Name: Izolacja podzbiorów makrofagów i komórek zrębu z próbek mięśnia sercowego u ludzi i myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj metodę izolacji podzbiorów makrofagów i komórek zrębu z mięśnia sercowego u ludzi i myszy. Technika ta umożliwia badanie heterogeniczności komórek immunologicznych w procesach zapalenia i naprawy serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był możliwy dzięki finansowaniu z Children's Discovery Institute of Washington University i St. Louis Children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Foundation of Barnes-Jewish Hospital (8038-88) i NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. jest wspierany przez NIH K08 HL123519 i Burroughs Welcome Fund (1014782).

Przedstawiony protokół został zatwierdzony przez Washington University in St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Wszyscy uczestnicy wyrażają świadomą zgodę przed pobraniem próbki, a eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z zatwierdzonym protokołem badania. Prezentowany protokół jest wykonywany za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Washington University School of Medicine i jest zgodny z wytycznymi opisanymi w Przewodniku NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie próbek tkanek ludzkiego serca
<ol>
	<li>Przepłukać wyczyszczone serca przez kaniulację ujścia lewej i prawej tętnicy wieńcowej i perfuzję 200 ml zimnego soli fizjologicznej.</li>
	<li>Przepłukać wierzchołkowe tkanki rdzeniowe LVAD przez kaniulację naczynia nasierdziowego i perfuzję 50 ml zimnej soli fizjologicznej.</li>
	<li>Wypreparuj próbkę tkanki z wierzchołkowej lub bocznej ściany lewej komory w zimnym roztworze soli fizjologicznej lub HBSS za pomocą sterylnych nożyczek.</li>
	<li>Ostrożnie wypreparuj tłuszcz nasierdziowy i struny ścięgniste z próbki za pomocą cienkich nożyczek.</li>
	<li>Rozciąć fragmenty tkanek na kawałki o wadze około 200 mg za pomocą sterylnego ostrza lub nożyczek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie Serca Myszy
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2 lub zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową za pomocą ostrych nożyczek. Użyj hemostatów, aby podnieść serce do góry. Wykonać perfuzję serca zimnym PBS za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki o pojemności 5 ml. Perfuzuj, aż serce stanie się blanowane.</li>
	<li>Wyjmij serce i umieść na sterylnej szalce Petriego na lodzie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki
<ol>
	<li>Umieść kawałki ludzkiej tkanki serca (~200 mg) lub mysie serce na sterylnej szalce Petriego. Drobno zmiel tkankę za pomocą sterylnego ostrza lub nożyczek.</li>
	<li>Ustaw trawienie:
	<ol>
		<li>Użyj końcowej objętości trawienia 3 ml na fragment ludzkiej tkanki serca (200 mg) lub na jedno mysie serce. Końcowe stężenia enzymów są następujące: kolagenaza1 (450 U/ml), DNaza1 (60 U/ml), hialuronidaza (60 U/ml).</li>
		<li>Do każdej reakcji trawienia dodać DMEM i wszystkie enzymy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Za pomocą czystych kleszczy umieść drobno zmieloną tkankę w każdej probówce reakcyjnej. Dobrze wymieszaj, delikatnie wirując.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawić przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na niską lub średnią prędkość mieszania.</li>
	<li>Po 1 godzinie trawienia wyjąć probówki z inkubatora i umieścić na lodzie. Ustaw stożkowe probówki o pojemności 50 ml z sitkiem o pojemności 40 μm na górze. Zwilżyć filtry 2 ml buforu dezaktywującego enzymy (ED).</li>
	<li>Dezaktywuj enzymy wytrawiające, dodając 8 ml buforu ED do każdej probówki wytrawiającej. Następnie wlej powstałą mieszaninę o objętości 13 ml przez sitko o pojemności 40 μm do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Przenieść próbki z powrotem do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umożliwia to optymalne granulowanie komórek i minimalizuje ich utratę podczas wirowania.</li>
	<li>Wirować próbki w temperaturze 400 x g przez 6 minut (wirówka ustawiona na 4 °C). Odrzucić sklarowany osad, pozostawiając 0,5 ml pożywki. Zawiesić osad komórkowy przez delikatne pipetowanie i dodać 1 ml buforu do lizy ACK. Delikatnie zakręć probówką i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby przeprowadzić lizę czerwonych krwinek (RBC).</li>
	<li>Po 5 minutach w buforze ACK dodać 9 ml DMEM do próbki. Załóż pokrywkę z powrotem na probówki i delikatnie odwróć probówki, aby się wymieszały, a następnie przefiltruj przez sitko o wielkości 40 μm. Zebrać filtrat do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować probówki o masie 400 x g przez 6 minut i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu FACS i ponownie zawiesić osad. Następnie przenieść do komórek w buforze FACS do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Ponownie odwirować przy 400 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu FACS. Zawiesina pojedynczej komórki jest teraz gotowa do barwienia przeciwciałami.</li>
</ol>
4. Barwienie przeciwciał
<ol>
	<li>Typowy ludzki panel przeciwciał składa się z następujących przeciwciał: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Proszę zapoznać się z Tabelą 1. Dodać wszystkie przeciwciała do próbek serca w rozcieńczeniu 1:50 i inkubować przez ~30-40 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Przejdź do kroku 4.4 poniżej.</li>
	<li>W przypadku komórek zrębu (komórki śródbłonka, fibroblasty, komórki mięśni gładkich) dodać DRAQ5 (stężenie końcowe 1 μM) i CD45-percpCy5.5. Proszę zapoznać się z Tabelą 1. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Przejdź do kroku 4.4 poniżej.</li>
	<li>W przypadku makrofagów serca mysiego dodaj następujące przeciwciała: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 i Ly6G-FITC. Proszę zapoznać się z Tabelą 2. Dodać wszystkie przeciwciała do próbek serca w rozcieńczeniu 1:100 i inkubować przez ~30-40 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Przejdź do kroku 4.4 poniżej.</li>
	<li>Umyć próbki dwukrotnie w buforze FACS. Do każdego przemywania dodać 1 ml buforu FACS, delikatnie odwirować i odwirować przy 400 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić w 350 μl buforu FACS i dodać DAPI (1 μM, stężenie końcowe). Próbki są teraz gotowe do analizy/sortowania metodą FACS.</li>
</ol>

