Izolacja podzbiorów makrofagów i komórek zrębu z próbek mięśnia sercowego u ludzi i myszy

Serce zawiera niejednorodną populację komórek odpornościowych, które odgrywają kluczową rolę w zapaleniu serca, a także w jego naprawie. Aby zrozumieć heterogeniczność komórek odpornościowych i uzyskać dalszy wgląd w ich funkcję, ważne jest, aby mieć metodę, która pozwoli na odzyskanie tych komórek z serca. Ta technika może pomóc w odkryciu różnorodności komórek zarówno immunologicznych, jak i nieimmunologicznych, które znajdują się w zdrowym lub chorym sercu.

Technika ta ma trzy główne zalety. Po pierwsze, jest to prosty pojedynczy przepływ pracy, który prowadzi do wygenerowania zawiesiny pojedynczej komórki różnych typów komórek w ciągu trzech godzin. Po drugie, prowadzi do wysokiej odbudowy żywotnych populacji komórek immunologicznych i nieimmunologicznych.

Po trzecie, jest to bardzo wszechstronna metoda i może być stosowana również do tkanek serca u innych gatunków. Ważne jest zwrócenie uwagi na ilość tkanki używanej do pojedynczej reakcji trawienia. Użyj sterylnych nożyczek, wypreparuj próbkę tkanki z wierzchołkowej lub bocznej ściany lewej komory w zimnym roztworze soli fizjologicznej lub HBSS.

Ostrożnie wypreparuj tłuszcz nasierdziowy i struny ścięgniste z próbki. Za pomocą sterylnego ostrza lub nożyczek rozetnij kawałki tkanki na kawałki o wadze około 200 miligramów. Po eutanazji myszy otwórz jamę klatki piersiowej za pomocą ostrych nożyczek.

Użyj hemostatów, aby podnieść serce do góry. Przelej serce zimnym PBS za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do pięciomililitrowej strzykawki. Perfuzuj, aż serce stanie się blanowane.

Wyjmij serce i umieść je na sterylnej szalce Petriego na lodzie. Umieść 200 miligramów kawałków ludzkiej tkanki serca lub mysiego serca na sterylnej szalce Petriego. Drobno zmiel tkankę za pomocą sterylnego ostrza lub nożyczek.

Aby skonfigurować trawienie, w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów przygotuj końcową objętość trawienia wynoszącą trzy mililitry na każdy fragment ludzkiej tkanki serca lub jedno mysie serce z enzymami kolagenazą I, DNazą I i hialuronidazą w stężeniach 450, 60 i 60 jednostek na mililitr. Dodaj 2,5 mililitra DMEM do probówki. Za pomocą czystych kleszczy umieść drobno zmieloną tkankę w każdej probówce reakcyjnej.

Dobrze wymieszaj, delikatnie wirując. Trawić przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na niską lub średnią prędkość mieszania. Po godzinie trawienia wyjmij probówki z inkubatora i umieść je na lodzie.

Ustaw 50-mililitrowe stożkowe probówki z sitkiem o średnicy 40 mikronów na górze. Zwilż filtry dwoma mililitrami buforu dezaktywującego enzymy. Następnie dezaktywuj enzymy wytrawiające, dodając osiem mililitrów buforu dezaktywującego enzymy do każdej probówki wytrawiającej.

Następnie wlej powstałe 13 mililitrów całkowitej mieszaniny przez sitko o średnicy 40 mikronów do stożkowych probówek o średnicy 50 mililitrów. Przefiltrowane próbki przenieść z powrotem do świeżych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Wirować próbki pod ciśnieniem 400 razy g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wyrzucić supernatant, pozostawiając 0,5 mililitra pożywki. Ponownie zawiesić osad komórkowy przez delikatne pipetowanie i dodać jeden mililitr buforu do lizy ACK. Delikatnie zakręć probówką i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut, aby przeprowadzić lizę czerwonych krwinek.

Po pięciu minutach w buforze ACK dodaj dziewięć mililitrów DMEM do próbki. Załóż pokrywkę z powrotem na probówki i delikatnie odwróć probówki, aby się wymieszać. Przefiltrować przez sitko komórkowe o średnicy 40 mikronów i zebrać filtrat w stożkowych probówkach o pojemności 15 mililitrów.

Odwirować probówki o ciśnieniu 400 g przez sześć minut i wyrzucić supernatant. Dodaj jeden mililitr buforu FACS i ponownie zawieś osad. Następnie przenieś go do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Odwirować ponownie w temperaturze 400 razy g przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach buforu FACS. Zawiesina pojedynczej komórki jest teraz gotowa do barwienia przeciwciałami.

Dodać typowy panel przeciwciał ludzkich do próbek serca w rozcieńczeniu od jednego do 50. Używaj różnych przeciwciał dla komórek zrębu i makrofagów mysiego serca. Inkubować przez 30 do 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Dodaj jeden mililitr buforu FACS, delikatnie zwiruj i odwiruj 400 razy g przez pięć minut. Powtórz ten krok prania po raz drugi. Następnie ponownie zawiesić próbkę w 350 mikrolitrach buforu FACS i dodać DAPI, aby osiągnąć końcowe stężenie jednego mikromola.

Próbki są teraz gotowe do analizy FACS. W tym protokole osiągnięto izolację makrofagów z mięśnia sercowego myszy i człowieka. Ten rysunek przedstawia nieprzetworzony i przetworzony ludzki rdzeń LVAD.

Przedstawiono schemat bramkowania dla sortowania przepływowego makrofagów ludzkich CCR2 ujemnych i CCR2 dodatnich z ludzkiego mięśnia sercowego, a także dla komórek zrębowych CD45 z ludzkiej kardiomiopatii niedokrwiennej. Obrazy komórek CD45 i CD45 ujemnych posortowanych przez Wrighta FACS pokazują nienaruszoną błonę komórkową wskazującą na żywotność. Schemat bramkowania w celu oddzielenia makrofagów od serca myszy również się powiódł.

Masa tkanki użytej do reakcji enzymatycznej ma kluczowe znaczenie dla efektywnego trawienia. Używaj nie więcej niż 200 miligramów tkanki dla stężeń enzymów wskazanych w protokole. Zgodnie z tą metodą komórki mogą być hodowane do testów stymulacji in vitro.

Komórki można sortować do sekwencjonowania masowego RNA lub sekwencjonowania pojedynczych komórek. Metoda ta posłużyła jako nieoceniona technika w odkrywaniu wcześniej nierozpoznanej heterogeniczności makrofagów, która jest obecna w zdrowym lub chorym ludzkim sercu. Stosując tę metodę, a następnie sekwencjonowanie pojedynczych komórek, trwają badania mające na celu odkrycie, w jaki sposób różne komórki odpornościowe i nieimmunologiczne różnią się od chorego serca w porównaniu ze zdrowym sercem.