Projektowanie, synteza i właściwości fotochemiczne klikalnych związków w klatkach

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie praktycznej metody otrzymywania związków w klatkach o dodatkowych właściwościach, takich jak rozpuszczalność w wodzie lub zdolność celowania komórkowego. Wykorzystując prostą procedurę syntezy, technika ta może być wykorzystana do rozszerzenia laboratorium na związki w klatkach oraz do wytwarzania związków w klatkach o dodatkowych właściwościach bez uszczerbku dla ich wrażliwości na światło. Syntezę tę można przeprowadzić w standardowym laboratorium, ponieważ nasze klikalne związki w klatkach są odporne na promieniowanie fotoelektryczne po rozpuszczeniu w nienukleofilowych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak dichlorometan lub dimetylosulfotlenek.

Procedurę z udziałem Hirony Sasaki zademonstrują Akinobu Suzuki, doktor habilitowany, Hanami Aoki i Rei Watahiki, doktoranci z laboratorium. Zacznij od dodania 709,6 miligramów metanolu paBhc i 397,6 miligramów n-karbonylodimidazolu do 30-mililitrowej kolby okrągłodennej. Dodać do kolby suche sześć mililitrów dichlorometanu i mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez godzinę.

Pod koniec inkubacji dodać 342,8 miligramów 4-dimetyloaminopirydyny i 552 mikrolitry karbaminianu tert-butylu sześcioaminoheksylowego i mieszać roztwór w temperaturze otoczenia przez dodatkowe trzy godziny. Następnie użyj wyparki obrotowej w próżni, aby usunąć rozpuszczalnik i inne lotne substancje, a następnie użyj chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym, aby bezpośrednio oczyścić pozostałości. Aby zainstalować jednostkę funkcjonalną w klikalnym związku klatkowym, rozpuść 249 miligramów pięciowodnego siarczanu miedzi w 10 mililitrach wody jonowymiennej, aby uzyskać 0,1 molowy roztwór siarczanu miedzi.

Rozpuścić osiem miligramów dwóch głównych makiet paklitakselu paBhc, 7,5 miligrama tris(3-hydroksypropylotriolilo)aminy, 162,4 miligrama l-askorbinianu sodu i 3,1 miligrama azydeku 15-chloro-3, 6, 9-trioksypentyloadylu w zmieszanym rozpuszczalniku 2,5 mililitra 0,1 molowego buforu fosforanowego i 0,5 mililitra dimetylosulfotlenku. Następnie dodać 81,2 mikrolitra 0,1 molowego roztworu siarczanu miedzi do mieszaniny reakcyjnej i mieszać mieszaninę w temperaturze otoczenia przez 80 minut, monitorując postęp reakcji za pomocą HPLC. Pod koniec reakcji rozpuść środki strącające w 3,5 mililitra 75% roztworu wodnego acetyloazotrylu i nałóż otrzymany roztwór bezpośrednio do półpreparatywnego systemu HPLC w celu oczyszczenia pożądanego produktu.

W przypadku pomiarów wydajności kwantowej, pod lampami fluorescencyjnymi pokrytymi filtrem odcinającym światło UV, rozcieńczyć roztwór podstawowy próbki w 10 mikrolitrach dimetylosulfotlenku z 10 mililitrami buforu KMOPS. Przenieść podwielokrotność roztworu do tej samej probówki, która jest używana w fotoreakcji aktynometru chemicznego. Napromieniać roztwór próbki światłem o długości 350 nanometrów przez pięć sekund, okresowo usuwając 50 mikrolitrów podwielokrotności z napromieniowanego roztworu w celu analizy za pomocą HPLC.

Następnie określ czas napromieniania w sekundach, w którym 90% materiału wyjściowego zareagowało, dopasowując wykresy zależnego od czasu zaniku materiału wyjściowego. W przypadku celowania w ligand HaloTag w klikalny związek umieszczony w klatce, należy zebrać docelową populację komórek będących przedmiotem zainteresowania za pomocą odpowiedniego odczynnika do dysocjacji komórek i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 2,5 razy 10 do piątej na mililitr DMEM. Następnie wysiewaj około 10 do piątych komórek na naczynie do 35-mililitrowych naczyń ze szklanym dnem do całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Następnego ranka rozcieńczyć 14 mikrogramów DNA PC DNA z trzema halo receptora naskórkowego czynnika wzrostu w osoczu w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej zawierającej 700 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy. Następnie dodać pięć mikrolitrów odczynnika do lipofekcji w 150 mikrolitrach zredukowanej pożywki surowicy do każdej z czterech probówek i pozostawić probówki w temperaturze otoczenia na pięć minut. Pod koniec inkubacji dodać 150 mikrolitrów rozcieńczonego DNA osocza do każdej z rozcieńczonych próbek odczynnika do lipofekcji i inkubować próbki w temperaturze otoczenia przez dodatkowe pięć minut.