<ol><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), e36814(2012).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+facilitate+electrical+conduction+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages facilitate electrical conduction in the heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+macrophages+promote+diastolic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction.</a> Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).</li>
<li>Aurora, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+are+required+for+neonatal+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophages are required for neonatal heart regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).</li>
<li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li>
<li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li>
<li>Leid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primitive+embryonic+macrophages+are+required+for+coronary+development+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation.</a> Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).</li>
<li>Bajpai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+heart+contains+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+origins+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions.</a> Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).</li>
<li>Dick, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewing+resident+cardiac+macrophages+limit+adverse+remodeling+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction.</a> Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).</li>
<li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół pozwala na ekstrakcję różnych podzbiorów makrofagów z ludzkiego mięśnia sercowego. Protokół jest prosty i zajmuje od 3 do 4 godzin, aby przygotować zawiesinę pojedynczej komórki gotową do analizy FACS. Chociaż protokół jest stosunkowo prosty do wykonania, istnieją pewne aspekty techniczne, które należy wziąć pod uwagę, co zminimalizuje zmienność. Po pierwsze, praca w odpowiednim czasie z tkanką ludzką jest niezbędna do optymalnej żywotności komórek. Ważne jest, aby utrzymywać tkankę w zimnym roztworze soli fizjo...

