Name: Przetwarzanie zarodków, skorupek jaj i kultur grzybów do skaningowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Poznaj standardowe protokoły przygotowania próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej embrionów żółwia, skorupek jaj i kultur grzybów. Metody te zachowują delikatne struktury i umożliwiają odróżnienie oryginalnych tkanek od artefaktów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Danielowi Baldassarre, SUNY Oswego za pomocne dyskusje i komentarze na temat manuskryptu. Badanie to było wspierane przez Rice Creek Associate Grants, Oswego; Challenge Granty SUNY Oswego i National Science Foundation (NSF) Małe granty dla PGL i JG.

UWAGA: Jaja żółwia malowanego (Chrysemys picta) użyte w tym badaniu zostały zebrane podczas sezonu lęgowego od maja do czerwca 2015-16 z Rice Creek Field Station, Oswego New York, za zgodą uzyskaną od Departamentu Ochrony Środowiska Stanu Nowy Jork (DEC).
1. Chemiczna metoda suszenia do przetwarzania zarodków do SEM
<ol>
	<li>Zbieraj jaja żółwi z terenów w okresie lęgowym. Przygotuj wcześniej komory inkubacyjne, wykonane z plastikowych pudełek z pokrywkami (dł. x szer. x wys.) o wymiarach 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm wypełnionych podłożem ściółkowym przygotowanym z wilgotnej mieszanki wermikulitu i mchu torfowego (stosunek 1:1). Wykonaj 4-6 otworów o długości około 0,25 cm wzdłuż boków pudełek i na pokrywie, aby umożliwić napowietrzenie.</li>
	<li>Delikatnie usuń ziemię z gniazda, aby odsłonić jaja. Przetrzyj powierzchnię jaj żółwi rozcieńczoną nalewką jodową (1:25 000), aby kontrolować zanieczyszczenie mikrobiologiczne podczas inkubacji. Umieść lęgi oddzielnie od siebie, wielkość lęgu pomalowanego żółwia może wahać się od 5-9 jaj i umieść maksymalnie 8-9 jaj w pudełku. 
	UWAGA: Ostrożnie obchodź się z jajkami podczas zbierania, wycierania, etykietowania i umieszczania w pudełkach. Pozycja i wyrównanie jaj muszą być takie same, jak zostały złożone, każdy ruch zahamuje rozwój zarodka.</li>
	<li>Ręcznie zakopać jaja do połowy w ściółce, przykryć i umieścić pudełko w inkubatorze ustawionym na 30 °C. Inkubuj jaja przez 10-17 dni, aby uzyskać stadia embrionalne odpowiednio 12, 13 i 18 użyte w tym badaniu. Dodawać wodę destylowaną, aby częściowo zwilżyć podłoże ściółkowe co drugi dzień, aby uniknąć odwodnienia i utrzymać poziom wilgoci dla prawidłowego rozwoju zarodków. 
	UWAGA: Inkubacja i klasyfikacja zarodków są zgodne z pełną tabelą rozwoju opublikowaną wcześniej39.</li>
	<li>Utrwal zarodki, wykonując pierwsze nacięcie po jednej stronie grzbietowej skorupki jaja i błony żółtka razem, pionowo do długiej osi za pomocą spiczastych nożyczek. Ostrożnie włóż nożyczki do żółtka, aby uniknąć przecięcia krążka zarodkowego. Teraz przetnij boczną stronę jajka wzdłuż długiej osi, a następnie odetnij drugą stronę jajka wzdłuż krótkiej osi.</li>
	<li>Oderwij wycięty kawałek zarodkiem do góry za pomocą kleszczy. Odciąć drugą boczną stronę skorupki jajka i umieścić wycięty kawałek w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS o pH 7,4). 
	UWAGA: Jajo żółwia jest wypełnione żółtkiem o dużej lepkości, a grzbietowa strona zarodka przylega do błony skorupki jaja. Błona skorupki jaja w pobliżu zarodka zmienia się wraz z inkubacją z półprzezroczystej bieli na nieprzezroczystą, kredowo-białą. Pozwala to na zlokalizowanie zarodka w środku długiej osi i bycie widzianym jako ciemna, zwapniała plama z zewnątrz40,41.</li>
	<li>Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby wyizolować zarodki wraz z błoną żółtka, obierając je ze skorupki jajka za pomocą kleszczy. Usuń błony pozazarodkowe za pomocą kleszczy i mikronożyczek. Przenieś zarodek za pomocą łyżki do zarodków do świeżego PBS na szalce Petriego, aby zmyć krew lub żółtko.</li>
	<li>Użyj przezroczystych 12-dołkowych płytek, aby utrwalić zarodki przez noc w 4% paraformaldehydzie w PBS w temperaturze 4 °C lub w 2-3% aldehydzie glutarowym w PBS. Umieść od jednego do trzech zarodków w każdym dołku, w zależności od wielkości zarodków. Zapewnić pełną infiltrację (próbki będą wydawały się białe) w przypadku starszych zarodków, wydłużając czas utrwalenia o 2-3 dni. Opłucz zarodki 3x świeżym PBS przez 5 minut przy każdym płukaniu. 
	UWAGA: Unikaj uszkadzania powierzchni zarodka poprzez stosowanie wkładek polistyrenowych z dnem z siatki poliestrowej do płytek 12-dołkowych do przenoszenia próbek z jednego rozpuszczalnika do drugiego.</li>
	<li>Odwodnić próbki, stosując serię stężeń etanolu w wodzie destylowanej: 30%, 50%, 70%, 80%, 95% i 100% i traktować próbki przez 1 godzinę w każdym roztworze odwadniającym. Powtórz ten krok ze 100% etanolem dwa razy, aby zapewnić całkowite odwodnienie. W przypadku natychmiastowego użycia próbki należy przechowywać przez dłuższy czas w 70% etanolu w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Suszenie zarodków za pomocą serii heksametyldisilazana (HMDS) do 100% stężenia etanolu: 1:2, 2:1 i 100%. Pozostawić próbki w każdym roztworze na 20 minut i utrzymywać szalkę Petriego częściowo przykrytą podczas procesu. 
	UWAGA: Wszystkie czynności związane z HMDS należy wykonywać w dygestoriach z niezbędnym sprzętem ochrony osobistej, ponieważ HMDS jest wysoce toksyczny.</li>
	<li>Pozostaw zarodki w końcowym 100% roztworze HMDS całkowicie lub częściowo przykryte pod wyciągiem na noc, pomagając w odparowaniu HMDS, pozostawiając próbki gotowe do montażu i napylenia. Przykryj naczynie, aby zapobiec osadzaniu się kurzu na próbkach. 
	UWAGA: Tkanka będzie wyglądać na białą po całkowitym wysuszeniu, a częściowo wysuszone próbki będą miały żółty kolor, pozostaw te chusteczki w dygestoriach na dłuższy czas.</li>
