Name: Model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc przez jednostronne wkroplenie kwasu dooskrzelowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Poznaj model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc u myszy poprzez jednostronne wkroplenie kwasu dooskrzelowego. Ta metoda pozwala badać zapalenie i jego rozwiązanie w kontrolowany sposób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Josephowi Mizgerdowi za jego wkład w rozwój metody selektywnego dooskrzelowego oraz za pomocne komentarze i recenzję manuskryptu. Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health P01GM095467 (B.D.L.) i K08HL130540 (R.E.A.).

Wszystkie poniższe procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Brigham and Women's Hospital (Protokół #2016N000356).
UWAGA: Sterylna technika była stosowana we wszystkich procedurach przetrwania. Dla każdej operacji ustalano sterylne pole przy użyciu sterylnego ręcznika do układania, podczas gdy chirurdzy nosili sterylne rękawiczki chirurgiczne, czepki, maski i czyste fartuchy laboratoryjne. Wszystkie narzędzia chirurgiczne sterylizowano w autoklawie, a sterylność utrzymywano za pomocą sterylizatora perełkowego.
1. Przygotowanie 0,1 N HCl
<ol>
	<li>Dodaj 11 ml ddH2O do butelki z pomarańczowego szkła. Powoli dodawaj 1 ml 37% HCl (12 N), aby uzyskać 1 N HCl zapas roboczy. 
	ostrożność: Upewnij się, że HCl jest dodany do wody. Jest to kwestia bezpieczeństwa, ponieważ dodanie wody bezpośrednio do kwasu może spowodować wrzenie kwasu i rozpryskiwanie się z butelki. Podczas obchodzenia się ze skoncentrowanym HCl należy upewnić się, że kwas jest przechowywany w wentylowanym kapturze chemicznym i należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne.</li>
	<li>Powoli dodawać 4 ml uprzednio rozcieńczonego materiału roboczego HCl do 35 ml ddH2O w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aby utworzyć 0,1 N HCl zapas doświadczalny.</li>
	<li>Zmierzyć pH materiału doświadczalnego za pomocą elektronicznej sondy pH po dwupunktowej kalibracji przy użyciu roztworów o niskim pH. W razie potrzeby miareczkować do pH 1,1 przy użyciu roztworów podstawowych NaOH lub HCl, tak aby końcowa objętość wynosiła 40 ml. 
	nuta: Pomiar niskich wartości pH może być trudny. Aby zapewnić dokładny pomiar, upewnij się, że sonda pH jest prawidłowo skalibrowana przy użyciu niskich standardów pH, aby uniknąć nadmiernej ekstrapolacji pomiaru.</li>
	<li>Bezpośrednio przed eksperymentem przefiltruj 1–2 ml eksperymentalnego wywaru HCl przez sterylny filtr 0,22 μm do sterylnej probówki mikrowirówkowej.</li>
</ol>
2. Selektywne wkraplanie HCl do oskrzel
<ol>
	<li>Przygotowanie pola operacyjnego
	<ol>
		<li>Wywołać znieczulenie ogólne, podając mieszaninę ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Upewnij się, że mysz jest całkowicie znieczulona, delikatnie ściskając czubek ogona lub tylną łapę. Przed wykonaniem nacięcia skóry wymagany jest brak reakcji odstawienia. W razie potrzeby podaj dodatkowe bolusy znieczulające.</li>
		<li>Podać 0,1 mg/kg buprenorfiny podskórnie pod kark szyi. Przedoperacyjne leki przeciwbólowe wzmocnią działanie znieczulenia oraz złagodzą ból przed- i pooperacyjny wynikający z zabiegu.</li>
		<li>Użyj elektrycznych maszynek do strzyżenia, aby delikatnie ogolić obszar chirurgiczny na brzusznej powierzchni myszy, poniżej podbródka w odcinku szyjnym gardła, wykonując powolne ruchy w dół. Usuń luźne futro, aby całkowicie odsłonić skórę znajdującą się pod spodem.</li>
		<li>Przygotuj obszar operacyjny, pobierając wymaz z ogolonego miejsca 10% roztworem jodu powidonu. Po zastosowaniu aseptycznego roztworu oczyść miejsce za pomocą wacika nasączonego 70% alkoholem izopropylowym. Powtórz ten krok 3 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolowanie tchawicy
	<ol>
		<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na czystej desce operacyjnej i przykryj mysz sterylną zasłoną chirurgiczną, zachowując ekspozycję obszaru operacyjnego. Zabezpiecz serwetę na miejscu.</li>
		<li>Wykonaj 0,5 cm podłużne nacięcie w skórze nad tchawicą i gruczołami ślinowymi. Użyj lekko zakrzywionych ząbkowanych kleszczy, aby ostrożnie odciągnąć skórę i delikatnie oddzielić gruczoły ślinowe, aby odsłonić mięśnie tchawicy.</li>
		<li>Używając ząbkowanych kleszczy do rozwarstwienia, delikatnie rozsuń mięśnie przytchawicze i odsuń powięź otaczającą tchawicę, aż chrzęstne pierścienie tchawicy zostaną całkowicie odsłonięte.</li>
		<li>Użyj w pełni zakrzywionych ząbkowanych kleszczy, aby podnieść tchawicę i oddzielić tkankę łączną między tchawicą a powięzią wsteczną. Po odłączeniu tkanki łącznej końcówka kleszczy powinna całkowicie wsunąć się za tchawicę.</li>
		<li>Trzymaj zakrzywione kleszcze za tchawicą i chwyć końcówkami kleszczy 10–15 cm pleciony jedwabny szew 4-0. Pociągnij szew za tchawicą, aby była równa długość po obu stronach.</li>
		<li>Po założeniu szwu delikatnie pociągnij boki szwu w kierunku tylnej części myszy i przytrzymaj boki na miejscu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Selektywna kaniulacja lewego oskrzela pnia głównego i wkraplanie HCl
	<ol>
		<li>Weź angiocewnik 24 G x 3/4" i włóż igłę, skosem do góry, do przedniej części tchawicy między pierwszym a drugim pierścieniem tchawicy. Po potwierdzeniu prawidłowego wprowadzenia przez bezpośrednią wizualizację końcówki igły w świetle tchawicy, zwolnij szew i przesuwaj kaniulę przez igłę i do tchawicy, aż do osiągnięcia oporu, a następnie wyjmij igłę. Ustawić kierunek wprowadzenia w kierunku lewego głównego oskrzela trzpienia w celu selektywnego wkraplania do lewego płuca.</li>
		<li>Gdy kaniula znajdzie się na miejscu, mocno chwyć port iniekcji, aby zapobiec przesuwaniu się cewnika.</li>
		<li>Za pomocą pipety P200 i sterylnych końcówek do pipet P200 wkraplać do cewnika 2,5 ml/kg (50 μl dla myszy 20 g) sterylnego, przefiltrowanego 0,1 N HCl, a następnie identyczną objętość powietrza.</li>
