Name: Projektowanie, synteza i właściwości fotochemiczne klikalnych związków w klatkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę syntezy modułowych związków w klatkach z możliwością klikowania, zachowujących fotoczułość. Technika umożliwia wprowadzenie właściwości takich jak rozpuszczalność w wodzie lub celowanie komórkowe bez utraty funkcjonalności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez grant JSPS KAKENHI numer JP16H01282 (TF), Grant-in-Aid na badania naukowe w innowacyjnych obszarach "Dynamika pamięci" oraz JP19H05778 (TF), "MolMovies."

1. Synteza modułowej grupy klatkowania paBhc dla klikalnych związków klatkowych28,41
<ol>
	<li>Otrzymywanie chlorku metylu (6-bromo-7-hydroksykumaryno-4-ylo)metylu (Bhc-CH2Cl)
	<ol>
		<li>Umieścić 4-bromoresorcynol (9,742 g, 51,5 mmol) w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml wyposażonej w mieszadło.</li>
		<li>Dodać stężenieH2SO4 (98%, 30 ml) do kolby i wymieszać mieszaninę do rozpuszczenia.</li>
		<li>Dodawać kroplami 4-chloroacetooctan etylu (10 ml, 74 mmol).</li>
		<li>Kontynuuj mieszanie mieszaniny w temperaturze otoczenia przez 5 dni.</li>
		<li>Oddzielnie umieść pokruszone kostki lodu (~200 ml) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml.</li>
		<li>Wlać mieszaninę reakcyjną do lodu i energicznie mieszać przez 30 minut, aż do uzyskania drobno sproszkowanego osadu.</li>
		<li>Zebrać osad przez filtrację próżniową. Umyj jasnobrązowy osad wodą pięć razy.</li>
		<li>Wysuszyć osad w próżni przez noc, aby uzyskać BhcCH2Cl w postaci jasnobrązowego proszku (13,57 g, 46,9 mmol).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie (6-bromo-7-hydroksykumaryno-4-ylo)metanolu (BhcCH2OH)
	<ol>
		<li>Umieścić przygotowany BhcCH2Cl (1,1440 g, 3,95 mmol) i 1 M HCl (300 mL) w kolbie okrągłodennej o pojemności 1 l wyposażonej w kondensator Dimroth. Mieszać mieszaninę w temperaturze 140 °C przez 5 dni. Po tym czasie schłodzić mieszaninę do temperatury otoczenia.</li>
		<li>Usuń wodę z reakcji przez obrotowe odparowanie w próżni, aby otrzymać BhcCH2OH (1) w postaci jasnobrązowego proszku (1,0359 g, 3,82 mmol, 97% wydajności). 
		UWAGA: Użycie 250 ml 1 M HCl na 1 g BhcCH2Cl daje zadowalający wynik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>OtrzymywaniepaBhcCH2OH (2) w reakcji Mannicha
	<ol>
		<li>Umieścić paraformaldehyd (446,4 mg, 14,9 mmol) w kolbie okrągłodennej o pojemności 50 ml. Dodać bezwodny etanol (5 ml) i N-metylopropargyloaminę (1,25 ml, 14,8 mmol) do kolby.</li>
		<li>Mieszać mieszaninę w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę w atmosferze Ar.</li>
		<li>DodaćBhcCH2OH (1) (1.367 g, 5.04 mmol) do kolby. Podgrzać mieszaninę do temperatury 80 °C za pomocą aparatu do podgrzewania bloku i kontynuować mieszanie mieszaniny w temperaturze 80 °C przez 2 godziny w atmosferze Ar.</li>
		<li>Zatrzymać grzałkę bloku i schłodzić mieszaninę reakcyjną do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Zebrać powstały jasnobrązowo-żółty osad przez filtrację próżniową. Przepłukać osad dwukrotnie niewielką ilością bezwodnego etanolu (za każdym razem 1 ml).</li>
		<li>Usunąć nadmiar etanolu w próżni, aby uzyskać paBhcCH2OH (2) (1.393 g, 3.96 mmol).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie klikalnych związków w klatkach
UWAGA: Następujące procedury mogą być stosowane do przygotowania innych klikalnych związków w klatkach zawierających hydroksylowe, aminowe i karboksylowe grupy funkcyjne.
<ol>
	<li>Ogólna procedura 1: Przygotowanie klikalnej aminy w sadzu
	<ol>
		<li>UmieścićpaBhcCH2OH (2) (709,6 mg, 2,02 mmol) i N,N'-karbonylodimidazol (CDI, 397,6 mg, 2,45 mmol) w kolbie okrągłodennej o pojemności 30 ml. Dodać suchy CH2Cl2 (6 ml) i mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dodać 4-dimetyloaminopirydynę (4-DMAP, 324,8 mg, 2,66 mmol) i tert-butyl (6-aminoheksyl)karbaminian (533,1 mg, 2,46 mmol). Mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez 3 godziny.</li>
		<li>Usunąć rozpuszczalnik i inne lotne substancje za pomocą wyparki obrotowej pod próżnią. Oczyścić pozostałość bezpośrednio za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Ogólna procedura 2: Przygotowanie alkoholu w klatce, który można kliknąć,
	<ol>
		<li>Umieścić paklitaksel (PTX, 48,7 mg, 0,057 mmol) w kolbie okrągłodennej o pojemności 30 ml wyposażonej w zawór odcinający trójdrożny i balon Ar. Dodaj suchy CH2Cl2 (1 ml), 4-DMAP (17,1 mg, 0,14 mmol) i chloromrówczan 4-nitrofenylu (26,0 mg, 0,13 mmol).</li>
		<li>Mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez 2,5 godziny w atmosferze Ar.</li>
		<li>Dodać 4-DMAP (15,7 mg, 0,13 mmol) i paBhcCH2 OH (2) (39,1 mg, 0,111 mmol) do roztworu. Kontynuuj mieszanie mieszaniny w temperaturze otoczenia przez 17 godzin.</li>
		<li>Do mieszaniny dodaćCHCl 3 (10 ml) i 15% wodnego roztworu NaHCO3 (5 ml). Mieszaj energicznie mieszaninę przez około 3 minuty. Usunąć warstwę wodną za pomocą pipety.</li>
		<li>Dodać 0,5 M kwasu cytrynowego (5 ml) do kolby zawierającej warstwę organiczną. Wymieszaj mieszaninę i usuń warstwę wodną jak powyżej.</li>
		<li>Oddzielić warstwę organiczną za pomocą kolumny separacji faz. Usunąć rozpuszczalniki za pomocą wyparki obrotowej w próżni. Oczyścić produkt za pomocą standardowej chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogólna procedura 3: Przygotowanie kwasu karboksylowego z klatką, który można kliknąć
	<ol>
		<li>Rozpuść kwas arachidonowy (33,0 μl, 0,100 mmol), paBhcCH2OH (2) (39,6 mg, 0,112 mmol) i 4-DMAP (14,1 mg, 0,115 mmol) w suchym CH2Cl2 (2 ml). Dodać N,Nʹ-diizopropylokarbodimid (DIPC, 17,0 μl, 0,110 mmol) i mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez 140 minut.</li>
		<li>Usunąć rozpuszczalnik w próżni. Oczyścić pozostałość bezpośrednio za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Instalacja jednostki funkcjonalnej w klikalnych klatkach
<ol>
	<li>Rozpuścić pięciowodny siarczan miedzi(II) (249 mg) w wodzie jonowymiennej (IEW, 10 ml), aby uzyskać 0,1 M roztwórCuSO4.</li>
	<li>Rozpuścić 2ʹ-paBhcmoc-PTX (8,0 mg, 6,5 μmol), tris(3-hydroksypropylotriazolylometylometylo)aminę (THPTA, 17,5 mg, 40,3 μmol), l-askorbinian sodu (162,4 mg, 0,825 mmol) i azydek 15-chloro-3,6,9-trioksapentadecylu (3,1 mg, 11 μmol) w mieszaninie rozpuszczalnika 0,1 M buforu fosforanowego (2,5 ml, pH 7,2) i dimetylosulfotlenku (DMSO, 0,5 ml).</li>
	<li>Dodać 0,1 M roztwór CuSO4 (81,2 μl, 8,1 μmol) do mieszaniny reakcyjnej. Mieszaj mieszaninę w temperaturze otoczenia przez 80 minut. Monitorować postęp reakcji za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).</li>
	<li>Rozpuścić osady, dodając 75% roztwór acetonitrylu i wody (3,5 ml). Otrzymany roztwór nanieść bezpośrednio na półpreparatywny system HPLC w celu oczyszczenia pożądanego produktu. 
	UWAGA: Solubilizacja mieszaniny reakcyjnej przez dodanie tert-butanolu może przyspieszyć postęp reakcji.</li>
</ol>
4. Fotolityczna reakcja rozpakowywania związków w klatkach
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów podstawowych
	<ol>
		<li>Rozpuścić żądany związek umieszczony w sadzu (5 μmol) w DMSO (500 μl), aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM. Dozować porcję każdego roztworu (10 μl) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w zamrażarce (−20 °C) do momentu tuż przed użyciem.</li>
		<li>6 mM K3[Fe(C2O4)3] (100 ml): Rozpuścić rekrystalizowany ferrioksalan potasu (0,295 g, 0,675 mmol) w 80 ml wody. Dodać 0,5 M H2SO4 (10 ml) i odpowiednią ilość IEW, aby uzupełnić objętość do 100 ml. 
		UWAGA: Żelazionoksalan potasu należy oczyścić przez rekrystalizację z gorącej wody i przechowywać w ciemności. Rekrystalizowany ferrioksalan potasu otrzymuje się w postaci trójwodzianu; dlatego jego wzór toK3[Fe(C, 2O,4)3]·3H2O, a podczas przygotowywania roztworu podstawowego należy wziąć pod uwagę masę wzoru wynoszącą 491,24. Sprawdzić czystość roztworu o stężeniu 6 mM, mierząc jego absorpcję przy długości fali 510 nm. Jeśli absorbancja wynosi <0,02, nadaje się do użycia w doświadczeniu.</li>
		<li>0,1% bufor-fen (30 ml): Rozpuścić NaOAc·3H2O (7,35 g), 1,10-fenantrolinę (phen)·H2O (30 mg) i skonc. H2SO4 (0,9 ml) w IEW (20 ml). Dodać IEW, aby uzupełnić objętość do 30 ml. 
		UWAGA: Roztwór zawiera 1,8 M NaOAc, 0,54 M H2SO4 i 0,1% 1,10-fenantroliny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar liczby fotonów za pomocą aktynometrii ferrioksalanowej
	<ol>
		<li>Umieścić 6 mM K3[Fe(C2O4)3] (V1 L) w kuwecie kwarcowej. Naświetlać roztwór światłem o długości fali 350 nm przez 5 sekund.</li>
		<li>Przenieść napromieniowany roztwór do kuwety Pyrex o długości drogi l [cm].</li>
		<li>Dodać 0,1% bufor-fen (V2 l) do napromienionego roztworu próbki i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Zmierzyć absorbancję próbki przy długości fali 510 nm. Obliczyć średnią zmianę absorpcji w jednostce czasu (ΔA510 [s−1]).</li>
		<li>Oblicz liczbę moli generowanych jonów Fe2+ w jednostce czasu zgodnie z następującym równaniem: 
		nFe2+ [mol s−1] = ((V1 + V2) [L] × ΔA510 [s−1])/(l [cm] × ε 510 [L mol−1 cm−1]), 
		gdzie (V1 + V2) jest objętością próbki do pomiaru absorpcji, l jest długością drogi optycznej kuwety, a ε510 jest absorpcją molową kompleksu Fe2+-phen przy 510 nm. 
		UWAGA: W typowych warunkach doświadczalnych przyjęto wartości V1 = 2,0 × 10−3 L, V2 = 0,33 × 10−3 L, l = 1,0 cm, a ε510 = 1,1 × 104 L mol−1 cm−1.</li>
		<li>Obliczyć liczbę moli fotonów, które docierają do próbki (I0), korzystając z następującego wzoru: 
		I0 [einstein cm−2 s−1] = nFe2+/Φ350 
		gdzie Φ 350 jest sprawnością kwantową fotoredukcji ferrioksalanu przy 350 nm. 
		UWAGA: Chociaż wydajność kwantowa aktynometru ferrioksalanu potasu przy 350 nm nie została podana, zastosowano podaną wartość 1,2542 przy 358 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiary wydajności kwantowej przy 350 nm
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy próbki (w DMSO, 10 μl) buforem K-MOPS (pH 7,2, 10 ml) w celu uzyskania 10 μM roztworu w K-MOPS zawierającego 0,1% DMSO. 
		UWAGA: Bufor K-MOPS składał się ze 100 mM KCl i 10 mM kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (Mops) miareczkowanego do pH 7,2 za pomocą KOH.</li>
