na interfejsie użytkownika mikroskopu, aż obraz będzie ostry. Gdy obraz jest już ostry, wybierz przycisk Połącz próbkę Z z odległością roboczą na pasku narzędzi. Upewnij się, że operacja została zakończona, patrząc na współrzędną osi Z na karcie nawigacji.

Wartość powinna wynosić około 11 milimetrów. Wpisz 4,0 milimetra w pozycji osi Z i naciśnij przycisk Przejdź do za pomocą myszy. Przesuń stolik w X i Y, aby zlokalizować ramię sondy krzemowej.

Umieść go jak najbliżej środka SEM. Zmień nachylenie stołu montażowego na 52 stopnie, wpisując 52 we współrzędnej T i naciskając Enter. Obserwuj, czy ramię sondy wydaje się poruszać w górę lub w dół na obrazie.

Użyj suwaka Stage Z, aby przesunąć ramię sondy z powrotem do środka obrazu SEM. Dostosuj tylko pozycję Z. Nie przesuwaj osi X, Y, T ani R.

Uruchom wbudowaną funkcję XT Align znajdującą się w menu rozwijanym sceny. Użyj myszy, aby kliknąć dwa punkty równoległe do krawędzi sondy. Upewnij się, że poziomy przycisk radiowy jest zaznaczony w wyskakującym okienku i kliknij przycisk Zakończ.

Stolik obróci się, aby wyrównać sondę z osią X stolika. Dostosuj stolik w XY, używając myszy, aby ponownie umieścić dolne ramię sondy na środku obrazu SEM. Wybierz FIB w ćwiartce drugiej i upewnij się, że prąd wiązki nadal wynosi 24 pikoampery.

Ustaw powiększenie na 5000X, a czas przebywania na 100 nanosekund. Wpisz Control-F na klawiaturze, aby ustawić ostrość FIB na 13 milimetrów. Na karcie Beam Control kliknij prawym przyciskiem myszy regulator Stigmator 2D i wybierz zero.

Kliknij prawym przyciskiem myszy regulator Beam Shift 2D i wybierz zero. Ustaw obrót skanowania na zero stopni i kliknij przycisk jasności automatycznego kontrastu na pasku narzędzi. Poszukaj zdjęcia ramienia sondy w ćwiartce drugiej.

Użyj narzędzia migawki, aby uzyskać obraz w FIB. Upewnij się, że ramię sondy znajduje się w środku obrazu FIB. Jeśli nie, kliknij dwukrotnie ramię sondy, aby przesunąć je do środka.

Przesuń scenę w lewo, naciskając strzałki w lewo na klawiaturze około 10 do 15 razy. Zrób kolejną migawkę i obserwuj, czy strona sondy nadal znajduje się w środku FIB. Po powtórzeniu tych kroków, aż krawędź ramienia sondy zostanie idealnie wyrównana z osią X stolika, użyj FIB, aby przesunąć stolik z powrotem na dolne ramię sondy.

Zapisz pozycję sceny na liście pozycji, klikając przycisk Dodaj. Zmień prąd wiązki FIB na 2,5 nanoampera i upewnij się, że powiększenie FIB nadal wynosi 5000X. Uruchom funkcję automatycznego kontrastu jasności i ustaw czas przebywania FIB na 100 nanosekund.

Naciśnij przycisk pauzy, aby rozpocząć skanowanie. Dostosuj ostrość FIB i astygmatyzm tak szybko i precyzyjnie, jak to możliwe, za pomocą pokręteł zgrubnego i precyzyjnego ustawiania ostrości oraz pokręteł stygmatora X i Y na panelu interfejsu użytkownika. Naciśnij przycisk pauzy, aby zatrzymać skanowanie FIB.

W oprogramowaniu Nanobuilder otwórz plik do tworzenia wzorów sond krzemowych. Wybierz menu rozwijane Mikroskop i wybierz opcję Ustaw początek etapu. Wybierz menu rozwijane Mikroskop, a następnie wybierz opcję Kalibruj detektory.

W interfejsie użytkownika mikroskopu kliknij raz myszą Quad One, aby wybrać Quad One. Kliknij przycisk OK, aby rozpocząć kalibrację. Proces zajmie około pięciu minut.

Upewnij się, że detektory ETD i ICE zostały skalibrowane. W oprogramowaniu wybierz menu rozwijane Mikroskop i wybierz opcję Wykonaj, aby rozpocząć sekwencję tworzenia wzorów. Po zakończeniu tworzenia wzoru zamknij oprogramowanie.

Naciśnij Vent w interfejsie użytkownika mikroskopu zakładka Sterowanie wiązką, aby wyłączyć wiązki mikroskopu i rozpocząć cykl wentylacji. Podczas wentylacji komory przesuń stolik do odpowiednich współrzędnych. Po odpowietrzeniu komory załóż czyste rękawice nitrylowe i otwórz drzwi komory.

Poluzuj dociskową na adapterze króćca za pomocą klucza imbusowego 1.5 milimetra. Wyjmij z komory aluminiowy króciec zawierający wzorzystą sondę. Ostrożnie zamknij drzwiczki komory mikroskopu.

Obejrzyj obraz z kamery CCD w ćwiartce czwartej podczas zamykania drzwi. Upewnij się, że stage adapter znajduje się w bezpiecznej odległości od jakiegokolwiek krytycznego elementu w komorze mikroskopu. Pokazano tutaj obrazy SEM niefunkcjonalnych sond krzemowych z pojedynczym trzpieniem z nanoarchitekturami wytrawionymi FIB wzdłuż tylnej strony trzonka.

Ostateczne wymiary wytrawionej nanoarchitektury to równoległe linie o szerokości 200 nanometrów oddalone od siebie o 300 nanometrów i głębokości 200 nanometrów. Aby określić, w jaki sposób wytrawianie nanoarchitektur na powierzchni sondy wpływa na gęstość neuronów bezpośrednio wokół implantu, jądra neuronalne zostały wybarwione i określone ilościowo. Przeżycie neuronów jest przedstawiane jako procent obszaru tła od tych samych zwierząt w odległości 50 mikronów od miejsca implantacji.

Wokół sond o nanoarchitekturze w odległości od 100 do 150 mikronów od miejsca implantacji znajdowało się znacznie więcej neuronów w porównaniu z gładkimi implantami kontrolnymi po czterech tygodniach od implantacji. Nanoarchitektury wytrawiono również FIB wzdłuż tylnej strony funkcjonalnych mikroelektrod krzemowych z pojedynczym trzpieniem, a pomiary elektrofizjologiczne określono ilościowo w celu zbadania, w jaki sposób wytrawianie nanoarchitektur wpływa na wydajność elektrody. Wyniki elektrofizjologiczne wykazały zwiększony odsetek kanałów rejestrujących pojedyncze jednostki z mikroelektrod o nanoarchitekturze w porównaniu z gładkimi mikroelektrodami kontrolnymi.

Nie przeprowadzono analizy statystycznej mikroelektrody o nanoarchitekturze, ponieważ tylko jedna z nich została wszczepiona na potrzeby badania pilotażowego potwierdzającego słuszność koncepcji. Wytrawianie FIB pozwala naukowcom zbadać, w jaki sposób dodanie wskazówek topograficznych do urządzeń medycznych może poprawić odpowiedź komórkową i ostatecznie wydajność urządzenia. Zakres urządzeń medycznych, do których można zastosować te metody, jest nieograniczony, ponieważ FIB można wykonywać na różnych materiałach, geometriach powierzchni, a co najważniejsze, na już wyprodukowanych urządzeniach.