	<li>Wybierz rozmiar aluminiowych króćców i węglowej taśmy klejącej dla każdej wielkości analizowanej próbki. Ostrożnie zamontuj wysuszone próbki na standardowym aluminiowym króćcu (12,7 mm x 8 mm) za pomocą podwójnej taśmy przewodzącej z włókna węglowego (12 mm).</li>
	<li>Wprowadzić zamontowane próbki do komory powlekarki napylającej, aby pokryć próbkę bardzo cienką warstwą złota, aby wyeliminować efekt ładunku. Pozłacane próbki przez 60-120 s przy napylaniu 35 mA.</li>
	<li>Zamontuj króćce do odpowiednich płytek porowych, bezpiecznie dokręcając dociskowe. Przenieść uchwyt próbki do lub z komory na próbkę SEM za pomocą narzędzia do wymiany próbek. Obrazowanie próbek w trybie wysokiej próżni z napięciem wiązki przyspieszającej 10 kV i prądem emisji 10 μA. 
	UWAGA: Zawsze noś rękawice podczas pracy z próbkami, uchwytami na próbki, króćcami montażowymi i narzędziami do przenoszenia, aby uniknąć zanieczyszczenia smarem rąk do systemu SEM.</li>
	<li>Przetestuj alternatywne techniki wymienione poniżej, aby porównać rozdzielczość próbek uzyskanych z powyższej procedury.
	<ol>
		<li>Dołącz utrwalanie po utrwaleniu 1% tetratlenku osmu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej po kroku 1.7.</li>
		<li>Częściowo lub całkowicie wyjmij gogle HMDS w kroku 1.10, aby szybko odparować gogle</li>.
		<li>Przetwarzaj zarodki po kroku 1.8 przy użyciu suszenia w punkcie krytycznym (CPD), wykonując kroki 3.3-3.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie skorupki jajka do SEM metodą suszenia na powietrzu
<ol>
	<li>Zebrać i wysiadywać jaja pomalowanego żółwia (Chrysemys picta) w celu utrwalenia zarodków, jak określono w krokach 1.1-1.7.</li>
	<li>Zachowaj skorupki jaj w wodzie destylowanej po utrwaleniu zarodka w kroku 2.1. Dokładnie oczyść skorupki jaj, mocząc je w wodzie destylowanej przez co najmniej 1 godzinę, aby wyeliminować zanieczyszczenie żółtkiem i albuminą.</li>
	<li>Wysuszyć skorupki jaj na powietrzu po umyciu na delikatnych chusteczkach antystatycznych w dygestoriach przez noc. Przechowuj wysuszone skorupki jaj w czystych butelkach z próbkami oznaczonych numerem i etapem.</li>
	<li>Zamontuj, napyl i zobrazuj próbki, wykonując czynności określone w krokach 1.11-1.13.</li>
</ol>
3. Metoda suszenia punktu krytycznego do przygotowania kultur grzybów do SEM
<ol>
	<li>Ustalanie kultur szkiełkowych
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę z agadem ziemniaczanym z dekstrozą (PDA) do hodowli grzybów: Dodać 39 g mocy PDA do 1 l wody destylowanej w kolbie Erlenmeyera. Dobrze wymieszać, obracając kolbę i sterylizować pożywkę w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Pozostawić roztwór pożywki do ostygnięcia, a następnie dodać antybiotyk chloramfenikol (25 μg/ml) za pomocą sterylnej mikropipety. 
		UWAGA: Po sterylizacji roztwór agaru powinien być gorący i nie zastygnie szybko. Ostudzić go na tyle, aby nie dezaktywował antybiotyków.</li>
		<li>Wymieszaj go, mieszając i wlewając talerze (około 10-12 ml pożywki na każde 10 cm szalki Petriego), ostrożnie ułóż w stos i pozwól mu zastygnąć.</li>
		<li>Użyj sterylnego ostrza skalpela, aby wyciąć małe bloki agaru o wielkości około 1/2 do 3/4 cala. Wyjmij i umieść blok agaru na czystym szklanym szkiełku mikroskopowym.</li>
		<li>Umieść szkiełko na czystej szalce Petriego, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zachować wilgoć podczas inkubacji.</li>
		<li>Podnieś szkiełko z dna szalki Petriego za pomocą sterylnej wykałaczki, aby wytworzyć napięcie powierzchniowe między płytką a szkiełkiem, aby usunąć szklane szkiełko bez przerywania delikatnego wzrostu po inkubacji.</li>
		<li>Użyj sterylnej pętli lub igły, aby przenieść część grzybów z inokulum próbki na każdą z czterech stron bloku agarowego na szkiełku.</li>
		<li>Po zaszczepieniu umieścić czyste szkiełko nakrywkowe na powierzchni bloku agaru. Dodaj kilka kropli sterylnej wody destylowanej do szalki Petriego wokół szkiełka, aby zapewnić wilgoć rosnącym grzybom.</li>
		<li>Częściowo uszczelnić płytkę folią parafinową i inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez odpowiedni okres czasu (w przypadku gatunków Fusarium inkubować przez 36–48 godzin).</li>
		<li>Zdjąć szkiełko z płytki Petriego i oddzielić ściśle przylegające szkiełko nakrywkowe od bloku agarowego za pomocą sterylnych kleszczyków. Utrwalić bloki agaru w 3% aldehydzie glutarowym w PBS przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwodnić próbki, przechodząc przez serie etanolu: 10%, 25%, 50%, 75% i 90% z 15 minutami na zmianę. Przetwarzaj próbki do końcowego odwodnienia z dwiema przemianami w 100% etanolu, z których każda trwa 30 minut, aby zapewnić całkowite nasycenie.</li>
	<li>Suszenie w punkcie krytycznym: Umieścić odwodnione próbki w komorze aparatu CPD. Uszczelnij i schłodzić komorę, otwierając zawory, aby umożliwić dopływ ciekłego CO2 i wypuścić etanol, aż ciekły CO2 całkowicie wypełni komorę.
	<ol>
		<li>Uszczelnij i podgrzej komorę powoli, aby osiągnąć punkt krytyczny, gdy ciśnienie w komorze przekracza 1000 psi, a temperatura przekracza 31 °C, faza ciekła i gazowa CO2 jest w równowadze. Powoli spuścić CO2 z komory i próbki w postaci gazu, aby uniknąć skutków napięcia powierzchniowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj montaż, złocenie i obrazowanie próbek, wykonując czynności określone w krokach 1.11-1.13.</li>
	<li>Przeprowadzić analizę porównawczą, susząc chemicznie próbki z kroku 3.2 za pomocą HMDS, wykonując kroki 1.9-1.13.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