		<li>Przenieść podwielokrotność roztworu (V1 l) do tej samej kuwety, która jest używana w fotoreakcji aktynometru chemicznego. Napromienić roztwór próbki, stosując tę samą konfigurację, która została opisana w kroku 4.2.1.</li>
		<li>Okresowo usuwać podwielokrotność (50 μl) z napromienianego roztworu i analizować przy użyciu HPLC.</li>
		<li>Określić czas napromieniania w sekundach, w którym 90% materiału wyjściowego zareagowało (t90%), dopasowując wykresy zależnego od czasu zaniku materiału wyjściowego. 
		UWAGA: Absorbancja napromienianej próbki musi być utrzymywana na poziomie <0,1, tak aby można było pominąć wewnętrzne filtrowanie promieniowania. Pożądane jest, aby zużycie fotolityczne materiału wyjściowego można było przybliżyć za pomocą rozpadu jednowykładniczego, tak aby nie wystąpił niepożądany efekt wtórny, który zakłócałby proces fotolizy.</li>
		<li>Oblicz kwantową wydajność zaniku (Φdis) za pomocą następującego równania28: 
		Φdis = 1/(t90% × I0 × σ350) 
		gdzie t90% [s] jest czasem napromieniowania, w którym zużyto 90% materiału wyjściowego, I0 [einstein cm−2 s−1] jest liczbą moli fotonów, a σ350 [cm2 mol−1] jest dziesięcioletnim współczynnikiem ekstynkcji próbki przy 350 nm. 
		UWAGA: σ350 [cm2 mol−1] = 103ε350 [M−1 cm−1].</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Celowanie w klikalny związek w klatce za pomocą liganda HaloTag
UWAGA: Przed użyciem utrzymuj komórki HeLa w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco (DMEM, niska glukoza, pirogronian sodu, l-glutamina) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) zawierającą 1% antybiotyków (siarczan streptomycyny, penicylinę G i amfoterycynę) w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę i trypsynizować komórki, poddając je działaniu kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 1 ml) w temperaturze 37 °C przez 1 minutę. Dodać DMEM (4 ml) do komórek i ponownie zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie. Wysiewać około 5 × 105 komórek na talerz do naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w DMEM (2 ml) 24 godziny przed transfekcją.</li>
	<li>Na cztery szalki, w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, rozcieńczyć plazmidowe DNA (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg) w zredukowanej pożywce surowicy (700 μl). Oddzielnie rozcieńczyć odczynnik do lipofekcji (5 μl) w zredukowanym podłożu surowicy (150 μl) do każdej z czterech probówek i pozostawić w temperaturze otoczenia na 5 minut.</li>
	<li>Dodać porcję rozcieńczonego plazmidowego DNA (150 μl) do każdej z rozcieńczonych próbek odczynnika do lipofekcji. Inkubować w temperaturze otoczenia przez 5 minut.</li>
	<li>Po utrzymaniu komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny, odessać DMEM i przepłukać komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, 2 ml). Dodać zredukowaną pożywkę surowicy (1,5 ml).</li>
	<li>Dodać kompleks odczynnika plazmid-lipofekcja (150 μl) do każdej potrawy. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
	<li>Odessać pożywkę, dodać porcję świeżo przygotowanego DMEM (1 ml) zawierającego 2 μM paBhc-hex-FITC/Halo i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.</li>
	<li>Odessać pożywkę zawierającą związek umieszczony w sadzkach i dwukrotnie przepłukać komórki PBS+ (1 ml na płukanie) w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych związków. Dodać zredukowaną pożywkę surowicy (500 μl) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut w celu usunięcia związków, które dostały się do komórek. 
	UWAGA: PBS+ to sól fizjologiczna buforowana fosforanami uzupełniona 2 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2.</li>
	<li>Usuń pożywkę i dwukrotnie przepłucz komórki PBS+ (1 ml). Dodać porcję podłoża (1 ml), które nie zawiera czerwieni fenolowej. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą skaningowej laserowej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
6. Modulacja lokalizacji kinazy za pośrednictwem fotomediamentu za pomocą klikalnego związku w klatce
UWAGA: Przed użyciem utrzymuj komórki CHO-K1 w pożywce F-12 firmy Ham, uzupełnione 10% FBS w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
<ol>
	<li>Przygotować 100× roztwór roboczy (1 mM) paBhc-AA (5) w DMSO. 
	UWAGA: Roztwór podstawowy związku o stężeniu 10 mM przygotowuje się i przechowuje w zamrażarce (-20 °C).</li>
	<li>Wysiewać około 5 × 105 komórek na talerz do naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w DMEM (2 ml) 24 godziny przed transfekcją.</li>
	<li>Transfekcja komórek CHO-K1 z plazmidowym kodowaniem GFP-DGKγ 48 godzin przed eksperymentami z odtworzeniem klatek. 
	UWAGA: Transfekcja odbywa się zgodnie z krokami 5.2–5.5.</li>
	<li>Zastąp pożywkę zredukowaną pożywką surowicy (2 ml). Dodać 100× roztworu roboczego paBhc-AA (20 μl) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez okres od 5 minut do 1 godziny 
	UWAGA: Czas ładowania zależy od zastosowanej mieszanki.</li>
	<li>Umieść komórki na stoliku obiektywowym odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w oświetlacz fluorescencyjny z podwójnym źródłem światła.</li>
	<li>Wykonuj obraz fluorescencyjny co 10 s. Naświetlaj komórki światłem o długości fali 330–385 nm przez obiektyw mikroskopu przez odpowiedni czas. Alternatywnie, naświetlić komórki światłem o długości fali 405 nm za pomocą lampy Xe przez elastyczne włókna kwarcowe.</li>
	<li>Kontynuuj nagrywanie obrazów fluorescencyjnych przez 10 minut.</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Wcześniej opracowaliśmy związki w klatkach Bhc różnych biologicznie aktywnych cząsteczek, które wykazują wysoką wydajność fotolityczną 28,45,46,47. W celu poszerzenia repertuaru grup klatkowych Bhc, opisaliśmy również platformy modułowych związków klatkowych, które można łatwo modyfikować poprzez wprowadzenie różnych jednostek funkcjonalnych 32,40,41. Niniejszy protokół stanowi zatem metodę syntezy klikalnego prekursora grup klatkowych Bhc, który może być modyfikowany poprzez katalizowaną miedzią(I) cyklizację Huisgena. Syntezę klikalnego prekursora, paBhcCH2OH (2), osiągnięto za pomocą czteroetapowej sekwencji reakcji, rozpoczynającej się od dostępnego na rynku 4-bromoresorcynolu (Figura 1A). Zaletą obecnego protokołu jest to, że nie są wymagane żadne pracochłonne etapy oczyszczania (np. rozdzielanie chromatograficzne kolumnowe).
Ponieważ klikalny prekursor paBhcCH2OH (2) może być używany do maskowania różnych grup funkcyjnych, zsyntetyzowano klikalne związki w klatkach amin, alkoholi i kwasów karboksylowych przy użyciu 2 jako prekursora (Figura 1B). Aminy zostały zmodyfikowane jako ich karbaminiany, podczas gdy alkohole zostały zmodyfikowane jako ich węglany. W procedurach ogólnych 1 i 2 CDI stosowano do otrzymywania klikalnych karbaminianów, natomiast chloromrówczan 4-nitrofenylu do otrzymywania węglanów. Jak wskazuje mechanizm reakcji, oba odczynniki mogą być używane do otrzymywania karbaminianów i węglanów. Należy również zauważyć, że wydajność pożądanego związku w klatce zależy od struktury chemicznej cząsteczki, która ma być umieszczona w klatce. Inne przykłady można zobaczyć w naszych poprzednich raportach 28,30,33,48.
Modyfikacja kliknięcia została następnie przeprowadzona przy użyciu niewielkiej modyfikacji zgłoszonej procedury49. Dodanie ligandów na bazie tris(triazolylmetylo)aminy jest niezbędne do uzyskania pożądanych produktów z dobrą lub wysoką wydajnością. Ponieważ różnorodne azydki są łatwo dostępne zarówno ze źródeł komercyjnych, jak i z procedur literaturowych, możemy przygotować różne modułowe związki w klatkach o dodatkowych właściwościach, takich jak rozpuszczalność w wodzie i zdolność celowania komórkowego (ryc. 2).
Wydajność kwantową fotolizy zmierzono następnie zgodnie z opisaną procedurą 28,50. Rysunek 3 pokazuje, że zużycie fotolityczne 2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX i uwalnianie PTX były przybliżone odpowiednio przez pojedynczy rozkład wykładniczy i wzrost, co sugeruje brak wewnętrznego filtrowania promieniowania lub niepożądanych efektów wtórnych. Zaobserwowano poprawę wydajności kwantowej fotolizy (Φ) i wydajności fotolizy (εΦ) dla klikalnych związków umieszczonych w klatkach paBhc w porównaniu z wcześniej opisanymi związkami w klatkach Bhc (Tabela 1)41,43. Ponieważ wydajność fotolizy (εΦ) związków zamkniętych w klatkach Bhc jest ponad sto razy wyższa niż w przypadku związków klatkowych typu 2-nitrobenzylowego48, wyraźna poprawa wynikająca z obecności grup klatkowania paBhc jest wyraźnie korzystna dla tego systemu.
W ramach eksperymentu potwierdzającego słuszność koncepcji do 2ʹ-paBhcmoc-PTX (4) wprowadzono ugrupowanie hydrofilowe, a do związku 3 wprowadzono ligand celujący w komórkę (ryc. 2). Rozpuszczalność w wodzie 2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX była 650 razy wyższa niż w przypadku macierzystego PTX (Tabela 1). Selektywne celowanie komórkowe osiągnięto za pomocą systemu tag-sonda, a paBhcmoc-hex-FITC / Halo (8) zawierający ligand HaloTag został z powodzeniem skierowany na błonę komórkową hodowanych komórek ssaków wykazujących ekspresję białka fuzyjnego HaloTag / EGFR (Figura 4). Modulację subkomórkowej lokalizacji kinazy za pośrednictwem światła osiągnięto również przy użyciu klikalnego związku w klatce 5 (ryc. 5).
Podsumowując, z powodzeniem zademonstrowaliśmy metodę przygotowania klikalnych platform dla fotoklatkowanych związków biologicznie interesujących cząsteczek, które można łatwo modyfikować za pomocą dodatkowych właściwości, takich jak rozpuszczalność w wodzie i zdolność do celowania komórkowego. Ponieważ grupa klatkowa paBhc może być używana do przygotowania dowolnych cząsteczek z modyfikowalnymi grupami funkcyjnymi, zastosowanie niniejszego protokołu nie jest ograniczone do cząsteczek opisanych w niniejszym dokumencie. Korzystając z modułowej platformy, a mianowicie grupy klatkowej paBhc, można łatwo przygotować pożądane związki w koszykach, a ich właściwości fizyczne i chemiczne można modulować za pomocą modyfikacji zatrzaskowej.

