Przetwarzanie zarodków, skorupek jaj i kultur grzybów do skaningowej mikroskopii elektronowej

Posiadamy ustandaryzowane protokoły przygotowania próbek do obrazowania malowanych zarodków żółwi, sztywnych skorupek jaj i kultur grzybów za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Te kompleksowe metody wykorzystują subtelne zmiany w znanych protokołach do przetwarzania trzech delikatnych tkanek, umożliwiając rozróżnienie oryginalnych struktur i przetwarzanie artefaktów. Procedurę zademonstruje mi Jessica Gibbons, doktorantka z mojego laboratorium.

Przed zebraniem jaj żółwi z pola w okresie lęgowym należy wykonać od czterech do sześciu otworów o średnicy 0,25 centymetra wzdłuż boków plastikowych pudełek i na ich pokrywach, aby umożliwić napowietrzenie. Przed napełnieniem skrzynek wilgotną mieszanką wermikulitu i mieszanki ściółki z mchu torfowego w stosunku jeden do jednego. W miejscu gniazdowania delikatnie usuń ziemię, aby odsłonić jaja i przetrzyj powierzchnię każdego jaja żółwia rozcieńczoną nalewką jodową, aby chronić przed zanieczyszczeniem mikrobiologicznym podczas inkubacji.

Umieść maksymalnie od ośmiu do dziewięciu jaj w pudełku w tej samej orientacji i wyrównaniu, w jakiej zostały złożone, trzymając poszczególne lęgi oddzielnie od siebie. Po zebraniu wszystkich jaj ręcznie zakop jaja do połowy w ściółce i umieść pudełka z pokrywką w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza na 10 do 17 dni, aby uzyskać odpowiednio 12, 13 i 18 zarodków w stadium embrionalnym. Dodawaj wodę destylowaną, aby częściowo zwilżyć podłoże ściółkowe co drugi dzień, aby uniknąć odwodnienia i utrzymać poziom wilgoci dla prawidłowego rozwoju zarodka.

Na odpowiednim etapie rozwoju za pomocą spiczastych nożyczek należy wykonać nacięcie po jednej stronie grzbietowej skorupki jaja i błony żółtkowej, pionowo do długiej osi jaja. Następnie odetnij drugą stronę jajka wzdłuż krótkiej osi i za pomocą kleszczy oderwij wycięty kawałek zarodkiem do góry. Odetnij drugą boczną stronę skorupki jajka i umieść wycięty kawałek skorupki w PBS.

Za pomocą mikroskopu stereoskopowego i kleszczy oderwij zarodek i błonę żółtka od skorupki jajka. Użyj kleszczy i mikronożyczek, aby usunąć dodatkowe błony embrionalne, a następnie użyj łyżki do zarodków, aby przenieść zarodek na szalkę Petriego ze świeżym PBS. Po zmyciu krwi i żółtka umieść do trzech zarodków w dołku 12-dołkowej płytki, zawierającej 4% paraformaldehydu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.

Gdy próbki wydają się białe, użyj wkładek polistyrenowych z dnem z siatki poliestrowej, aby przepłukać zarodki trzema pięciominutowymi płukaniami w świeżym PBS na pranie. Po ostatnim przemyciu odwadniać próbki w rosnącej serii etanolu przez jedną godzinę na stężenie. Po drugim zanurzeniu w etanolu wysuszyć zarodki w serii HMDS do stężenia etanolu przez 20 minut na zanurzenie z częściowo przykrytymi szalkami Petriego.

Następnie umieść zarodki w końcowym 100% roztworze HMDS, całkowicie lub częściowo pokrytym przez noc pod wyciągiem. Powolne suszenie poprzez stopniowe zwiększanie stężenia HDMS do etanolu jest ważne dla ujawnienia doskonałej struktury powierzchni zarodków. Następnego ranka użyj podwójnej taśmy przewodzącej z włókna węglowego, aby ostrożnie zamontować całkowicie wysuszone próbki na standardowym aluminiowym króćcu.

Po zamontowaniu wszystkich próbek należy wprowadzić je do komory napylania w celu pokrycia próbek bardzo cienką warstwą złota przez 60 do 120 sekund przy napylaniu 35 miliamperów. Następnie mocno dokręć dociskowe, aby zamontować klocki na odpowiednich płytach do nalewania. Użyj narzędzia do wymiany próbek, aby przenieść uchwyt próbki do komory próbki skaningowego mikroskopu elektronowego w celu obrazowania.

Aby przygotować skorupki jaj do skaningowej mikroskopii elektronowej, należy umieścić skorupki jaj w wodzie destylowanej na co najmniej jedną godzinę po zbiorze zarodków, aby wyeliminować wszelkie zanieczyszczenie żółtkiem lub albuminą. Następnie wysusz oczyszczone skorupki jaj na powietrzu na delikatnych chusteczkach antystatycznych w dygestoriach przez noc. Wysuszone skorupki jaj należy przechowywać w czystych butelkach z próbkami, oznaczonych numerem i stadium zarodka.