Makrofagi reprezentują najliczniejszy typ komórek odpornościowych w sercu i odgrywają znaczącą rolę w generowaniu silnych reakcji zapalnych i naprawczych po urazie serca1,2,3,4. Wcześniej nasza grupa zidentyfikowała dwa główne podzbiory makrofagów w mysim sercu, pochodzące z różnych źródeł rozwojowych5,6. Ogólnie rzecz biorąc, można zidentyfikować odrębne populacje podzbiorów makrofagów sercowych rezydujących w tkankach na podstawie ekspresji CCR2 (receptor chemokiny z motywem C-C 2). Makrofagi CCR2 (ekspresja powierzchni komórki: CCR2-MHCIIniska iCCR2-MHCII wysoka) są pochodzenia embrionalnego (linie pierwotne i erytromieloidalne), zdolne do samoodnawiania się i reprezentują populację dominującą w warunkach homeostazy. Makrofagi rezydentne CCR2 + są ostatecznego pochodzenia hematopoetycznego, są utrzymywane poprzez rekrutację z krążących monocytów i reprezentują niewielką populację w warunkach homeostatycznych. Funkcjonalnie, makrofagi CCR2- generują minimalny stan zapalny i mają kluczowe znaczenie dla rozwoju naczyń wieńcowych regeneracja serca noworodków5,7. W przeciwieństwie do tego, makrofagi CCR2+ inicjują silne reakcje zapalne po urazach serca i przyczyniają się do pobocznego uszkodzenia kardiomiocytów, niekorzystnej przebudowy lewej komory i progresji niewydolności serca8,9.
Ostatnio wykazaliśmy, że ludzki mięsień sercowy zawiera również dwa odrębne podzbiory makrofagów zidentyfikowane podobnie jak CCR2- lub CCR2+8. Ekspresja genów i analizy funkcjonalne wykazały, że ludzkie makrofagi CCR2 i CCR2+ reprezentują funkcjonalnie rozbieżne podzbiory i są funkcjonalnie analogiczne do makrofagów CCR2 i CCR2+ znajdujących się w sercu myszy. Ludzkie makrofagi CCR2- wyrażają silne poziomy czynników wzrostu, w tym IGF1, PDGF, Cyr61 i HB-EGF. Makrofagi CCR2+ są wzbogacone w chemokiny i cytokiny sprzyjające zapaleniu, takie jak IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 i TNF-a. Stymulowane makrofagi CCR2+ wydzielają znacznie wyższe poziomy cytokiny zapalnej interleukiny-1β (IL-1β) w hodowli. To, w jaki sposób te podzbiory w różny sposób przyczyniają się do naprawy tkanek i przebudowy lewej komory (LV) w kontekście uszkodzenia serca, pozostaje obszarem aktywnych badań.
Analiza heterogeniczności makrofagów w sercu myszy i człowieka oparta na cytometrii przepływowej wymaga trawienia tkanki serca i wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki, a następnie analizy cytometrycznej przepływowej lub sortowania komórek do dalszych procesów, takich jak sekwencjonowanie masowego RNA/sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki lub hodowla komórek do testów funkcjonalnych. Oryginalny protokół wytwarzania zawiesiny pojedynczej komórki z mysich serc został po raz pierwszy opisany przez grupę Nahrendorfa w Nahrendorf et al. 200710. Nasze laboratorium dostosowało i zmodyfikowało protokół ekstrakcji makrofagów z ludzkiego mięśnia sercowego. Korzystając z tego samego protokołu, ale z niewielkimi modyfikacjami w schemacie barwienia i bramkowania, można również pobrać komórki zrębu CD45 z ludzkiego mięśnia sercowego. Przedstawiony tutaj, w tekście i filmie, jest protokołem, który jest wykonywany rutynowo w celu ekstrakcji makrofagów lub zrębu z ludzkiego mięśnia sercowego.
Próbki tkanek serca są pobierane od dorosłych pacjentów z kardiomiopatią rozstrzeniową (DCM: idiopatyczną lub rodzinną) lub kardiomiopatią niedokrwienną (ICM) poddawanych implantacji urządzenia wspomagającego lewą komorę (LVAD) lub przeszczepowi serca. Eksplantowane serca lub rdzenie LVAD są donaczyniowo perfundowane zimną solą fizjologiczną przed rozpoczęciem procedury trawienia. Należy zauważyć, że "jakość" próbki tkanki określona pod kątem stopnia bliznowacenia lub naciekania tkanki tłuszczowej może mieć duży wpływ na wydajność makrofagów. Próbki serca z dużymi obszarami bliznowacenia będą miały znacznie niższą wydajność komórek i mogą stanowić poważne ograniczenie techniczne, gdy pożądane metody dalszej analizy wymagają hodowli komórek in vitro.