Związki w klatce to syntetyczne cząsteczki, których pierwotne funkcje są czasowo maskowane przez kowalencyjnie dołączone fotousuwalne grupy ochronne. Co ciekawe, związki biologicznie istotnych cząsteczek w klatkach stanowią nieodzowną metodę czasoprzestrzennej kontroli fizjologii komórki1,2,3,4,5,6. W 1977 roku Engels i Schlaeger opisali ester 2-nitrobenzylowy cAMP jako przepuszczalną dla membrany i fotolabilną pochodną cAMP7. W następnym roku Kaplan opisał ester 1-(2-nitrofenylo)etylowy ATP (NPE-ATP) i nazwał ten związek "w klatce" ATP8. Od tego czasu istnieje szereg fotochemicznie usuwalnych grup ochronnych, takich jak 2-nitrobenzyle, p-hydroksyfenacyle9, 2-(2-nitrofenylo)etylo10,11, 7-nitroindolin-1-yls12,13, and (kumaryno-4-ylo)metylowe14,15,16 zostały użyte do przygotowania związków zamkniętych w sadzach.
Synteza związków zamkniętych w klatkach o pożądanych dodatkowych właściwościach, takich jak przepuszczalność błony, rozpuszczalność w wodzie i zdolność do celowania komórkowego, powinna ułatwić biologiczne zastosowania komórek. Ponieważ właściwości fizyczne i fotochemiczne tych cząsteczek zależą przede wszystkim od struktury chemicznej fotochemicznie usuwalnych grup ochronnych użytych do ich przygotowania, wymagany jest zróżnicowany repertuar grup foto-klatkowych. Jednak różnorodność strukturalna obecnie dostępnych grup umieszczanych w sadzach, które wykazują wysoką wydajność fotolizy, jest ograniczona. Może to stanowić przeszkodę w zwiększeniu wykorzystania związków trzymanych w klatkach.
Aby rozwiązać ten problem, repertuar grup foto-klatkowych został rozszerzony poprzez chemiczną modyfikację istniejących fotousuwalnych grup ochronnych lub zaprojektowanie nowych fotolabilnych chromoforów o doskonałych właściwościach fotofizycznych i fotochemicznych. Przykłady obejmują nitrodibenzofuran (NDBF)17, [3-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl)-2-butyl] (DMNPB)18,19, wrażliwa na wapń fotoklatka 2-nitrobenzylowa20, podstawione kumarylometyle (DEAC45021, DEAdcCM22, 7-azetidinyl-4-methylcoumarin23, oraz styryl coumarins24), pochodne cyjaniny (CyEt-pan)25, oraz pochodne BODIPY26,27.
Ponadto, wcześniej opracowaliśmy grupę (6-bromo-7-hydroksykumaryno-4-ylo)metylową (Bhc) i z powodzeniem zsyntetyzowaliśmy różne związki neuroprzekaźników w klatkach28, second messengers29,30, and oligonukleotydy31,32,33 wykazujące duże przekroje wzbudzenia jedno- i dwufotonowego. Jeśli dodatkowe właściwości mogą być łatwo zainstalowane w grupach umieszczanych w klatkach bez uszczerbku dla ich wrażliwości na światło, wówczas repertuar związków zamkniętych w klatkach może zostać rozszerzony34,35,36,37,38,39. W związku z tym zaprojektowaliśmy modułowe związki w klatkach, które składają się z trzech części, a mianowicie grupy Bhc jako rdzenia reagującego na światło, uchwytów chemicznych do instalacji dodatkowych funkcji oraz cząsteczek, które mają być maskowane40,41.
Tak więc, ten artykuł dostarcza praktycznej metody przygotowania związków biologicznie istotnych cząsteczek. Niniejszy protokół opisuje metody przygotowania klikalnej platformy dla grup foto-klatkowych, wprowadzenia dodatkowych funkcjonalności w celu poszerzenia repertuaru związków umieszczanych w klatkach, pomiaru ich właściwości fizycznych i fotochemicznych oraz selektywnego kierowania typu komórkowego klikalnego związku klatkowego do dalszego zastosowania komórkowego.

