Name: Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Poznaj metodę charakteryzacji transporterów błonowych napędzanych protonami przy użyciu pęcherzyków błonowych z E. coli. Technika ta umożliwia określenie powinowactwa substratu i mechanizmów transportu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie dla tego projektu pochodziło z BGSU Graduate College oraz Biura Programów Sponsorowanych i Badań BGSU.

1. Generacja podwójnie nokautującego mutanta E. coli z transdukcją P1
<ol>
	<li>Zmutowane szczepy E. coli z pojedynczym nokautem ΔPotE i ΔCadB należy uzyskać z Centrum Zasobów Genetycznych E. coli (<a href="http://cgsc.biology.yale.edu" target="_blank">http://cgsc.biology.yale.edu</a>). 
	nuta: Szczep ΔPotE jest odporny na kanamycynę26, a szczep ΔCadB jest odporny na tetracyklinę27.</li>
	<li>Zbuduj szczep PotE/CadB z podwójnym nokautem (DKO) przy użyciu protokołu transdukcji P128.
	<ol>
		<li>Przygotowanie lizatu
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć nocną hodowlę ΔPotE w świeżym LB (1:100) uzupełnionym 10-25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2 i 0,1-0,2% glukozy.</li>
			<li>Rosnąć w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny.</li>
			<li>Dodać 40 μl lizatu fagowego P1 do kultury i kontynuować wzrost w temperaturze 37 °C. Monitorować przez 1-3 godziny, aż hodowla ulegnie lizie 
			UWAGA: Gdy kultura jest poddawana lizie, w probówce będą widoczne resztki komórkowe, a kultura będzie miała znaczną utratę zmętnienia.</li>
			<li>Dodaj kilka kropli chloroformu (50-100 μl) do lizatu i wiruj. Wirować przy 12 000 x g przez 2 minuty w celu usunięcia resztek komórkowych i przeniesienia supernatantu do świeżej probówki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Transdukcji
		<ol>
			<li>Uprawiaj szczep ΔCadB przez noc na podłożu LB.</li>
			<li>Zebrać komórki przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić w 1/5-1/3 zebranej objętości kultury w świeżym LB uzupełnionym 100 mMMgSO4 i 5 mM CaCl2.</li>
			<li>Dodać zawiesinę komórek ΔCadB do probówki z fagiem z kroku 1.2.1.4 i szybko wymieszać.</li>
			<li>Dodać 200 μl 1 M cytrynianu na-cytrynianu (pH 5,5), a następnie dodać 1 ml LB. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić ekspresję markera oporności na antybiotyki.</li>
			<li>Wiruj komórki przy 4000 x g przez 5 min.</li>
			<li>Zawiesić ponownie w 100 μl LB uzupełnionym 100 mM cytrynianem na-cytrynianu (pH 5,5) i dobrze zmieszać, aby rozproszyć komórki.</li>
			<li>Wybierz rekombinowane szczepy na płytkach agarowych LB z 50 μg/ml kanamycyny i 10 μg/ml tetracykliny, a następnie potwierdź reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) z odpowiednimi starterami26,27.</li>
			<li>Zweryfikuj fragmenty PCR przez sekwencjonowanie.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekspresja genu docelowego (AtBAT1) w zmutowanym E. coli
<ol>
	<li>Amplifikuj pełną długość sekwencji genu docelowego metodą PCR i wprowadź do wektora wejściowego bramki pENTR/D-TOPO29. 
	nuta: W tym przypadku ATBAT1.1 amplifikowano za pomocą startera do przodu 5'CGGCGATCAATCCTTTGTT i startera wstecznego 5'GCTAAGAATGTTGGAGATGG, początkowej denaturacji w temperaturze 98 °C przez 2 min, a następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 0,1 min, wyżarzania w temperaturze 59 °C przez 0,3 min, przedłużania w temperaturze 72 °C przez 0,40 min i końcowego przedłużania w temperaturze 72 °C przez 10 min. Produkt PCR oczyszczono przy użyciu zestawu do czyszczenia PCR, oznaczonego ilościowo za pomocą spektrometru. Wprowadzenie produktu PCR do wektora Gateway odbyło się zgodnie ze wskazówkami producenta.
	<ol>
		<li>Przekształć wektor wejściowy w kompetentne komórki Top10 E. coli za pomocą szoku termicznego i wybierz udane rekombinanty na pożywkach LB z 50 μg / ml kanamycyny zgodnie ze standardowymi protokołami klonowania molekularnego30.</li>
		<li>Wyodrębnij plazmidowe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta i sekwencją, aby potwierdzić prawidłowe wprowadzenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś gen docelowy do wektora docelowego E. coli, pBAD-DEST49 przez klonowanie Gateway LR, aby utworzyć wektor wyrażenia29.
	<ol>
		<li>Przekształć wektor ekspresyjny w kompetentne komórki Top10 E. coli przez szok termiczny przez 30 s i wybierz udane rekombinanty na pożywce LB z 100 μg / ml ampicyliny30.</li>
		<li>Wyodrębnij plazmidowe DNA30 i sekwencjonuj, aby potwierdzić poprawną insercję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć wektor ekspresji w E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 i wybierz na płytkach LB z ampicyliną, kanamycyną i tetracykliną30.</li>
	<li>W celu określenia optymalnego stężenia arabinozy do indukcji, należy spryskać gen docelowy pod kontrolą promotora araBAD w pożywkach LB z gradientowymi stężeniami arabinozy, jak opisano29.</li>
	<li>Zbierz osady komórkowe i oceń ekspresję białka za pomocą SDS-PAGE i wizualizacji prążków białkowych zgodnie z opisem w instrukcji produktu29. 
	nuta: Jako próbkę kontrolną bez ekspresji BAT1 użyto E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10. Zmutowane komórki E.coli z podwójnym nokautem z pustym wektorem pBAD-DEST49 nie były stosowane jako kontrola ze względu na obecność genu ccdB w wektorze.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie pęcherzyków błonowych na lewą stronę
<ol>
	<li>Hodowla zmutowanych komórek E. coli wykazujących ekspresję białka docelowego poprzez wyhodowanie pojedynczej kolonii przez noc w 5 ml pożywki wolnej od poliaminy (2% glicerolu, 6 gK2HPO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl, NH4Cl, 50 mg tiaminy, 0,79 g drożdży kompletne syntetyczne pożywki hemisulfian adeniny (10 mg / L), L-arginina (50 mg/L), kwas L-asparaginowy (80 mg/L), L-chlorowodorek histydyny jednowodny (20 mg/L), L-leucyna (100 mg/L), chlorowodorek L-lizyny (50 mg/L), L-metionina (20 mg/L), L-fenyloalanina (50 mg/L), L-treonina (100 mg/L), L-tryptofan (50 mg/L), L-tyrozyna (50 mg/L), L-walina (140 mg/L), Uracyl (20 mg/L)). Przenieś tę kulturę do 500 ml pożywki bez poliaminy uzupełnionej 0,0002% arabinozy i hoduj, aż kultura komórkowa osiągnie OD600 0,6-0,8 (zwykle ~5 godzin).</li>
	<li>Zebrać osad komórkowy przez odwirowanie w stężeniu 2 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad i przepłukać trzykrotnie 0,1 M buforem fosforanu potasu o pH 6,6, zawierającym 10 mM EDTA (bufor 1). Ostateczna objętość komórek w buforze 1 po trzecim wirowaniu powinna wynosić 10 ml.</li>
	<li>Wygeneruj pęcherzyki błonowe od wewnątrz na zewnątrz przez obróbkę French Press (10 000 psi) nienaruszonych komórek za pomocą 35 ml francuskiej komory ciśnieniowej.</li>