<table><tbody><tr><td>15 ml Probówki konoczne</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Sitka komórkowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-828-736</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurki stożkowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>ACK Bufor do lizy</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza 1</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Sigma</td><td>D4527-20KU</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Thermo Fisher</td><td>62251</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M pH 8</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> dezaktywujący enzymy <td>490 ml HBSS, 10 ml FBS, 1 g</td></tr><tr><td>BSA FACS Bufor</td><td></td><td></td><td>976 ml PBS, 20 ml FBS, 4 ml EDTA (0,5 M)</td></tr><tr><td>Płód Surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>A3840201</td><td></td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1x</td><td>Gibco</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatyki</td><td>VWR</td><td>63042-052</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza typ 1-s</td><td>Sigma</td><td>H3506-500MG</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>172931 Żyletka</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja podzbiorów makrofagów i komórek zrębu z próbek mięśnia sercowego u ludzi i myszy

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Makrofagi reprezentują najbardziej heterogeniczne i obfite populacje komórek odpornościowych w sercu i odgrywają kluczową rolę w wywoływaniu stanów zapalnych i reakcjach naprawczych po urazie serca. Sposób, w jaki różne podzbiory makrofagów koordynują odpowiedzi immunologiczne po urazie serca, jest aktywnym obszarem badań. Przedstawiono tutaj prosty protokół, który nasze laboratorium wykonuje rutynowo, w celu ekstrakcji makrofagów z próbek mięśnia sercowego myszy i ludzi uzyskanych od osób zdrowych i chorych. Krótko mówiąc, protokół ten obejmuje enzymatyczne trawienie tkanki serca w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki, a następnie barwienie przeciwciał i cytometrię przepływową. Technika ta nadaje się do testów funkcjonalnych wykonywanych na posortowanych komórkach, a także do sekwencjonowania RNA masowych i jednokomórkowych. Główną zaletą tego protokołu jest jego prostota, minimalna codzienna zmienność i szerokie zastosowanie, umożliwiające badanie heterogeniczności makrofagów w różnych modelach mysich i ludzkich jednostkach chorobowych.

Opisany protokół umożliwia izolację makrofagów z mięśnia sercowego myszy i człowieka. Stosując ten sam protokół, ale inną strategię barwienia i bramkowania, można również pozyskać komórki zrębowe z ludzkiego mięśnia sercowego. Przedstawione tutaj wyniki FACS uzyskano na platformie BD LSRII lub BD FACS ARIA III. Kontrole kompensacji wygenerowano z próbek kontrolnych pojedynczego barwnika z barwionych splenocytów. Rycina 1 przedstawia nieprzetworzony i przetwor...

Prezentowany tutaj jest protokół izolowania różnych podzbiorów makrofagów i innych komórek nieimmunologicznych z mięśnia sercowego ludzkiego i mysiego poprzez przygotowanie zawiesiny pojedynczej komórki poprzez trawienie enzymatyczne. Przedstawiono również schematy bramkowania do identyfikacji i charakterystyki izolowanych makrofagów w oparciu o cytometrię przepływową.

Izolacja podzbiorów makrofagów i komórek zrębu z próbek mięśnia sercowego u ludzi i myszy