<table><tbody><tr><td>acetonitryl, EP</td><td>Nacalai</td><td>00404-75</td><td></td></tr><tr><td>acetonitryl, super odwodniony</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>010-22905</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk, 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>4-bromoresorcynol</td><td>TCI Chemicals</td><td>B0654</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-karbonylodimidazol</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>034-10491</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Kanto</td><td>07278-71</td><td></td></tr><tr><td>Pięciowodny siarczan miedzi (II), 99,9%</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>032-12511</td><td></td></tr><tr><td>dichlorometan, odwodniony</td><td>Kanto</td><td>11338-05</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-diizopropylokarbodimid (DIPC)</td><td>TCI Chemicals</td><td>D0254</td><td></td></tr><tr><td>4-dimetyloaminopirydyna</td><td>TCI Chemicals</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek, odwodniony -</td><td>super-Kanto</td><td>10380-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Sigma</td><td>D6046-500ML</td><td></td></tr><tr><td>podwójny oświetlacz fluorescencyjny źródła światła, IX2-RFAW</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99,5)</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>054-07225</td><td></td></tr><tr><td>4-chloroacetooctan etylu</td><td>TCI Chemicals</td><td>C0911</td><td></td></tr><tr><td>Szynka F-12 z L-glutaminą i fenolem Czerwień</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-08335</td><td></td></tr><tr><td>kwas solny</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>087-01076</td><td></td></tr><tr><td>odwrócony mikroskop fluorescencyjny IX-71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOLUTE Separator faz, 15 ml</td><td>Biotage</td><td>120-1906-D</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu L-(+)-askorbinowego</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>196-01252</td><td></td></tr><tr><td>skaningowa mikroskopia konfokalna ze skaningiem laserowym, FLUOVIEW FV1200/IX-81</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668027</td><td>odczynnik do lipofekcji</td></tr><tr><td>Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy</td><td>Dojindo</td><td>345-01804</td><td>MOPS</td></tr><tr><td>4-nitrofenylochloromrówczan (4-NPC)</td><td>TCI Chemicals</td><td>C1400</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana pożywka surowicy, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td>zredukowana pożywka surowicy nie zawiera czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>1,10-fenantroliny monohydrat</td><td>Nacalai</td><td>26707-02</td><td></td></tr><tr><td>Reaktor fotochemiczny z lampami RPR 350 nm</td><td>Rayonet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trioksalatożelazian potasu (III) trójwodny</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>W01SRM19-5000</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu Trójwodzian</td><td>Nacalai</td><td>31115-05</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>199-05985</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy, 96-98%</td> <td>FUJIFILM Wako</td><td>190-04675</td><td></td></tr><tr><td>Tris(3-hydroksypropylotriazolylo)amina (THPTA)</td><td>ALDRICH</td><td>762342-100MG</td><td></td></tr><tr><td>dwuwodny cytrynian trisodu</td><td>Nacalai</td><td>31404-15</td><td></td></tr><tr><td>Światło ksenonowe źródło, MAX-303</td><td>Asahi Spectra</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

