Name: Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj trójwymiarowy system sferoidów współhodowlanych ECFC i MSC do oceny modulatorów angiogenezy. Ta metoda naśladuje fizjologiczną angiogenezę i umożliwia przewidywanie skutecznych stężeń leków przed badaniami in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant (17172MFDS215) z Ministerstwa Bezpieczeństwa Żywności i Leków, grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIP) (2017R1A2B4005463) oraz Program Badań Podstawowych przez National Research Foundation of Korea(NRF) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2016R1A6A1A03007648).

Ludzkie ECFC zostały wyizolowane z ludzkiej krwi obwodowej, jak opisano w poprzednim raporcie27. Krótko mówiąc, warstwa komórek jednojądrzastych została oddzielona od krwi pełnej za pomocą Ficoll-Paque Plus i hodowana w odpowiednim podłożu, aż pojawiły się kolonie podobne do śródbłonka. Zebrano kolonie, a ECFC wyizolowano za pomocą kulek magnetycznych pokrytych CD31. MSCs wyizolowano z przylegającej frakcji komórek jednojądrzastych (MNC) dorosłego ludzkiego szpiku kostnego. Protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Duksung Women's University (IRB nr 2017-002-01).
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Przygotowanie płytek ECFC i MSC i pośrednich i powłokowych
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę do wzrostu komórek śródbłonka MV2 (ECGM-MV2, z wyjątkiem hydrokortyzonu) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% glutaminą-penicyliną-streptomycyną (GPS).</li>
		<li>Przygotuj mezenchymalne podłoże do wzrostu komórek macierzystych-2 (MSCGM-2) zawierające 10% FBS i 1% GPS.</li>
		<li>W przypadku hodowli ECFC należy pokryć płytki hodowli komórkowych 1% roztworem żelatyny. Aby przygotować 1% roztwór żelatyny, rozpuść 1 g proszku żelującego w 500 ml PBS za pomocą mieszadła magnetycznego i wysterylizuj w autoklawie. Płytki można pokryć 3 ml/60 mm, 5 ml/100 mm lub 15 ml/150 mm 1% roztworu żelatyny. Inkubować powlekane płytki przez 15 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ). Następnie usunąć pozostały 1% roztwór żelatyny przez aspirację i przemyć powlekane płytki raz PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uprawa ECFC i MSC
	<ol>
		<li>Wysiewaj 1 x 106 ECFC na 1% pokrytych żelatyną płytkach o średnicy 150 mm i hoduj przy użyciu ECGM-MV2 (10% FBS, 1% GPS) w inkubatorze do hodowli komórkowych (37°C i 5% CO2) do 80-90% konfluencji. Użyj ECFC we fragmentach o numerach 7-10, aby uzyskać spójne wyniki.</li>
		<li>Wysiewaj 1 x 106 MSC na niepowlekanych płytkach o średnicy 150 mm i hoduj przy użyciu MSCGM-2 w inkubatorze do hodowli komórkowych (37°C i 5%CO2) do 80-90% konfluencji. Użyj MSC przy przejściach o numerach 7-10, aby uzyskać spójne wyniki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie 1,2% w/v roztworu metylocelulozy
<ol>
	<li>Odmierz 6 g metylocelulozy w szklanej butelce o pojemności 500 ml i sterylizuj w autoklawie.</li>
	<li>Podgrzewać ECGM-MV2 (bez FBS i GPS) w temperaturze 60 °C przez 20 minut i dodać 250 ml podgrzanego ECGM-MV2 do wysterylizowanego proszku metylocelulozy. Aby utrzymać sterylne warunki, przeprowadź proces wewnątrz okapu przepływowego.</li>
	<li>Dodać wysterylizowane mieszadło magnetyczne i mieszać roztwór przez 20 minut na mieszadle magnetycznym, aż metyloceluloza zostanie dokładnie zwilżona i równomiernie zdyspergowana bez grudek. Dodać 250 ml zimnego (4 °C) ECGM-MV2 (bez FBS i GPS) w sterylnych warunkach i mieszać przez dodatkowe 10 minut na mieszadle magnetycznym. Następnie schłodzić roztwór w lodówce (4 °C) przez noc. 
	nuta: Metyloceluloza jest polimerem węglowodanowym, który dobrze rozpuszcza się w niskich temperaturach dzięki pęcznieniu i późniejszemu uwodnieniu.</li>
	<li>Następnego dnia podsycić roztwór do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 5 000 x g przez 3 godziny w temperaturze 4 °C. Pobrać klarowny, lepki roztwór sklarowany nad osadem i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia przez okres do 3-6 miesięcy. 
	nuta: Osad może zawierać resztki włókna celulozowego, dlatego delikatnie pobrać roztwór sklarowanego osadu, pozostawiając co najmniej 5 ml objętości. Objętość tę można dostosować do warunków eksperymentalnych.</li>
</ol>
3. Generowanie i osadzanie sferoid tylko ECFC, tylko MSC i ECFCs-MSCs
Dzień 1 
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny komórek ECFC i MSCs
	<ol>
		<li>Przepłukać 80-90% zlewające się ECFC i MSC, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu oraz aspirat.</li>
		<li>Aby odłączyć ECFC i MSCs od płytki hodowlanej, należy je inkubować z 0,05% trypsyną-EDTA przez 3 minuty i 5 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (odpowiednio 37°C i 5%CO2) w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając pożywkę DMEM zawierającą 10% FBS i 1% GPS. Pipetuj komórki w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
		<li>Osadzać komórki przez odwirowywanie przy 282 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiednim pożywce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znakowanie ECFC i MSC barwnikiem fluorescencyjnym 