W naszym badaniu przetestowano różne środki utrwalające, metody odwadniania i suszenia, aby przygotować trzy różne delikatne próbki biologiczne do obrazowania SEM: zarodki, skorupki jaj i kultury grzybów. SEM jest powszechnie stosowany do analizy powierzchni, więc penetracja utrwalająca jest mniej niepokojąca, ale należy zrozumieć, że źle zamocowane struktury wewnętrzne spowodują kurczenie się do wewnątrz i/lub zapadnięcie struktur powierzchniowych. W przypadku większych próbek tkanek należy również rozważyć wydłużenie c...

Analiza ultrastrukturalna skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) i obrazowanie wewnątrzkomórkowe uzupełniają mikroskopię świetlną do trójwymiarowego profilowania prokariontów, roślin i zwierząt. Wysoka rozdzielczość przestrzenna SEM sprawia, że jest to jedna z najbardziej wszechstronnych i wydajnych dostępnych technik badania cech mikrostrukturalnych próbek w skali od nanometra do mikrometra. Wysuszone próbki są przekształcane w struktury kompozycyjne i topograficzne z dużą szczegółowością, co stanowi podstawę do wyciągania prawidłowych wniosków na temat relacji funkcjonalnych1,2,3,4,5,6,7,8,9. Podczas interpretacji obrazów SEM próbek biologicznych dużym wyzwaniem jest rozróżnienie między strukturami natywnymi a artefaktami, które powstają podczas przetwarzania. SEM jest zazwyczaj eksploatowany w bardzo wysokich próżniach, aby uniknąć jakichkolwiek zakłóceń ze strony cząsteczek gazu wpływających na pierwotne, wtórne lub wstecznie rozproszone wiązki elektronów emitowane z próbki10,11. Ponadto materiały biologiczne są podatne na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem ze względu na ich słabe lub nieprzewodzące właściwości. Istotne jest, aby próbki załadowane do SEM były całkowicie suche i wolne od wszelkich zanieczyszczeń organicznych, aby wyeliminować ewentualne odgazowanie w środowisku wysokiej próżni10,11. Ponieważ okazy biologiczne składają się w większości z wody, wymagane są dodatkowe techniki przygotowawcze, aby zapewnić zachowanie rodzimych struktur.
Uzyskana rozdzielczość opiera się na optymalizacji metod przygotowania specyficznych dla typów próbek i wykorzystywanych parametrów instrumentalnych. W związku z tym konieczne jest unikanie stosowania uogólnionych etapów przetwarzania dla wszystkich typów tkanek. Niektóre próbki biologiczne będą wymagały mniej rygorystycznego przetwarzania, aby zachować ich strukturę, podczas gdy w przypadku delikatnych rodzajów próbek może być potrzebne więcej czasu i ostrożności, aby uniknąć wprowadzania artefaktów wysuszających, takich jak kurczenie się i zapadanie. Przygotowanie próbki jest krytycznym etapem obrazowania SEM; Na wyniki badań morfometrycznych znaczący wpływ mają procedury przygotowania próbek<klasa SUP="xref">12,<klasa SUP="XREF">13. Typowymi etapami przygotowania wielu próbek biologicznych są utrwalanie, odwadnianie i powlekanie metalem, takim jak złoto, platyna lub pallad, w celu przekształcenia ich powierzchni w przewodzenie do analizy SEM. Charakter i kombinacja zastosowanych kroków będą się różnić w zależności od rodzaju tkanki i konkretnych celów badania. Nagromadzenie ładunku, wrażliwość na próżnię i uszkodzenie wiązką elektronów stwarzają problemy podczas przetwarzania miękkich, delikatnych próbek biologicznych, co wymaga dodatkowych etapów przetwarzania w celu zachowania natywnej struktury obiektu. Stosowanie konwencjonalnych metod, takich jak wiązanie tetratlenku osmu i odwodnienie, powoduje kurczenie się i zapadanie delikatnych tkanek14,15,16,17. Celem pracy jest opracowanie eleganckich metodologii powstałych poprzez połączenie pomysłów z wcześniejszych badań z modyfikacjami w celu przygotowania i zobrazowania miękkich, delikatnych tkanek (np. zarodków, skorupek jaj malowanych żółwi i kultur grzybów).
Wybór odpowiedniej metody mocowania jest pierwszym najważniejszym krokiem do mikroskopowej analizy próbek biologicznych. Utrwalenie tkanek natychmiast po wyizolowaniu z organizmu jest niezbędne, aby zapobiec zmianom w ich morfologii spowodowanym rozkładem. Skuteczny utrwalacz powinien kończyć procesy komórkowe poprzez szybkie przenikanie komórek i nieodwracalne utrzymywanie efektu, aby ustabilizować strukturę próbki, aby wytrzymać zarówno kolejne etapy przetwarzania, jak i badanie w ramach SEM17,18. Chociaż znanych jest kilka chemicznych i fizycznych metod utrwalania, utrwalanie chemiczne jest częściej stosowane w przypadku próbek biologicznych, aby uniknąć zmian komórkowych spowodowanych autolizą, gniciem i efektami suszenia. W literaturze omówiono wiele utrwalających preparatów chemicznych17,19,20,21,22,23, utrwalacze, które działają poprzez denaturację i koagulację makrocząsteczek