projektowanie, synteza i właściwości fotochemiczne klikalnych związków w klatkach

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

Związki zamknięte w klatkach umożliwiają manipulację fizjologią komórki za pośrednictwem światła z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną. Jednak ograniczona różnorodność strukturalna obecnie dostępnych grup umieszczanych w sadzach oraz trudności w modyfikacji syntetycznej bez poświęcania ich skuteczności fotolizy stanowią przeszkodę w rozszerzaniu repertuaru związków trzymanych w klatkach do zastosowań w żywych komórkach. Ponieważ chemiczna modyfikacja grup fotoklatkowania typu kumarynowego jest obiecującym podejściem do otrzymywania związków w klatkach o różnych właściwościach fizycznych i chemicznych, przedstawiamy metodę syntezy klikalnych związków w klatkach, które można łatwo modyfikować za pomocą różnych jednostek funkcjonalnych za pomocą katalizowanej miedzią(I) cyklizacji Huisgena. Cząsteczka platformy modułowej zawiera grupę (6-bromo-7-hydroksykumaryno-4-ylo)metylową (Bhc) jako grupę fotoklatkową, która wykazuje wysoką wydajność fotolizy w porównaniu z konwencjonalnymi 2-nitrobenzylami. Przedstawiono ogólne procedury przygotowania klikalnych związków klatkowych zawierających aminy, alkohole i karboksylany. Dodatkowe właściwości, takie jak rozpuszczalność w wodzie i zdolność do celowania w komórki, można łatwo włączyć do klikalnych związków klatkowych. Ponadto zmierzono właściwości fizyczne i fotochemiczne, w tym wydajność kwantową fotolizy, i stwierdzono, że są one lepsze niż w przypadku odpowiednich związków Bhc zamkniętych w klatkach. Opisany protokół można zatem uznać za potencjalne rozwiązanie problemu braku różnorodności strukturalnej w dostępnych związkach trzymanych w klatkach.

