Name: Kinetyczne badanie przesiewowe aktywności nukleazy za pomocą sond kwasów nukleinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj metodę przesiewowego badania aktywności nukleaz jako biomarkerów chorób z wykorzystaniem sond kwasów nukleinowych. Technika umożliwia identyfikację znanych i nieznanych aktywności enzymatycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Luizie I. Hernandez (Uniwersytet w Linköping) za staranną korektę manuskryptu i cenne rady. Prace te były wspierane przez Fundację Knuta i Alice Wallenbergów oraz Strategiczny Obszar Badań Materiałowych Rządu Szwecji nad Zaawansowanymi Materiałami Funkcjonalnymi na Uniwersytecie w Linköping (grant wydziałowy SFO-Mat-LiU nr 2009-00971).

1. Projektowanie i przygotowanie biblioteki oligonukleotydów
<ol>
	<li>Projektowanie biblioteki
	<ol>
		<li>Na podstawie następujących kryteriów zaprojektuj bibliotekę wygaszonych fluorescencyjnych sond oligonukleotydowych o długości od 8 do 12 merów, aby uniknąć tworzenia się struktur drugorzędowych, przy zachowaniu jednakowej długości dla wszystkich sond.
		<ol>
			<li>Uwzględnij co najmniej jedną losową sekwencję DNA i jedną losową sekwencję RNA zawierającą kombinację adeniny (A), guaniny (G), cytozyny (C) i tyminy (T)/uracylu (U) (sondy DNA i RNA w Tabeli 1). 
			UWAGA: Sekwencje DNA i RNA opisane w Tabeli 1 okazały się użyteczne jako początkowe substraty do klasyfikacji nieznanego typu aktywności nukleazy, albo DNazy lub RNazy. Te dwie sekwencje są zalecane jako punkt wyjścia dla każdego przesiewu, ponieważ wykazały szerokie możliwości wykrywania profili aktywności nukleaz w bakteriach i próbkach tkankowych. Jeśli w przypadku tych sekwencji DNA i RNA nie zaobserwowano aktywności nukleazy, konieczne jest zaprojektowanie dodatkowych oligonukleotydów.</li>
			<li>Uwzględnij sekwencje polinukleotydowe składające się z jednego rodzaju nukleotydu, aby określić zależność od sekwencji dla danej aktywności nukleazy (DNA-Poly A, DNA-Poly T, DNA-Poly C, DNA-Poly G, RNA-Poly A, RNA-Poly U, RNA-Poly C i RNA-Poly G w Tabeli 1).</li>
			<li>Wykorzystując tę samą sekwencję reszt nukleotydowych co w początkowych sekwencjach DNA i RNA, uwzględnij sekwencje zawierające analogi nukleozydów z modyfikacjami chemicznymi w pozycji 2' cukru rybozy, takimi jak 2'-Fluoro i 2'-O-Metylo, jako rygorystyczny etap zwiększania selektywności nukleaz.
			<ol>
				<li>Uwzględnij sekwencje w pełni zmodyfikowane, składające się wyłącznie z analogów nukleozydów 2'-Fluoro lub analogów nukleozydów 2'-O-Metylo (All 2'-F i All 2'-OMe, Tabela 1)</li>
				<li>Uwzględnij sekwencje chimeryczne składające się z niemodyfikowanych naturalnych puryn i analogów nukleozydów pyrymidyn 2'-Fluoro (RNA Pyr-2'F, Tabela 1).</li>
				<li>Uwzględnij sekwencje chimeryczne składające się z niemodyfikowanych naturalnych puryn i analogów nukleozydów pyrymidyn 2'-O-Metylo (RNA Pyr-2'OMe, Tabela 1).</li>
				<li>Uwzględnij sekwencje chimeryczne składające się z niemodyfikowanych naturalnych pyrymidyn i analogów nukleozydów puryn 2'-Fluoro (RNA Pur-2'F, Tabela 1).</li>
				<li>Uwzględnij sekwencje chimeryczne składające się z niemodyfikowanych naturalnych pyrymidyn i analogów nukleozydów puryn 2'-O-Metylo (RNA Pur-2'OMe, Tabela 1).</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i przechowywanie sond oligonukleotydowych 
	UWAGA: Oligonukleotydy są syntetyzowane metodą fosforamidytową. Po syntezie oligonukleotydy są oczyszczane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), a ich masa jest mierzona metodą spektrometrii mas.
	<ol>
		<li>Wirowarką odwirować liofilizowane sondy oligonukleotydowe i rozpuścić je w buforze Tris-EDTA (TE), aby zapobiec degradacji przez nukleazy. Obliczyć objętość rozcieńczania zgodnie z wydajnością każdej sondy, aby otrzymać roztwór zapasowy o stężeniu 50 pmol/μL.</li>
		<li>Liofilizowane oligonukleotydy przechowywać w temperaturze 4 °C lub temperaturze pokojowej przez krótki czas. W przypadku długoterminowego przechowywania (od miesięcy do lat) liofilizowane oligonukleotydy przechowywać w temperaturze -20 °C. Po resuspensji liofilizowanych oligonukleotydów w buforze TE, roztwory zapasowe przechowywać w temperaturze -20 °C lub, preferencyjnie, w -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla bakteryjna
<ol>
	<li>W warunkach sterylnych wyjmij jedną porowatą szklaną kulkę z kriostaliki.</li>
	<li>W celu izolacji pojedynczych kolonii bakteryjnych (Salmonella i E. coli) zastosuj metodę pasmową (metoda kwadrantów)24, przecierając/przetaczając kulkę bezpośrednio po szalce Petri zawierającej podłoże Tryptic Soy Agar (TSA) uzupełnione o defibrynowaną krew owczą.</li>
	<li>Inkubuj kulturę w temperaturze 37 °C przez 24 h.</li>
</ol>
3. Przygotowanie supernatantu
<ol>
	<li>Przenieś pojedynczą kolonię z podłoża stałego do 50 mL bulionu sojowo-kazeinowego (TSB) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24 h przy 20 rpm.</li>
	<li>Rozcieńcz kulturę (1:50) w TSB (podkultura) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24 h przy 20 rpm w inkubatorze z wytrząsaniem. 
	UWAGA: Przewiduje się, że po 24 h inkubacji kultury bakteryjne znajdą się w fazie stacjonarnej, osiągając wartości wyższe niż 109 CFU/mL.</li>
	<li>Po okresie inkubacji przenieś kultury do zakręcanych sterylnych probówek i odwiruj przy 4 50 x g przez 30 min.</li>
	<li>Zabierz nadsącz i użyj go niezwłocznie. Alternatywnie nadsącze można przechowywać w temperaturze 4 °C lub -20 °C.</li>
</ol>
4. Analiza aktywności nukleazy
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów roboczych
	<ol>
		<li>Przygotuj 20 μL roztwór roboczy dla każdej sondy w probówkach do mikrocentryfugi bez nukleaz o pojemności 1,5 ml poprzez rozcieńczenie (w stosunku 1:10) roztworu zapasowego (50 pmol/μL) do uzyskania końcowego stężenia roboczego 50 pmol/ μLW tym celu wymieszać 18 μL buforu fosforanowo-solnego (PBS) zawierającego MgCl22 oraz CaCl22 z 2 μL roztworu zapasu sondy. 
		UWAGA: Należy pamiętać, że w roztworze roboczym oligonukleotydy są bardziej podatne na degradację nukleazową, dlatego zaleca się przygotowanie roztworów roboczych bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji.</li>