		<li>Szybko wycofaj cewnik i podnieś deskę chirurgiczną pod kątem 60° na 30 sekund.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamykanie pola operacyjnego
	<ol>
		<li>Połóż deskę chirurgiczną płasko i usuń szew zza tchawicy.</li>
		<li>Użyj plecionego jedwabnego szwu 4-0 pokrytego woskiem, aby zamknąć nacięcie skóry za pomocą 2-3 szwów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Po zamknięciu nacięcia umieść mysz na lewym boku na ciepłej poduszce grzewczej, aż mysz wyzdrowieje ze znieczulenia. Rozpocznij monitorowanie myszy pod kątem bólu i poziomu aktywności przed przywróceniem jej do normalnej obudowy. 
	nuta: Buprenorfinę należy podawać w dawce 0,1 mg/kg mc. podskórnie co 6-12 godzin przez pierwsze 24 godziny. Jeśli występuje uporczywy ból przebijający, przedłuż schemat leczenia przeciwbólowego, aż ból ustąpi.</li>
</ol>
4. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe całego płuca (BAL) i immunofenotypowanie leukocytów
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji, podając 3-krotność dawki ketaminy/ksylazyny użytej w kroku 2.1.1.
	<ol>
		<li>Aby rozróżnić neutrofile śródmiąższowe i wewnątrznaczyniowe, należy wstrzyknąć dożylnie wybrane przeciwciało Ly6G znakowane fluoroforem 5 minut przed eutanazją. Etykieta ta powinna nadawać się do wykrywania za pomocą cytometrii przepływowej w celu odróżnienia neutrofili wewnątrznaczyniowych od neutrofili śródmiąższowych i pęcherzykowych płuc, które zostaną znakowane podczas przygotowywania tkanki innym fluoroforem (patrz poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mysz na desce chirurgicznej i zaczep przednie siekacze wokół pętli z plecionego jedwabnego szwu 2-0.</li>
	<li>Wykonaj kroki 2.2.2–2.2.6., aby przygotować tchawicę do kaniulacji. 
	nuta: Upewnij się, że membrana nie jest przebita, aby zmaksymalizować ciśnienie napompowania pęcherzyków płucnych podczas płukania płuc; Podatność lewego płuca zmniejsza się po urazie, co może wymagać wyższego ciśnienia przezpęcherzykowego w przypadku płukania płuc.</li>
	<li>Wprowadzić kanulację tchawicy zgodnie z krokiem 2.3.1, ale nie przesuwać cewnika poniżej cariny; wprowadzić cewnik równolegle do tchawicy.</li>
	<li>Po wprowadzeniu cewnika zawiąż szew wokół tchawicy, aby utrzymać cewnik na miejscu.</li>
	<li>Wkroplić i pobrać dwie kolejne porcje po 1 ml lodowatego PBS -/- (bez magnezu i wapnia) z 0,6 mM EDTA za pomocą strzykawki o pojemności 1 cm3. W celu immunofenotypowania metodą cytometrii przepływowej należy usunąć każdą podwielokrotność i umieścić ją z powrotem w probówce FACS o pojemności 5 ml z polistyrenu na lodzie.</li>
	<li>Aby zapewnić eutanazję, należy wykonać torakotomię za pomocą nożyczek chirurgicznych, a następnie nakłucie serca. Płuca mogą być pobierane w celu dalszego przetwarzania.</li>
	<li>Odwirować BAL przez 10 minut w temperaturze 800 g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.</li>
	<li>Zdekantować supernatant do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml i podwielokrotność do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszej analizy.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w PBS -/- z 2% FBS w celu analizy różnicowej leukocytów za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Aby rozróżnić neutrofile śródmiąższowe i wewnątrznaczyniowe, należy oddzielnie usunąć lewe i prawe płuco i przetworzyć płuca do cytometrii przepływowej, jak w Abdulnour i wsp. 20146.</li>
	<li>Wybarwić otrzymaną zawiesinę komórkową za pomocą wybranych przeciwciał FACS, upewniając się, że barwisz Ly6G, który jest sprzężony z innym fluoroforem niż przeciwciało Ly6G z kroku 4.1.1.</li>
</ol>
5. Ocena przepuszczalności bariery pęcherzykowej przy użyciu niebieskiego barwnika Evana (EBD)
<ol>
	<li>Wstrzyknąć dożylnie Evan's Blue Dye (40 mg/kg) 30 minut przed eutanazją.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji za pomocą przedawkowania ketaminy/ksylazyny (krok 4.1).</li>
	<li>Aby zmierzyć integralność bariery pęcherzykowej, wykonaj kroki 4.2–4.9 dla zbierania BAL.</li>
	<li>Przenieś 100 μl BALF na przezroczystą 96-dołkową mikropłytkę z przezroczystym dnem wraz ze 100 μl zduplikowanych wzorców EBD. Użyj PBS -/- jako wartości pustej.</li>
	<li>Za pomocą czytnika mikropłytek zmierz absorbancję BALF przy 620 nm i 740 nm. Użyj absorbancji przy 740 nm, aby skorygować zanieczyszczenie hemem w próbkach7.</li>
	<li>Aby zmierzyć integralność bariery naczyniowej, należy wykonać perfuzję płuc, powoli wstrzykując 5 ml lodowatego PBS -/- przez prawą komorę serca. Usuń lewe płuco.</li>
	<li>Suszyć lewe płuco przez 72 godziny w temperaturze 58 °C, aby usunąć nadmiar wody.</li>
	<li>Przetwarzaj wysuszoną tkankę płucną jak w Radu i Chernoff 20138 i zmierz absorbancję przy 620 nm i 740 nm.</li>
</ol>
6. Histologia płuc
<ol>
	<li>Wprowadź kanulokację tchawicy, wykonując kroki 4.1–4.5.</li>
	<li>Aby unieruchomić płuca pod ciśnieniem 20 cm H2O, użyj stojaka pierścieniowego i zacisku, aby podnieść strzykawkę o pojemności 60 ml wyposażoną w rurkę sterowaną zaworem i wypełnioną wybranym roztworem utrwalającym (np. utrwalaczem cynkowym) tak, aby menisk roztworu utrwalającego znajdował się 20 cm powyżej płuc.</li>
	<li>Przymocuj rurkę do cewnika i otwórz wartość. Powoli napełniaj płuca utrwalaczem, aż przestaną się napełniać.</li>
	<li>Usuń cewnik w 3/4 drogi wyjścia z tchawicy. Zwiąż tchawicę szwem przed całkowitym usunięciem cewnika, aby zminimalizować utratę utrwalacza.</li>
	<li>Usunąć płuca i serce en bloc. 
	nuta: Upewnij się, że płuca nie są nakłute podczas usuwania, aby utrzymać utrwalacz podawany pod ciśnieniem.</li>
	<li>Utrwalić płuca na 24 godziny w 25 ml utrwalacza w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj nieruchome płuca w sekwencyjnych 20-minutowych odstępach w PBS -/-, 30% etanolu i 50% etanolu.</li>
	<li>Po ostatnim praniu przechowuj płuca w 70% etanolu do przetwarzania histologicznego, jak w Eickmeier et al. 20139.</li>
</ol>