biologicznych oraz te, które utrwalają się poprzez kowalencyjne sieciowanie makrocząsteczek. Alkohole są stosowane jako utrwalacze denaturujące, które bardzo słabo zachowują ultrastrukturę i są używane głównie do mikroskopii świetlnej i nie są zalecane do analizy mikroskopem elektronowym. Utrwalacze sieciujące, takie jak formaldehyd, aldehyd glutarowy i tetratlenek osmu, tworzą międzycząsteczkowe i wewnątrzcząsteczkowe sieciowanie między makrocząsteczkami w tkankach, zapewniając doskonałe zachowanie ultrastruktur11,24,25,26. Próbki biologiczne są wrażliwe na temperaturę. Zaleca się, aby temperatura na początku wiązania wynosiła 4 °C, aby zmniejszyć boczną ruchliwość białek błonowych, spowolnić dyfuzję cząsteczek międzykomórkowych i spowolnić tempo fiksacji11. Czas potrzebny do utrwalenia tkanek w dużej mierze zależy od wielkości próbki i szybkości, z jaką utrwalacz dyfunduje i reaguje ze składnikami próbki. Utrwalanie przez noc w 4% paraformaldehydzie lub 3% aldehydzie glutarowym w PBS w temperaturze 4 °C jest preferowaną metodą analizy SEM próbek użytych w tym badaniu ze względu na ich sekwencyjne właściwości penetracyjne, które pozwalają na przetwarzanie mniejszych, delikatnych próbek17,18,19,20,27. Etap po utrwaleniu tetratlenkiem osmu został wyeliminowany nie tylko ze względu na jego toksyczny charakter, ale także stwierdzono, że nie zapewnia on żadnych dodatkowych korzyści w zakresie poprawy jakości obrazu próbek analizowanych w tym badaniu.
Próbki biologiczne zawierają płyny, które zakłócają działanie SEM; dlatego próbki muszą być wysuszone przed włożeniem ich do komory na próbki SEM. Po zapewnieniu odwodnienia rozpuszczalnik musi zostać usunięty z tkanki bez tworzenia artefaktów w próbkach z powodu napięcia powierzchniowego/wysuszenia. Trzy różne metody suszenia były powszechnie stosowane podczas przetwarzania tkanek do obrazowania SEM: suszenie powietrzem, suszenie w punkcie krytycznym i liofilizacja próbek28,29,30,31. Niewiele badań podaje, że wszystkie trzy metody suszenia dają identyczne wyniki z próbkami tkanek zwierzęcych28,29,30,31. Ogólną praktyką stosowaną w przypadku mniejszych próbek jest chemiczne odwadnianie za pomocą rosnących serii stężeń alkoholu i heksametyldisilazanu (HMDS), ale większe próbki są suszone przy użyciu przyrządu do suszenia w punkcie krytycznym (CPD)32. Podczas procesu suszenia w małych wnękach powstają znaczne siły, które są przepuszczane przez próbkę przez granicę faz ciecz/gaz; Może to nawet doprowadzić do całkowitego zawalenia się pustych struktur33. Wszelkie deformacje powstałe w wyniku obróbki mogą być wówczas mylone z natywną cechą strukturalną próbki. W związku z tym należy wyeliminować uogólnione zjawisko przetwarzania i ustandaryzować unikalny proces suszenia dla każdego rodzaju tkanki, zwłaszcza gdy analizowane są delikatne próbki tkanek.
W kilku próbach przeprowadzonych przy użyciu różnych kombinacji wszystkich wyżej wymienionych procesów, ustandaryzowaliśmy metody, które mogą być używane do analizy SEM trzech delikatnych tkanek: embrionów, skorupek jaj malowanych żółwi i kultur grzybów. Biolodzy i morfolodzy rozwojowi opisują normalną i nieprawidłową morfogenezę podczas rozwoju zarodka u reprezentatywnych kręgowców. Badania nad szlakami sygnalizacji genów zależą od morfologicznego opisu nowych struktur. Aby uniknąć nagłych zmian w strukturze zarodka kręgowców podczas analizy SEM, zalecamy suszenie chemiczne po odwodnieniu. Suszenie chemiczne przy użyciu HMDS jest stosunkowo nową metodą suszenia, a zalety obejmują względną szybkość, łatwość użycia, utracone koszty oraz ograniczoną wiedzę specjalistyczną i potrzebny sprzęt9. CPD jest powszechnie stosowaną techniką suszenia polegającą na przepuszczaniu CO2 przez próbki w określonej temperaturze i ciśnieniu. Stwierdziliśmy, że HMDS nadaje się do suszenia miękkich, delikatnych tkanek i umożliwia przetwarzanie większych próbek w porównaniu z suszeniem w punkcie krytycznym, które powodowało rozległe deformacje tkanek embrionalnych. Do przygotowania próbek do obrazowania SEM wykorzystano kilka metod w celu zbadania cech morfologicznych grzybów34. Próbki grzybów są zwykle utrwalane w tetratlenku osmu, a następnie odwadniane etanolem i suszenie w punkcie krytycznym, co może zapewnić zadowalające wyniki, chociaż toksyczne działanie tetratlenku osmu 6,7,35 i utrata materiałów grzybowych podczas zmiany roztworów podczas przetwarzania są wyraźnymi wadami. Technika przygotowania próbek przy użyciu suszenia na powietrzu bez utrwalania była również praktykowana36, ale skutkuje skurczonymi i zapadniętymi strukturami, a obserwacja takich okazów może być łatwo błędnie zinterpretowana podczas charakteryzowania