Następnie zamontuj, rozpyl i zobrazuj próbki skorupek jaj, jak właśnie pokazano dla zarodków. Aby założyć szkiełkowe kultury grzybów, użyj sterylnego skalpela, aby pociąć od pół do trzech czwartych cala bloków stałego agaru z dekstrozą ziemniaczaną i umieść bloki na pojedynczych szklanych szkiełkach mikroskopowych. Umieść sterylne wykałaczki na dnie czystych szalek Petriego, aby podnieść z nich szkiełka, aby wytworzyć napięcie powierzchniowe między płytką a szkiełkiem.

Umieść każde szkiełko na wykałaczkach na szalce Petriego. Następnie użyj sterylnej pętli, aby przenieść grzyby z inokulum próbki na każdą z czterech bocznych stron bloku agarowego. Dodaj kilka kropli sterylnej wody destylowanej do szalki Petriego wokół szkiełka, aby zapewnić wilgoć rosnącym grzybom.

Częściowo uszczelnić płytkę folią parafinową i umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza na okres inkubacji odpowiedni dla gatunków grzybów. Pod koniec inkubacji zdjąć szkiełko z płytki Petriego i za pomocą sterylnych kleszczy przenieść ściśle przylegający blok agaru ze szkiełka do pojemnika z 3% aldehydem glutarowym do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka należy odwodnić próbki w rosnącej serii etanolu przez 15 minut na stężenie.

Po 90% zanurzeniu należy przetworzyć próbki do końcowego odwodnienia z dwiema 30-minutowymi zmianami w 100% etanolu, aby zapewnić pełne nasycenie przed umieszczeniem odwodnionych próbek w komorze aparatu do suszenia w punkcie krytycznym. Uszczelnij komorę i otwórz zawory, aby ciekły dwutlenek węgla mógł się wydostać do środka i wypuścić etanol, aż ciekły dwutlenek węgla całkowicie wypełni komorę. Następnie uszczelnij i powoli podgrzej komorę, aby osiągnąć punkt krytyczny, gdy ciśnienie w komorze przekracza 1,000 funtów ciśnienia na cal kwadratowy, temperatura przekracza 31 stopni Celsjusza, a przestrzeń cieczy i gazu dwutlenku węgla jest w równowadze.

Następnie powoli spuść dwutlenek węgla z komory i próbki w postaci gazu, aby uniknąć wpływu napięcia powierzchniowego na próbkę, a następnie zamontuj, płytkuj i zobrazuj próbki grzybów, jak pokazano. Boczny skaningowy mikroskop elektronowy zarodka żółwia w stadium 12 ujawnia, w jaki sposób wypukłość szczęki rozciąga się poza żuchwę i przyśrodkowo ogranicza dobrze zaznaczony dół nosowy. Można również zaobserwować pięć łuków gardłowych.

W zarodku w stadium 15 nowo powstałe somity są widoczne w tylnej części ogona zarodka, a pąki kończyn przednich są skierowane bardziej korowo niż brzusznie. Dobrze zdefiniowany wyrostek grzbietu pancerza można również uwidocznić wzdłuż całego obszaru boku międzykończynowego zarodka. W stadium 18 utworzył się krótki, słabo wystający pysk z lekko odwróconym dolnym dziobem z końcowym haczykiem, który pasuje do środkowego wycięcia górnego dzioba.

Górna szczęka ma karbowany wygląd, a na końcu górnej szczęki można zobaczyć maleńki ząb jajowy. Analiza ultrastrukturalna skorupki jaja Chrysemys picta i błony skorupy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej ujawnia zewnętrzną warstwę skorupy jaja calcarinus, mocno połączoną z wewnętrzną nitkowatą błoną skorupy. Zewnętrzna powierzchnia skorupki jaja składa się z dobrze wyróżniających się zmineralizowanych jednostek skorupy zbudowanych z kulistych kulistych guzków ułożonych w grupy i pomiędzy sąsiednimi jednostkami muszli, z koncentracją małych zaokrąglonych zagłębień lub porów o różnych rozmiarach.

Nie można uogólniać wspólnych metodologii dla wszystkich próbek biologicznych, aby osiągnąć przyzwoitą jakość obrazu przy użyciu SEM. Unikalne zmiany, jak wykazano, są niezbędne dla określonych typów tkanek. Metoda suszenia chemicznego i powietrznego może być również stosowana w przypadku innych próbek organicznych, a technika hodowli szkiełka sprzęgającego może być stosowana w przypadku wszystkich miękkich, wytrzymałych kultur mikrobiologicznych.