		<li>Podczas pracy z fluoroforami należy unikać bezpośredniego kontaktu ze światłem w trakcie przygotowywania próbek oraz przechowywać je w ciemności (owinięte w folię).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie reakcji
	<ol>
		<li>Podgrzej wstępnie fluorometr (np. Cytation 1) do 37 °C.</li>
		<li>Przygotuj zestaw (jedna probówka/sonda) probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, wolnych od nukleaz, dla każdej próbki (TSB, E. coli i Salmonella) i odpowiednio oznakować.</li>
		<li>Ostrożnie dodać 96 μL sterylnej pożywki TSB, Salmonella nadpływ lub E. coli nadfiltr (z kroku 3.4.). Następnie dodać 4 μL/tube odpowiedniej ilości roztworu roboczego sondy. Ten etap należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: W pierwszej rundzie przesiewu wykorzystano 10 sond, a w drugiej rundzie 6 sond.</li>
		<li>Wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodny roztwór. Podczas mieszania należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza do próbek.</li>
		<li>Naładuj 95 μL każdego roztworu (sonda + nadsącz lub pożywka hodowlana) do osobnej dołki czarnej, nietraktowanej płytki 96-dołkowej. Aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza w dołkach podczas dozowania, należy nanosić ciecz ostrożnie, trzymając końcówkę blisko ścianki dołka.</li>
		<li>Przykryć płytkę pokrywką. Przeprowadzić oględziny pokrywki, sprawdzając, czy nie występują na niej oznaczenia pisakiem lub nagromadzenie cząsteczek kurzu, które mogłyby wprowadzić artefakty pomiarowe. W takim przypadku wymienić pokrywkę na nową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja pomiarowa
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji (Gen5 3.05), klikając ikonę skrótu do programu (Rycina S1A).</li>
		<li>Wybierz Czytaj teraz z okna Menedżera zadań i wybierz Nowy… w celu opracowania protokołu pomiaru kinetycznego (Rycina S1B).</li>
		<li>Kliknij w Ustawienie temperatury w oknie dialogowym zatytułowanym Procedura i wybierz 37 ˚C. Potwierdź i zapisz ustawienia, naciskając Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. (Rycina S1C).</li>
		<li>Kliknij w Kinetyka początkowa w oknie dialogowym o nazwie ProceduraNastępnie w wyskakującym oknie dialogowym o nazwie Krok kinetycznywybrać 2 h w Czas trwania pole wejściowe i 2 min w Przedział pole wprowadzania. Potwierdź i zapisz ustawienia, naciskając Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. (Rysunek S1D).</li>
		<li>Kliknij w Przeczytaj w oknie dialogowym o nazwie ProceduraNastępnie w wyskakującym oknie dialogowym o nazwie Opis metodywybierz Intensywność fluorescencji jako metoda detekcji, Punkt końcowy/Kinetyka jako typ odczytu i Filtry jako typ optyki. Potwierdź i zapisz ustawienia, naciskając Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do przetłumaczenia. (Rycina S1E).</li>
		<li>W oknie dialogowym typu pop-up zatytułowanym Odczyt (kinetyczny)wybierz Zielony z Zestaw filtrówPotwierdź i zapisz ustawienia, naciskając Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. (Rysunek S2A).</li>
		<li>W oknie dialogowym zatytułowanym Procedurawybierz użyć pokrywki i kliknij w waliduj aby upewnić się, że utworzony protokół jest poprawny. Potwierdza to wyskakujące okno dialogowe (Rycina S2B).</li>
		<li>Wybierz protokół na pasku menu i wybierz procedura (Rycina S2C).</li>
		<li>W oknie dialogowym o nazwie Procedura, zdefiniuj do pomiaru odpowiednie studzienki (Rysunek S2D).</li>
		<li>W polu wprowadzania nazwy pliku wpisz nazwę eksperymentu (Rysunek S2E).</li>
		<li>Włóż płytkę wraz z pokrywą do czytnika płytek. Upewnij się, że płytka jest ustawiona w odpowiedniej orientacji.</li>
		<li>Rozpocznij akwizycję, klikając czytaj nowe przycisk na pasku narzędzi (Rycina S2F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych
	<ol>
		<li>Kliknij jedną z zmierzonych studzienek w oknie dialogowym zatytułowanym Rycina 1 (Rycina S3A).</li>
		<li>Kliknij wybierz dołki oraz uwzględnić wszystkie zmierzone studzienki w dialog wyboru studzienek okno. Potwierdź i zapisz ustawienia, naciskając Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.. (Rycina S3B).</li>
		<li>Wybierz Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia. w oknie dialogowym o nazwie Rycina 1 aby zwizualizować zestawione w tabeli wyniki (Rycina S3C).</li>
		<li>Eksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, wybierając szybki eksport z menu kontekstowego (Rysunek S3C).</li>
		<li>W arkuszu kalkulacyjnym odpowiednio opisz kolumny z danymi dla każdej próbki i sondy.</li>
		<li>Generuj wykresy kinetyczne, wykorzystując linia z markerami stylu, wykreślając względne jednostki fluorescencji (RFU) w funkcji czasu (oś x: oś czasu reakcji, oś y: RFU). 
		UWAGA: Opis generowania wykresu odnosi się do korzystania z programów arkuszy kalkulacyjnych (np. Excel). Do generowania wykresów z uzyskanych surowych danych można jednak użyć dowolnego innego programu, wykreślając RFU w funkcji czasu.</li>
		<li>Oblicz szybkość reakcji enzymatycznej dla każdego zmierzonego przedziału czasowego zgodnie z następującym wzorem25szybkość= <img alt="Równanie ciepła właściwego If-Ii/Tf-Ti, formuła, termodynamika, schemat edukacyjny." src="/files/ftp_upload/60005/60005eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">, gdzie Jeśli jest RFU w maksymalnym punkcie czasowym interwału i Ii jest RFU w minimalnym punkcie czasowym odstępu, a Tf i Ti stanowią odpowiednio maksymalny i minimalny punkt czasowy przedziału.</li>
		<li>Wybierz szybkość o najwyższej wartości (Rmaksymalny) dla każdej krzywej. Jeśli istnieje więcej niż jedno Rmaks. dla każdej próbki należy wybrać tę, która występuje w najwcześniejszym punkcie czasowym pomiaru.</li>
		<li>Oblicz stosunek Rmaksymalny or średnia wartość przedziału czasowego, w którym Rmaksymalny występuje: współczynnik szybkości = <img alt="Wzór na równowagę statyczną Rmax/(Tf+Ti)/2; równanie do analizy stanu równowagi w fizyce." src="/files/ftp_upload/60005/60005eq2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"></li>
