Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi
29 czerwca 2020
Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.
Protokół ten może być stosowany do pośmiertnej diagnostyki wścieklizny zwierząt od początkowego wglądu w dykcję w terenie do konformacji molekularnej na scentralizowanym poziomie aktywności. Szybkie testy diagnostyki immunochromatograficznej są użyteczną alternatywą dla cech wiejskich i wiejskich w Afryce i Azji, w których materiały referencyjne do diagnozowania wścieklizny nie są dostępne. Procedurę zademonstruje Simon Bonas, technik z mojego laboratorium.
Pierwszą część procedury zademonstruje Ibrahima Dicko, technik z Laboratoire Central Veterinaire w Bamako w Mali. Aby uzyskać dostęp do otworu wielkiego, użyj noża, aby usunąć głowę zwierzęcia przed pierwszymi kręgami szyjnymi. I użyj odpowiedniego narzędzia, aby pobrać próbkę pnia mózgu.
Takich jak jednorazowa pipeta, słomka do picia, zacisk lub zakraplacz, jak pokazano tutaj. Pień mózgu jest wówczas wyraźnie widoczny, jak to pokazano tutaj z końcówką tej pipety. Użyj odpowiedniego narzędzia, aby pobrać część tego pnia mózgu, takiego jak słomka do picia.
Włóż go ostrożnie i delikatnie obróć, aby zebrać tkankę mózgową. Nie zapomnij zatkać słomki palcem przed jej wyjęciem, w celu pobrania biopsji. Możliwe jest również użycie zacisku.
W celu zebrania większych fragmentów pnia mózgu na poziomie otworu wielkiego. Alternatywnie możliwe jest bezpośrednie użycie zakraplacza dołączonego do zestawu do pobrania pnia mózgu. Podobnie jak w przypadku słomki do picia, ostrożnie włóż zakraplacz, naciskając i delikatnie obracając, aby zebrać tkankę mózgową.
Następnie odessaj tkankę mózgową i umieść ją w pojemniku przypominającym korek probówki. Dla dokładnej diagnozy bardzo ważne jest pobranie pnia mózgu, który zawiera rdzeń przedłużony, podczas pobierania próbki. Ostrożnie rozdrobnić materiał mózgowy bezpośrednio w probówce zawierającej bufor za pomocą wacika lub zakraplacza przez około 30 sekund, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny.
Za pomocą zakraplacza umieść cztery krople około 100 mikrolitrów zawiesiny we wlocie próbki na urządzeniu testowym. W przypadku opóźnienia spowodowanego zawiesiną o wysokiej lepkości lub w celu przyspieszenia rozpoczęcia migracji, delikatnie podrapaj zakraplaczem spód miejsca osadzania urządzenia. Poczekaj na pełną migrację próbki, od jednej do pięciu minut przed odczytaniem urządzenia testowego.
Próbkę uważa się za dodatnią pod kątem wścieklizny, gdy widoczne są dwie linie. Ujemny, jeśli obecna jest tylko linia kontrolna. I nieważne, jeśli widoczna jest tylko linia testowa lub nie ma żadnych linii.
Aby wyekstrahować RNA z próbki urządzenia, ostrożnie otwórz urządzenie i usuń bibułę filtracyjną. Zebrać obszar osadu próbki i umieścić próbkę w jednym mililitrze trireagenta LS. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej z regularnym delikatnym ręcznym mieszaniem, wyekstrahuj RNA z supernatantu probówek zgodnie ze standardowymi protokołami ekstrakcji RNA. Dodanie dwóch mikrolitrów glikogenu w celu ułatwienia wytrącania RNA zgodnie z zaleceniami producenta.
Dostosuj końcową objętość resuspension RNA do 50 mikrolitrów wodą wolną od nukleaz. I przygotuj roztwór reakcyjny mieszaniny głównej dla trzech różnych ilościowych testów PCR z odwrotną transkryptazą zgodnie z tabelą. Za pomocą starterów i sond zgodnie z tabelą.
W pięciu mikrolitrach rozcieńczonych próbek RNA. I 15 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego z trzech różnych testów w dwóch egzemplarzach na odpowiednich 96-dołkowych płytkach reakcyjnych. Dodać odpowiednie kontrole dodatnie i ujemne dla każdego testu do każdej płytki w dwóch egzemplarzach.