gatunku. Strzępka grzybów traci swoją integralność w kontakcie z cieczami, a równomierne wysuszenie może nie być osiągnięte w celu przywrócenia struktury. Ze względu na ten efekt, liofilizacja jest powszechnie stosowana do suszenia tkanek miękkich, takich jak grzybnia. Liofilizacja sprawdza się dobrze w przypadku czystych materiałów, ale obecność jakichkolwiek soli lub wydzieliny zasłania szczegóły powierzchni, które zostaną zidentyfikowane dopiero na etapie oglądania SEM. Połączyliśmy metodę hodowli szkiełkowej z wiązaniem aldehydu glutarowego i suszeniem w punkcie krytycznym, aby uzyskać szczegóły strukturalne nienaruszonych strzępek i zarodników grzybów. Chociaż suszenie CPD powodowało kurczenie się zarodków, skutkowało to dobrze zachowanymi strukturami grzybni w połączeniu z wiązaniem aldehydu glutarowego. Skorupka jaja ma podstawowe znaczenie dla zarodka jajorodnych, ponieważ nie tylko działa jako osłona ochronna, ale także zapewnia stabilność mechaniczną, przepuszczalność gazów i wody oraz rezerwę wapnia dla rozwijającego się zarodka. Skorupki jaj żółwi słodkowodnych są klasyfikowane jako "sztywne" na podstawie ich struktury, a ze względu na ich dostępność spotkały się z dużym zainteresowaniem biologów1,2,3,4,5,6,7,37, 38.
Szczegółowo opisujemy proste metody łatwego badania skorupek jaj i błon skorupek malowanych żółwi, które można zastosować do każdego gatunku skorupy jaja o sztywnej skorupie. Metodologie przygotowania zostały ocenione na podstawie uzyskanej jakości obrazu i zredukowanych potencjalnych artefaktów.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Fischer Scientific</td><td>S25127A</td><td>do hodowli szkiełek</td></tr><tr><td>Aluminiowy króciec</td><td>Tedpella</td><td>16111</td><td>12,7 mm x 8 mm</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrated Culture Podłoża: Agar z dekstrozą ziemniaczaną</td><td>BD 213400</td><td>DF0013-17-6</td><td>Pożywki do izolacji i hodowli grzybów, drożdży i pleśni</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Fischer BioReagents</td><td>BP904-100</td><td>Antybiotyk do pożywek</td></tr><tr><td>Gruboziarnista szklarnia wermikulitowa</td><td>Megastore</td><td>SO-VER-12</td><td>podłoże</td></tr><tr><td>ściółkowe Przezroczysta 12-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>07-201-589</td><td>do utrwalania zarodków</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fischer Scientific</td><td>S17525B</td><td>do hodowli szkiełek</td></tr><tr><td>Suszarka do punktów krytycznych</td><td>Quorum CPD</td><td>EMS850</td><td>suszenie w punkcie krytycznym</td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane</td><td>Fischer Scientific</td><td>08 747B</td><td>SZALKA PETRI 100X10MM 12/PK</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A406P 4</td><td>środek odwadniający</td></tr><tr><td>Kleszcze - Pęseta Aquarius</td><td>Tedpella</td><td>5804</td><td>styl 4, długość 108mm, szer. x grubość 0,017 x 0,17 mm</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Fischer Scientific</td><td>G151-1</td><td>utrwalacz</td></tr><tr><td>Złoty cel do powlekarki napylającej</td><td>DENTON</td><td>TAR001-0158</td><td>Złoty Cel, 2.375&Prime; D x .002&Prime;</td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazana</td><td>Fischer Scientific</td><td>C19479-5000</td><td>chemiczny środek osuszający</td></tr><tr><td>Kim chusteczki</td><td>Kimtech</td><td>S-8115</td><td>czyszczenie</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>67-762-16</td><td>do hodowli</td></tr><tr><td>preparatów Nożyczki</td> mikroskopowe <td>Tedpella</td><td>1327</td><td>Podwójnie spiczaste, stal nierdzewna, 100 mm L (3-5/8").</td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Tedpella</td><td>1346</td><td>Vannas-type, proste, 80mm L</td></tr><tr><td>Moria Perforated Embryo Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Długość 14,5 cm, średnica końcówki 20 mm, głębokość łyżki 5 mm</td></tr><tr><td>Wkładki Netwell</td><td>Corning</td><td>0330B09</td><td>15 mm Wkładki z 74 &mikro; m Rozmiar oczek Membrana poliestrowa działa jako poręczne nośniki podczas przetwarzania próbek na różne rozpuszczalniki</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fischer Scientific</td><td>T353 500</td><td>utrwalacz</td></tr><tr><td>Mech torfowy</td><td>Walmart- Miracle Gro</td><td>551705263</td><td>pościel medium</td></tr><tr><td>PELCO zakładki podwójna taśma przewodząca węglowa</td><td>Tedpella</td><td>5000</td><td>12 mm OD</td></tr><tr><td>Napylarka</td><td>DENTON</td><td>VACUUM DESK V</td><td>cienka powłoka metalowa</td></tr><tr><td>SEM</td><td>JEOL USA</td><td>JEOL JSM 6610LV skaningowy mikroskop elektronowy</td><td></td></tr></tbody></table>

