Kinetyczne badanie przesiewowe aktywności nukleazy za pomocą sond kwasów nukleinowych
1 listopada 2019
Zmieniona aktywność nukleazy jest związana z różnymi schorzeniami ludzkimi, co potwierdza jej potencjał jako biomarkera. Modułowa i łatwa do wdrożenia metodologia badań przesiewowych przedstawiona w tym artykule pozwala na wybór konkretnych sond kwasów nukleinowych do wykorzystania aktywności nukleazy jako biomarkera choroby.
Protokół ten stanowi potężną alternatywę dla badań przesiewowych aktywności nukleazy jako biomarkera choroby, z łatwą do wdrożenia metodologią nawet dla badaczy, którzy nie są tak wyspecjalizowani w sondach kwasów nukleinowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wyboru sond kwasów nukleinowych, które mogą identyfikować zarówno znane, jak i nieznane aktywności nukleazy, wykorzystując dynamiczną interakcję sonda-nukleaza. Inne zalety tej metodyki to jej elastyczność, wysoka powtarzalność i łatwość użycia.
Pokaz zostanie przeprowadzony przez Khadiję, studentkę studiów magisterskich, oraz Barisa, doktora habilitowanego z naszego laboratorium. Projektując bibliotekę oligonukleotydów, należy uwzględnić co najmniej jedną losową sekwencję DNA i jedną RNA zawierającą kombinację adeniny, guaniny, cytozyny i tiaminy lub uracylu. Aby przygotować sondy oligonukleotydowe, odkręć liofilizowane sondy oligonukleotydowe i rozcieńcz każdą sondę w buforze Tris-EDTA w stężeniu 500 pikomolarów na mikrolitr, aby zapobiec degradacji nukleazy.
W przypadku hodowli bakteryjnej na podłożu stałym, należy przetoczyć pojedynczą porowatą szklaną kulkę z magazynu kriogenicznego bezpośrednio na jedno naczynie hodowlane zawierające TSA uzupełnione zdefibrynowaną krwią owczą w celu usunięcia pojedynczych kolonii bakteryjnych. Następnie umieść talerz w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny. W przypadku hodowli bakteryjnej w płynnym podłożu przenieś pojedynczą kolonię z kultury ze stałego podłoża do 50 mililitrów TSB w celu inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny przy 200 obrotach na minutę.
Następnego dnia rozcieńczyć kulturę w stosunku jeden do 500 w świeżym TSB i inkubować bakterie przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę w inkubatorze z wytrząsaniem. Aby skonfigurować test aktywności nukleazy, najpierw podgrzej fluorometr do 37 stopni Celsjusza i ostrożnie dodaj 96 mikrolitrów sterylnego TSB lub supernatantu z płynnej pożywki Salmonelli lub E.Coli do jednej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki bez nukleaz na sondę. Dodaj cztery mikrolitry roztworu roboczego sondy do każdej probówki i za pomocą pipety dokładnie wymieszaj zawartość każdej probówki, aż do uzyskania jednorodnych roztworów, uważając, aby uniknąć pęcherzyków.
Następnie ostrożnie załaduj 95 mikrolitrów każdego roztworu blisko ścianki poszczególnych studzienek z czarnym dnem, nieobrobionej 96-dołkowej płytki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Po dodaniu wszystkich roztworów przykryj płytkę i sprawdź wzrokowo pokrywę pod kątem śladów pisaka lub kurzu, które mogą wprowadzać artefakty pomiaru. Aby skonfigurować oprogramowanie do pomiaru aktywności nukleazy, otwórz odpowiedni program do akwizycji.
Wybierz opcję Czytaj teraz w oknie Menedżer zadań, a następnie wybierz opcję Nowy, aby utworzyć protokół pomiaru kinetycznego. Kliknij Ustaw temperaturę, aby wybrać 37 stopni Celsjusza, a następnie potwierdź i zapisz ustawienia, klikając OK. Kliknij przycisk Start Kinetics (Uruchom kinetykę). W wyskakującym okienku wybierz dwie godziny w polu wprowadzania Czas pracy i dwie minuty w polu wprowadzania interwału, zanim klikniesz OK, aby potwierdzić i zapisać ustawienia.