	<li>Przed załadowaniem próbki do standardowej francuskiej komory ciśnieniowej należy nasmarować tłok i pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym, aby ułatwić włożenie do ogniwa. 
	nuta: Poniższe instrukcje dotyczą korzystania ze standardowej komory ciśnieniowej31.
	<ol>
		<li>Ostrożnie wkręć zatyczkę zamykającą w dolny koniec ogniwa. Upewnij się, że komórka jest skierowana prawą stroną do góry zgodnie z literą z boku komórki. Włóż tłok do komórki i przenieś go do komórki, aż linia maksymalnego napełnienia tłoka dotrze do górnej części tłoka. Odwróć urządzenie i umieść je na dostarczonym stojaku między trzema słupkami.</li>
		<li>Wlać zawiesinę komórkową do korpusu komórki. 
		nuta: Do tej pory zużywaliśmy tylko 10 ml, więc we francuskiej komorze ciśnieniowej o pojemności 35 ml zostanie jeszcze dużo miejsca.</li>
		<li>Zamontuj standardową komorę ciśnieniową na francuskim zespole komory ciśnieniowej.
		<ol>
			<li>Najpierw sprawdź, czy zasilanie jest wyłączone. Po lewej stronie panelu znajduje się przełącznik wyboru proporcji. Ma trzy pozycje: Dół na końcu cyklu, Niska do korzystania z mniejszej celi ciśnieniowej i Wysoka do użytku ze standardową francuską komorą ciśnieniową. Jeśli prasa francuska była wcześniej używana z mniejszą komórką, tłok może nie być całkowicie cofnięty. Ustaw ten przełącznik w pozycji W dół.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Włącz maszynę za pomocą przełącznika na RHS z tyłu urządzenia i ustaw przełącznik Pauza-Praca w pozycji Praca. Spowoduje to całkowite cofnięcie tłoka. Przesuń przełącznik z powrotem do pozycji Pauza i wyłącz urządzenie.</li>
		<li>Poluzuj radełkowane i przesuń na bok zacisk zabezpieczający, który obejmuje dwie kolumny ze stali nierdzewnej. Wychyli się w prawo. Jedną ręką trzymając podstawę korka zamykającego na miejscu, podnieś francuską komorę ciśnieniową obiema rękami i obróć ją o 180°, tak aby tłok znalazł się teraz w pozycji pionowej. Ustaw go na platformie i przesuń zacisk bezpieczeństwa z powrotem na miejsce, tak aby ten zacisk utrzymywał francuską komorę ciśnieniową na miejscu.</li>
		<li>Należy pamiętać, że zespół zaworu przepływowego na korku zamykającym musi być dostępny dla operatora i umieszczony tak, aby zawór można było swobodnie obracać. Otwórz zespół zaworu przepływowego, wykonując kilka obrotów w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Ustawić ramiona tłoka tak, aby były zorientowane w pozycji godziny drugiej i ósmej. Dokręć skrzydełkowe tak, aby standardowa komora ciśnieniowa została utrzymana na miejscu.</li>
		<li>Włóż rurkę wylotową próbki do zatyczki zamykającej i podłącz krótki kawałek elastycznej rurki, aby uszkodzone resztki komórek można było zebrać w probówce Falcon. Zwykle używamy zlewki wypełnionej lodem o pojemności 300 ml, aby utrzymać rurkę sokoła w pozycji pionowej i utrzymać resztki komórek w chłodzie.</li>
		<li>Upewnij się, że przełącznik Pauza-Praca jest ustawiony w pozycji Pauza, a zespół zaworu jest w pozycji otwartej. Włącz maszynę z powrotem, ustaw przełącznik wyboru proporcji w pozycji wysokiej i przekręć zawór zwiększania ciśnienia na panelu przednim w prawo o około pół obrotu.</li>
		<li>Tłok zacznie unosić się od podstawy, aby wyprzeć powietrze w komorze. Skierować powietrze wychodzące z rurki Tygon podłączonej do rurki wylotowej próbki do rurki w zlewce.</li>
		<li>Gdy wypłyną pierwsze krople płynu, zamknij zespół zaworu przepływowego, obracając go zgodnie z ruchem wskazówek zegara. W ten sposób powstaje uszczelnienie metal-metal z ogniwem ciśnieniowym, więc nie dokręcaj zbyt mocno.</li>
		<li>Z przodu French Press znajduje się wykres na przednim panelu, który wytwarza odpowiednie ciśnienie na komórkach biologicznych wewnątrz komory ciśnieniowej. W takim przypadku zwiększ ciśnienie, obracając zawór zwiększający ciśnienie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż manometr osiągnie 640 psi. Spowoduje to wytworzenie ciśnienia wewnętrznego o wartości 10 000 psi.</li>
		<li>Gdy ogniwo osiągnie ciśnienie docelowe, otwórz lekko zespół zaworu przepływowego, obracając go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Wyreguluj otwarcie zaworu, aby umożliwić przepływ tylko około 10 kropli na minutę.</li>
		<li>Gdy linia zatrzymania na korpusie tłoka osiąga górną część komory przepływowej. Przełącz przełącznik Pauza-Uruchom w pozycji Pauza. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ włożenie tłoka głębiej w ogniwo spowoduje uszkodzenie urządzenia. Otwórz zespół zaworu przepływowego i zbierz pozostałe krople.</li>
		<li>Ustaw przełącznik Selektor proporcji w pozycji W dół, a następnie ustaw przełącznik Pause Run (Wstrzymaj bieg) w pozycji Run (Biegnij). Gdy dolna płyta jest całkowicie schowana, ustaw przełącznik Run w pozycji Pauza i wyłącz maszynę.</li>
		<li>Wyjmij francuską komórkę ciśnieniową z prasy francuskiej i zdemontuj w celu czyszczenia. Przechowuj wszystkie części w suchym miejscu, lekko przykrywając glicerolem. Usuń i wymień wszelkie uszczelki lub uszczelki noszące ślady zużycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć nieuszkodzone komórki i resztki komórek eluentu z prasy francuskiej przez odwirowanie w temperaturze 10 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić osad i przenieść supernatant do probówek ultrawirówek.</li>
	<li>Pęcherzyki membranowe osadu z otrzymanego supernatantu przez ultrawirowanie w temperaturze 150 000 g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć pęcherzyki membranowe raz, bez ponownego zawieszania, w 1 mM tris-maleinianu o pH 5,2 zawierającym 0,14 M KCl, 2 mM 2-merkaptoetanolu i 10% glicerolu i ponownie zawiesić w tym samym buforze (Buffer 2)23 za pomocą młynka do tkanek Dounce. Zazwyczaj frakcja błonowa z 500 ml kultury byłaby zawieszona w 5 ml buforu o stężeniu 5-10 mg białka błonowego / ml przy użyciu testu kwasu biochińskiego < klasa sup = "xref">32.</li>
	<li>Przechowywać 100 μl porcji preparatów membranowych w temperaturze -80 °C w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
4. Western Blot i orientacja testu transportera
<ol>
	<li>Umyj i ponownie zawieś pęcherzyki z kroku 3,7 w 30 mM Tris pH 7,8 + 0,1 mM CoCl2.</li>
	<li>Do 100 μl próbek dodać 1 μl karboksypeptydazy A o stężeniu 2 mg/ml w 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl2 pH 7,8.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w temperaturze 20 °C. Zatrzymać trawienie, dodając 5 μl 0,5 M NaEDTA, 0,5 M 2-merkaptoetanolu o pH 7,5.</li>
	<li>Aby całkowicie dezaktywować enzym, inkubować roztwór przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	nuta: Jako kontrolę stosowano pęcherzyki bez leczenia katboksypeptydazą A.</li>