Udało się pomyślnie zsyntezować aktywowane światłem „zablokowane” związki biologicznie interesujących cząsteczek, w tym kwasu arachidonowego i paklitakselu, wyposażone w grupy reaktywne do tzw. reakcji klika (Rycina 1)28,41. Dodatkowe właściwości, takie jak rozpuszczalność w wodzie i zdolność do kierowania się do komórek, wprowadzono do paBhcmoc-PTX za pomocą cyklizacji Huisgena katalizowanej przez miedź(I) (tzw. reakcja „klik”) (Rycina 2). Następnie te aktywowane światłem „zablokowane” formy PTX poddano fotolizie, uzyskując w ten sposób aktywne, macierzyste PTX po naświetleniu falą o długości 350 nm (Rycina 3), a właściwości fizyczne i fotochemiczne tych związków ze strukturą „klik” zebrano w Tabeli 1. Wydajności kwantowe aktywowanych światłem „zablokowanych” związków 2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX (Φdis 0,14) i paBhc-AA (Φdis 0,083) były ponad dwukrotnie większe niż konwencjonalnych związków „zablokowanych” z grupą Bhc, tj. 2ʹ-Bhcmoc-PTX (Φdis 0,040) i Bhc-AA (Φdis 0,038)43. Ponadto zaobserwowano poprawę rozpuszczalności w wodzie dla 2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX, który zawiera resztę glukozy.
W eksperymentach z żywymi komórkami udało się skutecznie dostarczyć paBhc-hex-FITC/Halo do hodowanych komórek ssaczych tymczasowo eksprymujących białko fuzję składające się z białka HaloTag i receptora czynnika wzrostu nabłonka (EGFR). Zielone fluorescencje pochodzące od reszty fluoresceiny w paBhc-hex-FITC/Halo zaobserwowano na błonie komórkowej (Rycina 4). Zmodyfikowanie lokalizacji podkomórkowej kinazy za pomocą związku chemicznego zablokowanego przez paBhc uzyskano przy udziale światła. Przeniesienie diacyloglicerolokinazy γ (DGKγ) aktywuje się w obecności kwasu arachidonowego (AA)44. Komórki CHO-K1 tymczasowo eksprymujące GFP-DGKγ poddano działaniu albo AA, albo paBhc-AA (5). Dodanie AA spowodowało zmianę lokalizacji podkomórkowej DGKγ (Rycina 5A,B). Podobne zmiany w lokalizacji DGKγ zaobserwowano w komórkach traktowanych paBhc-AA po naświetleniu światłem UV (Rycina 5C,D).
<img alt="Schemat drogi syntezy chemicznej z etapami reakcji, wydajnościami i procedurami dla związków 1–5." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
Rycina 1: Otrzymywanie aktywowalnych chemicznie związków zabezpieczonych. 
(A) Odczynniki i warunki: a. etyl 4-chloroacetoacetan/konc. H2SO4/rt/7 dni/91% wydajność, b. 1 M HCl/reflux/3 dni/97% wydajność. c. N-metylopropargylamina /HCHO/EtOH, następnie dodać (1) i ogrzewać w warunkach wrzenia z powrotem przez 17 h/79% wydajność. (B) Syntezy aktywowalnego chemicznie aminy zabezpieczonej oraz PTX i kwasu arachidonowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Synteza reakcji chemicznej, diagram katalizy przez CuSO₄; chemia klika, reakcja azotku z alkinem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
Rycina 2: Wprowadzanie jednostek funkcyjnych do związków klatkowych z grupami reaktywnymi. 
(A) Synteza rozpuszczalnego w wodzie klatkowego PTX za pomocą cykloaddycji Huisgena katalizowanej przez miedź(I). (B) Struktury klatkowych związków z grupami reaktywnymi zawierających ligand HaloTag do celowania komórkowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki chromatografii i wykres kinetyczny pokazujący rozdział związków i ich degradację w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
Rycina 3: Fotoliza 2ʹ-glc-paBhcmoc-PTX (6). 
Próbki (10 μM) w roztworze K-MOPS (pH 7,2) napromieniowano światłem o długości fali 350 nm. (A) Typowe chromatogramy HPLC dla fotolizy związku 6 (rejestrowane przy 254 nm). Próbki analizowano po określonym czasie napromieniowania. (B) Zależność ilości związku 6 od czasu fotolizy. Niebieskie kółka przedstawiają ubytek związku 6. Cienka linia ciągła to dopasowanie krzywej metodą najmniejszych kwadratów do prostego wykładniczego modelu rozpadu dla związku 6. Czerwone kwadraty pokazują wydajność PTX. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (±SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wizualizacja komórek, analiza mikroskopii fluorescencyjnej, wizualizacja struktur komórkowych, badania biologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
Rycina 4: Obrazy fluorescencyjne hodowanych komórek ssaczych inkubowanych z paBhc-hex-FITC/Halo (8). 
Komórki transfekowane plazmidem pcDNA3-Halo-EGFR inkubowano z roztworem związku 8 o stężeniu 2 μM w temperaturze 37 °C przez 30 min. Obrazy uzyskano po wielokrotnym przemywaniu buforem PBS+. Komórki HEK293T poddane fałszywemu zabiegowi (A: obraz kontrastowo-interferencyjny (DIC) i D: obraz fluorescencyjny). Komórki HEK293T (B i E) oraz komórki HeLa (C i F) tymczasowo eksprymujące białko Halo-EGFR (B i C: obrazy DIC oraz E i F: obrazy fluorescencyjne). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego obrazu.</a>
<img alt="Porównanie morfologii komórek, obrazy mikroskopii fluorescencyjnej, analiza struktur komórkowych, skala 20 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60021/60021fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
Rysunek 5: Obrazy fluorescencyjne po napromieniowaniu UV komórek CHO-K1 inkubowanych z zakleszczonym kwasem arachidonowym Bhc. Komórki CHO-K1 zostały transfekowane białkiem fuzji DGKγ-EGFP. 
(A) Obraz fluorescencyjny transfekowanych komórek. (B) 100 s po dodaniu roztworu kwasu arachidonowego o stężeniu 10 μM. (C) Komórki inkubowano z roztworem paBhc-AA (5) o stężeniu 10 μM w 37 °C przez 5 min. (D) 100 s po 20-sekundowym napromieniowaniu UV (330–385 nm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60021/60021fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>związki</td>
			<td>λmax (nm)a</td>
			<td>εmax (M-1 cm-1)b</td>
			<td>ϕdisc</td>
			<td>εϕdisd</td>
			<td>Rozpuszczalność (μM)e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTX</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>340</td>
			<td>10500</td>
			<td>0,040</td>
			<td>400</td>
			<td>55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-paBhcmoc-PTX</td>
			<td>359</td>
			<td>9300</td>
			<td>0,059</td>
			<td>670</td>
			<td>8,3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2'-glc-Bhcmoc-PTX</td>
			<td>373</td>
			<td>12300</td>
			<td>0,14</td>
			<td>1280</td>
			<td>650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bhc-AA</td>
			<td>341</td>
			<td>10800</td>
			<td>0,038</td>
			<td>390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paBhc-AA</td>
			<td>366</td>
			<td>10300</td>
			<td>0,083</td>
			<td>750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Właściwości fizyczne i fotochemiczne związków cufkowanych o aktywności „klik”. 
a. Maksimum absorpcji (nm), b. Molarny współczynnik absorpcji przy λmax (M−1 cm−1), c. Wydajność kwantowa zaniku substratów przy 350 nm, d. Iloczyn molarnego współczynnika absorpcji i wydajności kwantowej zaniku przy 350 nm, e. Stężenie roztworu nasyconego w K-MOPS (pH 7,2) (μg mL−1).