<ol><li>Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaron%2C+RM+%22Harrison%27s+Principles+of+Internal+Medicine%2C+20e%22">Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e</a>. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).</li>
<li>Bellani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+Patterns+of+Care%2C+and+Mortality+for+Patients+With+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome+in+Intensive+Care+Units+in+50+Countries%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries.</a> The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).</li>
<li>The ARDS Definition Task. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%3A+The+Berlin+DefinitionThe+Berlin+Definition+of+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS.</a> The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).</li>
<li>Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).</li>
<li>Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -E. E., Engstrom, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+Proresolving+Mediators+in+Innate+and+Adaptive+Immune+Responses+in+Airway+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases.</a> Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maresin+1+biosynthesis+during+platelet-neutrophil+interactions+is+organ-protective%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526(2014).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+permeability+assessed+by+fluorescent-labeled+dextran+instilled+intranasally+into+mice+with+LPS-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li>
<li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+assay+to+test+blood+vessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An in vivo assay to test blood vessel permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. 73 (73), e50062(2013).</li>
<li>Eickmeier, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspirin-triggered+resolvin+D1+reduces+mucosal+inflammation+and+promotes+resolution+in+a+murine+model+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury.</a> Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+isoforms+differentially+regulate+leukocyte+responses+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).</li>
<li>Fukunaga, K., Kohli, P., Bonnans, C., Fredenburgh, L. E., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclooxygenase+2+Plays+a+Pivotal+Role+in+the+Resolution+of+Acute+Lung+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury.</a> Journal of Immunology. 174 (8), 5033(2005).</li>
<li>Colby, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D3+and+Aspirin-Triggered+Resolvin+D3+Are+Protective+for+Injured+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia.</a> American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).</li>
<li>Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phosphatidylinositol+3-kinase+by+polyisoprenyl+phosphates+in+neutrophil-mediated+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).</li>
<li>Mandell, L. A., Niederman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Aspiration Pneumonia.</a> New England Journal of Medicine. 380 (7), 651-663 (2019).</li>
<li>Seki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-inflammatory+and+proresolving+mediator+resolvin+E1+protects+mice+from+bacterial+pneumonia+and+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).</li>
<li>Abdulnour, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspirin-triggered+resolvin+D1+is+produced+during+self-resolving+gram-negative+bacterial+pneumonia+and+regulates+host+immune+responses+for+the+resolution+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation.</a> Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).</li>
<li>Traber, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-epithelial+cross+talk+coordinates+synthesis+of+the+tissue-protective+cytokine+leukemia+inhibitory+factor+during+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia.</a> American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).</li>
<li>Yamamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+lung+epithelium+in+neutrophil+recruitment+during+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).</li>
<li>Acute Respiratory Distress Syndrome Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilation+with+Lower+Tidal+Volumes+as+Compared+with+Traditional+Tidal+Volumes+for+Acute+Lung+Injury+and+the+Acute+Respiratory+Distress+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).</li>
<li>Peng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+contributes+to+ventilator-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).</li>
<li>Abdulnour, R. -E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+activates+xanthine+oxidoreductase+through+MAP+kinase-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).</li>
<li>Serhan, C. N., Levy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvins+in+inflammation%3A+emergence+of+the+pro-resolving+superfamily+of+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda wkraplania dooskrzelowego wykorzystuje selektywną kaniulację lewego oskrzela głównego w celu wkroplenia HCl do lewego płuca, co powoduje jednostronne i samoograniczające się ostre uszkodzenie płuc u myszy. Ten model uszkodzenia płuc spowodowany kwasem mysim ściśle odzwierciedla reakcję zapalną, histopatologię i dysfunkcję fizjologiczną obserwowaną w ludzkim ARDS, gdzie aspiracja kwasu żołądkowego jest częstym czynnikiem strącającym lub przyczyniającym siędo wzrostu 4. Narażenie mysich dróg oddechowych na HCl o niskim pH powoduje zwiększoną przepuszczalność bariery pęcherzykowo-kapilarnej, obrzęk pęcherzyków płucnych i głęboki naciek neutrofili w miejscu urazu. Zdarzeń tych nie obserwuje się w nieuszkodzonym prawym płucu. Ponadto model ten wytwarza szybkie reakcje zapalne, które osiągają szczyt w ciągu 24 godzin po wkropleniu kwasu i dzieli zmiany w ekspresji genów z ludzkimi ARDS, takie jak różnicowa ekspresja izoform fosfolipazy D10.
Chociaż ten mysi model przedkliniczny odtwarza wiele cech ARDS na poziomie molekularnym, komórkowym i tkankowym, nie podsumowuje w pełni ludzkiego ARDS. Definicja ARDS obejmuje obustronne zajęcie płuc3, podczas gdy opisana tutaj metoda wkraplania z założenia prowadzi do jednostronnej choroby płuc. Ponadto zwierzęta nie wymagają ciągłej wentylacji mechanicznej, unieruchomienia ani sedacji pozajelitowej. Wyniki przedstawione tutaj (vide supra) i gdzie indziej 6,9,11,12,13 pokazują, że jednostronne uszkodzenie płuc wywołane kwasem odtwarza większość patologicznych cech ARDS, zapewniając jednocześnie wyjątkową okazję do wykorzystania prawego płuca jako kontroli wewnętrznej i zbadania fazy ustąpienia tej choroby. W związku z tym omawiany tutaj model modeluje patobiologię ARDS, ale umożliwia również mechanistyczne badanie podstawowych reakcji tkanki płucnej na uraz i mechanizmów rozwiązania, które mogą być istotne w leczeniu tej ważnej choroby.
Wkroplenie HCl stanowi bezpośrednie ostre uszkodzenie płuc, a więc modeluje aspekty patofizjologii związane z zachłystowym zapaleniem płuc. Ponadto początkowe uszkodzenie lewego płuca w tym modelu jest generowane przy użyciu sterylnego HCl, a nie zawartości żołądkowej obciążonej bakteriami, obserwowanej w niektórych zdarzeniach zachłyśnięcia u ludzi, które mogą również prowadzić do zapalenia płuc14. U ludzi aspiracja bakterii chorobotwórczych może prowadzić do wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc, które zaostrza ostrą reakcję zapalną, przedłużając początkowe uszkodzenie płuc i zwiększając podatność pacjenta na rozwój ARDS14. To potencjalne ograniczenie zostało rozwiązane przez badaczy, którzy celowo wszczepili bakterie chorobotwórcze Escherichia coli (E. coli)15 po sterylnym HCl. Dodatkowo metoda ta została wykorzystana do zbadania stanu zapalnego, w którym pośredniczy patogen; Jednostronne bakteryjne zapalenie płuc może być wywołane przez selektywne wkraplanie do lewego płuca bakterii, takich jak E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16 i Streptococcus pneumoniae18. Opisany tutaj model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc może być również wykorzystany do badania uszkodzenia płuc wywołanego respiratorem (VILI), ważnej przyczyny zwiększonej śmiertelności w ludzkim ARDS19. Eksperymentalne modele zwierzęce VILI zwykle obejmują wentylację mechaniczną u nieleczonych myszy z objętościami oddechowymi, które są znacznie wyższe niż te, które są klinicznie stosowane do powodowania uszkodzenia płuc (>15 ml / kg; patrz poprzednia praca20,21). W kierunku bardziej istotnego klinicznie modelu VILI, w pierwszej kolejności można zastosować wkraplanie kwasu do oskrzeli, jak opisano tutaj, w celu wywołania nieśmiertelnego uszkodzenia płuc, a następnie wentylacji mechanicznej przy objętościach oddechowych w zakresie klinicznym (6-12 ml / kg). Ten hipotetyczny model zwierzęcy może pozwolić badaczom na badanie VILI w klinicznie istotny sposób po opracowaniu i walidacji. Razem te mysie modele podkreślają wszechstronność metody selektywnego wkraplania dooskrzelowego w celu generowania jednostronnych uszkodzeń płuc, które bardzo przypominają patologie związane z chorobami płuc u ludzi.
Oprócz umożliwienia selektywnego wkraplania różnych szkodliwych czynników do lewego płuca, technika wkraplania dooskrzelowego po tracheostomii nie wymaga długiego szkolenia, długiego czasu zabiegu ani skomplikowanego sprzętu, a w doświadczonych rękach powoduje minimalny stres u zwierząt. Mimo to podczas procedury selektywnego wkraplania HCl może wystąpić kilka problemów, które mogą mieć wpływ na wyniki eksperymentalne. Niewłaściwa kaniulacja lewego głównego oskrzela pnia może spowodować obustronne uszkodzenie płuc, które zmniejsza przeżywalność myszy eksperymentalnych i zakłóca użycie prawego płuca jako nieuszkodzonej kontroli wewnętrznej. Można tego uniknąć, ustawiając cewnik wystarczająco pod kątem w kierunku lewego płuca podczas kaniulacji, aż do osiągnięcia oporu. Po wstrzyknięciu HCl należy wstrzyknąć bolus powietrzny, szybko usunąć cewnik i ustawić deskę chirurgiczną w pozycji pionowej pod kątem 60°. Kroki te mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że kwas dotrze do dystalnych dróg oddechowych lewego płuca i zapobiegnie refluksowi kwasu do prawego płuca i tchawicy, co może spowodować uszkodzenie proksymalne. W ciągu 24 godzin po wkropleniu uraz w lewym płucu ulega rozlaniu z rozległym obrzękiem płuc, obejmującym zarówno dystalne, jak i proksymalne lewe płuco.
Podczas opracowywania metody u dorosłych myszy w wieku 8-12 tygodni 2,5 ml / kg HCl dooskrzelowego spowodowało znaczne, ale subletalne ostre uszkodzenie płuc; mniejsze dawki HCl nie powodowały powtarzalnego i jednorodnego uszkodzenia płuc. Chociaż nie przeprowadziliśmy tego modelu u młodszych (np. 3-6 tygodni) lub starszych myszy (np. 10-14 miesięcy), przewidujemy, że dawkowanie HCl w zależności od masy ciała spowoduje fenotyp uszkodzenia płuc podobny do tego, który obserwuje się u myszy w wieku 8-12 tygodni. Zalecamy, aby badacze dostosowali dawki HCl w celu osiągnięcia pożądanego stopnia uszkodzenia płuc przed przeprowadzeniem eksperymentów na myszach o skrajnej wadze.
Ta selektywna procedura wkraplania kwasem oferuje nieśmiertelny mysi model zapalenia sterylnych tkanek, który zmniejsza potrzebę opieki wspomagającej, takiej jak wentylacja mechaniczna. Dzięki wydłużonemu przeżyciu rannych myszy, stan zapalny wywołany kwasem ma wystarczająco dużo czasu, aby się rozwiązać. Faza rozdzielczości tego modelu została wykorzystana do identyfikacji czasowo regulowanych endogennych bioaktywnych mediatorów lipidowych, określanych jako wyspecjalizowane mediatory prorozdzielcze (SPM), takie jak lipoksyna A4 (LXA4), maresyna 1 (MaR1) i resolwinyny 6,11,12,16. Podawanie egzogennych SPM rannym myszom przyspiesza ustąpienie uszkodzenia płuc wywołanego kwasem poprzez tłumienie mechanizmów zapalnych i promowanie katapodstawy uszkodzonej tkanki płucnej. Te SPM promują usuwanie obrzęku pęcherzyków płucnych12, zwiększają efferocytozę apoptotycznych neutrofili przez rekrutowane makrofagi16 i przyspieszają reepitelializację dróg oddechowych i pęcherzyków płucnych12 w celu zmniejszenia przecieku naczyniowego i niedotlenienia tkanek. W modelu uszkodzenia płuc wywołanego przez patogen, 15-epi-resolwin D1 wykazywał również działanie przeciwdrobnoustrojowe poprzez zwiększoną fagocytozę bakteryjną przez makrofagi i zwiększony klirens bakteryjny z zakażonego płuca16. Badanie tych endogennych mechanizmów ustępowania dostarcza informacji na temat potencjalnych nowych strategii terapeutycznych dla pacjentów z ARDS5.
Aby jak najlepiej zbadać czasoprzestrzenną regulację mechanizmów rozwiązywania problemów, potrzebne są modele eksperymentalne in vivo. Modele ostrego uszkodzenia płuc muszą obejmować odpowiednie ostre reakcje zapalne i dysfunkcję narządów z zaangażowaniem rozdzielczości gospodarza, promując procesy molekularne i komórkowe. Mechanizmy te można określić ilościowo za pomocą ustalonych wskaźników rozdzielczości22. Metoda selektywnego wkraplania dooskrzelowego w celu wywołania jednostronnego ostrego uszkodzenia płuc okazała się przydatna w tym zakresie do badania endogennych mediatorów i szlaków rozdzielczości. Przyszłe badania, które pogłębią naszą wiedzę na temat tych aktywnych procesów ustępowania, mogą doprowadzić do powstania terapeutycznych agonistów, którzy naśladują biodziałania endogennych mediatorów lipidowych w celu zwiększenia ustąpienia stanu zapalnego i złagodzenia zachorowalności i śmiertelności ARDS i innych ważnych chorób płuc.

Zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) jest ważną przyczyną ostrej niewydolności oddechowej1. Jest to powszechna i śmiertelna lub powodująca niepełnosprawność choroba, która występuje u 10% wszystkich pacjentów przyjmowanych na oddziały intensywnej terapii na całym świecie2. Zgodnie z berlińską definicją3, ARDS definiuje się na podstawie ostrego początku hipoksemicznej niewydolności oddechowej (<1 tydzień) i obustronnych nacieków płucnych na radiogramach klatki piersiowej, które nie są wyjaśnione niewydolnością serca4. Podstawowa patobiologia charakteryzuje się nadmierną reakcją zapalną. Płuco może zostać uszkodzone bezpośrednio, np. w zapaleniu płuc lub przy aspiracji kwasu żołądkowego, lub pośrednio, np. w sepsie lub po wielokrotnych transfuzjach krwi4. Po początkowej zniewadze, patogeneza ARDS postępuje w trzech fazach: fazy wysiękowej, proliferacyjnej i zwłóknieniowej1. Fazy te charakteryzują się odrębnymi molekularnymi i komórkowymi mechanizmami immunologicznymi i naprawczymi, które determinują rokowanie dla pacjentów z ARDS. Opieka wspomagająca pozostaje podstawą dla pacjentów z ARDS; Obecnie nie ma skutecznych metod leczenia farmakologicznego ARDS, dlatego istnieje pilna potrzeba nowych badań nad tym wyniszczającym schorzeniem4.
Dysregulacja wrodzonej odpowiedzi immunologicznej podczas fazy wysiękowej przyczynia się do ostrego wystąpienia ARDS i związanej z nim niewydolności oddechowej1. Silna sygnalizacja mediatora prozapalnego koordynuje początkowe odpowiedzi immunologiczne, prowadząc do przerwania bariery pęcherzykowo-kapilarnej, rozlanego obrzęku pęcherzyków płucnych i infiltracji neutrofili w miejscu uszkodzenia tkanki płucnej<klasa sup="xref">4. W ARDS nieskuteczne sygnały hamowania dla ostrego stanu zapalnego predysponują do niewydolności płuc i mogą opóźnić w odpowiednim czasie katabasis uszkodzonej tkanki płucnej5. W tym celu badania przedkliniczne nad endogennymi mechanizmami inicjowania i pro-rozwiązywania ARDS mogą doprowadzić do odkrycia nowych strategii terapeutycznych. Takie badania wymagają samoograniczających się eksperymentalnych modeli in vivo ostrego uszkodzenia płuc, które bardzo przypominają cechy ludzkiego ARDS, umożliwiając zbadanie mechanizmów leżących u podstaw faz inicjacji i ustąpienia uszkodzenia tkanki.
Prezentowany tutaj model mysi powoduje bezpośrednie ostre uszkodzenie płuc, które pokazuje główne procesy patobiologiczne wysiękowych ARDS, a mianowicie przerwanie bariery pęcherzykowo-kapilarnej i infiltrację neutrofili. Metoda polega na selektywnym wkraplaniu HCl do oskrzeli poprzez kaniulację lewego oskrzela głównego pnia, lokalizację urazu i reakcję zapalną do lewego płuca; Nieuszkodzone prawe płuco może być używane jako kontrola wewnętrzna do wybranych oznaczeń uszkodzeń tkanek i stanu zapalnego. Ponadto jednostronne uszkodzenie płuc nie jest śmiertelne i ujawnia program rozwiązywania problemów. Daje to wyraźne okno na rozwiązanie zapalenia płuc, które można wykorzystać do identyfikacji endogennych mediatorów prorozdzielczych i mechanizmów komórkowych oraz do otwarcia nowych dróg terapeutycznych dla ARDS, które kładą nacisk na fizjologię rozdzielczości i farmakologię.