	<li>Analizować próbki metodą elektroforezy w obecności dodecylosiarczanu litu. Dodać 5-10 μl 150 mg/ml dodecylowego siarczanu litu, 450 mg/ml glicerolu, 0,1 mg/ml błękitu bromofenolowego, 0,4 M Tris pH 7,5 do 100 μl próbki.</li>
	<li>Przeprowadzić immunoblotting, kładąc filtr nitrocelulozowy zwilżony 25 mM wodorofosforanem sodu o pH 7,5 na żelu poliakrylamidowym. Umieść je między dwoma zwilżonymi filtrami celulozowymi, a na końcu między dwoma zwilżonymi plastikowymi gąbkami do szorowania. Umieścić ten zestaw między elektrodami komory zawierającej 25 mM wodorofosforanu sodu o pH 7,5 w temperaturze 2-4 °C.</li>
	<li>Pozostawić elektrotransfer białek przez 3 godziny przy napięciu 20 V i natężeniu 2-3 A.</li>
	<li>Zablokuj membranę nitrocelulozową na noc w temperaturze 2 °C w buforze blokującym 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5 i 0,5 mg/ml Tween 2033.</li>
	<li>Inkubować filtr nitrocelulozowy przez 2 godziny w rozcieńczeniu 1:5000 przeciwciała Anti-His (C-terminal)-HRP w buforze blokującym (20 ml) i przemywać dwukrotnie 50 ml buforu przez łącznie 60 minut.</li>
	<li>Aby uwidocznić immunoblot, rozpuść 6 mg 4-chloro-1-naftolu w 20 ml denaturatu alkoholu i dodaj 80 ml 15 mM Tris pH 7,5 i 50 μL 30% H2O2 . Kąpać bibułę filtracyjną w roztworze podłoża przez 20 minut. Odczynnik zareaguje z przeciwciałem, tworząc niebieski osad na membranie nitrocelulozowej. Gdy rozwinie się wystarczający kolor, spłucz membranę wodą i pozostaw do wyschnięcia.</li>
</ol>
5. Test transportu
<ol>
	<li>Inkubować 100 μl porcji pęcherzyków błonowych w temperaturze 12 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Rozpocząć transport, dodając do pęcherzyków błonowych znakowane radioizotopowo poliaminy o końcowym stężeniu 50 μM (o ile nie zaznaczono inaczej). Przygotuj 3roztwory substratu H (spermidyna lub putrescyna) w buforze testowym składającym się z 10 mM Tris-HCl, 10 mM fosforanu potasu, pH 8,0 i 0,14 M KCl23 (Bufor 3) z modyfikacjami w zależności od testu.</li>
	<li>Przeprowadzać testy transportowe przez 1 minutę w temperaturze 12 °C w probówkach do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Po upływie 1 minuty przenieść mieszaniny reakcyjne do kolektora filtracyjnego i przefiltrować przez filtr membranowy nitrocelulozowy o wielkości 0,45 μm.
	<ol>
		<li>Dodać 3 ml lodowatego buforu testowego zawierającego 10-krotnie wyższe stężenie nieznakowanych poliamin, a następnie 3 ml buforu testowego bez poliamin w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania.</li>
		<li>Przenieść umyte filtry do jednorazowych fiolek scyntylacyjnych o pojemności 20 ml zawierających 10 ml cieczy scyntylacyjnej i określić radioaktywność za pomocą licznika scyntylacyjnego cieczy. Licznik scyntylacyjny mierzy radioaktywność w próbce i podaje ją jako rozpady na minutę (dpm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć wychwyt netto poliaminy jako różnicę między wychwytem po 1 minucie przez pęcherzyki inkubowane w temperaturze 12 °C a wychwytem po 0 minutach przez pęcherzyki inkubowane na lodzie. 
	nuta: Masę substratu importowanego do pęcherzyków oblicza się w następujący sposób. Jeśli objętość próbki w probówce do mikrofuge wynosi 0,2 μL, a początkowe stężenie substratu wynosi 100 μM, to całkowita masa substratu w probówce do mikrofuge wynosi 20 x 10-12 M. Ze względu na bardzo wysoką aktywność właściwą komercyjnie znakowanych substratów (często 2,22 x 109 dpm/mM) masa dodanego izotopu może być pominięta w obliczeniach. Tak więc, jeśli całkowita ilość izotopu, która została dodana do probówki mikrofuge, wynosiła 100 x 106 dpm, a pęcherzyki miały pobór netto 1,000 dpm, to całkowita masa substratu pobranego przez pęcherzyki wynosiła 1% całkowitej liczby moli substratu lub 2 x 10-13 M.
	<ol>
		<li>Oznaczyć Km dla substratu, mierząc wychwyt 10, 25, 50, 250 i 500 μM znakowanego radioaktywnie substratu do pęcherzyków wykazujących ekspresję białka docelowego. Oblicz kinetykę Michaelisa-Mentena przy użyciu metody regresji nieliniowej przy użyciu modelu Michaelisa Mentona pakietu oprogramowania statystycznego34.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku doświadczeń konkursowych dodać 100 μM, 500 μM, 1 mM, 1,5 mM lub 2 mM nieznakowanego konkurencyjnego substratu wytworzonego w buforze testowym do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 100 μl pęcherzyków w temperaturze 12 °C.
	<ol>
		<li>Dodać jednocześnie znakowany radioizotopowo poliaminę (50 μM) do probówki mikrowirówkowej.</li>
		<li>Zmierzyć radioaktywność uwięzioną wewnątrz pęcherzyków, jak wspomniano powyżej, powtarzając kroki od 5 do 5.4.2.</li>
		<li>Określić pozorne Km (Km, app) dla konkurencyjnych substratów, mierząc wychwyt 10, 25, 50, 250 i 500 μM znakowanych radioizotopem poliamin w obecności 100 μM lub więcej nieznakowanego substratu i stosując metodę regresji nieliniowej do wykreślenia krzywej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Haferkamp, I., Linka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+and+characterisation+of+membrane+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology+%28Stuttgart%29%22%5BJournal%5D)">Functional expression and characterisation of membrane transport proteins.</a> Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).</li>
<li>Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+Chlorella+hexose+transporter+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).</li>
<li>Sauer, N., Stolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUC1+and+SUC2%3A+two+sucrose+transporters+from+Arabidopsis+thaliana%3B+expression+and+characterization+in+baker%27s+yeast+and+identification+of+the+histidine-tagged+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein.</a> The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).</li>
<li>Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+sugar+transporters+during+seed+development%3A+molecular+characterization+of+a+hexose+and+a+sucrose+carrier+in+fava+bean+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds.</a> Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).</li>
<li>Huang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GhDREB1+enhances+abiotic+stress+tolerance%2C+delays+GA-mediated+development+and+represses+cytokinin+signalling+in+transgenic+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis.</a> Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).</li>
<li>Bassham, D. C., Raikhel, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cells+are+not+just+green+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plant cells are not just green yeast.</a> Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).</li>