przetwarzanie zarodków, skorupek jaj i kultur grzybów do skaningowej mikroskopii elektronowej

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Chociaż skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) jest powszechnie stosowana do ultrastrukturalnej analizy różnych próbek biologicznych i niebiologicznych, metody związane z przetwarzaniem różnych próbek biologicznych wymagają unikalnych praktyk. Wszystkie konwencjonalne praktyki opisane w literaturze dotyczące przetwarzania próbek nadal znajdują użyteczne zastosowania, ale subtelne zmiany w przygotowaniu próbki mogą zmienić jakość obrazu, a także wprowadzić artefakty. W związku z tym do uzyskania dobrej jakości obrazu o rozdzielczości ultrastrukturalnej wymagane jest zastosowanie unikalnej techniki przygotowania próbki specyficznej dla rodzaju analizowanej tkanki. Celem tego badania jest zapewnienie optymalnych protokołów przygotowania próbek do obrazowania zarodków, sztywnych skorupek jaj i kultur grzybów za pomocą SEM. Zalecono następujące optymalizacje, aby uzyskać dobre wyniki dla trzech różnych delikatnych próbek biologicznych badanych. Obowiązkowe jest stosowanie łagodniejszych utrwalaczy, takich jak 4% paraformaldehydu lub 3% aldehydu glutarowego, a następnie odwodnienie serią etanolową. Grzybnia grzybów na blokach agarowych uzyskana przez hodowle szkiełkowe daje lepszą integralność ultrastrukturalną w porównaniu z kulturami pobranymi bezpośrednio z płytek agarowych. Suszenie chemiczne zarodków za pomocą HMDS zapewnia suszenie bez wprowadzania artefaktów napięcia powierzchniowego w porównaniu z suszeniem w punkcie krytycznym. HMDS zapobiega pękaniu spowodowanemu skurczem, ponieważ próbki są mniej kruche podczas suszenia. Jednak w przypadku hodowli grzybów suszenie w punkcie krytycznym zapewnia akceptowalną jakość obrazu w porównaniu z suszeniem chemicznym. Skorupki jaj można obrazować bez specjalnych czynności przygotowawczych, z wyjątkiem dokładnego umycia i wysuszenia na powietrzu przed montażem. Metodologie przygotowania zostały ustandaryzowane w oparciu o akceptowalną jakość obrazu uzyskaną w każdym badaniu.

Rycina 1 przedstawia analizę mikroskopii elektronowej skaningowej embrionów żółwia malowanego (Chrysemys picta). Do obrazowania metodą SEM wykorzystano jaja żółwia malowanego zebrane i inkubowane na podłożu, zamontowane na aluminiowych trzpieniach po chemicznym osuszeniu (Rycina 1A–E). Widok boczny embrionu w stadium 12 pokazuje struktury czaszkowo-twarzowe; wyrostek szczękowy wystaje poza wyrostek żuchwowy i ogranicza dobrze wykształco...

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły przetwarzania dla obrazowania delikatnych próbek tkanek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Opisano trzy różne metody przetwarzania, a mianowicie suszenie chemiczne heksametylu disilazana (HMDS), proste suszenie powietrzem i suszenie w punkcie krytycznym dla przygotowania sztywnych skorupek jaj, zarodków we wczesnych stadiach rozwojowych i kultur grzybów.