<table><tbody><tr><td>10x Utrwalacz</td><td>BD Biosciences</td><td>552658</td><td></td></tr><tr><td>2-0 Pleciony jedwabny szew</td><td>Specjalizacje chirurgiczne</td><td>SP118</td><td></td></tr><tr><td>24 G x 3/4 "Jednorazowy cewnik dożylny Safelet</td><td>Excel</td><td>26751</td><td></td></tr><tr><td>33 mm, 0,22 i mikro; M Filtr strzykawkowy</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>4-calowe długie ząbkowane kleszcze Graefe z lekką krzywizną</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>4-calowe ząbkowane szczypce Graefe z długą końcówką o pełnej krzywiźnie</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>4,5-calowe mikronożyczki preparacyjne</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td></td></tr><tr><td>6-calowy uchwyt na igły z drewna Crile</td><td>Roboz</td><td>RS-7860</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 60 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom FITC-Ly6G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-9668-82</td><td>Można użyć preferowanego fluoroforu</td></tr><tr>Przeciwciało<td>przeciw myszom PE-Ly6G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-9668-82</td><td>Można użyć preferowanego fluoroforu</td></tr><tr><td>Sterylizator koralików</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Betadine Wacik</td><td>Betadine</td><td>67618-153-01</td><td></td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td>NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5</td></tr><tr><td>Przezroczysta, płaskodenna, 96-dołkowa mikropłytka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) bez Ca2+ lub Mg+</td><td>life</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr>Maszynki <td></td><td></td><td></td><td>do strzyżenia elektrycznego</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue Dye</td><td>Millipore-Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka</td><td></td><td></td><td></td>grzewcza</tr><tr><td>Kwas solny, 37%</td><td>Milipore-Sigma</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Henry-Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek (640, 720 nm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 Końcówki do pipet Sonda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>pH</tr><tr><td>Stojak pierścieniowy z zaciskiem</td><td></td><td></td><td></td>przedłużającym</tr><tr><td>Sterylne podkładki nasączone alkoholem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna serweta na mysz 8 "x 8" z owalną folią samoprzylepną</td><td>Steris</td><td>88VCSTF</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne rękawice nitrylowe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>56890</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna zasłona na ręczniki</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>Powlekany woskiem 4-0 Pleciony jedwabny szew</td><td>Covidien</td><td>SS733</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>AKORN</td><td></td><<td>strong>NDC: 59399-111-50</td></tr></tbody></table>

model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc przez jednostronne wkroplenie kwasu dooskrzelowego