<li>Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+dynamics+of+aggresome+formation+by+a+cytosolic+GFP-chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera.</a> Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).</li>
<li>Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+copper-dependent+endocytosis+and+vacuolar+degradation+of+the+yeast+copper+transporter%2C+Ctr1p%2C+by+the+Rsp5+ubiquitin+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase.</a> Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).</li>
<li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li>
<li>Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+inward-rectifying+potassium+channel+by+the+Arabidopsis+KAT1+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA.</a> Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).</li>
<li>Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+plant+plasma+membrane+transporter+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes.</a> FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).</li>
<li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).</li>
<li>Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+LjSUT4%2C+a+vacuolar+sucrose+transporter+from+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus.</a> Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).</li>
<li>Kovermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+vacuolar+malate+channel+is+a+member+of+the+ALMT+family%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family.</a> The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).</li>
<li>Blattner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li>
<li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production%3A+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), e29191(2011).</li>
<li>Takabatake, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cDNAs+encoding+mitochondrial+phosphate+transporters+in+soybean%2C+maize%2C+rice%2C+and+Arabidopis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis.</a> Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).</li>
<li>Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+transporter+for+dicarboxylates+and+tricarboxylates+in+plant+mitochondria.+Bacterial+expression%2C+reconstitution%2C+functional+characterization%2C+and+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).</li>
<li>Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tonoplast+Glu%2FAsp%2FGABA+exchanger+that+affects+tomato+fruit+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition.</a> The Plant Journal. 81 (5), (2015).</li>
<li>Kashiwagi, K., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+assays+of+polyamine+transport+systems+in+Escherichia+coli+and+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).</li>
<li>Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excretion+of+putrescine+by+the+putrescine-ornithine+antiporter+encoded+by+the+potE+gene+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).</li>
<li>Tsuchiya, T., Rosen, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transport+driven+by+a+proton+gradient+and+inverted+membrane+vesicles+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li>
<li>Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+Tn10+insertion+sites+in+a+collection+of+Escherichia+coli+strains+used+for+genetic+mapping+and+strain+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction.</a> Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).</li>
<li>Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).</li>
<li>Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+Cloning%3A+a+laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a laboratory Manual</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).</li>
<li>GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+biochinic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using biochinic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wright, J. K., Overath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+lactose%3A+H%2B+carrier+of+Escherichia+coli+and+characterization+of+galactoside+binding+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport.</a> European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).</li>
<li>PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).</li>
<li>Kirchberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biochemical+analysis+of+the+plastidic+ADP-glucose+transporter+%28ZmBT1%29+from+Zea+mays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).</li>
<li>Deniaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+chloroplast+ATP%2FADP+transporter+in+E.+coli+membranes%3A+behind+the+Mistic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).</li>
<li>Sze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-Translocating+ATPases%3A+Advances+Using+Membrane+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles.</a> Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).</li>
<li>Bush, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-coupled+sugar+and+amino+acid+transporters+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants.</a> Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).</li>
<li>Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+membrane+vesicle+from+Escherichea+coli+prepared+by+different+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures.</a> Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).</li>
<li>Seckler, R., Wright, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sideness+of+native+membrane+vesicles+of+Escherichea+coli+and+orientation+of+the+reconstituted+lactose%3A+H%2B+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).</li>
<li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).</li>
<li>Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+effects+of+N-terminal+codon+bias+in+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes.</a> Science. 342 (6157), 475-479 (2013).</li>
<li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+in+Campylobacter+jejuni+and+its+functional+transfer+into+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli.</a> Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym badaniu przedstawiamy metodę charakterystyki antyportera poprzez najpierw ekspresję białka w E. coli , a następnie generowanie pęcherzyków błonowych, tak aby heterologicznie wyrażane białko można było oznaczyć w systemie bezkomórkowym. Oprócz sprzętu znajdującego się w większości laboratoriów biologii molekularnej, strategia ta wymaga użycia prasy francuskiej, ultrawirówki i dostępu do obiektu do przeprowadzania testów radioizotopowych.
Podstawowym wymogiem tej techniki j...

Białka biorące udział w transporcie metabolitów stanowią niezbędny poziom regulacji fizjologicznej, ale zdecydowana większość transporterów błon roślinnych nie została jeszcze funkcjonalnie scharakteryzowana. Wdrożono kilka strategii w celu scharakteryzowania nowych białek transportowych. Heterologiczna ekspresja w organizmach modelowych, takich jak E. coli i komórkach eukariotycznych, takich jak drożdże, oocyty Xenopus, komórki ssaków, komórki owadów i komórki roślinne, została wykorzystana do określenia ich aktywności transportowej1. Komórki eukariotyczne są preferowane do ekspresji białek eukariotycznych, ponieważ podstawowy skład komórkowy, szlaki transdukcji sygnału, mechanizmy transkrypcji i translacji są zgodne z warunkami natywnymi.
Drożdże były ważnym organizmem modelowym do charakterystyki nowych białek transportowych w roślinach. Pierwszym białkiem transportowym roślinnym, które z powodzeniem uległo ekspresji w drożdżach (Saccharomyces pombe) był transporter heksozy HUP1 z Chlorella2. Od tego czasu wiele białek transportowych roślin zostało funkcjonalnie scharakteryzowanych przy użyciu systemu ekspresji drożdży. Należą do nich transportery cukru roślinnego (SUC1 i SUC23, VfSUT1 i VfSTP14) oraz transportery auksyny (AUX1 i PIN5). Wady wykorzystania drożdży do ekspresji białek roślinnych mogą obejmować upośledzoną aktywność białek zlokalizowanych plastydowo, ponieważ drożdże nie mają tych organelli, błędne ukierunkowanie6 oraz tworzenie nieprawidłowo sfałdowanych agregatów i aktywację reakcji stresowych u drożdży z powodu nadekspresji białek błonowych7,8,9.
Heterologiczna ekspresja białek transportowych w oocytach Xenopus była szeroko stosowana do elektrofizjologicznej charakterystyki transporterów10. Pierwszymi białkami transportowymi roślin scharakteryzowanymi za pomocą ekspresji heterologicznej w oocytach Xenopus były kanał potasowy Arabidopsis KAT110 i transporter heksozy Arabidopsis STP111. Od tego czasu oocyty Xenopus zostały wykorzystane do scharakteryzowania wielu białek transportu roślinnego, takich jak transportery błony komórkowej12, wakuolarny transporter sacharozy SUT413 i transporter jabłczanu wakuolarnego ALMT914. Ważnym ograniczeniem oocytów Xenopus do oznaczania transportu jest to, że nie można manipulować stężeniem metabolitów wewnątrzkomórkowych1. Ponadto do przygotowania oocytów Xenopus potrzebna jest fachowa wiedza, a zmienność partii oocytów jest trudna do kontrolowania.
Heterologiczna ekspresja w organizmie modelowym E. coli jest idealnym systemem pod względem charakterystyki nowych białek transportu roślinnego. Dzięki w pełni zsekwencjonowanemu genome15, molekularne i fizjologiczne cechy E. coli są dobrze znane. Narzędzia i techniki molekularne są dobrze znane16. Ponadto dostępne są różne wektory ekspresji, niepatogenne szczepy i mutanty17,18,19. Ponadto E. coli ma wysokie tempo wzrostu i może być łatwo uprawiana w warunkach laboratoryjnych. Wiele białek może być łatwo eksprymowanych i oczyszczanych w dużych ilościach w E. coli9. W sytuacji, gdy białka nie mogą być oznaczane bezpośrednio w systemach komórkowych, rekonstytucja białek w liposomach była również udaną, choć trudną innowacją w zakresie charakterystyki oczyszczonych białek błonowych. Funkcjonalna charakterystyka mitochondrialnych białek transportowych roślin, w tym transporterów substancji rozpuszczonych, takich jak transportery fosforanów w soi, kukurydzy, ryżu i rzodkiewniku, nośnik dikarboksylanowo-trikarboksylowy u Arabidopsis, została osiągnięta przy użyciu tego systemu modelowego20,21. Jednak w eksperymentach rekonstytucji stwierdzono, że rekombinowane białka pomidora SICAT9 nie działają, a inni członkowie rodziny transporterów CAT są niefunkcjonalni w testach oocytów Xenopus22. W związku z tym potrzebne są dodatkowe narzędzia molekularne do scharakteryzowania transporterów błonowych.
W E. coli23 znajduje się pięć systemów transportu poliamin. Obejmują one dwa transportery ABC pośredniczące w wychwytywaniu spermidyny i putrescyny, wymiennik putrescyna/ornityna, wymiennik kadaweryna/lizyna, eksporter spermidyny i importer putrescyny. Wymiennik putrescyny PotE został pierwotnie scharakteryzowany za pomocą testu pęcherzykowego, w którym pęcherzyki wywrócone na lewą stronę zostały przygotowane przez lizę komórek za pomocą prasy francuskiej i pomiar wychwytu znakowanej radioaktywnie putrescyny do pęcherzyków w zamian za ornitynę24. Testy pęcherzykowe wykorzystano również do scharakteryzowania transportera wapnia, który pośredniczył w transporcie wapnia w odpowiedzi na gradient protonów25. Eksperymenty te skłoniły nas do opracowania strategii charakterystyki innych wymienników poliaminowych. Najpierw stworzyliśmy szczep E. coli z niedoborem wymienników PotE i CadB. W tym miejscu demonstrujemy funkcjonalną charakterystykę roślinnego antyportera poliaminowego poprzez ekspresję heterlogiczną w zmodyfikowanym szczepie E. coli, generowanie pęcherzyków błonowych za pomocą prasy francuskiej i testy znakowane radioaktywnie.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3H-putrescyna</td><td>PerkinElmer</td><td>NET185001MC</td><td></td></tr><tr><td>3H-spermidyna</td><td>PerkinElmer</td><td>NET522001MC</td><td></td></tr><tr><td>4-chloro-1-naftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8890</td><td></td></tr><tr><td>14C arginina</td><td>Moravek Inc.</td><td>MC137</td><td></td></tr><tr><td>Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5006</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-His (C-term)-HRP</td><td>ThermoFisher</td><td>R931-25</td><td>Wykrywa C-końcowy znacznik polihistydyny (6xHis), wymaga wolnej grupy karboksylowej do wykrycia</td></tr><tr><td>Arabinoza</td> Zestaw do oznaczania białek <td>BCA Sigma-Aldrich A3256</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Pierce BCA zestaw.</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0404</td><td></td></tr><tr><td>Karboksypeptydaza B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9584-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorvall</td><td></td><td>SS-34 o stałym kącie nachylenia i GA-6 o stałym kącie</td></tr><tr><td>rozdrabniania Młynek do tkanek</td><td>LabGenome</td><td>7777-7</td><td>Corning 7777-7 homogenizator pyrexowy z dziobkiem.</td></tr><tr><td>Ecoscint-H</td><td>National Diagnostics</td><td>LS275</td> koktajl <td>scyntylacyjny</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolektor filtracyjny</td><td>Hoefer</td><td>FH225V</td><td></td></tr><tr><td>Francuska komórka ciśnieniowa</td><td>Glen Mills</td><td>FA-080A120</td> GABA Sigma-Aldrich A2129 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6904</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td> Glycerol <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> GraphPad Prism<a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>KROGER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>Licznik scyntylacyjny cieczy</td><td>Beckman</td><td>LS-6500</td><td></td></tr><tr><td>Maleate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtry membranowe nitrocelulozowe</td><td>Merck Millipore</td><td>hawp02500</td><td>0,45 i mikro; </td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia M PCR</td><td>Genscript</td><td></td><td>QuickClean II</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>ThermoFisher</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>putrescyna</td><td>fluka</td><td>32810</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>J.T.Baker</td><td>4008</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma-aldrich</td><td>S2501</td><td></td></tr><tr><td>Szczepy: E. coli i Delta; potE740(del)::kan, &Delta; cadB2231::Tn10</td><td>Ten manuskrypt</td><td>dostępny na żądanie.</td><td>Niedobór szczepu występuje w wymiennikach poliaminowych PotE i CadB.</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Research Products</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Sorvall MTX 150</td><td>46960</td><td>Thermo Fisher S150-AT z wirnikiem o stałym kącie</td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek</td><td>ThermoFisher</td><td>45237</td><td>Probówki wirówkowe do wirnika S150-AT</td></tr><tr><td>Wektor: pBAD-DEST49</td><td>Wektor wyrażenia ThermoFisher Gateway dla E. coli</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u e. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Opracowano kilka metod do funkcjonalnego charakteryzowania nowych transporterów membranowych. Poliaminy są wszechobecne we wszystkich organizmach, ale wymienniki poliaminowe w roślinach nie zostały zidentyfikowane. W tym miejscu przedstawiamy metodę charakteryzowania antyporterów poliaminowych za pomocą pęcherzyków błonowych powstałych w wyniku lizy komórek Escherichia coli heterologicznie eksprymujących antyporter roślinny. Po pierwsze, heterologicznie eksprymowaliśmy AtBAT1 w szczepie E. coli z niedoborem transporterów wymiany poliaminy i argininy. Pęcherzyki wyprodukowano za pomocą prasy francuskiej, oczyszczono przez ultrawirowanie i wykorzystano w teście filtracji membranowej znakowanych substratów w celu wykazania specyficzności substratu transportera. Testy te wykazały, że AtBAT1 jest transporterem argininy, kwasu γ-aminomasłowego (GABA), putrescyny i spermidyny, za pośrednictwem protonów. Zmutowany szczep, który został opracowany do testu AtBAT1, może być przydatny do analizy funkcjonalnej innych rodzin roślinnych i zwierzęcych wymienników poliaminowych. Stawiamy również hipotezę, że to podejście może być wykorzystane do scharakteryzowania wielu innych typów antyporterów, o ile białka te mogą ulegać ekspresji w błonie komórkowej bakterii. E. coli jest dobrym systemem do charakterystyki nowych transporterów, ponieważ istnieje wiele metod, które można zastosować do mutagenizacji rodzimych transporterów.

Główne etapy niniejszego protokołu zostały przedstawione schematycznie na Rysunku 1. W skrócie: komórki E. coli pozbawione wszystkich wymienników poliamin i wykazujące ekspresję AtBAT1 są hodowane, odwirowywane, płukane buforem, a następnie poddawane lizie komórkowej za pomocą prasy francuskiej. Liza ta prowadzi zazwyczaj do powstania pęcherzyków, które w większości są wywinięte na drugą stronę (inside-out) i więżą bufor znajdujący się poza ...

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Jedną z kluczowych zalet tej techniki charakteryzowania transporterów błonowych jest to, że można określić względne powinowactwo transportera do określonych substratów, a także uzyskać wgląd w mechanizm transportu. Charakterystyka białek błonowych, które wykorzystują gradienty białek do napędzania transportu substratu, jest szczególnie odpowiednia dla tego testu pęcherzykowego na lewą stronę, który tutaj pokazujemy. Chociaż test ten wymaga specjalistycznego sprzętu, takiego jak francuska prasa i dostęp do ultrawirówki, uważamy, że może być technicznie łatwiejszy niż testy, które wymagają odtworzenia transporterów membranowych w sztucznych liposomach.Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia nam ilościowe określenie względnego powinowactwa do różnych substratów i przeprowadzenie testów konkurencji w celu przetestowania wpływu konkurencyjnych substratów na ruszty transportowe. W przypadku transportera BAT1 użytego do zilustrowania tego testu, udało nam się również pokazać aktywację substratu transportera przez argininę. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować przygotowane zmutowane komórki E. coli, które wyrażają docelowe białko, zaszczepiając pojedynczą kolonię w pięciu mililitrach pożywki poliaminowej 3 odpowiednimi antybiotykami i hodując ją przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia przenieś tę kulturę do 500 mililitrów świeżej pożywki z poliaminy 3, która jest uzupełniona 0,0002% arabinozy i hoduj, aż hodowla komórkowa osiągnie OD600 między 0,6 a 0,8. Następnie odwirować w temperaturze 2000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut, aby zebrać osad komórkowy. Ponownie zawiesić osad i przemyć go trzykrotnie buforem pierwszym, wirując w temperaturze 2000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut za każdym razem.Ostateczna objętość komórek w buforze pierwszym po trzecim wirowaniu powinna wynosić 10 mililitrów. Ustaw francuską celę ciśnieniową o pojemności 35 mililitrów i wlej zawiesinę ogniwa do korpusu ogniwa. Włącz maszynę za pomocą przełącznika na RHS z tyłu urządzenia i ustaw przełącznik wyboru proporcji w pozycji wysokiej.Włącz przełącznik pompy. Tłok zacznie unosić się od podstawy, aby wyprzeć powietrze w komorze. Zwiększ ciśnienie, obracając zawór zwiększający ciśnienie zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż manometr osiągnie 640 PSI.Spowoduje to wytworzenie ciśnienia wewnętrznego o wartości 10 000 PSI. Gdy ogniwo osiągnie ciśnienie docelowe, lekko otwórz zespół zaworu przepływowego, obracając go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Dostosuj otwarcie zaworu, aby umożliwić natężenie przepływu tylko około 10 kropli na minutę.Gdy linia zatrzymania na korpusie tłoka dotrze do górnej części komory przepływowej, wyłącz pompę. Opuść dolną płytę, ustawiając przełącznik wyboru proporcji w dół, a następnie włączając przełącznik pompy. Gdy dolna płyta jest całkowicie schowana, zmniejsz ciśnienie w układzie do zera, obracając zawór zwiększający ciśnienie całkowicie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.Wyłącz pompę i wyłącz maszynę. Odwiruj eluant z prasy francuskiej w temperaturze 10 000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, aby usunąć nieuszkodzone komórki i resztki komórek. Wyrzucić osad i przenieść supernatant do probówek ultrawirówek.Otrzymany supernatant należy odwirować ultra w temperaturze 150 000 razy G i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę, aby osadzać pęcherzyki membranowe. Pęcherzyki błonowe przemyć jeden raz bez ponownego zawieszania w buforze drugim. Następnie użyj młynka do tkanek Dounce, aby ponownie zawiesić pęcherzyki błony w buforze drugim.Przygotować 100 mikrolitrów podwielokrotności preparatów membranowych w 1,5 mililitrowych probówkach wirówkowych i przechowywać je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Najpierw umyj i ponownie zawieś pęcherzyki w 30 milimolach Tris o pH 7,8, które zawierają 0,1 milimola chlorku kobaltu II. Dodaj jeden mikrolitr karboksypeptydazy A w chlorku sodu, Tris i chlorku kobaltu II do każdej próbki o objętości 100 mikrolitrów.Inkubować w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 20 minut. Dodać pięć mikrolitrów roztworu zawierającego EDTA sodu i 2-merkaptoetanol o pH 7,5, aby zatrzymać trawienie. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez godzinę, aby całkowicie dezaktywować enzym.Następnie dodać od pięciu do 10 mikrolitrów roztworu zawierającego dodecylowy siarczan litu, glicerol, błękit bromofenolowy i Tris o pH od 7,5 do 100 mikrolitrów próbki i analizować próbki metodą elektroforezy. Aby przeprowadzić osuszanie amino, należy położyć filtr nitrocelulozowy zwilżony 25 milimolowym wodorofosforanem sodu na żelu poliakrylamidowym. Umieść je między dwoma zwilżonymi filtrami celulozowymi, a na koniec między dwoma zwilżonymi plastikowymi gąbkami do szorowania.Umieść ten zestaw między elektrodami komory zawierającej 25 milimolowy wodorofosforan sodu w temperaturze od dwóch do czterech stopni Celsjusza. Elektrotransferuj białka pod napięciem 20 woltów i przy dwóch do trzech amperach przez trzy godziny. Zablokuj błonę nitrocelulozową w buforze blokującym przez noc w temperaturze dwóch stopni Celsjusza.Następnego dnia inkubować nitrocelulozę w 20 mililitrach od jednego do 5 000 rozcieńczenia przeciwciała Anti-His C-end HRP i buforu blokującego przez dwie godziny i przemywać dwukrotnie 50 mililitrami buforu