		<li>Oblicz krotność różnicy (FD) między współczynnikiem szybkości Salmonella i E. coli dla każdej sondy.</li>
		<li>Wartość różnicy krotności wyższą niż 3 należy uznać za istotną.</li>
		<li>Sondy istotne statystycznie z najwyższymi wartościami krotności różnicy (FD) należy uznać za sondy kandydujące i podstawę do zaprojektowania biblioteki w kolejnej rundzie przesiewowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Kryteria wyboru rund przesiewowych (Rycina 1)
<ol>
	<li>Pierwsza runda przesiewania
	<ol>
		<li>Przeprowadzić test aktywności nukleazy (opisany w sekcji 4) z wykorzystaniem sond DNA, RNA oraz polinukleotydowych.</li>
		<li>Ocenić preferencję dla chemii DNA lub RNA poprzez porównanie liczby i wydajności (wartości FD) kandydatów na sondy DNA i RNA.</li>
		<li>Wybrać rodzaj chemii kwasów nukleinowych, który pozwolił na uzyskanie największej liczby kandydatów na sondy, zgodnie z ilustracją na Rysunku 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Druga runda przesiewania
	<ol>
		<li>Przeprowadzić test aktywności nukleazy (opisany w sekcji 4) z wykorzystaniem sond w pełni zmodyfikowanych oraz sond chimerycznych, zaprojektowanych na podstawie substratu kwasu nukleinowego wybranego w pierwszej rundzie przesiewania.</li>
		<li>Ocenić preferencję względem sekwencji zawierających analogi nukleozydów 2'-Fluoro i 2'-O-Metylo poprzez porównanie wyników uzyskanych dla zmodyfikowanych kandydatów na sondy 2'-Fluoro i 2'-O-Metylo.</li>
		<li>Wybrać rodzaj modyfikacji analogu nukleozydowego, który pozwolił na uzyskanie największej liczby kandydatów na sondy, zgodnie z ilustracją na Rysunku 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleases%3A+diversity+of+structure%2C+function+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Nucleases: diversity of structure, function and mechanism.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 44 (1), 1-93 (2011).</li>
<li>Adli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR+tool+kit+for+genome+editing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The CRISPR tool kit for genome editing and beyond.</a> Nature Communication. 9 (1), 1911(2018).</li>
<li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1317-1340 (2012).</li>
<li>Berends, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclease+expression+by+Staphylococcus+aureus+facilitates+escape+from+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-586 (2010).</li>
<li>Kiedrowski, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Nuc2+is+a+functional%2C+surface-attached+extracellular+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Nuc2 is a functional, surface-attached extracellular nuclease.</a> PLoS One. 9 (4), 95574(2014).</li>
<li>Morita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall-anchored+nuclease+of+Streptococcus+sanguinis+contributes+to+escape+from+neutrophil+extracellular+trap-mediated+bacteriocidal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell wall-anchored nuclease of Streptococcus sanguinis contributes to escape from neutrophil extracellular trap-mediated bacteriocidal activity.</a> PLoS One. 9 (8), 103125(2014).</li>
<li>Hasegawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+virulence-associated+and+cell-wall-located+DNase+of+Streptococcus+pyogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a virulence-associated and cell-wall-located DNase of Streptococcus pyogenes.</a> Microbiology. 156, Pt 1 184-190 (2010).</li>
<li>Moon, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+catalytic+and+substrate+binding+mechanisms+of+the+strategic+EndA+nuclease+from+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural insights into catalytic and substrate binding mechanisms of the strategic EndA nuclease from Streptococcus pneumoniae.</a> Nucleic Acids Research. 39 (7), 2943-2953 (2011).</li>
<li>Li, L. Y., Luo, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+G+is+an+apoptotic+DNase+when+released+from+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.</a> Nature. 412 (6842), 95-99 (2001).</li>
<li>McDermott-Roe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease+G+is+a+novel+determinant+of+cardiac+hypertrophy+and+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endonuclease G is a novel determinant of cardiac hypertrophy and mitochondrial function.</a> Nature. 478 (7367), 114-118 (2011).</li>
<li>Wang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+adipogenesis+and+innate+immunity%3A+RNase-L+promotes+3T3-L1+adipogenesis+by+destabilizing+Pref-1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">A link between adipogenesis and innate immunity: RNase-L promotes 3T3-L1 adipogenesis by destabilizing Pref-1 mRNA.</a> Cell Death & Disease. 7 (11), 2458(2016).</li>
<li>Li, C. L., Yang, W. Z., Shi, Z., Yuan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tudor+staphylococcal+nuclease+is+a+structure-specific+ribonuclease+that+degrades+RNA+at+unstructured+regions+during+microRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Tudor staphylococcal nuclease is a structure-specific ribonuclease that degrades RNA at unstructured regions during microRNA decay.</a> RNA. 24 (5), 739-748 (2018).</li>
<li>Wan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTDH-SND1+interaction+is+crucial+for+expansion+and+activity+of+tumor-initiating+cells+in+diverse+oncogene-+and+carcinogen-induced+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">MTDH-SND1 interaction is crucial for expansion and activity of tumor-initiating cells in diverse oncogene- and carcinogen-induced mammary tumors.</a> Cancer Cell. 26 (1), 92-105 (2014).</li>
<li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnases+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dnases in health and disease.</a> Developmental Biology. 429 (1), 1-11 (2017).</li>
<li>Hernandez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+Staphylococcus+aureus+infections+with+a+nuclease-activated+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of Staphylococcus aureus infections with a nuclease-activated probe.</a> Nature Medicine. 20 (3), 301-306 (2014).</li>