Kliknij przycisk Przeczytaj. W wyskakującym oknie wybierz Intensywność fluorescencji jako metodę wykrywania, Punkt końcowy kinetyczny jako typ odczytu i filtry jako typ optyki. Następnie kliknij OK.In wyskakującym okienku, wybierz opcję Zielony z zestawu filtrów i kliknij OK.In oknie Procedura, wybierz opcję Użyj pokrywy i kliknij przycisk Zatwierdź.
Pojawi się wyskakujące okienko potwierdzające, że utworzony protokół jest ważny. W menu Protokół wybierz pozycję Procedura. W oknie Procedura zdefiniuj studzienki, które mają być mierzone, a następnie wprowadź nazwę eksperymentu w polu wprowadzania Nazwa pliku.
Następnie załaduj płytkę do czytnika płytek, uważając, aby płyta była we właściwej orientacji i kliknij przycisk Czytaj nowy, aby rozpocząć akwizycję. W celu analizy danych otwórz dane w odpowiednim oprogramowaniu do analizy i wybierz jeden z mierzonych dołków w oknie płyty pierwszej. Kliknij przycisk Wybierz studnie i uwzględnij wszystkie zmierzone studnie w oknie dialogowym Wybór studni przed kliknięciem przycisku OK. Następnie wybierz Dane w pierwszym oknie, aby wyświetlić wyniki w tabeli, a następnie kliknij przycisk Szybki eksport, aby wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego.
W arkuszu kalkulacyjnym oznacz kolumny danych odpowiednio dla każdej próbki i sondy, a następnie wykreśl względne jednostki fluorescencji w funkcji czasu, w którym dane mają wygenerować wykresy kinetyczne. W tym reprezentatywnym eksperymencie, po pierwszej rundzie badań przesiewowych, supernatanty z kultur Salmonelli zgłosili wyraźną preferencję dla sond RNA w stosunku do sond DNA. Opierając się na identyfikacji RNA jako preferowanego typu kwasu nukleinowego przez nukleazy Salmonella, zaprojektowano nową bibliotekę zawierającą tylko RNA, która ma być wykorzystana w drugiej rundzie badań przesiewowych.
W przeciwieństwie do tego, E.Coli w pożywce hodowlanej wykazywała bardzo ograniczoną zdolność do degradacji sond RNA. Po drugiej rundzie badań przesiewowych z użyciem chemicznie modyfikowanych nukleotydów mających na celu zwiększenie specyficzności sond RNA, 2'O-metylo pirymidyny i 2'O-metylo puryna RNA mogły zostać zidentyfikowane na podstawie ich modyfikacji chemicznych jako wykazujące najlepsze zachowanie kinetyczne w porównaniu odpowiednio z 2'fluoro pirymidyny i 2'fluoro puryny RNA. Wyniki te sugerują, że Salmonella ma ważną aktywność RNAzy z różnicowymi preferencjami chemicznymi substratów, które można wykorzystać do wyboru sond zdolnych do specyficznego rozpoznawania tej bakterii.
Procedura ta umożliwia wybór sond, które są w stanie zidentyfikować aktywność nukleazy związaną ze stanami chorobowymi, takimi jak rak lub infekcja bakteryjna, co pozwala na opracowanie nowych klinicznych narzędzi diagnostycznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół stanowi skuteczną alternatywę dla badania aktywności nukleaz jako biomarkerów chorób, wykorzystując łatwą w implementacji metodologię odpowiednią dla badaczy o różnym stopniu doświadczenia w pracy z sondami kwasów nukleinowych. Technika ta umożliwia wybór sond kwasów nukleinowych pozwalających na identyfikację zarówno znanych, jak i nieznanych aktywności nukleaz.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Odkrywanie biomarkerów
- Przesiewowe badanie aktywności nukleaz
- Technologia sond kwasów nukleinowych
Wstęp
- Zaburzona aktywność nukleaz jest powiązana z różnymi schorzeniami u ludzi.
- Aktywność nukleaz ma potencjał jako biomarker chorób.
- Metodologia została zaprojektowana tak, aby była modułowa i elastyczna.
- Kluczowymi zaletami są wysoka powtarzalność oraz łatwość użycia.
Cel badania
- Przedstawienie metodologii przesiewowej dla aktywności nukleazy.
- Ułatwienie identyfikacji sond kwasów nukleinowych.