przez łącznie 60 minut. Aby uwidocznić amino blot, rozpuść sześć miligramów 4-chloro-1-naftolu w 20 mililitrach denaturowanego alkoholu i dodaj 80 mililitrów 15-milimolowego Tris i 50 mikrolitrów 30% nadtlenku wodoru. Kąpać bibułę filtracyjną w tym roztworze substratu przez 20 minut.Gdy rozwinie się wystarczający kolor, spłucz membranę wodą i pozostaw do wyschnięcia. Na początek inkubuj 100 mikrolitrów porcji pęcherzyków błonowych w temperaturze 12 stopni Celsjusza przez pięć minut. Dodać bufor 3 zawierający znakowane radioizotopowo poliaminy o końcowym stężeniu 50 mikromolów do pęcherzyków membranowych w 1,5 mililitrowych probówkach mikrowirówkowych, aby rozpocząć transport.Przeprowadzić test transportowy w temperaturze 12 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Następnie przenieś mieszaniny reakcyjne do kolektora filtracyjnego i przefiltruj je przez filtr membranowy nitrocelulozowy o średnicy 0,45 mikrometra. Dodać trzy mililitry lodowatego buforu testowego zawierającego dziesięciokrotnie wyższe stężenie nieznakowanych poliamin, a następnie trzy mililitry buforu testowego bez poliamin, aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie.Przenieś umyte filtry do 20-mililitrowych jednorazowych fiolek scyntylacyjnych zawierających 10 mililitrów cieczy scyntylacyjnej i użyj licznika scyntylacji cieczy w celu określenia radioaktywności. Obliczyć absorpcję poliaminy netto zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Określ Km dla substratu, mierząc wychwyt substratu znakowanego radioaktywnie do pęcherzyków wyrażających białko docelowe i oblicz kinetykę Michaelisa-Mentena przy użyciu metody regresji nieliniowej.W przypadku eksperymentów konkursowych dodać nieznakowany substrat konkurencyjny wytworzony w buforze testowym do probówki wirówkowej zawierającej 100 mikrolitrów pęcherzyków w temperaturze 12 stopni Celsjusza, jednocześnie dodając 50 mikromolów znakowanej radioaktywnie poliaminy. Zmierzyć radioaktywność uwięzioną wewnątrz pęcherzyków, jak opisano wcześniej. Określ nadrzędny KM dla konkurencyjnych substratów, mierząc wychwyt poliamin znakowanych radioaktywnie i obecność 100 mikromolowych lub więcej nieznakowanego substratu i użyj metody regresji nieliniowej do wykreślenia krzywej.W tym badaniu anty-porter charakteryzuje się najpierw ekspresją białka w E. coli, a następnie generowaniem pęcherzyków błonowych, dzięki czemu heterologicznie wyrażane białko można oznaczyć w systemie bezkomórkowym. Western blot służy do sprawdzenia, czy AtBAT1 jest przemieszczony do pęcherzyka. Sondowanie blot za pomocą C-końcowego przeciwciała anty-His ujawniło białko konstruktu fuzyjnego, które ma około 72,3 kilodaltonów.Trawienie pęcherzyków przed SDS-PAGE spowodowało zmniejszenie, ale nie całkowitą utratę sygnału sondy. W temperaturze 12 stopni Celsjusza wychwyt znakowanej radioaktywnie spermidyny przez pęcherzyki jest najwyższy po jednej minucie i pozostaje liniowy przez trzy minuty. W związku z tym czas inkubacji dla testu transportowego ustala się na jedną minutę.Po jednej minucie nie ma wychwytu netto izotopu przez pęcherzyki błonowe, które zostały przygotowane i przechowywane w pH 8,0, ponieważ nie ma gradientu protonów w poprzek błony pęcherzyka. Aby zademonstrować efekt rozpraszania sztucznego gradientu protonów, pęcherzyki błonowe inkubuje się w buforze o pH 8,0 przez 10 minut przed dodaniem znakowanego substratu, co prowadzi do minimalnego wychwytu substratu znakowanego radioaktywnie. Podsumowując, wyniki te wskazują, że wychwyt spermidyny przez protony jest spowodowany białkiem BAT1.Aby określić specyficzność substratową białka, wartości Km oblicza się, mierząc wychwyt substratu znakowanego radioaktywnie w różnych stężeniach. Wartości Km dla spermidyny, putrescyny i argininy wskazują, że białko to jest wymiennikiem poliaminy i argininy o wysokim powinowactwie. Powinowactwo transportera do określonego substratu można również określić pośrednio za pomocą testów konkurencji.Testy te ujawniają, że GABA jest kompetycyjnym inhibitorem spermidyny. Co więcej, pomiar wychwytu 50 mikromoli znakowanej radioaktywnie spermidyny w obecności różnych stężeń różnych aminokwasów ujawnia, że AtBAT1 jest również zdolny do transportu glutaminianu i alaniny w stężeniach milimolowych. Podczas wykonywania tej procedury integracja transportera błonowego z błoną bakteryjną jest oczywiście krytyczna.Weryfikację, czy białko będące przedmiotem zainteresowania jest zintegrowane z błoną, można przeprowadzić przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko znacznikom C-końcowym. Zmienność genetyczna ludzkich transporterów może wpływać na transport zarówno metabolitów, jak i leków, które są substratami danego transportera. W związku z tym zmienność alleli może wpływać zarówno na wchłanianie, jak i wydalanie leków.Wiele wariantów alleli można szybko wytworzyć przez mutagenezę ukierunkowaną bocznie genu transportera w wektorze ekspresyjnym. Testy funkcjonalne tych wariantów mogą być następnie testowane w bardzo kontrolowanych warunkach przy użyciu testów pęcherzykowych na lewą stronę. Transportery błonowe stanowią od 8 do 10 wszystkich białek, a większość z nich nie została w pełni scharakteryzowana w żadnym z organizmów modelowych.Transportery, które są zlokalizowane w błonach organelli, są szczególnie trudne do scharakteryzowania przez heterologiczną ekspresję w komórkach eukariotycznych. Jeśli transportery typu wymiany lub protony mogą być zlokalizowane w tej błonie E. coli, transportery te można funkcjonalnie scharakteryzować za pomocą tego testu in vitro. Na jakość i wydajność pęcherzyków wpływa szybkość elucji fragmentów komórek z prasy francuskiej.Podczas wykonywania testów transportu pęcherzyków z izotopami ważne jest, aby mieć zestaw eksperymentalny, który ułatwia przeprowadzanie replik eksperymentalnych. Można to zrobić na wiele sposobów, ale uważamy, że pomocne będzie dla nas pokazanie Ci, jak to zrobiliśmy.