<li>Flenker, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Urinary+Tract+Infections+via+Bacterial+Nuclease+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Urinary Tract Infections via Bacterial Nuclease Activity.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1353-1362 (2017).</li>
<li>Kannan, N., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tipping+the+balance%3A+MTDH-SND1+curbs+oncogene-induced+apoptosis+and+promotes+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tipping the balance: MTDH-SND1 curbs oncogene-induced apoptosis and promotes tumorigenesis.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 118-120 (2014).</li>
<li>Kemmer, T. P., Malfertheiner, P., Buchler, M., Kemmer, M. L., Ditschuneit, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+ribonuclease+activity+in+the+diagnosis+of+pancreatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Serum ribonuclease activity in the diagnosis of pancreatic disease.</a> International Journal of Pancreatology. 8 (1), 23-33 (1991).</li>
<li>Fernandez-Salas, E., Peracaula, R., Frazier, M. L., de Llorens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleases+expressed+by+human+pancreatic+adenocarcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ribonucleases expressed by human pancreatic adenocarcinoma cell lines.</a> European Journal of Biochemistry. 267 (5), 1484-1494 (2000).</li>
<li>Fujibayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deoxyribonuclease+I+activity+can+be+a+useful+diagnostic+marker+for+the+early+diagnosis+of+unstable+angina+pectoris+or+non-ST-segment+elevation+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Serum deoxyribonuclease I activity can be a useful diagnostic marker for the early diagnosis of unstable angina pectoris or non-ST-segment elevation myocardial infarction.</a> Journal of Cardiology. 59 (3), 258-265 (2012).</li>
<li>Kawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+use+of+serum+deoxyribonuclease+I+activity+as+a+novel+early-phase+marker+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Diagnostic use of serum deoxyribonuclease I activity as a novel early-phase marker in acute myocardial infarction.</a> Circulation. 109 (20), 2398-2400 (2004).</li>
<li>Hernandez, L. I., Ozalp, V. C., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclease+activity+as+a+specific+biomarker+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communication+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Nuclease activity as a specific biomarker for breast cancer.</a> Chemical Communication (Cambridge). 52 (83), 12346-12349 (2016).</li>
<li>Machado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+specific+detection+of+Salmonella+infections+using+chemically+modified+nucleic+acid+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Rapid and specific detection of Salmonella infections using chemically modified nucleic acid probes.</a> Analytica Chimica Acta. 1054, 157-166 (2019).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> Journal of Visualized Experiment. (63), e3064(2012).</li>
<li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+Clinical+Enzyme+Measurements%22">Manual of Clinical Enzyme Measurements</a>. , Worthington Diagnostics. (1972).</li>
<li>Burghardt, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Culture-Free+Detection+of+Staphylococcus+aureus+Bacteremia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid, Culture-Free Detection of Staphylococcus aureus Bacteremia.</a> PLoS One. 11 (6), 0157234(2016).</li>
<li>Bibette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+confidence+in+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gaining confidence in high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (3), 649-650 (2012).</li>
<li>Hernandez, L. I., Machado, I., Schafer, T., Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers+overview%3A+selection%2C+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aptamers overview: selection, features and applications.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 15 (12), 1066-1081 (2015).</li>
<li>Pande, J., Szewczyk, M. M., Grover, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display%3A+concept%2C+innovations%2C+applications+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Phage display: concept, innovations, applications and future.</a> Biotechnology Advances. 28 (6), 849-858 (2010).</li>
<li>Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+binding+proteins%3A+anticalins+-+harnessing+the+structural+plasticity+of+the+lipocalin+ligand+pocket+to+engineer+novel+binding+activities%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.</a> FEBS Journal. 275 (11), 2677-2683 (2008).</li>
<li>Ku, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+Acid+Aptamers%3A+An+Emerging+Tool+for+Biotechnology+and+Biomedical+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Nucleic Acid Aptamers: An Emerging Tool for Biotechnology and Biomedical Sensing.</a> Sensors (Basel). 15 (7), 16281-16313 (2015).</li>
<li>Jayasena, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptamers%3A+an+emerging+class+of+molecules+that+rival+antibodies+in+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics.</a> Clinical Chemistry. 45 (9), 1628-1650 (1999).</li>
<li>Gray, B. P., Brown, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+peptide+libraries%3A+mining+for+cell-binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Combinatorial peptide libraries: mining for cell-binding peptides.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 1020-1081 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zmiany aktywności nukleazy są związane z szeroką gamą fenotypów chorobowych, w tym różnymi rodzajami raka i infekcji bakteryjnych. Proponuje się, że zmiany te są czynnikiem sprawczym stanu14, podczas gdy w innych przypadkach są one konsekwencją szkodliwego zdarzenia fizjologicznego20 lub czynnika chorobotwórczego16,26. Nic dziwnego, że próby wykorzystania nukleaz i aktywności nukleaz jako biomarkera diagnostycznego ...