	nuta: Wykonać znakowanie błony komórkowej ECFC za pomocą PKH67 (zielony) i MSC za pomocą barwnika fluorescencyjnego PKH26 (czerwony) zgodnie z instrukcjami producenta z niewielkimi modyfikacjami w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Umyj komórki dwa razy pożywką wolną od surowicy, aby usunąć FBS. 
		nuta: Białka i lipidy w FBS zmniejszają efektywne stężenie barwnika do znakowania komórek poprzez wiązanie.</li>
		<li>Policz ECFC i MSC za pomocą hemocytometru pod mikroskopem i przenieś 3 x 106 ECFC i 2 x 106 MSC do mikroprobówek o pojemności 2 ml. 
		nuta: Są to optymalne gęstości komórek do znakowania komórek za pomocą barwników. Użycie dużej liczby komórek powoduje słabe i niejednorodne barwienie, podczas gdy użycie zbyt małej liczby komórek powoduje słabą regenerację komórek.</li>
		<li>Odwirować probówki o sile 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać osad komórkowy. Ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając nie więcej niż 15-25 μl resztkowej objętości.</li>
		<li>Ponownie zawiesić ECFC i MSC w 250 μl rozcieńczalnika C z zestawu do farbowania. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek, aby zapewnić pełną dyspersję. 
		nuta: Rozcieńczalnik C jest solą fizjologiczną i może zmniejszać skuteczność barwienia barwnika poprzez tworzenie miceli. Dlatego nie pozwól, aby komórki stały długo w rozcieńczalniku C i nie obracaj probówek.</li>
		<li>Przygotować roztwór barwiący dla ECFC, dodając 5 μl PKH67 do 250 μl rozcieńczalnika C (końcowe stężenie 20 μM), a dla MSC, dodając 3 μl PKH26 do 250 μl rozcieńczalnika C (końcowe stężenie 12 μM). 
		nuta: Końcowe stężenia barwnika różnią się od zaleceń producenta. Wysokie stężenie prowadziłoby do zlepiania się komórek i toksyczności komórek. Niskie stężenie nie byłoby wystarczające do barwienia.</li>
		<li>Dodać 250 μl zawiesiny komórek ECFC do 250 μl roztworu barwnika PKH67 i 250 μl MSCs do 250 μl roztworu barwnika PKH26. Natychmiast wymieszaj komórki z barwnikami, pipetując w górę i w dół, a następnie inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Aby uzyskać lepsze rezultaty, przykryj probówkę folią aluminiową i umieść na shakerze, aby zapewnić wystarczające wymieszanie podczas barwienia.</li>
		<li>Zatrzymaj proces barwienia, dodając 0,5 ml FBS do wybarwionej zawiesiny komórek, a następnie inkubuj przez 1 minutę, aby umożliwić FBS związanie nadmiaru niezwiązanego barwnika. Osadzane komórki należy rozsiewać przez odwirowanie przy 100 x g przez 5 min. 
		nuta: Granulki ECFC i MSCs po barwieniu są odpowiednio jasnożółte i różowe.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant i przemyć komórki dwa razy kompletnym podłożem, aby usunąć nadmiar barwnika. Odwirować probówki o stężeniu 100 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 2 ml każdej kompletnej pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie sferoid ECFC, MSC lub ECFC+MSC 
	nuta: Zastosuj technikę wiszącego upuszczania, aby wygenerować sferoidy, jak opisano wcześniej28. Kroki przygotowania sferoid podano poniżej.
	<ol>
		<li>Policz poplamione ECFC i MSC.</li>
		<li>Zawiesić barwione ECFC, MSC lub ECFCs+MSC w ECGM-MV2 zawierającym 20% roztworu metylocelulozy i 5% FBS. Przygotować w gęstości komórek 4 x 104 komórki/ml dla ECFC lub MSC (25 μl zawiesiny komórkowej zawiera 1 000 komórek). W przypadku dwukomórkowej zawiesiny ECFC i MSC należy przygotować w gęstości komórek 2 x 104 komórek/ml ECFC i 0,4 x 104 komórek/ml MSC (25 μl zawiera 500 ECFC i 100 MSCs). 
		nuta: Stosunek ECFC do MSC nie powinien przekraczać 5:1. Większa liczba MSCs może prowadzić do nadmiernej migracji i nieregularnej morfologii kiełków. Mniejsza liczba MSCs może powodować słabą interakcję między komórkami, powodując słabe kiełkowanie.</li>
		<li>Przygotuj jednostkę nawadniającą, dodając 15 ml PBS na dno płytki hodowlanej o średnicy 150 mm.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórek do wysterylizowanego prostokątnego zbiornika z polistyrenu w celu użycia pipety wielokanałowej. Zawiesinę komórek rozprowadzić równomiernie, pipetując.</li>
		<li>Umieść 25 μl kropli zawiesiny komórek na pokrywie płytki hodowlanej o średnicy 150 mm za pomocą pipety wielokanałowej (około 100 kropli/pokrywę płytki 150 mm). Odwrócić pokrywę na jednostce hydratacyjnej wypełnionej PBS i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 24 godziny 
		nuta: Roztwór metylocelulozy zapewnia odpowiednią lepkość roztworu zawiesiny. Gdy metoda wiszącej kropli była wykonywana bez roztworu metylocelulozy, krople były łatwo zsuwane w dół, gdy pokrywa była odwrócona (rysunek uzupełniający 1). Co więcej, po całonocnej inkubacji sferoidy nie były idealnie uformowane bez roztworu metylocelulozy. Wynik ten wskazuje, że odpowiednia lepkość roztworu metylocelulozy jest niezbędna do uzyskania okrągłego kształtu sferoid.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Dzień 2
<ol start="4">
	<li>Osadzanie sferoid w zneutralizowanym żelu kolagenowym
	<ol>
		<li>Ciepły FBS i ECGM-MV2 (bez FBS i GPS) w łaźni wodnej (37 °C). Umieść zimny roztwór metylocelulozy na stole roboczym, aby osiągnąć temperaturę pokojową.</li>
		<li>Umieścić 24-dołkową płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C) w celu ogrzania.</li>