characterization-membrane-transporters-heterologous-expression-e-coli

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym protokole przedstawiamy ekspresję, solubilizację i oczyszczanie rekombinowanego białka błonowego MexB w formie rozpuszczalnego kompleksu białko-detergent. MexB jest błonowym transporterem oporności wielolekowej pochodzącym z oportunistycznego patogenu bakteryjnego Pseudomonas aeruginosa.

Ekspresja, solubilizacja w detergencie i oczyszczanie transportera błonowego – białka oporności wielolekowej MexB

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

β-beczkowate białka błony zewnętrznej (OMP) pełnią wiele funkcji w zewnętrznych błonach bakterii Gram-ujemnych, mitochondriów i chloroplastów. W tym miejscu mamy nadzieję złagodzić znane wąskie gardło w badaniach strukturalnych poprzez przedstawienie protokołów produkcji β-beczkowych OMP w ilościach wystarczających do określenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub spektroskopii NMR.

Od konstruktów do kryształów – w kierunku określania struktury β-baryłkowych białek błony zewnętrznej

Przedstawiono protokół produkcji, oczyszczania i stosowania pęcherzyków z zewnętrzną błoną upakowaną enzymem (OMV), zapewniający zwiększoną stabilność enzymów do zastosowania w różnych zastosowaniach.

Ukierunkowane pakowanie białka w pęcherzykach błony zewnętrznej z Escherichia coli: projektowanie, produkcja i oczyszczanie

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Przedstawione tutaj są protokoły tworzenia małych jednopłytkowych pęcherzyków opartych na peptydach, zdolnych do wzrostu. Aby ułatwić produkcję pęcherzyków peptydu błonowego, pęcherzyki te są wyposażone w system transkrypcyjno-translacyjny i plazmid kodujący peptydy.

In Vesiculo Synteza prekursorów błony peptydowej do autonomicznego wzrostu pęcherzyków

Kotranslacyjna insercja do wstępnie uformowanych nanodysków umożliwia badanie bezkomórkowych syntetyzowanych białek błonowych w określonych środowiskach lipidowych bez kontaktu z detergentami. Protokół ten opisuje przygotowanie podstawowych komponentów systemu oraz parametry krytyczne dla poprawy wydajności odciągania i jakości próbki.

Kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków

Ten protokół opisuje efektywną metodę produkcji wysokiej jakości proteoliposomu metodą dializy dwuwarstwowej przy użyciu systemu bezkomórkowego pszenicy i liposomów. Metoda ta zapewnia odpowiednie środki do analizy funkcjonalnej białek błonowych, badań przesiewowych celów leków i opracowywania przeciwciał.

Bezkomórkowa produkcja proteoliposomów do analizy funkcjonalnej i rozwoju przeciwciał ukierunkowanych na białka błonowe

Ten artykuł przedstawia protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę w celu scharakteryzowania białka Cdr1 Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), którego nadekspresja występuje w Saccharomyces cerevisiae. Podwójny znacznik c-końcowy mGFPHis z rozszczepialnym proteazą z łącznikiem 16 reszt między Cdr1 a znacznikiem został zaprojektowany w celu ułatwienia oczyszczania i przesiewania detergentem Cdr1.

Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Obecny protokół opisuje szczegółową metodę produkcji przez bakterie białek rekombinowanych, w tym zazwyczaj nierozpuszczalnych lub zawierających wiązania dwusiarczkowe, upakowanych wewnątrz pęcherzyków związanych z błoną zewnątrzkomórkową. Ma to potencjał do zastosowania w różnych obszarach badań naukowych, w tym w biotechnologii stosowanej i medycynie.

Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli

Ten protokół opisuje metodę odwróconej emulsji używaną do hermetyzacji systemu ekspresji bezkomórkowej (CFE) w gigantycznym pęcherzyku jednowarstwowym (GUV) w celu zbadania syntezy i włączenia modelowego białka błonowego do dwuwarstwy lipidowej.

Rekonstrukcja kanału receptora glutaminianu bakteryjnego poprzez enkapsulację bezkomórkowego systemu ekspresji

Poznaj metodę charakteryzacji transporterów błonowych napędzanych protonami przy użyciu pęcherzyków błonowych z E. coli. Technika ta umożliwia określenie powinowactwa substratu i mechanizmów transportu.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

Przeglądaj więcej filmów