Nukleazy to klasa enzymów zdolnych do rozszczepiania wiązań fosfodiestrowych, które tworzą szkielet struktury cząsteczek kwasu nukleinowego. Ogromna różnorodność nukleaz sprawia, że ich klasyfikacja jest dość trudna. Istnieją jednak pewne wspólne kryteria używane do opisywania nukleaz, takie jak między innymi preferencja substratu (kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) lub kwas rybonukleinowy (RNA)), miejsce cięcia (endonukleazy lub egzonukleazy) lub zależność od jonów metali1. Nukleazy są wysoce konserwatywnymi enzymami katalitycznymi, które odgrywają fundamentalną rolę zarówno w organizmach prokariotycznych, jak i eukariotycznych i były używane i nadal są używane jako narzędzia do edycji genów2. Są również kluczowymi aktorami w utrzymaniu i replikacji DNA, pomagając utrzymać stabilność genomu i uczestnicząc w procesach korekty3. Na przykład u bakterii nukleazy zostały zidentyfikowane jako ważne czynniki wirulencji, zdolne do wspierania przetrwania bakterii poprzez zmniejszenie skuteczności układu odpornościowego gospodarza4,5,6,7,8. Sugeruje się, że u ssaków nukleazy są zaangażowane w apoptozę9, biogenezę i utrzymanie mitochondriów10 oraz pośredniczenie przeciwbakteryjnych i przeciwwirusowych wrodzonych odpowiedzi immunologicznych11. Nic dziwnego, że zmiany aktywności nukleazy, niezależnie od tego, czy są one zwiększane, czy nie, są związane z szerokim wachlarzem chorób u ludzi. Choroby te obejmują szeroką gamę nowotworów12,13 do przerostu serca10 lub chorób autoimmunologicznych14. W związku z tym nukleazy stały się interesującymi kandydatami jako biomarkery dla niejednorodnej grupy schorzeń ludzkich. W rzeczywistości nukleazy wykazały już swój potencjał jako skuteczne narzędzia diagnostyczne do wykrywania infekcji wywołanych przez określone czynniki bakteryjne, takie jak Staphylococcus aureus lub Escherichia coli15,16. W wielu typach nowotworów ekspresja rybonukleazy zawierającej białko 1 (SND1) w domenie nukleazy gronkowcowej wskazuje na złe rokowanie17. U pacjentów z rakiem trzustki stwierdzono podwyższone stężenie rybonukleazy I (RNazy I) w surowicy18 i zaproponowano związek z fenotypami komórek rakowych19. W chorobach niedokrwiennych serca, takich jak zawał mięśnia sercowego lub niestabilna dławica piersiowa, wykazano, że poziom deoksyrybonukleazy I (DNazy I) w surowicy jest ważnym markerem diagnostycznym20,21.
Postawiono hipotezę, że globalny plan aktywności nukleazy może być różny zarówno w stanie zdrowym, jak i chorobowym. W rzeczywistości ostatnie doniesienia wykorzystywały różnice w aktywności nukleazy do rozróżnienia między fenotypami zdrowymi i nowotworowymi22 lub do identyfikacji patogennych infekcji bakteryjnych w sposób specyficzny dla gatunku15,23. Odkrycia te otworzyły nową drogę do wykorzystania nukleaz jako biomarkerów choroby. W związku z tym istnieje konieczność opracowania kompleksowej metody badań przesiewowych, która będzie w stanie systematycznie identyfikować związane z chorobą różnice w aktywności nukleazy, co może mieć kluczowe znaczenie w opracowywaniu nowych narzędzi diagnostycznych.
W niniejszym artykule przedstawiamy i opisujemy nowe podejście do badań przesiewowych in vitro (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) w celu identyfikacji czułych i specyficznych sond zdolnych do rozróżniania między aktywnością nukleazy u zdrowych i niezdrowych, lub aktywnością specyficzną dla typu komórki lub bakterii. Wykorzystując modułowość kwasów nukleinowych, zaprojektowaliśmy wstępną bibliotekę wygaszanych fluorescencyjnych sond oligonukleotydowych, składającą się z obszernego zestawu różnych sekwencji i substancji chemicznych, które są ważnymi parametrami przy projektowaniu biblioteki. Te sondy oligonukleotydowe są otoczone fluoroforem (amidyn fluoresceiny, FAM) i wygaszaczem (wygaszacz pływów 2, TQ2) odpowiednio na końcach 5' i 3' (Tabela 1). Wykorzystując ten test fluorometryczny oparty na rezonansie rezonansowym (FRET) do pomiaru kinetyki degradacji enzymatycznej, byliśmy w stanie zidentyfikować sondy kandydujące z potencjałem do rozróżniania zróżnicowanych wzorców aktywności nukleazy związanych ze stanami zdrowia lub chorobą. Zaprojektowaliśmy iteracyjny proces, w którym tworzone są nowe biblioteki w oparciu o najlepsze sondy kandydujące, co pozwala na identyfikację coraz bardziej szczegółowych sond kandydujących w kolejnych krokach przesiewowych. Co więcej, podejście to wykorzystuje katalityczny charakter nukleaz w celu zwiększenia czułości. Osiąga się to dzięki wykorzystaniu aktywacyjnego charakteru sond reporterowych i zdolności nukleaz do ciągłego przetwarzania cząsteczek substratu, co stanowi kluczową przewagę nad alternatywnymi metodami badań przesiewowych opartymi na przeciwciałach lub małych cząsteczkach.
To podejście oferuje wysoce modułowe, elastyczne i łatwe do wdrożenia narzędzie do badań przesiewowych do identyfikacji specyficznych sond kwasów nukleinowych zdolnych do rozróżniania stanów zdrowych od chorobowych, a także doskonałą platformę do rozwoju nowych narzędzi diagnostycznych, które mogą być dostosowane do przyszłych zastosowań klinicznych. W związku z tym podejście to zastosowano do identyfikacji aktywności nukleazy pochodzącej z Salmonella Typhimurium (zwanej dalej Salmonellą) w celu specyficznej identyfikacji tej bakterii. W poniższym protokole przedstawiamy metodę badania przesiewowego aktywności nukleazy bakteryjnej za pomocą analizy kinetycznej.