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

Selektywne dooskrzelowe wkraplanie kwasu solnego (HCl) do mysiego lewego oskrzela głównego powoduje ostre uszkodzenie tkanek z objawami histopatologicznymi podobnymi do zespołu ostrej niewydolności oddechowej u ludzi (ARDS). Wynikający z tego obrzęk pęcherzyków płucnych, uszkodzenie bariery pęcherzykowo-kapilarnej i naciek leukocytów wpływają głównie na lewe płuco, zachowując prawe płuco jako nieuszkodzoną kontrolę i umożliwiając zwierzętom przeżycie. Ten model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc umożliwia badanie mechanizmów rozwiązywania się tkanek, takich jak makrofagowa, efferocytoza apoptotycznych neutrofili i restytucja integralności bariery pęcherzykowo-kapilarnej. Model ten pomógł zidentyfikować ważne role agonistów zajmujących się rozwiązywaniem, w tym wyspecjalizowanych mediatorów pro-resolving (SPM), stanowiąc podstawę do opracowania nowych podejść terapeutycznych dla pacjentów z ARDS.

Selektywne wlewanie HCl do oskrzeli skutkuje jednostronnym ostrym uszkodzeniem płuc
Metoda selektywnej instylacji HCl do lewego oskrzela głównego została przedstawiona na Rysunku 1A. W wyniku powstałe ostre uszkodzenie płuc obejmuje całe lewe płuco, a po dożylnym podaniu EBD i perfuzji płuc, EBD pozostało jedynie w lewym płucu (Rysunek 1B). Ilość wysięku EBD do lewego płuca została określona ilościowo i stwierdzono, że jest ona znacznie zwiększona w porównaniu z grupą kontrolną po pozornej selektywnej instylacji (Rysunek 1C; zaadaptowano z Abdulnour et al. 20146). W odpowiedzi na uszkodzenie płuc krążące leukocyty przenikają przez ścianę naczyń do zapalonej tkanki. W tym modelu neutrofile naczyniowe migrują przez śródbłonek do śródmiąższu uszkodzonego płuca. Neutrofile śródmiąższowe nagromadziły się w lewym płucu 24 h po instylacji HCl, w przeciwieństwie do prawego płuca, w którym zaobserwowano niewiele neutrofili śródmiąższowych (Rysunek 1D). Wyniki te wskazują, że metoda selektywnej wewnątrzoskrzelowej instylacji do lewego oskrzela głównego doprowadziła u myszy do ostrego uszkodzenia płuc, które było w dużej mierze zlokalizowane w lewym płucu i wywołało zmiany patologiczne obserwowane również w przypadku ludzkiego ARDS, w tym zwiększone przerwanie bariery pęcherzykowo-kapilarnej oraz naciek neutrofili.
Jednostronne ostre uszkodzenie płuc umożliwia badanie mechanizmów wygaszania stanu zapalnego
Aby zbadać fazę rozdzielczą ostrego uszkodzenia płuc indukowanego kwasem, myszy muszą przetrwać początkowy uraz. W przeciwieństwie do podania HCl do tchawicy, instylacja wyłącznie do lewego oskrzela głównego prowadzi do samoograniczającego się uszkodzenia z jednolitym przeżyciem u w pozostałych aspektach zdrowych myszy. Płuca można pobrać od myszy we wczesnych lub późniejszych punktach czasowych, jak pokazano na Ryc. 2A. Histologia płuc wykazuje uszkodzenie tkanki i stan zapalny na poziomie narządowym i komórkowym, z zapaleniem wysiękowym 24 h po urazie, charakteryzującym się wyraźnym obrzękiem pęcherzyków płucnych i infiltracją neutrofili w lewym płucu. Należy zauważyć, że w nieuszkodzonym prawym płucu kontrolnym nie występuje istotne uszkodzenie ani napływ leukocytów (Ryc. 2A). 72 h po urazie obrzęk i nacieki komórkowe są znacznie zmniejszone, co reprezentuje ustępującą fazę wysiękową. Neutrofile pęcherzykowe można monitorować za pomocą cytometrii przepływowej (CD45+/CD68-/F4/80-/Ly6G+/CD11b+) z materiału uzyskanego poprzez całkowite płukanie płuc. Liczba neutrofili w lewym płucu wzrasta 24 h po początkowym urazie i ulega znacznemu zmniejszeniu po 48 i 72 h (Ryc. 2B). W przypadku badania późniejszych punktów czasowych liczba neutrofili powróci do poziomu bazowego, co umożliwi badanie mechanizmów w późniejszych fazach katabazy, takich jak odpowiedzi włóknisto-proliferacyjne.
<img alt="Eksperyment dotyczący uszkodzenia płuc: schemat, obraz tkanki, wykres słupkowy i cytometria przepływowa w analizie stanu zapalnego płuc." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60024/60024fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Selektywna instylacja HCl do oskrzeli powoduje jednostronne uszkodzenie płuc charakteryzujące się przerwaniem bariery pęcherzykowej i infiltracją neutrofili. (A) Przedstawienie kaniulacji lewego oskrzela głównego myszy w celu selektywnej instylacji HCl do lewego płuca. (B) Wycięte prawe (RL) i lewe (LL) płuca poddane selektywnej instylacji kwasu i perfuzji po dożylnym podaniu barwnika Evan's blue. (C) Ilościowe oznaczenie śródmiąższowego barwnika Evan's blue z homogenizatów perfundowanych płuc 24 h po uszkodzeniu kwasem lub w grupie kontrolnej (sham); rysunek dostosowany z Abdulnour et al. 20146. Wartości reprezentują średnią ± SEM, gdzie n ≥ 5. *p &lt; 0.05, test U Manna-Whitneya. (D) Reprezentatywna cytometria przepływowa neutrofili wewnątrz naczyniowych (I.V.; fluorofor 1) i śródmiąższowych (I.S.; fluorofor 2) jako procent wszystkich komórek CD45+ w przetworzonym płucu 24 h po uszkodzeniu kwasem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60024/60024fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Histologia tkanki płucnej i analiza cytometrią przepływową; ocena stanu zapalnego w ciągu 72 godzin." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60024/60024fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Jednostronne ostre uszkodzenie płuc jest samoistnie cofające się. (A) Reprezentatywne obrazy histologiczne H&amp;E (10x) lewych płuc pobranych od myszy naiwnych (0 h) lub myszy 24, 48, 72 h po uszkodzeniu, wraz z odpowiadającym im prawym płucem od tej samej myszy (Pasek skali = 250 µm). (B) Reprezentatywna cytometria przepływowa neutrofili pęcherzykowych (Ly6G+ CD11b+) uzyskanych z płukania całych płuc jako procent całkowitej liczby komórek CD45+ u myszy naiwnych (0 h) lub myszy 24, 48 i 72 h po uszkodzeniu kwasem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60024/60024fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Selektywne wkraplanie kwasu dooskrzelowego do lewego płuca u myszy powoduje jednostronne i samoograniczające się ostre uszkodzenie płuc, które modeluje ludzki zespół ostrej niewydolności oddechowej (ARDS) wywołany aspiracją kwasu żołądkowego.