Przedstawiono protokół syntezy i pomiaru właściwości fotochemicznych modułowych związków zamkniętych w klatkach z klikalnymi cząstkami.

Projektowanie, synteza i właściwości fotochemiczne klikalnych związków w klatkach

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie praktycznej metody otrzymywania związków w klatkach o dodatkowych właściwościach, takich jak rozpuszczalność w wodzie lub zdolność celowania komórkowego. Wykorzystując prostą procedurę syntezy, technika ta może być wykorzystana do rozszerzenia laboratorium na związki w klatkach oraz do wytwarzania związków w klatkach o dodatkowych właściwościach bez uszczerbku dla ich wrażliwości na światło. Syntezę tę można przeprowadzić w standardowym laboratorium, ponieważ nasze klikalne związki w klatkach są odporne na promieniowanie fotoelektryczne po rozpuszczeniu w nienukleofilowych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak dichlorometan lub dimetylosulfotlenek.Procedurę z udziałem Hirony Sasaki zademonstrują Akinobu Suzuki, doktor habilitowany, Hanami Aoki i Rei Watahiki, doktoranci z laboratorium. Zacznij od dodania 709,6 miligramów metanolu paBhc i 397,6 miligramów n-karbonylodimidazolu do 30-mililitrowej kolby okrągłodennej. Dodać do kolby suche sześć mililitrów dichlorometanu i mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez godzinę.Pod koniec inkubacji dodać 342,8 miligramów 4-dimetyloaminopirydyny i 552 mikrolitry karbaminianu tert-butylu sześcioaminoheksylowego i mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez dodatkowe trzy godziny. Następnie użyj wyparki obrotowej w próżni, aby usunąć rozpuszczalnik i inne lotne substancje, a następnie użyj chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym, aby bezpośrednio oczyścić pozostałości. Aby zainstalować jednostkę funkcjonalną w klikalnym związku klatkowym, rozpuść 249 miligramów pięciowodnego siarczanu miedzi w 10 mililitrach wody jonowymiennej, aby uzyskać 0,1 molowy roztwór siarczanu miedzi.Rozpuścić osiem miligramów dwóch głównych makiet paklitakselu paBhc, 7,5 miligrama tris(3-hydroksypropylotriolilo)aminy, 162,4 miligrama l-askorbinianu sodu i 3,1 miligrama azydeku 15-chloro-3, 6, 9-trioksypentyloadylu w zmieszanym rozpuszczalniku 2,5 mililitra 0,1 molowego buforu fosforanowego i 0,5 mililitra dimetylosulfotlenku. Następnie dodać 81,2 mikrolitra 0,1 molowego roztworu siarczanu miedzi do mieszaniny reakcyjnej i mieszać mieszaninę w temperaturze otoczenia przez 80 minut, monitorując postęp reakcji za pomocą HPLC. Pod koniec reakcji rozpuść środki strącające w 3,5 mililitra 75% roztworu wodnego acetyloazotrylu i nałóż otrzymany roztwór bezpośrednio do półpreparatywnego systemu HPLC w celu oczyszczenia pożądanego produktu.W przypadku pomiarów wydajności kwantowej, pod lampami fluorescencyjnymi pokrytymi filtrem odcinającym światło UV, rozcieńczyć roztwór podstawowy próbki w 10 mikrolitrach dimetylosulfotlenku z 10 mililitrami buforu KMOPS. Przenieść podwielokrotność roztworu do tej samej probówki, która jest używana w fotoreakcji aktynometru chemicznego. Napromieniać roztwór próbki światłem o długości 350 nanometrów przez pięć sekund, okresowo usuwając 50 mikrolitrów podwielokrotności z napromieniowanego roztworu w celu analizy za pomocą HPLC.Następnie określ czas napromieniania w sekundach, w którym 90% materiału wyjściowego zareagowało, dopasowując wykresy zależnego od czasu zaniku materiału wyjściowego. W przypadku celowania w ligand HaloTag w klikalny związek umieszczony w klatce, należy zebrać docelową populację komórek będących przedmiotem zainteresowania za pomocą odpowiedniego odczynnika do dysocjacji komórek i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 2,5 razy 10 do piątej na mililitr DMEM. Następnie wysiewaj około 10 do piątych komórek na naczynie do 35-mililitrowych naczyń ze szklanym dnem do całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Następnego ranka rozcieńczyć 14 mikrogramów DNA PC DNA z trzema halo receptora naskórkowego czynnika wzrostu w osoczu w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej zawierającej 700 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy. Następnie dodać pięć mikrolitrów odczynnika do lipofekcji w 150 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy do każdej z czterech probówek i pozostawić probówki w temperaturze otoczenia na pięć minut. Pod koniec inkubacji dodać 150 mikrolitrów rozcieńczonego DNA osocza do każdej z rozcieńczonych próbek odczynnika do lipofekcji i inkubować próbki w temperaturze otoczenia przez dodatkowe pięć minut.Pod koniec inkubacji przepłukać komórki dwoma mililitrami PBS na szalkę i dodać 1,5 mililitra zredukowanej pożywki surowicy do każdej hodowli. Dodaj 150 mikrolitrów kompleksu odczynników do lipofekcji plazmidowej do każdej naczynia i włóż komórki do inkubatora do hodowli komórkowych na 48 godzin. Pod koniec inkubacji odessać supernatanty i dodać jeden mililitr świeżo przygotowanego DMEM uzupełnionego dwoma mikromolowymi paBhc hex fitzi halo do każdej potrawy.Po 30 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza odessać pożywkę zawierającą związek w klatce i przepłukać komórki dwa razy jednym mililitrem PBS plus, aby usunąć wszelkie niezwiązane związki. Dodaj 500 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do każdej pożywki i wróć komórki do inkubatora hodowli komórkowych na kolejne 30 minut, aby usunąć związki, które dostały się do komórek. Pod koniec inkubacji przepłukać komórki dwa razy jednym mililitrem PBS plus na naczynie i dodać jeden mililitr pożywki bez czerwieni fenolowej do każdej hodowli.Następnie zapisz obrazy kwiatostanów za pomocą skaningowej laserowej konfokalnej mikroskopii kwiatowej. W celu fotomodulacji lokalizacji kinazy za pomocą klikalnego związku w klatce, wysiewa się około pięć razy 10 do piątej komórki TOC-A-one w dwóch mililitrach pożywki F12 Hama na 35 mililitrowe szklane naczynie dolne. Następnego dnia należy transfekować komórki plazmidem kodującym kinazę gamma diacyloglicerolu GFP przez 48 godzin, jak właśnie pokazano.Po zakończeniu transfekcji zastąpić supernatant transfekcji dwoma mililitrami zredukowanej pożywki surowicy. Dodaj 20 mikrolitrów 100-krotnego roztworu roboczego paBhcAA do komórek na pięć do 60 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji umieścić szalkę na stoliku obiektywowym odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w oświetlacz fluorescencyjny z podwójnym źródłem światła.Obrazuj komórki co 10 sekund przez 10 minut, jednocześnie naświetlając komórki w odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych i długościach fal zgodnie z protokołem eksperymentalnym. Korzystając z tej metody, jak pokazano, można z powodzeniem zsyntetyzować klikalne związki w klatkach niektórych biologicznie interesujących cząsteczek, w tym paklitakselu i kwasu arachidonowego. Dodatkowe właściwości, takie jak rozpuszczalność w wodzie i zdolność do celowania w komórki, można wprowadzić do makiety paklitakselu paBhc poprzez reakcję kliknięcia katalizowaną przez cyklizację miedzi.Te klikalne paklitaksele w klatkach mogą być następnie fotolizowane w celu wytworzenia swoich związków macierzystych po napromieniowaniu na głębokość 350 nanometrów. Właściwości fizyczne i fotochemiczne związków umieszczanych w klatkach podsumowano w tabeli. W eksperymentach na żywych komórkach ukierunkowanie halo paBhc hex fitzi na hodowane komórki ssaków przejściowo eksprymujące białko HaloTagged i receptor naskórkowego czynnika wzrostu indukuje zielony sygnał florescencji z ugrupowania fluoresceiny PAHBHC hex fitzi halo na błonie komórkowej.Ponadto leczenie komórek CHO-K1 przejściowo eksprymujących kinazę diacyloglicerolową gamma GFP kwasem arachidonowym powoduje modulację subkomórkowej lokalizacji kinazy diacyloglicerolowej gamma. Podobne zmiany w lokalizacji kinazy diacylo-glicerynowej gamma obserwuje się również w komórkach traktowanych paBhc-AA po ekspozycji na światło UV. Podczas wykonywania eksperymentów z sadzeniem w roztworach wodnych zwiększających pożywkę hodowlaną, należy zawsze pracować pod lampą fluorescencyjną z filtrem o krótkiej długości fali.Postępując zgodnie z tą procedurą, można badać związki w klatkach, które były obfite do stosowania w eksperymentach biologicznych ze względu na brak rozpuszczalności w wodzie, przepuszczalności błony lub zdolności celowania komórkowego.