Następnie uruchom różne testy zgodnie z warunkami cykli termicznych, jak wskazano w tabeli. Wyniki można analizować zgodnie z opisem w tabeli. Pobranie biopsji mózgu jest tak proste, jak to tylko możliwe, aby zagwarantować pobranie próbek wysokiej jakości.
W porównaniu z techniką referencyjną czułość i swoistość szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego była wysoka we wszystkich laboratoriach stosujących te protokoły. Na podstawie skumulowanej liczby badanych próbek, ogólna czułość i swoistość wyniosły ponad 95%Szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny jest odpowiedni do wykrywania lisawirusa w biopsjach mózgu od zakażonych zwierząt. Ponieważ jednak poziom antygenów lisawirusa jest ważny dla diagnozy wścieklizny, granica wykrywalności pozostaje wysoka podczas testowania domiareczkowanych zawiesin wirusa.
W tych reprezentatywnych wynikach, uzyskanych po wykryciu RNA za pomocą podwójnie złożonej odwrotnej transkryptazy panlisawirusa ukierunkowanej ilościowo na polimerazę wirusa lisawirusa, przeprowadzono panel 51 dodatnich szybkich immunochromatograficznych testów diagnostycznych. Ponadto genotypowanie można przeprowadzić dla czternastu próbek przy użyciu hemi-zagnieżdżonego PCR ukierunkowanego na częściowy gen nukleoproteiny. Diagnostyka i ekstrakcja paska testowego do genotypowania na podstawie po RT PCR lub w celu dodatkowej analizy długich ciągów.
Szybki test diagnostyki immunochromatograficznej może zapewnić szybką i dokładną diagnozę wścieklizny. Ma to kluczowe znaczenie dla utrzymania funkcji fal w systemach nadzoru i kontroli opartych na falach ciągłych. I minimalizowanie humannes.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół pośmiertnej diagnostyki wścieklizny u zwierząt z wykorzystaniem szybkiego testu immunochromatograficznego (RIDT). Procedura obejmuje pobieranie i interpretację próbek z biopsji mózgu, a także dodatkowe zastosowania w analizie molekularnej i genotypowaniu wirusa.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Diagnostyka weterynaryjna
- Wirusologia
- Biologia molekularna
Wprowadzenie
- Wścieklizna jest krytyczną chorobą odzwierzęcą dotykającą zwierzęta i ludzi.
- Tradycyjne metody diagnostyczne mogą być ograniczone w obszarach wiejskich.
- RIDT stanowi szybką i skuteczną alternatywę dla diagnostyki wścieklizny.
- W warunkach terenowych często brakuje dostępu do materiałów referencyjnych służących do diagnostyki.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnego protokołu diagnostyki wścieklizny u zwierząt pośmiertnie.
- Wykazanie skuteczności testu RIDT w różnych warunkach.
- Zbadanie dodatkowych zastosowań, takich jak genotypowanie wirusa.
Zastosowane metody
- Pobieranie próbek pnia mózgu od zwierząt.
- Wykorzystanie RIDT do szybkiej diagnostyki.
- Ekstrakcja RNA oraz ilościowa PCR z odwrotną transkrypcją.
- Genotypowanie próbek wirusa wścieklizny.
Główne wyniki
- Metoda RIDT wykazała wysoką czułość i swoistość powyżej 95%.
- Pomyślne pobranie biopsji mózgu osiągnięto przy użyciu prostych narzędzi.
- Genotypowanie przeprowadzono na podzbiorze próbek.
- Protokół nadaje się do stosowania w terenie w warunkach ograniczonych zasobów.
Wnioski
- Test RIDT zapewnia szybką i dokładną metodę diagnostyki wścieklizny.
- Niniejszy protokół może usprawnić działania w zakresie nadzoru i zwalczania wścieklizny.
- Jest on kluczowy dla utrzymania zdrowia i bezpieczeństwa publicznego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybkie immunochromatograficzne testy diagnostyczne (RIDTs) umożliwiają zdecentralizowany nadzór nad wścieklizną w warunkach ograniczonych zasobów, wypełniając krytyczne luki w monitorowaniu chorób odzwierzęcych. Dzięki połączeniu wykrywania antygenu w miejscu opieki (point-of-care) z późniejszym genotypowaniem molekularnym z inaktywowanych pasków testowych, protokół ten wspiera zarówno natychmiastowe reagowanie na ogniska choroby, jak i długoterminowe śledzenie wirusa. To dwufunkcyjne podejście zwiększa pewność predykcyjną w wczesnej walidacji celów dla interwencji przeciwwirusowych, jednocześnie zmniejszając zależność od scentralizowanej infrastruktury laboratoryjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną analizę mechanizmów lizostatycznych poprzez szybkie potwierdzenie obecności antygenu wścieklizny w tkance nerwowej.
- Wartość operacyjna: Ułatwia wysokoprzepustowe pobieranie próbek w warunkach terenowych w celu zmniejszenia ryzyka związanego z hipotezami dotyczącymi angażowania celu in vivo.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia znormalizowaną, jakościową detekcję antygenu z odczytem wizualnym w celu normalizacji testów w różnych typach próbek.
- Wartość operacyjna: Pozwala na uzyskanie inaktywowanych pasków testowych odpowiednich do bezpiecznego transportu i analizy molekularnej, co zapewnia ciągłość procesu od przesiewu do genotypowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera genotypowanie wirusów poprzez ekstrakcję RNA z pasków testowych, łącząc diagnozę fenotypową z molekularną charakterystyką specyficzną dla szczepu.
- Wartość operacyjna: Tworzy pomost pomiędzy nadzorem terenowym a scentralizowaną analizą laboratoryjną, poprawiając ciągłość translacyjną w badaniach nad patogenami odzwierzęcymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Protokół RIDT integruje się z procesami badawczymi, umożliwiając wstępną weryfikację hipotez w regionach endemicznych, a uzyskane wyniki służą do identyfikacji związków wiodących poprzez śledzenie szczepów wirusa.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację celu poprzez potwierdzenie ekspresji antygenu wścieklizny w biopsjach mózgu, wyjaśniając znaczenie patofizjologiczne mechanizmów inwazji neuronalnej.
- Screening: Zapewnia powtarzalne wykrywanie antygenu bez użycia aparatury, z określonymi kryteriami dodatniego wyniku (dwie widoczne linie), co umożliwia skalowalną segregację próbek.
- Analityka: Umożliwia ilościową analizę następczą poprzez ekstrakcję RNA i RT-qPCR, dostarczając mierzalnych wyników dla korelacji ładunku wirusowego i genotypowania.
- Badania translacyjne: Łączy diagnostykę terenową z modelowaniem przedklinicznym dzięki danym z genotypowania, które informują o wyborze szczepów do oceny szczepionek lub terapii.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy przenośny moduł diagnostyczny możliwy do adaptacji dla innych lyssavirusów, maksymalizując użyteczność platformy w wielu programach R&D.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w patogenezie zoonotycznej, umożliwiając szybkie potwierdzenie obecności wirusa w tkankach docelowych.
- Wartość operacyjna: Eliminuje potrzebę stosowania łańcucha chłodniczego lub specjalistycznego sprzętu, standaryzując przetwarzanie próbek w rozproszonych geograficznie ośrodkach.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w programach przeciwwirusowych, dostarczając wczesnych i wiarygodnych dowodów na modulację celu in vivo.
- Wpływ na portfolio: Poprawia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki dostępnym danym nadzorowym, które informują strategie inwestycyjne specyficzne dla regionów geograficznych i szczepów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga przeszkolenia w zakresie prawidłowej techniki pobierania próbek z pnia mózgu, aby zapewnić pobranie rdzenia przedłużonego dla zachowania dokładności diagnostycznej.
- Zależy od dostępu do podstawowych narzędzi do przygotowania próbek (pipet, probówek, buforu) oraz czytników do testów przepływu bocznego w celu uzyskania spójnych wyników.
- Wymaga standaryzacji protokołów ekstrakcji RNA z pasków testowych w celu zachowania wiarygodności genotypowania w różnych laboratoriach.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji dla lyssavirusów innych niż wirus wścieklizny ze względu na potencjalne różnice w stężeniu antygenu i widoczności linii testowej.
- Ograniczone przez próg detekcji wizualnej testu, co może wymagać przeprowadzenia badań potwierdzających w próbkach o niskiej zawartości antygenu, mimo wysokiej czułości analitycznej po ekstrakcji.