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

Serce zawiera niejednorodną populację komórek odpornościowych, które odgrywają kluczową rolę w zapaleniu serca, a także w jego naprawie. Aby zrozumieć heterogeniczność komórek odpornościowych i uzyskać dalszy wgląd w ich funkcję, ważne jest, aby mieć metodę, która pozwoli na odzyskanie tych komórek z serca. Ta technika może pomóc w odkryciu różnorodności komórek zarówno immunologicznych, jak i nieimmunologicznych, które znajdują się w zdrowym lub chorym sercu.Technika ta ma trzy główne zalety. Po pierwsze, jest to prosty pojedynczy przepływ pracy, który prowadzi do wygenerowania zawiesiny pojedynczej komórki różnych typów komórek w ciągu trzech godzin. Po drugie, prowadzi do wysokiej odbudowy żywotnych populacji komórek immunologicznych i nieimmunologicznych.Po trzecie, jest to bardzo wszechstronna metoda i może być stosowana również do tkanek serca u innych gatunków. Ważne jest zwrócenie uwagi na ilość tkanki używanej do pojedynczej reakcji trawienia. Użyj sterylnych nożyczek, wypreparuj próbkę tkanki z wierzchołkowej lub bocznej ściany lewej komory w zimnym roztworze soli fizjologicznej lub HBSS.Ostrożnie wypreparuj tłuszcz nasierdziowy i struny ścięgniste z próbki. Za pomocą sterylnego ostrza lub nożyczek rozetnij kawałki tkanki na kawałki o wadze około 200 miligramów. Po eutanazji myszy otwórz jamę klatki piersiowej za pomocą ostrych nożyczek.Użyj hemostatów, aby podnieść serce do góry. Przelej serce zimnym PBS za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do pięciomililitrowej strzykawki. Perfuzuj, aż serce stanie się blanowane.Wyjmij serce i umieść je na sterylnej szalce Petriego na lodzie. Umieść 200 miligramów kawałków ludzkiej tkanki serca lub mysiego serca na sterylnej szalce Petriego. Drobno zmiel tkankę za pomocą sterylnego ostrza lub nożyczek.Aby skonfigurować trawienie, w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów przygotuj końcową objętość trawienia wynoszącą trzy mililitry na każdy fragment ludzkiej tkanki serca lub jedno mysie serce z enzymami kolagenazą I, DNazą I i hialuronidazą w stężeniach 450, 60 i 60 jednostek na mililitr. Dodaj 2,5 mililitra DMEM do probówki. Za pomocą czystych kleszczy umieść drobno zmieloną tkankę w każdej probówce reakcyjnej.Dobrze wymieszaj, delikatnie wirując. Trawić przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na niską lub średnią prędkość mieszania. Po godzinie trawienia wyjmij probówki z inkubatora i umieść je na lodzie.Ustaw 50-mililitrowe stożkowe probówki z sitkiem o średnicy 40 mikronów na górze. Zwilż filtry dwoma mililitrami buforu dezaktywującego enzymy. Następnie dezaktywuj enzymy wytrawiające, dodając osiem mililitrów buforu dezaktywującego enzymy do każdej probówki wytrawiającej.Następnie wlej powstałe 13 mililitrów całkowitej mieszaniny przez sitko o średnicy 40 mikronów do stożkowych probówek o średnicy 50 mililitrów. Przefiltrowane próbki przenieść z powrotem do świeżych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Wirować próbki pod ciśnieniem 400 razy g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wyrzucić supernatant, pozostawiając 0,5 mililitra pożywki. Ponownie zawiesić osad komórkowy przez delikatne pipetowanie i dodać jeden mililitr buforu do lizy ACK. Delikatnie zakręć probówką i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby przeprowadzić lizę czerwonych krwinek.Po pięciu minutach w buforze ACK dodaj dziewięć mililitrów DMEM do próbki. Załóż pokrywkę z powrotem na probówki i delikatnie odwróć probówki, aby się wymieszać. Przefiltrować przez sitko komórkowe o średnicy 40 mikronów i zebrać filtrat w stożkowych probówkach o pojemności 15 mililitrów.Odwirować probówki o ciśnieniu 400 g przez sześć minut i wyrzucić supernatant. Dodaj jeden mililitr buforu FACS i ponownie zawieś osad. Następnie przenieś go do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.Odwirować ponownie w temperaturze 400 razy g przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu FACS. Zawiesina pojedynczej komórki jest teraz gotowa do barwienia przeciwciałami.Dodać typowy panel przeciwciał ludzkich do próbek serca w rozcieńczeniu od jednego do 50. Używaj różnych przeciwciał dla komórek zrębu i makrofagów mysiego serca. Inkubować przez 30 do 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.Dodaj jeden mililitr buforu FACS, delikatnie zwiruj i odwiruj 400 razy g przez pięć minut. Powtórz ten krok prania po raz drugi. Następnie ponownie zawiesić próbkę w 350 mikrolitrach buforu FACS i dodać DAPI, aby osiągnąć końcowe stężenie jednego mikromola.Próbki są teraz gotowe do analizy FACS. W tym protokole osiągnięto izolację makrofagów z mięśnia sercowego myszy i człowieka. Ten rysunek przedstawia nieprzetworzony i przetworzony ludzki rdzeń LVAD.Przedstawiono schemat bramkowania dla sortowania przepływowego makrofagów ludzkich CCR2 ujemnych i CCR2 dodatnich z ludzkiego mięśnia sercowego, a także dla komórek zrębowych CD45 z ludzkiej kardiomiopatii niedokrwiennej. Obrazy komórek CD45 i CD45 ujemnych posortowanych przez Wrighta FACS pokazują nienaruszoną błonę komórkową wskazującą na żywotność. Schemat bramkowania w celu oddzielenia makrofagów od serca myszy również się powiódł.Masa tkanki użytej do reakcji enzymatycznej ma kluczowe znaczenie dla efektywnego trawienia. Używaj nie więcej niż 200 miligramów tkanki dla stężeń enzymów wskazanych w protokole. Zgodnie z tą metodą komórki mogą być hodowane do testów stymulacji in vitro.Komórki można sortować do sekwencjonowania masowego RNA lub sekwencjonowania pojedynczych komórek. Metoda ta posłużyła jako nieoceniona technika w odkrywaniu wcześniej nierozpoznanej heterogeniczności makrofagów, która jest obecna w zdrowym lub chorym ludzkim sercu. Stosując tę metodę, a następnie sekwencjonowanie pojedynczych komórek, trwają badania mające na celu odkrycie, w jaki sposób różne komórki odpornościowe i nieimmunologiczne różnią się od chorego serca w porównaniu ze zdrowym sercem.

isolation-macrophage-subsets-stromal-cells-from-human-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Przedstawiamy protokół generowania pierwotnych kultur mysich i ludzkich komórek zrębu przełyku z fenotypem miofibroblastów. Hodowane komórki mają morfologię wrzecionowatą, wykazują ekspresję α-SMA i wimentyny oraz nie mają markerów powierzchni komórek nabłonkowych, krwiotwórczych i śródbłonkowych. Scharakteryzowane komórki zrębu mogą być wykorzystane w badaniach funkcjonalnych oddziaływań nabłonkowo-zrębowych.

Izolacja miofibroblastów z przełyku myszy i człowieka

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Ten protokół pozwala badaczowi na wyizolowanie i scharakteryzowanie makrofagów rezydujących w tkankach w różnych charakterystycznych tkankach objętych stanem zapalnym, pobranych z modeli zaburzeń metabolicznych wywołanych dietą.

Izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością

W tym artykule przedstawiono metodę izolowania mezenchymalnych komórek zrębu serca z próbek bioptycznych endomiokardiów pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną. Opisano ich charakterystykę oraz protokół zwiększający ich różnicowanie adipogenne.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębowych serca z próbek bioptycznych endomięśnia sercowego pacjentów z kardiomiopatią arytmogenną

Ta komunikacja opisuje metodologie izolacji i hodowli makrofagów pęcherzykowych od ludzi oraz modeli mysich do celów eksperymentalnych.

Izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych

Ten protokół przedstawia prostą i efektywną metodę izolacji, identyfikacji i ilościowego oznaczania komórek odpornościowych znajdujących się w mięśniu sercowym myszy podczas stanu stacjonarnego lub zapalnego. Protokół łączy trawienie enzymatyczne i mechaniczne w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki, która może być dalej analizowana za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i identyfikacja pozanaczyniowych komórek odpornościowych serca

Zoptymalizowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania mysich perycytów serca do podstawowych badań i badania ich potencjału biologicznego i terapeutycznego.

Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Przedstawiony tutaj protokół krok po kroku pozwala na izolację makrofagów rezydujących w sercu z obszaru węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) i węzła przedsionkowo-komorowego (AVN) w sercach myszy.

Izolacja i hodowla rezydentnych makrofagów sercowych z mysiego węzła zatokowo-przedsionkowego i przedsionkowo-komorowego

Poznaj metodę izolacji podzbiorów makrofagów i komórek zrębu z mięśnia sercowego u ludzi i myszy. Technika ta umożliwia badanie heterogeniczności komórek immunologicznych w procesach zapalenia i naprawy serca.

Izolacja podzbiorów makrofagów i komórek zrębu z próbek mięśnia sercowego u ludzi i myszy

Przeglądaj więcej filmów