		<li>Przetnij spiczaste końcówki pipet o pojemności 1 ml na 3-5 mm, aby wygodnie i dokładnie zassać sferoidy i lepkie zawiesiny, takie jak roztwór metylocelulozy i kolagen typu I.</li>
		<li>Przygotuj 3 mg/ml zneutralizowany żel kolagenowy typu I na lodzie zgodnie z instrukcją producenta żelu kolagenowego typu I. 
		nuta: Neutralizację należy przeprowadzić na lodzie, aby uniknąć żelowania kolagenu w temperaturze pokojowej. Do jednego dołka z 24-dołkowej płytki potrzeba 500 μl zneutralizowanego kolagenu. Zawsze przygotuj 1 ml dodatkowej objętości kolagenu. Żel kolagenowy można stosować do 2-3 godzin po neutralizacji, jeśli jest przechowywany na lodzie.</li>
		<li>Zebrać sferoidy, przepłukując pokrywę zawierającą sferoidy 5 ml PBS. Zebrać roztwór zawieszony sferoidalnie w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Ponownie przepłukać pokrywę 5 ml PBS, aby uzyskać pozostałe sferoidy. 
		nuta: Podczas zbiorów uważnie obserwuj, aby potwierdzić istnienie sferoid. W celu dokładniejszej kontroli wzrokowej przenieś około 50-100 μl roztworu zawieszonego sferoidy na szkiełku szkiełkowym i sprawdź okrągły kształt sferoid pod mikroskopem.</li>
		<li>Sferoidy należy osadzić przez odwirowanie przy 282 x g przez 5 minut. Supernatant należy wyrzucić ostrożnie, nie naruszając sferoid, pozostawiając nie więcej niż 100-200 μl pozostałej objętości.</li>
		<li>Delikatnie postukaj w ściankę probówki, aby sferoidy swobodnie zawiesiły się w pozostałych 100-200 μl pozostałego roztworu.</li>
		<li>Dodać ECGM-MV2 zawierający 5% FBS i 40% roztwór metylocelulozy do probówki zawierającej sferoidy. Dodaną objętość określa się na podstawie około 100 sferoid/ml. Zawiesinę sferoidalną należy delikatnie wymieszać, pipetując końcówką pipety o pojemności 1 ml. 
		nuta: Roztwór metylocelulozy jest szeroko stosowany jako środek zawieszający, który nie pozwala na osadzanie się sferoid. Stężenie FBS powinno wynosić 5%. Wyższe stężenie FBS powoduje nieprawidłowe kiełkowanie z powodu nadmiernych czynników wzrostu. Niższe stężenie FBS nie jest w stanie utrzymać zdrowych warunków dla komórek.</li>
		<li>Wymieszać roztwór zawiesiny sferoidowej i zneutralizowany żel kolagenowy typu I (3 mg/ml) w stosunku 1:1 na lodzie. Użyj końcówki do pipety o pojemności 1 ml, aby uniknąć pękania sferoidów. 
		UWAGA: 1 ml roztworu żelu kolagenowego zawieszającego sferoidy jest wymagany na jedno zagłębienie płytki 24-dołkowej. Jeśli to możliwe, należy przygotować dodatkowy roztwór mieszanej zawiesiny.</li>
		<li>Jeśli konieczne jest zbadanie właściwości angiogennych któregokolwiek ze środków lub substancji chemicznych, przenieś 1 ml roztworu żelu kolagenowego zawieszającego sferoidy do mikroprobówki o pojemności 1 ml i dodaj środek(i) lub substancję chemiczną(e), a następnie delikatnie wymieszaj końcówką do pipety o pojemności 1 ml. 
		UWAGA: Objętość środka i substancji chemicznej może wynosić 200 μl, co rozcieńcza stężenie żelu kolagenowego typu I od 1,5 mg / ml do 1,25 mg / ml, ale nie wpływa na polimeryzację żelu kolagenowego typu I. Dodać tę samą objętość nośnika do sferoid kontrolnych.</li>
		<li>Dodaj roztwór żelu kolagenowego zawieszającego sferoidy do studzienek wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki (0,9 ml / dołek) przez pipetowanie, a następnie inkubować przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w celu polimeryzacji. 
		nuta: Podczas procesu zatapiania sferoidy nie należy naruszać żelu poprzez mieszanie płytki.</li>
		<li>Przykryj żel kolagenowy zawieszający sferoidy, dodając 100 μl ECGM-MV2 zawierającego 2,5% FBS z/bez VEGF. W przypadku sferoid zawierających tylko ECFC należy stymulować komórki egzogennym dodatkiem VEGF (końcowe stężenie 50 ng / ml) w celu utworzenia odpowiednich kiełków. Sferoidy ECFC+MSC nie wymagają egzogennej stymulacji żadnymi czynnikami wzrostu.</li>
		<li>Umieść płytkę w rejestratorze komórek w czasie rzeczywistym zainstalowanym w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C i 5% CO2 ) i losowo ustaw ostrość na 5-10 sferoidach (soczewka obiektywu 10x). Monitoruj formowanie się kiełkowania każdej sferoidy znakowanej fluorescencyjnie co 1 godzinę przez 24 godziny bez żadnych zakłóceń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ilościowe określanie kiełkowania sferoidów
<ol>
	<li>Zaimportuj pliki obrazów do oprogramowania ImageJ, aby określić ilościowo liczbę kiełków i zmierzyć długość każdego kiełka. W przypadku sferoid z kohodowli należy oznaczyć ECFC zielonym barwnikiem fluorescencyjnym przed wykonaniem sferoid. Następnie zmierz liczbę i długość kiełków zabarwionych zieloną fluorescencją (rysunek uzupełniający 2). Pięć losowo wybranych sferoid określono ilościowo dla każdej grupy eksperymentalnej. 
	nuta: Kiełki są wspólnie wydłużonymi strukturami utworzonymi przez kilka ECFC wystających ze sferoid. Długość kiełków mierzy się jako długość od punktu początku kiełków od powierzchni sferoid do wierzchołka kiełków.</li>
	<li>Wartości należy wyrazić jako średnie ± SEM z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Określ statystycznie istotną różnicę za pomocą jednoczynnikowej ANOVA dla porównań wielokrotnych lub testu t-Studenta dla porównań sparowanych. 
	UWAGA: P ≤ 0,05 jest uważane za statystycznie istotne.</li>
</ol>

