Model samoograniczającego się ostrego uszkodzenia płuc przez jednostronne wkroplenie kwasu dooskrzelowego

Selektywna metoda dooskrzelowa jest istotna, ponieważ oferuje badaczom powtarzalny i nieśmiertelny model do badania ostrego uszkodzenia płuc, głównej przyczyny zespołu ostrej niewydolności oddechowej u ludzi. Zaletą selektywnej techniki dooskrzelowej jest lokalizacja odpowiedzi zapalnej w lewym płucu, oferując prawe płuco jako nieuszkodzoną kontrolę i minimalizując stres zwierząt. Tę procedurę zademonstruje Alexander Tavares, technik i student studiów przedmagisterskich w naszym laboratorium.

Aby przygotować 0,1 normalnego kwasu solnego, dodaj 11 mililitrów podwójnie destylowanej wody do butelki z bursztynowego szkła, a następnie powoli dodaj jeden mililitr 37%12 normalnego kwasu. Następnie powoli dodaj cztery mililitry jednego normalnego kwaśnego bulionu roboczego do 35 mililitrów podwójnie destylowanej wody w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Następnie użyj elektronicznej sondy pH, aby zmierzyć pH 0,1 normalnego roztworu podstawowego, miareczkując do pH 1,1 przy użyciu wodorotlenku sodu lub kwaśnego roztworu podstawowego, w razie potrzeby, do końcowej objętości 40 mililitrów.

Przed rozpoczęciem zabiegu przefiltruj od jednego do dwóch mililitrów roztworu kwasu przez sterylny filtr o pojemności 0,22 mikrolitra do sterylnej probówki mikrowirówki i potwierdź brak reakcji na odruch bólowy u znieczulonej myszy. Używając elektrycznych maszynek do strzyżenia powolnymi ruchami w dół, delikatnie ogol obszar operacyjny na brzusznej powierzchni myszy poniżej podbródka w odcinku szyjnym gardła. Usuń luźne włosy i przetrzyj odsłoniętą skórę trzema kolejnymi 10% roztworem jodu powidonu i 70% wacikami nasączonymi alkoholem izopropylowym.

Po przygotowaniu skóry ułóż mysz w pozycji leżącej na czystej desce chirurgicznej i przykryj zwierzę sterylnym serwetem chirurgicznym. Wykonaj podłużny otwór o długości 0,5 centymetra w skórze nad tchawicą i gruczołami ślinowymi i użyj lekko zakrzywionych ząbkowanych kleszczy, aby ostrożnie cofnąć skórę. Delikatnie oddziel gruczoły ślinowe, aby odsłonić mięśnie tchawicy i użyj lekko zakrzywionych ząbkowanych kleszczy, aby delikatnie rozsunąć mięśnie przytchawicze

Oderwij powięź otaczającą tchawicę, aż chrzęstne pierścienie tchawicy zostaną całkowicie odsłonięte, i użyj w pełni zakrzywionych ząbkowanych kleszczy, aby usunąć tkankę łączną między tchawicą a zatchawicą. Wsuń w pełni zakrzywione ząbkowane kleszcze za tchawicę i podnieś tchawicę. Gdy końcówka kleszczy znajdzie się za tchawicą, chwyć końcówkami kleszczy 10 do 15 centymetrowy kawałek jedwabnego szwu plecionego 4-0 i pociągnij szew za tchawicą, tak aby była równa długość po obu stronach.

Deskę chirurgiczną można obrócić, aby zbliżyć obszar operacyjny do ręki dominującej w celu wykonania kolejnych kroków. Następnie delikatnie pociągnij końce szwu w kierunku przedniej części myszy i przytrzymaj końce na miejscu. W celu kaniulacji lewego oskrzela głównego pnia należy odsłonić igłę angiocewnika o rozmiarze 24 x 3/4 cala i wprowadzić igłę skośną stroną do góry do wewnętrznego obszaru tchawicy między pierwszym a drugim pierścieniem tchawicy.

Gdy końcówkę igły można uwidocznić w świetle tchawicy, zwolnij szew i wsuń kaniulę nad igłą do tchawicy pod kątem w kierunku lewej tylnej strony myszy. W przypadku napotkania oporu należy wycofać igłę. Po umieszczeniu kaniuli na miejscu mocno chwyć port iniekcji, aby zapobiec przesuwaniu się cewnika i zamocuj końcówkę mikropipety P-200 w porcie.

Następnie wkroplić 50 mikrolitrów przefiltrowanego 0,1 normalnego roztworu kwasu do cewnika, a następnie równą objętość powietrza. Ten etap wymaga precyzyjnej manipulacji kaniulą, gdy drogi oddechowe są zatkane, i powinien być zakończony szybko i płynnie, aby przywrócić prawidłowy przepływ powietrza i zminimalizować uszkodzenie dróg oddechowych. Szybko wycofaj cewnik i przechyl deskę chirurgiczną pod kątem 60 stopni.

Po 30 sekundach połóż deskę chirurgiczną płasko i usuń szew zza tchawicy. Następnie użyj jedwabnego szwu plecionego 4-0 pokrytego woskiem, aby zamknąć nacięcie skóry za pomocą dwóch do trzech szwów. Ostre uszkodzenie płuc wynikające z wkroplenia kwasu dooskrzelowego obejmuje całe lewe płuco.

Rzeczywiście, po dożylnym podaniu niebieskiego barwnika Evansa i perfuzji płuc, barwnik jest wykrywany tylko w lewym płucu. Kwantyfikacja wynaczynienia barwnika do lewego płuca jest znacznie zwiększona w porównaniu z pozorowanym wkraplaniem selektywnym. Neutrofile śródmiąższowe gromadzą się w lewym płucu 24 godziny po wkropleniu kwasu, w przeciwieństwie do prawego płuca, w którym obserwuje się niewiele neutrofili śródmiąższowych.

Histologia płuc ujawnia uszkodzenie tkanek i stan zapalny na poziomie narządowym i komórkowym z wysiękowym zapaleniem 24 godziny po urazie, charakteryzującym się wyraźnym obrzękiem pęcherzyków płucnych i naciekiem neutrofili w lewym płucu. Należy zauważyć, że brak znaczącego uszkodzenia lub napływu leukocytów do nieuszkodzonego prawego płuca kontrolnego. 72 godziny po urazie obrzęk i nacieki komórkowe ulegają znacznemu zmniejszeniu, co stanowi ustępującą fazę wysiękową.

Jak oceniono za pomocą cytometrii przepływowej, neutrofile pęcherzykowe zwiększają się w lewym płucu 24 godziny po początkowym urazie i znacznie zmniejszają się po 48 i 72 godzinach. Ważne jest, aby uwidocznić cewnik w tchawicy przed przejściem dalej. Podczas wprowadzania skieruj kaniulę w kierunku lewego oskrzela pnia głównego i postępuj zgodnie z kwasem za pomocą 50 mikrolitrów powietrza.

celu oceny stanu zapalnego i ustąpienia można przeprowadzić analizę płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, histologię płuc, fenotypowanie komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej, obrazowanie żywych myszy i badanie czynności płuc. Opracowanie tego samoograniczającego się modelu ostrego uszkodzenia płuc pozwoliło naukowcom wnieść znaczący wkład w dziedzinę biologii rozdzielczości. Należy pamiętać, że stężony kwas solny jest niebezpieczny i należy obchodzić się z nim w kapturze chemicznym, przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.