- Zapewnienie przystępnego podejścia dla badaczy.
Zastosowane metody
- Projektowanie biblioteki oligonukleotydów z sekwencjami DNA i RNA.
- Przygotowywanie sond oligonukleotydowych w buforze Tris-EDTA.
- Wykorzystanie dynamicznej interakcji między sondami a nukleazami.
- Prezentacja protokołu przeprowadzona przez personel laboratoryjny.
Główne wyniki
- Metodologia ta umożliwia identyfikację różnych aktywności nukleazowych.
- Sondy mogą być dostosowane do konkretnych zastosowań.
- Wykazano elastyczność i powtarzalność wyników.
- Metoda jest dostępna dla badaczy o różnym poziomie doświadczenia.
Wnioski
- Przedstawiona metodologia stanowi znaczący postęp w badaniach przesiewowych biomarkerów.
- Oferuje ona praktyczne rozwiązanie dla badaczy w tej dziedzinie.
- Przyszłe zastosowania mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia mechanizmów chorobowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Aktywność nukleazy stanowi obiecujący biomarker dla takich stanów chorobowych jak infekcje bakteryjne i nowotwory, jednak liczba skutecznych metod przesiewowych pozostaje ograniczona. Niniejszy protokół umożliwia iteracyjny dobór sond kwasów nukleinowych w celu odróżnienia stanów patologicznych od zdrowych, co wspiera rozwój narzędzi diagnostycznych. Jego elastyczność, powtarzalność i łatwość zastosowania sprawiają, że jest to skalowalne podejście do walidacji celów w wczesnej fazie badań nad nowymi lekami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez identyfikację wzorców aktywności nukleaz powiązanych z mechanizmami chorobowymi.
- Wartość operacyjna: Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez funkcjonalną walidację celów nukleazowych z wykorzystaniem dynamicznych oddziaływań sonda-nukleaza.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację kandydatów na sondy o zwiększonej specyficzności wobec nukleaz związanych z chorobami.
Przesiew oraz opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analiz poprzez ustanowienie powtarzalnych odczytów aktywności nukleazy.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji testu poprzez kinetyczne pomiary fluorescencji w kontrolowanych warunkach buforowych.
- Wartość skalowalności: Umożliwienie przygotowania do screeningu i ponownego wykorzystania platformy dzięki modularnej konstrukcji biblioteki sond oraz iteracyjnej optymalizacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera badania nad układami istotnymi dla przebiegu chorób, łącząc aktywność nukleaz z warunkami patologicznymi, takimi jak infekcja *Salmonella*.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki spójnym wskaźnikom wydajności sond.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ilościowe określenie preferencji substratowych nukleaz w odniesieniu do chemicznie modyfikowanych nukleotydów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków — od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, umożliwiając testowanie hipotez oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe profilowanie nukleaz.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez pomiar aktywności nukleazy jako funkcjonalny odczyt zaangażowania celu w modelach chorobowych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość analizy dzięki powtarzalnym wykresom kinetycznym generowanym na podstawie względnych jednostek fluorescencji w czasie.
- Analityka: Dostarcza ilościowych pomiarów zmiennej zależnej (intensywności fluorescencji), umożliwiając porównanie wydajności sond w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez identyfikację kandydatów na sondy z właściwościami rozpoznawania nukleaz specyficznych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako możliwość wielokrotnego wykorzystania do iteracyjnej optymalizacji biblioteki sond w wielu rundach przesiewania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w oddziaływaniach nukleaza-substrat.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki określonym stężeniom sond oraz protokołom pomiarów kinetycznych.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki umożliwieniu wczesnego wyboru celu powiązanego z biomarkerami.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja i decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko, oparte na ilościowych profilach aktywności nukleaz.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie projektowania sond kwasów nukleinowych oraz fluorescencyjnych analiz kinetycznych.
- Metoda jest zależna od aparatury fluorometrycznej z kontrolą temperatury i oprogramowaniem do rejestracji kinetyki.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania sond i warunków buforowych pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wymagane jest uwzględnienie adaptacji przy zastosowaniu w różnych systemach modelowych lub dla różnych typów nukleaz.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność przeprowadzenia wielu rund przesiewowych w celu doprecyzowania specyficzności sond, co potwierdzają materiały źródłowe.