<ol><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li>
<li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li>
<li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).</li>
<li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li>
<li>Fina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+CD34+gene+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells.</a> Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).</li>
<li>Delia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34+expression+is+regulated+reciprocally+with+adhesion+molecules+in+vascular+endothelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro.</a> Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).</li>
<li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+forces+in+fibrillar+extracellular+matrices+control+directional+capillary+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting.</a> Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).</li>
<li>Korff, T., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+endothelial+cells+in+multicellular+spheroids+prevents+apoptosis+and+induces+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation.</a> The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).</li>
<li>Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mural+cell+signaling+in+vascular+development+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).</li>
<li>Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+offer+cancer+research+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials offer cancer research the third dimension.</a> Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).</li>
<li>Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessel+maturation+in+a+3-dimensional+spheroidal+coculture+model%3A+direct+contact+with+smooth+muscle+cells+regulates+endothelial+cell+quiescence+and+abrogates+VEGF+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness.</a> FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).</li>
<li>Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+mouse+vascular+endothelium.+In+vitro+studies+of+lymphatic%2C+large+blood+vessel+and+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).</li>
<li>Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-786C+polymorphism+of+the+NOS-3+gene+and+the+endothelial+cell+response+to+fluid+shear+stress-a+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).</li>
<li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).</li>
<li>Ingram, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).</li>
<li>Murasawa, S., Asahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+progenitor+cells+for+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Endothelial progenitor cells for vasculogenesis.</a> Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).</li>
<li>Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+and+haematopoietic+stem+cells%3A+novel+targets+for+anti-angiogenesis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy.</a> Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).</li>
<li>Shi, S., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+niche+of+postnatal+mesenchymal+stem+cells+in+human+bone+marrow+and+dental+pulp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li>
<li>Lee, H., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+tube+formation+assay+using+human+endothelial+colony+forming+cells+for+in+vitro+evaluation+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+Journal+of+Physiology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis.</a> Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).</li>
<li>Melero-Martin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).</li>
<li>Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+vascular+networks+transplanted+into+secondary+mice+reconnect+with+the+host+vasculature+and+re-establish+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion.</a> Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).</li>
<li>Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+vasculogenic+cells+form+functional+blood+vessels+and+mitigate+adverse+remodeling+after+ischemia+reperfusion+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats.</a> Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).</li>
<li>Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+colony+forming+cells+and+mesenchymal+progenitor+cells+form+blood+vessels+and+increase+blood+flow+in+ischemic+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle.</a> Scientific Reports. 7 (1), 770(2017).</li>
<li>Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphangiogenesis+in+post-natal+tissue+remodeling%3A+lymphatic+endothelial+cell+connection+with+its+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment.</a> Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).</li>
<li>Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+a+dynamic+niche+in+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression.</a> Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).</li>
<li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMelero-Martin%2C+JM+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 445, 303-329 (2008).</li>
<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li>
<li>Leuning, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokine+secretion+profile+of+mesenchymal+stromal+cells+is+determined+by+surface+structure+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7716(2018).</li>
<li>Shah, S., Kang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Cell+Spheroid+Angiogenesis+Assay+System+Using+Both+Endothelial+Colony+Forming+Cells+and+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules+%26+Therapeutics+%28Seoul%29%22%5BJournal%5D)">Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells.</a> Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejsze badanie wprowadza ulepszony system testów angiogenezy in vitro wykorzystujący sferoidy z kokultury utworzone przez dwa ludzkie komórki progenitorowe komórek naczyniowych, ECFC i MSC. System sferoidalny kohodowli może naśladować tworzenie się kiełków naczyniowych in vivo, co odbywa się poprzez interakcję i włączenie między komórkami śródbłonka a perycytami. W porównaniu z innymi testami angiogenezy in vitro, które odzwierciedlają tylko angiogenezę za pośrednictwem ECs, ten system testów kohodowlanych jest bardzi...