Przetwarzanie zarodków, skorupek jaj i kultur grzybów do skaningowej mikroskopii elektronowej

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

Posiadamy ustandaryzowane protokoły przygotowania próbek do obrazowania malowanych zarodków żółwi, sztywnych skorupek jaj i kultur grzybów za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Te kompleksowe metody wykorzystują subtelne zmiany w znanych protokołach do przetwarzania trzech delikatnych tkanek, umożliwiając rozróżnienie oryginalnych struktur i przetwarzanie artefaktów. Procedurę zademonstruje mi Jessica Gibbons, doktorantka z mojego laboratorium.Przed zebraniem jaj żółwi z pola w okresie lęgowym należy wykonać od czterech do sześciu otworów o średnicy 0,25 centymetra wzdłuż boków plastikowych pudełek i na ich pokrywach, aby umożliwić napowietrzenie. Przed napełnieniem skrzynek wilgotną mieszanką wermikulitu i mieszanki ściółki z mchu torfowego w stosunku jeden do jednego. W miejscu gniazdowania delikatnie usuń ziemię, aby odsłonić jaja i przetrzyj powierzchnię każdego jaja żółwia rozcieńczoną nalewką jodową, aby chronić przed zanieczyszczeniem mikrobiologicznym podczas inkubacji.Umieść maksymalnie od ośmiu do dziewięciu jaj w pudełku w tej samej orientacji i wyrównaniu, w jakiej zostały złożone, trzymając poszczególne lęgi oddzielnie od siebie. Po zebraniu wszystkich jaj ręcznie zakop jaja do połowy w ściółce i umieść pudełka z pokrywką w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza na 10 do 17 dni, aby uzyskać odpowiednio 12, 13 i 18 zarodków w stadium embrionalnym. Dodawaj wodę destylowaną, aby częściowo zwilżyć podłoże ściółkowe co drugi dzień, aby uniknąć odwodnienia i utrzymać poziom wilgoci dla prawidłowego rozwoju zarodka.Na odpowiednim etapie rozwoju za pomocą spiczastych nożyczek należy wykonać nacięcie po jednej stronie grzbietowej skorupki jaja i błony żółtkowej, pionowo do długiej osi jaja. Następnie odetnij drugą stronę jajka wzdłuż krótkiej osi i za pomocą kleszczy oderwij wycięty kawałek zarodkiem do góry. Odetnij drugą boczną stronę skorupki jajka i umieść wycięty kawałek skorupki w PBS.Za pomocą mikroskopu stereoskopowego i kleszczy oderwij zarodek i błonę żółtka od skorupki jajka. Użyj kleszczy i mikronożyczek, aby usunąć dodatkowe błony embrionalne, a następnie użyj łyżki do zarodków, aby przenieść zarodek na szalkę Petriego ze świeżym PBS. Po zmyciu krwi i żółtka umieść do trzech zarodków w dołku 12-dołkowej płytki, zawierającej 4% paraformaldehydu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.Gdy próbki wydają się białe, użyj wkładek polistyrenowych z dnem z siatki poliestrowej, aby przepłukać zarodki trzema pięciominutowymi płukaniami w świeżym PBS na pranie. Po ostatnim przemyciu odwadniać próbki w rosnącej serii etanolu przez jedną godzinę na stężenie. Po drugim zanurzeniu w etanolu wysuszyć zarodki w serii HMDS do stężenia etanolu przez 20 minut na zanurzenie z częściowo przykrytymi szalkami Petriego.Następnie umieść zarodki w końcowym 100% roztworze HMDS, całkowicie lub częściowo pokrytym przez noc pod wyciągiem. Powolne suszenie poprzez stopniowe zwiększanie stężenia HDMS do etanolu jest ważne dla ujawnienia doskonałej struktury powierzchni zarodków. Następnego ranka użyj podwójnej taśmy przewodzącej z włókna węglowego, aby ostrożnie zamontować całkowicie wysuszone próbki na standardowym aluminiowym króćcu.Po zamontowaniu wszystkich próbek należy wprowadzić je do komory napylania w celu pokrycia próbek bardzo cienką warstwą złota przez 60 do 120 sekund przy napylaniu 35 miliamperów. Następnie mocno dokręć dociskowe, aby zamontować klocki na odpowiednich płytach do nalewania. Użyj narzędzia do wymiany próbek, aby przenieść uchwyt próbki do komory próbki skaningowego mikroskopu elektronowego w celu obrazowania.Aby przygotować skorupki jaj do skaningowej mikroskopii elektronowej, należy umieścić skorupki jaj w wodzie destylowanej na co najmniej jedną godzinę po zbiorze zarodków, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczenie żółtkiem lub albuminą. Następnie wysusz oczyszczone skorupki jaj na powietrzu na delikatnych chusteczkach antystatycznych w dygestoriach przez noc. Wysuszone skorupki jaj należy przechowywać w czystych butelkach z próbkami, oznaczonych numerem i stadium zarodka.Następnie zamontuj, rozpyl i zobrazuj próbki skorupek jaj, jak właśnie pokazano dla zarodków. Aby założyć szkiełkowe kultury grzybów, użyj sterylnego skalpela, aby pociąć od pół do trzech czwartych cala bloków stałego agaru z dekstrozą ziemniaczaną i umieść bloki na pojedynczych szklanych szkiełkach mikroskopowych. Umieść sterylne wykałaczki na dnie czystych szalek Petriego, aby podnieść z nich szkiełka, aby wytworzyć napięcie powierzchniowe między płytką a szkiełkiem.Umieść każde szkiełko na wykałaczkach na szalce Petriego. Następnie użyj sterylnej pętli, aby przenieść grzyby z inokulum próbki na każdą z czterech bocznych stron bloku agarowego. Dodaj kilka kropli sterylnej wody destylowanej do szalki Petriego wokół szkiełka, aby zapewnić wilgoć rosnącym grzybom.Częściowo uszczelnić płytkę folią parafinową i umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza na okres inkubacji odpowiedni dla gatunków grzybów. Pod koniec inkubacji zdjąć szkiełko z płytki Petriego i za pomocą sterylnych kleszczy przenieść ściśle przylegający blok agaru ze szkiełka do pojemnika z 3% aldehydem glutarowym do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka należy odwodnić próbki w rosnącej serii etanolu przez 15 minut na stężenie.Po 90% zanurzeniu należy przetworzyć próbki do końcowego odwodnienia z dwiema 30-minutowymi zmianami w 100% etanolu, aby zapewnić pełne nasycenie przed umieszczeniem odwodnionych próbek w komorze aparatu do suszenia w punkcie krytycznym. Uszczelnij komorę i otwórz zawory, aby ciekły dwutlenek węgla mógł się wydostać do środka i wypuścić etanol, aż ciekły dwutlenek węgla całkowicie wypełni komorę. Następnie uszczelnij i powoli podgrzej komorę, aby osiągnąć punkt krytyczny, gdy ciśnienie w komorze przekracza 1,000 funtów ciśnienia na cal kwadratowy, temperatura przekracza 31 stopni Celsjusza, a przestrzeń cieczy i gazu dwutlenku węgla jest w równowadze.Następnie powoli spuść dwutlenek węgla z komory i próbki w postaci gazu, aby uniknąć wpływu napięcia powierzchniowego na próbkę, a następnie zamontuj, płytkuj i zobrazuj próbki grzybów, jak pokazano. Boczny skaningowy mikroskop elektronowy zarodka żółwia w stadium 12 ujawnia, w jaki sposób wypukłość szczęki rozciąga się poza żuchwę i przyśrodkowo ogranicza dobrze zaznaczony dół nosowy. Można również zaobserwować pięć łuków gardłowych.W zarodku w stadium 15 nowo powstałe somity są widoczne w tylnej części ogona zarodka, a pąki kończyn przednich są skierowane bardziej korowo niż brzusznie. Dobrze zdefiniowany wyrostek grzbietu pancerza można również uwidocznić wzdłuż całego obszaru boku międzykończynowego zarodka. W stadium 18 utworzył się krótki, słabo wystający pysk z lekko odwróconym dolnym dziobem z końcowym haczykiem, który pasuje do środkowego wycięcia górnego dzioba.Górna szczęka ma karbowany wygląd, a na końcu górnej szczęki można zobaczyć maleńki ząb jajowy. Analiza ultrastrukturalna skorupki jaja Chrysemys picta i błony skorupy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ujawnia zewnętrzną warstwę skorupy jaja calcarinus, mocno połączoną z wewnętrzną nitkowatą błoną skorupy. Zewnętrzna powierzchnia skorupki jaja składa się z dobrze wyróżniających się zmineralizowanych jednostek skorupy zbudowanych z kulistych kulistych guzków ułożonych w grupy i pomiędzy sąsiednimi jednostkami muszli, z koncentracją małych zaokrąglonych zagłębień lub porów o różnych rozmiarach.Nie można uogólniać wspólnych metodologii dla wszystkich próbek biologicznych, aby osiągnąć przyzwoitą jakość obrazu przy użyciu SEM. Unikalne zmiany, jak wykazano, są niezbędne dla określonych typów tkanek. Metoda suszenia chemicznego i powietrznego może być również stosowana w przypadku innych próbek organicznych, a technika hodowli szkiełka sprzęgającego może być stosowana w przypadku wszystkich miękkich, wytrzymałych kultur mikrobiologicznych.