<table><tbody><tr><td>płytka 96-dołkowa z czarnym dnem i niepoddana obróbce</td><td>Fisher Scientific</td><td>10000631</td><td></td></tr><tr><td>Cytation1</td> Probówki <td>BioTek</td><td>CYT1FAV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>Thermofisher</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>25922</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka do przechowywania kriogenicznego mikrobanku zawierająca kulki</td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>22-286-155</td><td></td></tr><tr><td>Sondy kwasów nukleinowych</td><td>Biomers.net</td><td>#</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna zawierająca MgCl2 i CaCl2</td><td>Gibco&trade;</td><td></td><td></td>14040117</tr><tr><td>Salmonella enterica subs. Enterica</td><td>ATCC</td><td>14028</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>10647633</td><td></td></tr><tr><td>Tryptonowy agar sojowy ze zdefibrynowaną krwią owczą</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362223</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22092</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetyczne badanie przesiewowe aktywności nukleazy za pomocą sond kwasów nukleinowych

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nukleazy to klasa enzymów, które rozkładają kwasy nukleinowe poprzez katalizowanie hydrolizy wiązań fosfodiestrowych, które łączą cukry rybozy. Nukleazy pełnią wiele istotnych ról fizjologicznych w organizmach prokariotycznych i eukariotycznych, począwszy od utrzymania stabilności genomu, a skończywszy na zapewnieniu ochrony przed patogenami. Zmieniona aktywność nukleazy jest związana z kilkoma stanami patologicznymi, w tym infekcjami bakteryjnymi i rakiem. W tym celu aktywność nukleazy wykazała ogromny potencjał do wykorzystania jako swoisty biomarker. Nadal jednak wysoce pożądana jest solidna i powtarzalna metoda badań przesiewowych oparta na tej aktywności.
Tutaj wprowadzamy metodę, która umożliwia badanie przesiewowe aktywności nukleazy przy użyciu sond kwasów nukleinowych jako substratów, z zakresem rozróżniania między stanami patologicznymi i zdrowymi. Metoda ta daje możliwość projektowania nowych bibliotek sond, o coraz większej specyficzności, w sposób iteracyjny. W związku z tym konieczne są wielokrotne rundy badań przesiewowych, aby udoskonalić konstrukcję sond o ulepszone funkcje, wykorzystując dostępność chemicznie modyfikowanych kwasów nukleinowych. Znaczny potencjał proponowanej technologii tkwi w jej elastyczności, wysokiej odtwarzalności i wszechstronności w badaniach przesiewowych aktywności nukleazy związanej ze stanami chorobowymi. Oczekuje się, że technologia ta pozwoli na opracowanie obiecujących narzędzi diagnostycznych o dużym potencjale w klinice.