Oczekuje się, że około 500 milionów ludzi na całym świecie skorzysta z terapii modulującej angiogenezę w chorobach związanych z malformacją naczyniową, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, okulopatia, choroby sercowo-naczyniowe i przerzuty nowotworowe1. W związku z tym opracowywanie leków kontrolujących angiogenezę stało się ważnym obszarem badawczym w przemyśle farmaceutycznym. W trakcie procesu opracowywania leku konieczne jest przeprowadzenie badań na zwierzętach in vivo w celu zbadania wpływu kandydatów na leki na funkcje fizjologiczne i interakcje ogólnoustrojowe między narządami. Jednak kwestie etyczne i kosztowe zwiększyły obawy związane z eksperymentami na zwierzętach2. W związku z tym potrzebne są ulepszone systemy testów in vitro, aby uzyskać dokładniejsze i bardziej przewidywalne dane, co pozwoli na lepsze podejmowanie decyzji przed eksperymentami na zwierzętach. Obecne testy angiogenezy in vitro zwykle mierzą proliferację, inwazję, migrację lub tworzenie struktury kanalików komórek śródbłonka (EC) wysianych na dwuwymiarowych (2D) płytkach hodowlanych3. Te testy angiogenezy 2D są szybkie, proste, ilościowe i opłacalne i znacząco przyczyniły się do odkrycia leków modulujących angiogenezę. Jednak kilka kwestii pozostaje jeszcze nierozwiązanych.
Takie systemy testów in vitro 2D nie mogą odzwierciedlać złożonych wieloetapowych zdarzeń angiogenezy, które występują w warunkach fizjologicznych in vivo, co prowadzi do niedokładnych wyników, które powodują rozbieżności między danymi z testów in vitro a wynikami badań klinicznych4. Warunki hodowli 2D również indukują zmianę fenotypów komórkowych. Na przykład, po proliferacji na płytkach hodowlanych 2D, EC mają słaby fenotyp komórkowy, co objawia się zmniejszoną ekspresją CD34 i kilkoma sygnałami, które rządzą odpowiedziami komórkowymi5,6. Aby przezwyciężyć ograniczenia systemów oznaczania angiogenezy opartych na kulturach 2D, opracowano trójwymiarowe (3D) systemy oznaczania angiogenezy sferoidalnej. Kiełkowanie, a następnie tworzenie struktury rurkowej ze sferoid utworzonych przez EC odzwierciedla procesy neowaskularyzacji in vivo7,8. W związku z tym test angiogenezy sferoidalnej 3D został uznany za skuteczny system testowy do badań przesiewowych potencjalnych leków pro- lub antyangiogenezy.
Większość testów angiogenezy sferoidalnej 3D wykorzystuje tylko ECs, głównie ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) lub ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego skóry (HDMEC), aby skupić się na odpowiedzi komórkowej EC podczas angiogenezy. Jednak naczynia włosowate krwi składają się z dwóch typów komórek: EC i perycytów. Opracowanie dwukierunkowej interakcji między EC a perycytami ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej integralności i funkcji naczyń krwionośnych. Niektóre choroby, takie jak dziedziczny udar mózgu, retinopatia cukrzycowa i malformacja żylna, są związane ze zmienioną gęstością perycytów lub zmniejszonym przyczepieniem perycytów do śródbłonka9. Perycyty są również znane jako kluczowy element procesu angiogennego. Perycyty są rekrutowane w celu stabilizacji nowo powstałych struktur naczyń krwionośnych przez EC. W związku z tym test angiogenezy sferoidalnej w monokulturze nie obejmuje pericytów7,10. W związku z tym sferoidy z kohodowli utworzone przez EC i perycyty mogą stanowić cenne podejście do ściślejszego naśladowania fizjologicznych zdarzeń angiogennych.
Niniejsze badanie miało na celu opracowanie testu angiogenezy sferoidalnej w 3D z kombinacją ludzkich komórek tworzących kolonie śródbłonka (ECFC) i mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), aby dokładniej odzwierciedlić angiogenezę in vivo. System sferoidalny kokulturowy jako zespół reprezentacyjny in vitro normalnego naczynia krwionośnego został po raz pierwszy ustanowiony przez Korffa i in. w 200111. Połączyli HUVEC i ludzkie komórki mięśni gładkich tętnicy pępowinowej (HUSMC) i wykazali, że jednoczesna hodowla dwóch dojrzałych komórek naczyniowych zmniejszyła potencjał kiełkowania. Wiadomo, że dojrzałe EC (HUVEC) stopniowo tracą zdolność do proliferacji i różnicowania, co negatywnie wpływa na ich reakcje angiogenezy12,13. Dojrzałe komórki okołonaczyniowe (HUSMC) mogą powodować inaktywację komórek śródbłonka poprzez zniesienie reakcji czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)11. Główną różnicą między systemem sferoidalnym Korffa a naszym systemem sferoidalnym jest użyty typ komórek. Zastosowaliśmy dwa prekursory naczyniowe, ECFC i MSC, aby ustalić właściwy system testów angiogenezy do badań przesiewowych i badań czynników pro- lub antyangiogennych. ECFC są prekursorami ECFC. ECFC mają dużą zdolność do proliferacji w porównaniu z dojrzałymi ECs14, co pozwala przezwyciężyć ograniczenia ECs. ECFC przyczyniają się do tworzenia nowych naczyń krwionośnych w wielu stanach patofizjologicznych po urodzeniu15,16,17. MSCs to pluripotencjalne komórki macierzyste, które mają zdolność różnicowania się w perycyty, przyczyniając się w ten sposób do angiogenezy18,19.
W poprzednich raportach, ECFC i MSC wykazały synergiczny wpływ na tworzenie jajowodów in vitro20, in vivo neowaskularyzacja21,22, oraz poprawiły reperfuzję niedokrwionych tkanek23,24. W niniejszym badaniu ECFC i MSCs wykorzystano do utworzenia sferoid kokulturowych i zatopiono w żelu kolagenowym typu I, aby odzwierciedlić środowisko 3D in vivo. Kolagen jest uważany za główny składnik macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) otaczającej ECs25. ECM odgrywa kluczową rolę w regulacji zachowania komórek26. Proponowany tutaj protokół testu można łatwo i szybko przeprowadzić w ciągu dwóch dni przy użyciu powszechnie stosowanych technik laboratoryjnych. W celu skutecznego śledzenia komórek podczas procesu kiełkowania, każdy typ komórek może być znakowany fluorescencyjnie i monitorowany za pomocą rejestratora komórek w czasie rzeczywistym. Nowo opracowany system oznaczania angiogenezy sferoidalnej 3D we wspólnej hodowli został zaprojektowany w celu zwiększenia czułości oceny potencjalnych modulatorów angiogennych i dostarczania przewidywalnych informacji przed badaniem in vivo.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Bevacizumab</td><td>Roche</td><td>NA</td><td>Nazwa handlowa: Avastin</td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Dulbeco's Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td>PBS (10x)</td></tr><tr><td>Dulbeco's Solanka buforowana fosforanem (1x)</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td>PBS (1x)</td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa komórek śródbłonka Zestaw MV2</td><td>Promocell</td><td>C-22121</td><td>ECGM-MV2</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Atlas</td><td>FP-0500A</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>BD Sciences</td><td>214340</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&ndash; Penicylina&ndash; Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>GPS</td></tr><tr><td>Mezenchymalne podłoże wzrostu komórek macierzystych-2</td><td>Promocell</td><td>C-28009</td><td>MSCGM-2</td></tr><tr><td>Metyloceluloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Zestawy łączników komórek fluorescencyjnych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>PKH26 PKH67</td></tr><tr><td>Zestawy łączników komórek fluorescencyjnych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67</td><td>PKH67</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Żel kolagenowy typu I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego A</td><td>R& D</td><td>293-VE-010</td><td>VEGF</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Badania nad angiogenezą agresywnie rozwijają się w ciągu ostatnich kilku dekad, uznając, że angiogeneza jest cechą charakterystyczną ponad 50 różnych stanów patologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, okulopatia, choroby sercowo-naczyniowe i przerzuty nowotworowe. Podczas opracowywania leków do angiogenezy kluczowe znaczenie ma stosowanie systemów testów in vitro z odpowiednimi typami komórek i odpowiednimi warunkami, aby odzwierciedlić fizjologiczny proces angiogenezy. Aby przezwyciężyć ograniczenia obecnych systemów oznaczania angiogenezy in vitro wykorzystujących głównie komórki śródbłonka, opracowaliśmy trójwymiarowy (3D) system do oznaczania kiełkowania sferoidów w kokulturze. Sferoidy z kohodowli zostały wytworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, komórki tworzące kolonie śródbłonka (ECFC) i mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) w stosunku 5 do 1. Sferoidy ECFCs + MSCs osadzono w macierzy kolagenu typu I, aby naśladować środowisko zewnątrzkomórkowe in vivo. Rejestrator komórek w czasie rzeczywistym został wykorzystany do ciągłej obserwacji postępu angiogennego kiełkowania ze sferoid przez 24 godziny. Zastosowano również technikę znakowania fluorescencyjnego żywych komórek w celu śledzenia lokalizacji każdego typu komórek podczas tworzenia kiełków. Potencjał angiogenny określono ilościowo, zliczając liczbę kiełków i mierząc łączną długość kiełków wygenerowanych z poszczególnych sferoid. Pięć losowo wybranych sferoid analizowano w każdej grupie eksperymentalnej. Eksperymenty porównawcze wykazały, że sferoidy ECFCs+MSCs wykazywały większą liczbę pędów i skumulowaną długość kiełków w porównaniu ze sferoidami zawierającymi wyłącznie ECFC. Bewacyzumab, zatwierdzony przez FDA inhibitor angiogenezy, został przetestowany za pomocą nowo opracowanego systemu testów sferoidalnych do współhodowli w celu zweryfikowania jego potencjału do badań przesiewowych leków antyangiogennych. Wartość IC50 dla sferoid ECFCs+MSCs w porównaniu ze sferoidami zawierającymi tylko ECFC była bliższa efektywnemu stężeniu bewacyzumabu w osoczu uzyskanemu z mysiego modelu guza ksenoprzeszczepu. Niniejsze badanie sugeruje, że system oznaczania angiogenezy sferoidalnej 3D ECFCs + MSCs jest istotny dla fizjologicznej angiogenezy i może przewidywać efektywne stężenie w osoczu przed eksperymentami na zwierzętach.

Eksperymenty porównawcze przeprowadzono z wykorzystaniem sferoidów w monokulturze (same ECFC) oraz sferoidów w kokulturze (ECFC+MSC), aby zbadać, czy MSC odgrywają istotną rolę w angiogenezie pośredniczonej przez ECFC. Formowanie wypustek z każdego sferoidu monitorowano przez 24 h za pomocą rejestratora komórek w czasie rzeczywistym, który umożliwiał rejestrację progresji wypustek angiogennych ze sferoidów. Potencjał angiogenny ilościowo określono poprzez zliczanie liczby wypustek oraz pomiar skumulowanej długości wypust...

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Ten system sferoidalny 3D do kohodowli został zaprojektowany w celu naśladowania fizjologicznej angiogenezy. Będzie on skuteczny w ocenie potencjalnych modulatorów angiogennych i dostarczy przewidywalnych informacji przed badaniami in vivo. System ten wykorzystuje sferoidy kohodowlane utworzone przez dwie naczyniowe komórki progenitorowe i może być używany do badania interakcji komórkowych, kiełkowania i dojrzewania kanalików fizjologicznej angiogenezy.Jeśli uda nam się wykorzystać komórki pacjenta do tworzenia sferoid we wspólnej hodowli, możemy wykorzystać ten system do opracowania spersonalizowanych metod leczenia nieprawidłowych chorób związanych z angiogenezą, takich jak rak. Ten system testowy może zwiększyć czułość i skuteczność badań nad angiogenezą i opracowywaniem leków. Zacznij od użycia 05% trypsyny-EDTA do odłączenia ECFC i MSC od 80 do 90% zlewających się kultur komórkowych odpowiednio na trzy lub pięć minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.Dezaktywuj trypsynę świeżą, kompletną pożywką DMEM i odpipetuj komórki kilka razy, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Zebrać komórki przez odwirowanie, a następnie dwa przemycia pożywką bez surowicy. Po drugim przemyciu rozcieńczyć ECFC do trzech razy 10 do sześciu komórek na mililitr średniego stężenia, a MSC do dwa razy 10 do sześciu komórek na milimetr o stężeniu medium w pojedynczych dwumililitrowych probówkach do mikrowirówek.Osadzać komórki przez odwirowanie i ostrożnie odsysać wszystkie oprócz ostatnich 15 do 25 mikrolitrów supernatantu z każdej próbki komórki. Następnie ponownie zamieszaj każdą granulkę w 250 mikrolitrach rozcieńczalnika C z zestawu do barwników fluorescencyjnych i delikatnie pipetuj zawiesiny komórek, aby zapewnić całkowitą dyspersję. Dodać 250 mikrolitrów świeżo przygotowanego 20-mikromolowego PKH67 do probówki ECFC.Dodać 250 mikrolitrów 12-mikromolowego PKH26 do probówki MSC. Natychmiast wymieszać obie zawiesiny komórkowe. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej z wstrząsaniem, chroniony przed światłem, przerwij proces barwienia jednominutową inkubacją w 0,5 mililitra FBS na probówkę.Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i ostrożnie usunąć supernatant, a następnie przepłukać dwa mililitry świeżej kompletnej pożywki na przemycie. Następnie zawieś komórki w odpowiednim podłożu w 15-mililitrowych probówkach. W celu wytworzenia sferoidów, po drugim przemyciu, najpierw rozcieńczyć zawiesiny komórkowe w odpowiednim stężeniu pożywki MV2 do wzrostu komórek śródbłonka uzupełnionej 20% roztworem metylocelulozy i 5% stężeniem surowicy płodowej bydła.Następnie dodaj zawiesinę każdej komórki do wysterylizowanego prostokątnego zbiornika z polistyrenu. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać około 125 mikrolitrowych kropelek komórek na pokrywę 150-milimetrowej płytki hodowlanej. Po dodaniu wszystkich komórek odwróć pokrywę na dnie naczynia zawierającego 15 mililitrów PBS i umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny.Następnego dnia opłucz pokrywki naczyń pięcioma mililitrami PBS w jednej 50-mililitrowej probówce na naczynie. Opłucz pokrywy dodatkowymi pięcioma mililitrami PBS, aby zebrać pozostałe sferoidy i rozpuść sferoidy przez odwirowanie. Ostrożnie wyrzuć wszystkie oprócz ostatnich 100 do 200 mikrolitrów supernatantu i delikatnie postukaj w ściankę probówki, tak aby sferoidy były swobodnie zawieszone w pozostałym supernatancie.Dodać odpowiednią objętość pożywki MV2 do wzrostu komórek śródbłonka uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą i 40% roztworem metylocelulozy do każdej probówki, aby ponownie zawiesić sferoidy w stężeniu 100 sferoid na mililitr podłoża. Użyj jednomililitrowej końcówki pipety przyciętej do średnicy od trzech do pięciu milimetrów, aby delikatnie wymieszać zawiesiny sferoidalne. Użyj nowej pipety o pojemności jednego mililitra z szeroką końcówką, aby wymieszać roztwór zawiesiny sferoidalnej ze zneutralizowanym żelem kolagenowym typu I w stosunku jeden do jednego na lodzie.Dodaj 900 mikrolitrów każdego roztworu żelu kolagenowego zawieszającego sferoidy do studzienek wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki. Pozostawić zawiesiny do polimeryzacji przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych, a następnie przykryć sferoidy 100 mikrolitrami pożywki do wzrostu komórek śródbłonka MV2 uzupełnionej 2,5% FBS i 50 nanogramów na mililitr VEGF do sferoid zawierających tylko ECFC i pożywki uzupełnionej FBS tylko do kultur sferoidalnych MSC i ECFC-plus-MSC. Następnie umieść każdą płytkę w rejestratorze komórek w czasie rzeczywistym zainstalowanym w inkubatorze do hodowli komórkowych i losowo skup się na pięciu do 10 sferoidach przy 10-krotnym powiększeniu, aby monitorować tworzenie się kiełkowania każdej sferoidy znakowanej fluorescencją co godzinę przez 24 godziny.Aby określić ilościowo kiełkowanie sferoidów, zaimportuj pliki obrazów do ImageJ i zmierz liczbę i długość kiełków wyrażających odpowiedni sygnał fluorescencyjny z pięciu losowo wybranych sferoid na grupę eksperymentalną. W przypadku sferoid ECFC-plus-MSC liczba kiełków i łączna długość kiełków są znacznie wyższe w porównaniu z sferoidami stosowanymi wyłącznie przez ECFC we wszystkich punktach czasowych. Sferoidy występujące wyłącznie w MSCs nie tworzą pędów, ale wykazują indywidualną migrację MSC poza sferoidy.Znakowanie ECFC barwnikiem zielonofluorescencyjnym i MSC barwnikiem czerwonofluorescencyjnym przed połączeniem w celu wytworzenia sferoid ECFC-plus-MSC pokazuje, że struktury kiełków, w których pośredniczy ECFC, są pokryte MSC, co sugeruje, że połączone MSCs działają jako komórki okołonaczyniowe podczas tworzenia kiełków, zwiększając stabilność i trwałość kiełków dzięki ścisłemu powiązaniu między dwiema komórkami naczyniowymi. Sferoidy ECFC-plus-MSC poddane wstępnej terapii inhibitorem angiogenezy wykazują zmniejszoną liczbę kiełków i skumulowaną długość kiełków w sposób zależny od dawki w porównaniu ze sferoidami kontrolnymi ECFC-plus-MSC. W równoległych eksperymentach sferoidy tylko z ECFC, wstępnie potraktowane inhibitorem, a następnie stymulowane VEGF, również wykazują zmniejszoną liczbę kiełków wywołanych czynnikiem wzrostu i skumulowaną długość kiełków w sposób zależny od dawki.Warto zauważyć, że do hamowania sferoid ECFC-plus-MSC potrzebne jest wyższe stężenie inhibitora angiogenezy w porównaniu ze sferoidami zawierającymi tylko ECFC. Wzrost guza jest znacznie zahamowany u zwierząt leczonych inhibitorem angiogenezy w dużych dawkach w porównaniu zarówno ze zwierzętami kontrolnymi, jak i zwierzętami leczonymi inhibitorem angiogenezy w ludzkiej mysiej grupie ksenoprzeszczepu. Stężenie bewacyzumabu w osoczu u myszy leczonych dużą dawką wynosiło 568 plus minus 40,62 mikrogramów na mililitr, co było bliższe wartości IC50 bewacyzumabu w hamowaniu skumulowanej długości kiełków w sferoidach ECFC-plus-MSC, a nie w sferoidach tylko ECFC.Sugeruje to, że system sferoidalny z kokulturą ECFC-plus-MSC jest odpowiedni do przewidywania efektywnych stężeń w osoczu przed badaniem na zwierzętach. Używanie pipety o pojemności jednego ml z szeroką końcówką do delikatnego mieszania sferoidów, gdy znajdują się one w żelu kolagenowym na lodzie, jest ważne dla ochrony integralności sferoid. Możemy zmodyfikować ten system, aby wprowadzić inne typy komórek, takie jak komórki odpornościowe i inne matryce zewnątrzkomórkowe, aby zbadać przesłuchy komórka-macierz podczas angiogenezy.

three-dimensional-angiogenesis-assay-system-using-co-culture

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Tutaj prezentujemy nowatorskie zastosowanie testu pierścienia aortalnego, w którym wstępnie znakowane komórki mezenchymalne są hodowane wspólnie z sieciami śródbłonka pochodzącymi z aorty szczura. Ta nowatorska metoda umożliwia wizualizację naprowadzania i integracji mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) z sieciami śródbłonka, ilościowe określenie właściwości sieci oraz ocenę immunofenotypów MSC i ekspresji genów.

Test kohodowli pierścienia aortalnego: wygodne narzędzie do oceny potencjału angiogennego mezenchymalnych komórek zrębu in vitro

Ten artykuł przedstawia kompleksową procedurę oceny in vitro, czy klasyczna angiogeneza nowotworów występuje w naczyniakach zarodkowych (HBs) i jaka jest jej rola w HBs. Wyniki podkreślają złożoność neowaskularyzacji HB i sugerują, że ta powszechna forma angiogenezy jest jedynie mechanizmem uzupełniającym w neowaskularyzacji HB.

Kompleksowa procedura oceny wydajności in vitro przypuszczalnego neowaskularyzmu naczyniaka zarodkowego przy użyciu testu kiełkowania sferoidalnego

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Powstaje nowy trójwymiarowy model sferoidalny oparty na heterotypowym oddziaływaniu komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu. Tutaj prezentujemy kokulturę komórek nowotworowych i fibroblastów zrębu, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną w celu wizualizacji powstawania sferoid. Ten trójwymiarowy model stanowi istotną platformę do badania interakcji między guzem a zrębem i testowania terapii przeciwnowotworowych.

Nowatorski, modulowany fibroblastami zrębu model sferoidalny 3D guza do badania interakcji guz-zręb i odkrywania leków

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Komórki macierzyste raka jajnika (OCSC) są odpowiedzialne za inicjację, nawrót, oporność terapeutyczną i przerzuty. Uważa się, że nisza naczyniowa OCSC sprzyja samoodnowie OCSC, co prowadzi do chemooporności. Protokół ten stanowi podstawę do ustanowienia odtwarzalnego modelu niszy naczyniowej OCSC in vitro.

Ocena właściwości angiogenetycznych komórek macierzystych podobnych do raka jajnika przy użyciu trójwymiarowego systemu kohodowli, NICO-1

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Istnieje krytyczna potrzeba modeli 3D raka, które rejestrują przesłuchy heterokomórkowe do badania przerzutów nowotworowych. Nasze badanie przedstawia wytwarzanie heterowielokomórkowego nabłonka podścielisko-podścieliskowego w środowisku wolnym od rusztowań i rusztowań, które można wykorzystać do badania inwazji i przestrzennych rozkładów komórkowych.

Heterowielokomórkowe komórki zrębu w wolnych od rusztowań hodowlach 3D nabłonkowych komórek nowotworowych w celu napędzania inwazji

Poznaj trójwymiarowy system sferoidów współhodowlanych ECFC i MSC do oceny modulatorów angiogenezy. Ta metoda naśladuje fizjologiczną angiogenezę i umożliwia przewidywanie skutecznych stężeń leków przed badaniami in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste (Wideo) | JoVE Journal

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Przeglądaj więcej filmów