processing-embryo-eggshell-fungal-culture-for-scanning-electron

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Opisujemy sekcję i hodowlę ex vivo skóry embrionalnej myszy. System hodowli utrzymuje granicę faz powietrze-ciecz na powierzchni tkanki i umożliwia obrazowanie pod mikroskopem odwróconym. Melanoblasty, składnik rozwijającej się skóry, są znakowane fluorescencyjnie, co pozwala na obserwację ich zachowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Hodowla skóry embrionalnej myszy i obrazowanie na żywo migracji melanoblastów

Opisujemy szczegółowy protokół wykorzystujący mikroskopię episkopową o wysokiej rozdzielczości do pozyskiwania trójwymiarowych (3D) obrazów embrionów myszy. Ten ulepszony protokół wykorzystuje zmodyfikowaną metodę przygotowania tkanek w celu zwiększenia penetracji barwnika fluorescencyjnego, umożliwiając w ten sposób analizę morfometryczną zarówno małych, jak i dużych próbek.

Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Węzeł i płytka struny grzbietowej są przejściowymi organizatorami sygnalizacji w rozwoju mysich embrionów, które można wizualizować za pomocą kilku technik. Tutaj szczegółowo opisujemy, jak wykonać dwie techniki badania ich struktury i morfogenezy: 1) skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM); i 2) immunofluorescencja całej góry (WMIF).

Wizualizacja węzła i płytki struny grzbietowej w zarodkach myszy z gastrulacją za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej i immunofluorescencji całej góry

Analiza SEM jest skuteczną metodą pomagającą w identyfikacji gatunków lub dyskryminacji fenotypowej. Protokół ten opisuje metody badania określonych szczegółów morfologicznych trzech reprezentatywnych typów organizmów i miałby szerokie zastosowanie do badania cech wielu typów organizmów i tkanek.

Otrzymywanie organizmów prokariotycznych i eukariotycznych z wykorzystaniem suszenia chemicznego do analizy morfologicznej w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Poznaj standardowe protokoły przygotowania próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej embrionów żółwia, skorupek jaj i kultur grzybów. Metody te zachowują delikatne struktury i umożliwiają odróżnienie oryginalnych tkanek od artefaktów.

Przetwarzanie zarodków, skorupek jaj i kultur grzybów do skaningowej mikroskopii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów