Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Jedną z kluczowych zalet tej techniki charakteryzowania transporterów błonowych jest to, że można określić względne powinowactwo transportera do określonych substratów, a także uzyskać wgląd w mechanizm transportu. Charakterystyka białek błonowych, które wykorzystują gradienty białek do napędzania transportu substratu, jest szczególnie odpowiednia dla tego testu pęcherzykowego na lewą stronę, który tutaj pokazujemy. Chociaż test ten wymaga specjalistycznego sprzętu, takiego jak francuska prasa i dostęp do ultrawirówki, uważamy, że może być technicznie łatwiejszy niż testy, które wymagają odtworzenia transporterów membranowych w sztucznych liposomach.

Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia nam ilościowe określenie względnego powinowactwa do różnych substratów i przeprowadzenie testów konkurencji w celu przetestowania wpływu konkurencyjnych substratów na ruszty transportowe. W przypadku transportera BAT1 użytego do zilustrowania tego testu, udało nam się również pokazać aktywację substratu transportera przez argininę. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować przygotowane zmutowane komórki E. coli, które wyrażają docelowe białko, zaszczepiając pojedynczą kolonię w pięciu mililitrach pożywki poliaminowej 3 odpowiednimi antybiotykami i hodując ją przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia przenieś tę kulturę do 500 mililitrów świeżej pożywki z poliaminy 3, która jest uzupełniona 0,0002% arabinozy i hoduj, aż hodowla komórkowa osiągnie OD600 między 0,6 a 0,8. Następnie odwirować w temperaturze 2000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut, aby zebrać osad komórkowy. Ponownie zawiesić osad i przemyć go trzykrotnie buforem pierwszym, wirując w temperaturze 2000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut za każdym razem.

Ostateczna objętość komórek w buforze pierwszym po trzecim wirowaniu powinna wynosić 10 mililitrów. Ustaw francuską celę ciśnieniową o pojemności 35 mililitrów i wlej zawiesinę ogniwa do korpusu ogniwa. Włącz maszynę za pomocą przełącznika na RHS z tyłu urządzenia i ustaw przełącznik wyboru proporcji w pozycji wysokiej.

Włącz przełącznik pompy. Tłok zacznie unosić się od podstawy, aby wyprzeć powietrze w komorze. Zwiększ ciśnienie, obracając zawór zwiększający ciśnienie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż manometr osiągnie 640 PSI.

Spowoduje to wytworzenie ciśnienia wewnętrznego o wartości 10 000 PSI. Gdy ogniwo osiągnie ciśnienie docelowe, lekko otwórz zespół zaworu przepływowego, obracając go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Dostosuj otwarcie zaworu, aby umożliwić natężenie przepływu tylko około 10 kropli na minutę.

Gdy linia zatrzymania na korpusie tłoka dotrze do górnej części komory przepływowej, wyłącz pompę. Opuść dolną płytę, ustawiając przełącznik wyboru proporcji w dół, a następnie włączając przełącznik pompy. Gdy dolna płyta jest całkowicie schowana, zmniejsz ciśnienie w układzie do zera, obracając zawór zwiększający ciśnienie całkowicie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.

Wyłącz pompę i wyłącz maszynę. Odwiruj eluant z prasy francuskiej w temperaturze 10 000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, aby usunąć nieuszkodzone komórki i resztki komórek. Wyrzucić osad i przenieść supernatant do probówek ultrawirówek.

Otrzymany supernatant należy odwirować ultra w temperaturze 150 000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę, aby osadzać pęcherzyki membranowe. Pęcherzyki błonowe przemyć jeden raz bez ponownego zawieszania w buforze drugim. Następnie użyj młynka do tkanek Dounce, aby ponownie zawiesić pęcherzyki błony w buforze drugim.

Przygotować 100 mikrolitrów podwielokrotności preparatów membranowych w 1,5 mililitrowych probówkach wirówkowych i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Najpierw umyj i ponownie zawieś pęcherzyki w 30 milimolach Tris o pH 7,8, które zawierają 0,1 milimola chlorku kobaltu II. Dodaj jeden mikrolitr karboksypeptydazy A w chlorku sodu, Tris i chlorku kobaltu II do każdej próbki o objętości 100 mikrolitrów.

Inkubować w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodać pięć mikrolitrów roztworu zawierającego EDTA sodu i 2-merkaptoetanol o pH 7,5, aby zatrzymać trawienie. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez godzinę, aby całkowicie dezaktywować enzym.

Następnie dodać od pięciu do 10 mikrolitrów roztworu zawierającego dodecylowy siarczan litu, glicerol, błękit bromofenolowy i Tris o pH od 7,5 do 100 mikrolitrów próbki i analizować próbki metodą elektroforezy. Aby przeprowadzić osuszanie amino, należy położyć filtr nitrocelulozowy zwilżony 25 milimolowym wodorofosforanem sodu na żelu poliakrylamidowym. Umieść je między dwoma zwilżonymi filtrami celulozowymi, a na koniec między dwoma zwilżonymi plastikowymi gąbkami do szorowania.

Umieść ten zestaw między elektrodami komory zawierającej 25 milimolowy wodorofosforan sodu w temperaturze od dwóch do czterech stopni Celsjusza. Elektrotransferuj białka pod napięciem 20 woltów i przy dwóch do trzech amperach przez trzy godziny. Zablokuj błonę nitrocelulozową w buforze blokującym przez noc w temperaturze dwóch stopni Celsjusza.

Następnego dnia inkubować nitrocelulozę w 20 mililitrach od jednego do 5 000 rozcieńczenia przeciwciała Anti-His C-end HRP i buforu blokującego przez dwie godziny i przemywać dwukrotnie 50 mililitrami buforu przez łącznie 60 minut. Aby uwidocznić amino blot, rozpuść sześć miligramów 4-chloro-1-naftolu w 20 mililitrach denaturowanego alkoholu i dodaj 80 mililitrów 15-milimolowego Tris i 50 mikrolitrów 30% nadtlenku wodoru. Kąpać bibułę filtracyjną w tym roztworze substratu przez 20 minut.

Gdy rozwinie się wystarczający kolor, spłucz membranę wodą i pozostaw do wyschnięcia. Na początek inkubuj 100 mikrolitrów porcji pęcherzyków błonowych w temperaturze 12 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodać bufor 3 zawierający znakowane radioizotopowo poliaminy o końcowym stężeniu 50 mikromolów do pęcherzyków membranowych w 1,5 mililitrowych probówkach mikrowirówkowych, aby rozpocząć transport.

Przeprowadzić test transportowy w temperaturze 12 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Następnie przenieś mieszaniny reakcyjne do kolektora filtracyjnego i przefiltruj je przez filtr membranowy nitrocelulozowy o średnicy 0,45 mikrometra. Dodać trzy mililitry lodowatego buforu testowego zawierającego dziesięciokrotnie wyższe stężenie nieznakowanych poliamin, a następnie trzy mililitry buforu testowego bez poliamin, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie.

Przenieś umyte filtry do 20-mililitrowych jednorazowych fiolek scyntylacyjnych zawierających 10 mililitrów cieczy scyntylacyjnej i użyj licznika scyntylacji cieczy w celu określenia radioaktywności. Obliczyć absorpcję poliaminy netto zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Określ Km dla substratu, mierząc wychwyt substratu znakowanego radioaktywnie do pęcherzyków wyrażających białko docelowe i oblicz kinetykę Michaelisa-Mentena przy użyciu metody regresji nieliniowej.

W przypadku eksperymentów konkursowych dodać nieznakowany substrat konkurencyjny wytworzony w buforze testowym do probówki wirówkowej zawierającej 100 mikrolitrów pęcherzyków w temperaturze 12 stopni Celsjusza, jednocześnie dodając 50 mikromolów znakowanej radioaktywnie poliaminy. Zmierzyć radioaktywność uwięzioną wewnątrz pęcherzyków, jak opisano wcześniej. Określ nadrzędny KM dla konkurencyjnych substratów, mierząc wychwyt poliamin znakowanych radioaktywnie i obecność 100 mikromolowych lub więcej nieznakowanego substratu i użyj metody regresji nieliniowej do wykreślenia krzywej.

W tym badaniu anty-porter charakteryzuje się najpierw ekspresją białka w E. coli, a następnie generowaniem pęcherzyków błonowych, dzięki czemu heterologicznie wyrażane białko można oznaczyć w systemie bezkomórkowym. Western blot służy do sprawdzenia, czy AtBAT1 jest przemieszczony do pęcherzyka. Sondowanie blot za pomocą C-końcowego przeciwciała anty-His ujawniło białko konstruktu fuzyjnego, które ma około 72,3 kilodaltonów.

Trawienie pęcherzyków przed SDS-PAGE spowodowało zmniejszenie, ale nie całkowitą utratę sygnału sondy. W temperaturze 12 stopni Celsjusza wychwyt znakowanej radioaktywnie spermidyny przez pęcherzyki jest najwyższy po jednej minucie i pozostaje liniowy przez trzy minuty. W związku z tym czas inkubacji dla testu transportowego ustala się na jedną minutę.

Po jednej minucie nie ma wychwytu netto izotopu przez pęcherzyki błonowe, które zostały przygotowane i przechowywane w pH 8,0, ponieważ nie ma gradientu protonów w poprzek błony pęcherzyka. Aby zademonstrować efekt rozpraszania sztucznego gradientu protonów, pęcherzyki błonowe inkubuje się w buforze o pH 8,0 przez 10 minut przed dodaniem znakowanego substratu, co prowadzi do minimalnego wychwytu substratu znakowanego radioaktywnie. Podsumowując, wyniki te wskazują, że wychwyt spermidyny przez protony jest spowodowany białkiem BAT1.

Aby określić specyficzność substratową białka, wartości Km oblicza się, mierząc wychwyt substratu znakowanego radioaktywnie w różnych stężeniach. Wartości Km dla spermidyny, putrescyny i argininy wskazują, że białko to jest wymiennikiem poliaminy i argininy o wysokim powinowactwie. Powinowactwo transportera do określonego substratu można również określić pośrednio za pomocą testów konkurencji.

Testy te ujawniają, że GABA jest kompetycyjnym inhibitorem spermidyny. Co więcej, pomiar wychwytu 50 mikromoli znakowanej radioaktywnie spermidyny w obecności różnych stężeń różnych aminokwasów ujawnia, że AtBAT1 jest również zdolny do transportu glutaminianu i alaniny w stężeniach milimolowych. Podczas wykonywania tej procedury integracja transportera błonowego z błoną bakteryjną jest oczywiście krytyczna.

Weryfikację, czy białko będące przedmiotem zainteresowania jest zintegrowane z błoną, można przeprowadzić przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko znacznikom C-końcowym. Zmienność genetyczna ludzkich transporterów może wpływać na transport zarówno metabolitów, jak i leków, które są substratami danego transportera. W związku z tym zmienność alleli może wpływać zarówno na wchłanianie, jak i wydalanie leków.

Wiele wariantów alleli można szybko wytworzyć przez mutagenezę ukierunkowaną bocznie genu transportera w wektorze ekspresyjnym. Testy funkcjonalne tych wariantów mogą być następnie testowane w bardzo kontrolowanych warunkach przy użyciu testów pęcherzykowych na lewą stronę. Transportery błonowe stanowią od 8 do 10 wszystkich białek, a większość z nich nie została w pełni scharakteryzowana w żadnym z organizmów modelowych.

Transportery, które są zlokalizowane w błonach organelli, są szczególnie trudne do scharakteryzowania przez heterologiczną ekspresję w komórkach eukariotycznych. Jeśli transportery typu wymiany lub protony mogą być zlokalizowane w tej błonie E. coli, transportery te można funkcjonalnie scharakteryzować za pomocą tego testu in vitro. Na jakość i wydajność pęcherzyków wpływa szybkość elucji fragmentów komórek z prasy francuskiej.

Podczas wykonywania testów transportu pęcherzyków z izotopami ważne jest, aby mieć zestaw eksperymentalny, który ułatwia przeprowadzanie replik eksperymentalnych. Można to zrobić na wiele sposobów, ale uważamy, że pomocne będzie dla nas pokazanie Ci, jak to zrobiliśmy.