Model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc przez jednostronne wkroplenie kwasu dooskrzelowego

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...

Selektywna metoda dooskrzelowa jest istotna, ponieważ oferuje badaczom powtarzalny i nieśmiertelny model do badania ostrego uszkodzenia płuc, głównej przyczyny zespołu ostrej niewydolności oddechowej u ludzi. Zaletą selektywnej techniki dooskrzelowej jest lokalizacja odpowiedzi zapalnej w lewym płucu, oferując prawe płuco jako nieuszkodzoną kontrolę i minimalizując stres zwierząt. Tę procedurę zademonstruje Alexander Tavares, technik i student studiów przedmagisterskich w naszym laboratorium.Aby przygotować 0,1 normalnego kwasu solnego, dodaj 11 mililitrów podwójnie destylowanej wody do butelki z bursztynowego szkła, a następnie powoli dodaj jeden mililitr 37%12 normalnego kwasu. Następnie powoli dodaj cztery mililitry jednego normalnego kwaśnego bulionu roboczego do 35 mililitrów podwójnie destylowanej wody w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Następnie użyj elektronicznej sondy pH, aby zmierzyć pH 0,1 normalnego roztworu podstawowego, miareczkując do pH 1,1 przy użyciu wodorotlenku sodu lub kwaśnego roztworu podstawowego, w razie potrzeby, do końcowej objętości 40 mililitrów.Przed rozpoczęciem zabiegu przefiltruj od jednego do dwóch mililitrów roztworu kwasu przez sterylny filtr o pojemności 0,22 mikrolitra do sterylnej probówki mikrowirówki i potwierdź brak reakcji na odruch bólowy u znieczulonej myszy. Używając elektrycznych maszynek do strzyżenia powolnymi ruchami w dół, delikatnie ogol obszar operacyjny na brzusznej powierzchni myszy poniżej podbródka w odcinku szyjnym gardła. Usuń luźne włosy i przetrzyj odsłoniętą skórę trzema kolejnymi 10% roztworem jodu powidonu i 70% wacikami nasączonymi alkoholem izopropylowym.Po przygotowaniu skóry ułóż mysz w pozycji leżącej na czystej desce chirurgicznej i przykryj zwierzę sterylnym serwetem chirurgicznym. Wykonaj podłużny otwór o długości 0,5 centymetra w skórze nad tchawicą i gruczołami ślinowymi i użyj lekko zakrzywionych ząbkowanych kleszczy, aby ostrożnie cofnąć skórę. Delikatnie oddziel gruczoły ślinowe, aby odsłonić mięśnie tchawicy i użyj lekko zakrzywionych ząbkowanych kleszczy, aby delikatnie rozsunąć mięśnie przytchawicze.Oderwij powięź otaczającą tchawicę, aż chrzęstne pierścienie tchawicy zostaną całkowicie odsłonięte, i użyj w pełni zakrzywionych ząbkowanych kleszczy, aby usunąć tkankę łączną między tchawicą a zatchawicą. Wsuń w pełni zakrzywione ząbkowane kleszcze za tchawicę i podnieś tchawicę. Gdy końcówka kleszczy znajdzie się za tchawicą, chwyć końcówkami kleszczy 10 do 15 centymetrowy kawałek jedwabnego szwu plecionego 4-0 i pociągnij szew za tchawicą, tak aby była równa długość po obu stronach.Deskę chirurgiczną można obrócić, aby zbliżyć obszar operacyjny do ręki dominującej w celu wykonania kolejnych kroków. Następnie delikatnie pociągnij końce szwu w kierunku przedniej części myszy i przytrzymaj końce na miejscu. W celu kaniulacji lewego oskrzela głównego pnia należy odsłonić igłę angiocewnika o rozmiarze 24 x 3/4 cala i wprowadzić igłę skośną stroną do góry do wewnętrznego obszaru tchawicy między pierwszym a drugim pierścieniem tchawicy.Gdy końcówkę igły można uwidocznić w świetle tchawicy, zwolnij szew i wsuń kaniulę nad igłą do tchawicy pod kątem w kierunku lewej tylnej strony myszy. W przypadku napotkania oporu należy wycofać igłę. Po umieszczeniu kaniuli na miejscu mocno chwyć port iniekcji, aby zapobiec przesuwaniu się cewnika i zamocuj końcówkę mikropipety P-200 w porcie.Następnie wkroplić 50 mikrolitrów przefiltrowanego 0,1 normalnego roztworu kwasu do cewnika, a następnie równą objętość powietrza. Ten etap wymaga precyzyjnej manipulacji kaniulą, gdy drogi oddechowe są zatkane, i powinien być zakończony szybko i płynnie, aby przywrócić prawidłowy przepływ powietrza i zminimalizować uszkodzenie dróg oddechowych. Szybko wycofaj cewnik i przechyl deskę chirurgiczną pod kątem 60 stopni.Po 30 sekundach połóż deskę chirurgiczną płasko i usuń szew zza tchawicy. Następnie użyj jedwabnego szwu plecionego 4-0 pokrytego woskiem, aby zamknąć nacięcie skóry za pomocą dwóch do trzech szwów. Ostre uszkodzenie płuc wynikające z wkroplenia kwasu dooskrzelowego obejmuje całe lewe płuco.Rzeczywiście, po dożylnym podaniu niebieskiego barwnika Evansa i perfuzji płuc, barwnik jest wykrywany tylko w lewym płucu. Kwantyfikacja wynaczynienia barwnika do lewego płuca jest znacznie zwiększona w porównaniu z pozorowanym wkraplaniem selektywnym. Neutrofile śródmiąższowe gromadzą się w lewym płucu 24 godziny po wkropleniu kwasu, w przeciwieństwie do prawego płuca, w którym obserwuje się niewiele neutrofili śródmiąższowych.Histologia płuc ujawnia uszkodzenie tkanek i stan zapalny na poziomie narządowym i komórkowym z wysiękowym zapaleniem 24 godziny po urazie, charakteryzującym się wyraźnym obrzękiem pęcherzyków płucnych i naciekiem neutrofili w lewym płucu. Należy zauważyć, że brak znaczącego uszkodzenia lub napływu leukocytów do nieuszkodzonego prawego płuca kontrolnego. 72 godziny po urazie obrzęk i nacieki komórkowe ulegają znacznemu zmniejszeniu, co stanowi ustępującą fazę wysiękową.Jak oceniono za pomocą cytometrii przepływowej, neutrofile pęcherzykowe zwiększają się w lewym płucu 24 godziny po początkowym urazie i znacznie zmniejszają się po 48 i 72 godzinach. Ważne jest, aby uwidocznić cewnik w tchawicy przed przejściem dalej. Podczas wprowadzania skieruj kaniulę w kierunku lewego oskrzela pnia głównego i postępuj zgodnie z kwasem za pomocą 50 mikrolitrów powietrza.W celu oceny stanu zapalnego i ustąpienia można przeprowadzić analizę płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, histologię płuc, fenotypowanie komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej, obrazowanie żywych myszy i badanie czynności płuc. Opracowanie tego samoograniczającego się modelu ostrego uszkodzenia płuc pozwoliło naukowcom wnieść znaczący wkład w dziedzinę biologii rozdzielczości. Należy pamiętać, że stężony kwas solny jest niebezpieczny i należy obchodzić się z nim w kapturze chemicznym, przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.

a-model-self-limited-acute-lung-injury-unilateral-intra-bronchial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mysi model uszkodzenia płuc indukowanego przez respirator jest ważnym narzędziem do badania ostrego uszkodzenia płuc in vivo. W niniejszej pracy przedstawiamy łatwy w zastosowaniu model in situ ostrego uszkodzenia płuc, w którym do wywołania ostrej niewydolności płuc wykorzystano mechaniczną wentylację wysokociśnieniową.

Wentylacja z kontrolowanym ciśnieniem w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc u myszy

Opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa. Model ten naśladuje uszkodzenie płuc podczas zapalenia płuc i ma znaczenie kliniczne.

Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc

Ten protokół wywołuje ostre uszkodzenie płuc u myszy, która jest bardzo zbliżona do patogenezy kwaśnego zapalenia płuc obserwowanej u ludzi. Generujemy maksymalne ostre, nieśmiertelne uszkodzenie płuc o niskim pH i uwzględniamy różnice w anatomicznej budowie układu oddechowego gryzoń i człowieka za pomocą otwartej tracheostomii w połączeniu ze zwolnieniem ciśnienia obwodowego.

Mysi model ostrego uszkodzenia płuc z otwartą tracheostomią do aspiracji kwasu żołądkowego skutkuje maksymalnym ostrym nieśmiertelnym uszkodzeniem płuc

Przedstawiona tutaj jest procedura krok po kroku do wywołania ostrego uszkodzenia płuc u myszy poprzez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydu dotchawiczego i przeprowadzenie analizy FACS próbek krwi, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i tkanki płucnej. Minimalna inwazyjność, prosta obsługa, dobra odtwarzalność i miareczkowanie ciężkości choroby to zalety tego podejścia.

Wywoływanie ostrego uszkodzenia płuc u myszy przez bezpośrednie wkroplenie lipopolisacharydów dotchawiczych

Opisujemy model zespołu ostrej niewydolności oddechowej wywołanej kwasem solnym (ARDS) u prosiąt otrzymujących sedację środkami chlorowcowanymi, izofluranem i sewofluranem, za pomocą urządzenia używanego do wziewnej sedacji intensywnej terapii. Model ten może być wykorzystany do badania biologicznych mechanizmów działania czynników halogenowych na uszkodzenie i naprawę płuc.

Podawanie środka chlorowcowanego w świńskim modelu zespołu ostrej niewydolności oddechowej za pomocą urządzenia typu oddział intensywnej terapii

Kombinacja wymywania środka powierzchniowo czynnego za pomocą 0,9% soli fizjologicznej (35 mL/kg masy ciała, 37 °C) i wentylacji o dużej objętości oddechowej z niskim PEEP powodującym umiarkowane uszkodzenie płuc wywołane respiratorem (VILI) skutkuje eksperymentalnym zespołem ostrej niewydolności oddechowej (ARDS). Metoda ta zapewnia model uszkodzenia płuc z niską/ograniczoną zdolnością rekrutacyjną do badania wpływu różnych strategii wentylacji przez dłuższy czas.

Niedobór środków powierzchniowo czynnych w połączeniu ze szkodliwą wentylacją skutkuje powtarzalnym modelem zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS)

Obecny protokół opisuje model uszkodzenia płuc u myszy używających kwasu oleinowego do naśladowania zespołu ostrej niewydolności oddechowej (ARDS). Model ten zwiększa mediatory stanu zapalnego w obrzęku i zmniejsza podatność płuc. Kwas oleinowy jest stosowany w postaci soli (oleinianu), ponieważ ta fizjologiczna forma pozwala uniknąć ryzyka zatoru.

Mysi model zespołu ostrej niewydolności oddechowej wywołanej kwasem oleinowym

Ten manuskrypt opisuje stworzenie zakaźnego modelu zapalenia płuc u myszy i odpowiednią charakterystykę leczenia urazów wraz z metodami hodowli bakterii i wkraplania dotchawiczego. Opisano również nowatorskie podejście wykorzystujące wysokowymiarową cytometrię przepływową do oceny krajobrazu immunologicznego.

Eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc

Tutaj proponujemy protokół dostarczania lipopolisacharydów dotchawiczych (LPS) poprzez nieinwazyjną intubację dotchawiczą ustno-gardłową. Metoda ta minimalizuje uraz związany z zabiegiem chirurgicznym u zwierzęcia i dokładnie dostarcza LPS do tchawicy, a następnie do płuc.

Nieinwazyjne wkraplanie lipopolisacharydu dotchawiczego u myszy

W tym badaniu wykazano, że nieinwazyjna technika instylacji tchawicy pozwala na rozwój ALI u szczurów za pomocą podstawowego laryngoskopu, aby zapewnić precyzyjne dostarczanie LPS do płuc. LPS jest wprowadzany za pomocą rurki tchawicowej za pomocą laryngoskopu. Skala uszkodzenia płuc jest oceniana w wielu punktach czasowych.

Nieinwazyjne podanie lipopolisacharydu przez endotchawicę w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc u gryzoni

Poznaj model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc u myszy poprzez jednostronne wkroplenie kwasu dooskrzelowego. Ta metoda pozwala badać zapalenie i jego rozwiązanie w kontrolowany sposób.

Model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc przez jednostronne wkroplenie kwasu dooskrzelowego

Przeglądaj więcej filmów