Rysunek 1 przedstawia przebieg pracy tej metodologii, która jest podzielona na dwie rundy przesiewowe. W pierwszej rundzie przesiewowej zastosowano 5 sond DNA (DNA, DNA Poly A, DNA Poly T, DNA Poly C i DNA Poly G) oraz 5 sond RNA (RNA, RNA Poly A, RNA Poly U, RNA Poly C i RNA Poly G). Surowe dane z tej rundy przesiewowej znajdują się w Tabela uzupełniająca 1. W drugiej rundzie zsyntetyzowano chemicznie modyfikowane sondy poprzez zastąpienie sekwencji RNA chemicznie modyfikow...

Zmieniona aktywność nukleazy jest związana z różnymi schorzeniami ludzkimi, co potwierdza jej potencjał jako biomarkera. Modułowa i łatwa do wdrożenia metodologia badań przesiewowych przedstawiona w tym artykule pozwala na wybór konkretnych sond kwasów nukleinowych do wykorzystania aktywności nukleazy jako biomarkera choroby.

Kinetyczne badanie przesiewowe aktywności nukleazy za pomocą sond kwasów nukleinowych

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Protokół ten stanowi potężną alternatywę dla badań przesiewowych aktywności nukleazy jako biomarkera choroby, z łatwą do wdrożenia metodologią nawet dla badaczy, którzy nie są tak wyspecjalizowani w sondach kwasów nukleinowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wyboru sond kwasów nukleinowych, które mogą identyfikować zarówno znane, jak i nieznane aktywności nukleazy, wykorzystując dynamiczną interakcję sonda-nukleaza. Inne zalety tej metodyki to jej elastyczność, wysoka powtarzalność i łatwość użycia.Pokaz zostanie przeprowadzony przez Khadiję, studentkę studiów magisterskich, oraz Barisa, doktora habilitowanego z naszego laboratorium. Projektując bibliotekę oligonukleotydów, należy uwzględnić co najmniej jedną losową sekwencję DNA i jedną RNA zawierającą kombinację adeniny, guaniny, cytozyny i tiaminy lub uracylu. Aby przygotować sondy oligonukleotydowe, odkręć liofilizowane sondy oligonukleotydowe i rozcieńcz każdą sondę w buforze Tris-EDTA w stężeniu 500 pikomolarów na mikrolitr, aby zapobiec degradacji nukleazy.W przypadku hodowli bakteryjnej na podłożu stałym, należy przetoczyć pojedynczą porowatą szklaną kulkę z magazynu kriogenicznego bezpośrednio na jedno naczynie hodowlane zawierające TSA uzupełnione zdefibrynowaną krwią owczą w celu usunięcia pojedynczych kolonii bakteryjnych. Następnie umieść talerz w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 24 godziny. W przypadku hodowli bakteryjnej w płynnym podłożu przenieś pojedynczą kolonię z kultury ze stałego podłoża do 50 mililitrów TSB w celu inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny przy 200 obrotach na minutę.Następnego dnia rozcieńczyć kulturę w stosunku jeden do 500 w świeżym TSB i inkubować bakterie przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obrotów na minutę w inkubatorze z wytrząsaniem. Aby skonfigurować test aktywności nukleazy, najpierw podgrzej fluorometr do 37 stopni Celsjusza i ostrożnie dodaj 96 mikrolitrów sterylnego TSB lub supernatantu z płynnej pożywki Salmonelli lub E.Coli do jednej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki bez nukleaz na sondę. Dodaj cztery mikrolitry roztworu roboczego sondy do każdej probówki i za pomocą pipety dokładnie wymieszaj zawartość każdej probówki, aż do uzyskania jednorodnych roztworów, uważając, aby uniknąć pęcherzyków.Następnie ostrożnie załaduj 95 mikrolitrów każdego roztworu blisko ścianki poszczególnych studzienek z czarnym dnem, nieobrobionej 96-dołkowej płytki, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Po dodaniu wszystkich roztworów przykryj płytkę i sprawdź wzrokowo pokrywę pod kątem śladów pisaka lub kurzu, które mogą wprowadzać artefakty pomiaru. Aby skonfigurować oprogramowanie do pomiaru aktywności nukleazy, otwórz odpowiedni program do akwizycji.Wybierz opcję Czytaj teraz w oknie Menedżer zadań, a następnie wybierz opcję Nowy, aby utworzyć protokół pomiaru kinetycznego. Kliknij Ustaw temperaturę, aby wybrać 37 stopni Celsjusza, a następnie potwierdź i zapisz ustawienia, klikając OK. Kliknij przycisk Start Kinetics (Uruchom kinetykę). W wyskakującym okienku wybierz dwie godziny w polu wprowadzania Czas pracy i dwie minuty w polu wprowadzania interwału, zanim klikniesz OK, aby potwierdzić i zapisać ustawienia.Kliknij przycisk Przeczytaj. W wyskakującym oknie wybierz Intensywność fluorescencji jako metodę wykrywania, Punkt końcowy kinetyczny jako typ odczytu i filtry jako typ optyki. Następnie kliknij OK.In wyskakującym okienku, wybierz opcję Zielony z zestawu filtrów i kliknij OK.In oknie Procedura, wybierz opcję Użyj pokrywy i kliknij przycisk Zatwierdź.Pojawi się wyskakujące okienko potwierdzające, że utworzony protokół jest ważny. W menu Protokół wybierz pozycję Procedura. W oknie Procedura zdefiniuj studzienki, które mają być mierzone, a następnie wprowadź nazwę eksperymentu w polu wprowadzania Nazwa pliku.Następnie załaduj płytkę do czytnika płytek, uważając, aby płyta była we właściwej orientacji i kliknij przycisk Czytaj nowy, aby rozpocząć akwizycję. W celu analizy danych otwórz dane w odpowiednim oprogramowaniu do analizy i wybierz jeden z mierzonych dołków w oknie płyty pierwszej. Kliknij przycisk Wybierz studnie i uwzględnij wszystkie zmierzone studnie w oknie dialogowym Wybór studni przed kliknięciem przycisku OK. Następnie wybierz Dane w pierwszym oknie, aby wyświetlić wyniki w tabeli, a następnie kliknij przycisk Szybki eksport, aby wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego.W arkuszu kalkulacyjnym oznacz kolumny danych odpowiednio dla każdej próbki i sondy, a następnie wykreśl względne jednostki fluorescencji w funkcji czasu, w którym dane mają wygenerować wykresy kinetyczne. W tym reprezentatywnym eksperymencie, po pierwszej rundzie badań przesiewowych, supernatanty z kultur Salmonelli zgłosili wyraźną preferencję dla sond RNA w stosunku do sond DNA. Opierając się na identyfikacji RNA jako preferowanego typu kwasu nukleinowego przez nukleazy Salmonella, zaprojektowano nową bibliotekę zawierającą tylko RNA, która ma być wykorzystana w drugiej rundzie badań przesiewowych.W przeciwieństwie do tego, E.Coli w pożywce hodowlanej wykazywała bardzo ograniczoną zdolność do degradacji sond RNA. Po drugiej rundzie badań przesiewowych z użyciem chemicznie modyfikowanych nukleotydów mających na celu zwiększenie specyficzności sond RNA, 2'O-metylo pirymidyny i 2'O-metylo puryna RNA mogły zostać zidentyfikowane na podstawie ich modyfikacji chemicznych jako wykazujące najlepsze zachowanie kinetyczne w porównaniu odpowiednio z 2'fluoro pirymidyny i 2'fluoro puryny RNA. Wyniki te sugerują, że Salmonella ma ważną aktywność RNAzy z różnicowymi preferencjami chemicznymi substratów, które można wykorzystać do wyboru sond zdolnych do specyficznego rozpoznawania tej bakterii.Procedura ta umożliwia wybór sond, które są w stanie zidentyfikować aktywność nukleazy związaną ze stanami chorobowymi, takimi jak rak lub infekcja bakteryjna, co pozwala na opracowanie nowych klinicznych narzędzi diagnostycznych.

kinetic-screening-of-nuclease-activity-using-nucleic-acid-probes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy procedurę określania aktywności helikazy docelowego białka w celu rozwinięcia znakowanego biotyną substratu dsRNA. Aktywność enzymu zidentyfikowano poprzez analizę przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej, a następnie test chemiluminescencyjny przy użyciu chemiluminescencyjnej streptawidyny sprzężonej z enzymem.

Pomiar aktywności helikazy białka docelowego za pomocą dupleksów RNA znakowanych biotyną

Egzonukleazy odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu stabilności genomu. Utrata funkcji egzonukleazy WRN powoduje przedwczesne starzenie się. Badanie substratów i innych wymagań nukleazy in vitro może pomóc w wyjaśnieniu jej roli in vivo. Tutaj demonstrujemy szybki i powtarzalny test oparty na fluorescencji do pomiaru jego aktywności nukleazy.

Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz

Opisujemy czułe, żelowe testy nieciągłe, aby zbadać kinetykę inicjacji opóźnionej nici przy użyciu białek replikacyjnych bakteriofaga T7.

Kinetyka syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacji bakteriofagów T7

Przedstawione tutaj są protokoły do testów biochemicznych in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny, które mogą być szeroko stosowane do badania interakcji białko-kwas nukleinowy.

Testy biochemiczne in vitro z wykorzystaniem etykiet biotyny do badania interakcji białko-kwas nukleinowy

Testy aktywności oparte na NMR zostały opracowane w celu identyfikacji i scharakteryzowania inhibitorów dwóch nukleozydowych enzymów rybohydrolazy. Przedstawiono protokoły dla początkowych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do oznaczania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów przesiewowych licznika rozcieńczeń skokowych oraz testów w całych komórkach E. coli.

Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych

Opisano wysoce równoległą metodę pomiaru specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Protokół ten demonstruje technikę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej NdeI. Metodę można łatwo zmodyfikować w celu zbadania dowolnego procesu, który prowadzi do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA.

Równoległy, wysokoprzepustowy test kinetyczny pojedynczej cząsteczki do specyficznego dla miejsca rozszczepienia DNA

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

W pracy przedstawiono prosty, przyjazny dla użytkownika ratiometryczny test FRET do wykrywania i ilościowej oceny aktywności DNazy oraz wykazano jego zastosowanie w analizie słabej nukleazy.

Ocena aktywności DNazy za pomocą ratiometrycznego transferu energii rezonansu fluorescencji

Protokół ten opisuje test biochemiczny przesunięcia żelu do pomiaru aktywności FEN1 (endonukleazy płatowej 1) i rozwoju inhibitora.

Fluorescencyjne wykrywanie aktywności nukleazy FEN1 i badania przesiewowe inhibitorów drobnocząsteczkowych

Poznaj metodę przesiewowego badania aktywności nukleaz jako biomarkerów chorób z wykorzystaniem sond kwasów nukleinowych. Technika umożliwia identyfikację znanych i nieznanych aktywności enzymatycznych.

Kinetyczne badanie przesiewowe aktywności nukleazy za pomocą sond kwasów nukleinowych

Przeglądaj więcej filmów