Pod koniec inkubacji przepłukać komórki dwoma mililitrami PBS na szalkę i dodać 1,5 mililitra zredukowanej pożywki surowicy do każdej hodowli. Dodaj 150 mikrolitrów kompleksu odczynników do lipofekcji plazmidowej do każdej naczynia i włóż komórki do inkubatora do hodowli komórkowych na 48 godzin. Pod koniec inkubacji odessać supernatanty i dodać jeden mililitr świeżo przygotowanego DMEM uzupełnionego dwoma mikromolowymi paBhc hex fitzi halo do każdej potrawy.

Po 30 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza odessać pożywkę zawierającą związek w klatce i przepłukać komórki dwa razy jednym mililitrem PBS plus, aby usunąć wszelkie niezwiązane związki. Dodaj 500 mikrolitrów zredukowanej pożywki surowicy do każdej pożywki i wróć komórki do inkubatora hodowli komórkowych na kolejne 30 minut, aby usunąć związki, które dostały się do komórek. Pod koniec inkubacji przepłukać komórki dwa razy jednym mililitrem PBS plus na naczynie i dodać jeden mililitr pożywki bez czerwieni fenolowej do każdej hodowli.

Następnie zapisz obrazy kwiatostanów za pomocą skaningowej laserowej konfokalnej mikroskopii kwiatowej. W celu fotomodulacji lokalizacji kinazy za pomocą klikalnego związku w klatce, wysiewa się około pięć razy 10 do piątej komórki TOC-A-one w dwóch mililitrach pożywki F12 Hama na 35 mililitrowe szklane naczynie dolne. Następnego dnia należy transfekować komórki plazmidem kodującym kinazę gamma diacyloglicerolu GFP przez 48 godzin, jak właśnie pokazano.

Po zakończeniu transfekcji zastąpić supernatant transfekcji dwoma mililitrami zredukowanej pożywki surowicy. Dodaj 20 mikrolitrów 100-krotnego roztworu roboczego paBhcAA do komórek na pięć do 60 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji umieścić szalkę na stoliku obiektywowym odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w oświetlacz fluorescencyjny z podwójnym źródłem światła.

Obrazuj komórki co 10 sekund przez 10 minut, jednocześnie naświetlając komórki w odpowiednich eksperymentalnych punktach czasowych i długościach fal zgodnie z protokołem eksperymentalnym. Korzystając z tej metody, jak pokazano, można z powodzeniem zsyntetyzować klikalne związki w klatkach niektórych biologicznie interesujących cząsteczek, w tym paklitakselu i kwasu arachidonowego. Dodatkowe właściwości, takie jak rozpuszczalność w wodzie i zdolność do celowania w komórki, można wprowadzić do makiety paklitakselu paBhc poprzez reakcję kliknięcia katalizowaną przez cyklizację miedzi.

Te klikalne paklitaksele w klatkach mogą być następnie fotolizowane w celu wytworzenia swoich związków macierzystych po napromieniowaniu na głębokość 350 nanometrów. Właściwości fizyczne i fotochemiczne związków umieszczanych w klatkach podsumowano w tabeli. W eksperymentach na żywych komórkach ukierunkowanie halo paBhc hex fitzi na hodowane komórki ssaków przejściowo eksprymujące białko HaloTagged i receptor naskórkowego czynnika wzrostu indukuje zielony sygnał florescencji z ugrupowania fluoresceiny PAHBHC hex fitzi halo na błonie komórkowej.

Ponadto leczenie komórek CHO-K1 przejściowo eksprymujących kinazę diacyloglicerolową gamma GFP kwasem arachidonowym powoduje modulację subkomórkowej lokalizacji kinazy diacyloglicerolowej gamma. Podobne zmiany w lokalizacji kinazy diacylo-glicerynowej gamma obserwuje się również w komórkach traktowanych paBhc-AA po ekspozycji na światło UV. Podczas wykonywania eksperymentów z sadzeniem w roztworach wodnych zwiększających pożywkę hodowlaną, należy zawsze pracować pod lampą fluorescencyjną z filtrem o krótkiej długości fali.

Postępując zgodnie z tą procedurą, można badać związki w klatkach, które były obfite do stosowania w eksperymentach biologicznych ze względu na brak rozpuszczalności w wodzie, przepuszczalności błony lub zdolności celowania komórkowego.