design-synthesis-photochemical-properties-clickable-caged

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Cząsteczki adenowirusów są modyfikowane tak, aby zawierały albo nienaturalny analog aminokwasu azydohomoalaninę, albo azydocukier O-GlcNAz. Grupa azydowa każdego z nich jest chemoselektywnie łączona za pomocą reakcji chemii „click” w celu modyfikacji powierzchni wirusa.

Chemoselektywna modyfikacja powierzchni wirusów za pomocą bioortogonalnej chemii klik

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Organiczne cząsteczki barwnika i nanocząstki nanocząsteczkowe pokryte kwasem oleinowym nie są rozpuszczalne w wodzie. Protokół ten opisuje metodę "plug and play", która umożliwia przenoszenie cząsteczek barwnika organicznego i przekształcanie cząstek w górę z ich początkowego rozpuszczalnika hydrofobowego do wody.

Metoda "plug and play" do tworzenia dyspergowalnych w wodzie nanozespołów zawierających amfifilowy polimer, barwniki organiczne i nanocząstki przekształcające się w górę

Fotostabilne barwniki cyjaninowe są dołączane do oligonukleotydów w celu monitorowania hybrydyzacji poprzez transfer energii.

Synteza sond hybrydyzacyjnych DNA zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych

Ten protokół szczegółowo opisuje ważne kroki wymagane do biokoniugacji białka zawierającego cysteinę z maleimidem, w tym oczyszczanie odczynników, warunki reakcji, oczyszczanie biokoniugatu i charakterystykę biokoniugatu.

Synteza biokoniugatów białkowych za pomocą chemii cysteiny-maleimidu

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego dla danego miejsca wprowadzania sond chemicznych do fragmentu przeciwciała poprzez genetyczne włączenie aminokwasu zawierającego azydek, a następnie sprzężenie azydu z sondą chemiczną za pomocą promowanej przez szczep cykloaddycji azydkowo-alkinowej (SPAAC).

Skuteczne i specyficzne dla miejsca znakowanie przeciwciał przez cykloaddycję azydowo-alkinową promowaną przez szczep

W tym protokole, kinaza białkowa A (PKA), bioefektor transdukcji sygnału komórkowego, została unieruchomiona na powierzchni nanocząsteczki, mikrowstrzyknięta do cytozolu i aktywowana przez przekonwertowane światło UV z bliskiej podczerwieni (NIR), indukując rozpad włókien naprężeniowych w cytozolu.

Zintegrowany system do zdalnego wyzwalania wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału poprzez fotoaktywację kinazy za pośrednictwem nanocząstek w górę

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Ten protokół opisuje wywołaną światłem translokację jądrową gości w żywych komórkach za pomocą klatkowanych znaczników kleju molekularnego. Metoda ta jest obiecująca w przypadku selektywnego dostarczania leków ukierunkowanych na cele jądrowe.

Czasowo kontrolowana translokacja jądrowa gości w żywych komórkach przy użyciu klatkowanych klejów molekularnych jako fotoaktywowanych znaczników

Poznaj metodę syntezy modułowych związków w klatkach z możliwością klikowania, zachowujących fotoczułość. Technika umożliwia wprowadzenie właściwości takich jak rozpuszczalność w wodzie lub celowanie komórkowe bez utraty funkcjonalności.

Projektowanie, synteza i właściwości fotochemiczne klikalnych związków w klatkach

Przeglądaj więcej filmów