Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Ten system sferoidalny 3D do kohodowli został zaprojektowany w celu naśladowania fizjologicznej angiogenezy. Będzie on skuteczny w ocenie potencjalnych modulatorów angiogennych i dostarczy przewidywalnych informacji przed badaniami in vivo. System ten wykorzystuje sferoidy kohodowlane utworzone przez dwie naczyniowe komórki progenitorowe i może być używany do badania interakcji komórkowych, kiełkowania i dojrzewania kanalików fizjologicznej angiogenezy.

Jeśli uda nam się wykorzystać komórki pacjenta do tworzenia sferoid we wspólnej hodowli, możemy wykorzystać ten system do opracowania spersonalizowanych metod leczenia nieprawidłowych chorób związanych z angiogenezą, takich jak rak. Ten system testowy może zwiększyć czułość i skuteczność badań nad angiogenezą i opracowywaniem leków. Zacznij od użycia 05% trypsyny-EDTA do odłączenia ECFC i MSC od 80 do 90% zlewających się kultur komórkowych odpowiednio na trzy lub pięć minut w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Dezaktywuj trypsynę świeżą, kompletną pożywką DMEM i odpipetuj komórki kilka razy, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Zebrać komórki przez odwirowanie, a następnie dwa przemycia pożywką bez surowicy. Po drugim przemyciu rozcieńczyć ECFC do trzech razy 10 do sześciu komórek na mililitr średniego stężenia, a MSC do dwa razy 10 do sześciu komórek na milimetr o stężeniu medium w pojedynczych dwumililitrowych probówkach do mikrowirówek.

Osadzać komórki przez odwirowanie i ostrożnie odsysać wszystkie oprócz ostatnich 15 do 25 mikrolitrów supernatantu z każdej próbki komórki. Następnie ponownie zamieszaj każdą granulkę w 250 mikrolitrach rozcieńczalnika C z zestawu do barwników fluorescencyjnych i delikatnie pipetuj zawiesiny komórek, aby zapewnić całkowitą dyspersję. Dodać 250 mikrolitrów świeżo przygotowanego 20-mikromolowego PKH67 do probówki ECFC.

Dodać 250 mikrolitrów 12-mikromolowego PKH26 do probówki MSC. Natychmiast wymieszać obie zawiesiny komórkowe. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej z wstrząsaniem, chroniony przed światłem, przerwij proces barwienia jednominutową inkubacją w 0,5 mililitra FBS na probówkę.

Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie i ostrożnie usunąć supernatant, a następnie przepłukać dwa mililitry świeżej kompletnej pożywki na przemycie. Następnie zawieś komórki w odpowiednim podłożu w 15-mililitrowych probówkach. W celu wytworzenia sferoidów, po drugim przemyciu, najpierw rozcieńczyć zawiesiny komórkowe w odpowiednim stężeniu pożywki MV2 do wzrostu komórek śródbłonka uzupełnionej 20% roztworem metylocelulozy i 5% stężeniem surowicy płodowej bydła.

Następnie dodaj zawiesinę każdej komórki do wysterylizowanego prostokątnego zbiornika z polistyrenu. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać około 125 mikrolitrowych kropelek komórek na pokrywę 150-milimetrowej płytki hodowlanej. Po dodaniu wszystkich komórek odwróć pokrywę na dnie naczynia zawierającego 15 mililitrów PBS i umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny.

Następnego dnia opłucz pokrywki naczyń pięcioma mililitrami PBS w jednej 50-mililitrowej probówce na naczynie. Opłucz pokrywy dodatkowymi pięcioma mililitrami PBS, aby zebrać pozostałe sferoidy i rozpuść sferoidy przez odwirowanie. Ostrożnie wyrzuć wszystkie oprócz ostatnich 100 do 200 mikrolitrów supernatantu i delikatnie postukaj w ściankę probówki, tak aby sferoidy były swobodnie zawieszone w pozostałym supernatancie.

Dodać odpowiednią objętość pożywki MV2 do wzrostu komórek śródbłonka uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą i 40% roztworem metylocelulozy do każdej probówki, aby ponownie zawiesić sferoidy w stężeniu 100 sferoid na mililitr podłoża. Użyj jednomililitrowej końcówki pipety przyciętej do średnicy od trzech do pięciu milimetrów, aby delikatnie wymieszać zawiesiny sferoidalne. Użyj nowej pipety o pojemności jednego mililitra z szeroką końcówką, aby wymieszać roztwór zawiesiny sferoidalnej ze zneutralizowanym żelem kolagenowym typu I w stosunku jeden do jednego na lodzie.

Dodaj 900 mikrolitrów każdego roztworu żelu kolagenowego zawieszającego sferoidy do studzienek wstępnie podgrzanej 24-dołkowej płytki. Pozostawić zawiesiny do polimeryzacji przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych, a następnie przykryć sferoidy 100 mikrolitrami pożywki do wzrostu komórek śródbłonka MV2 uzupełnionej 2,5% FBS i 50 nanogramów na mililitr VEGF do sferoid zawierających tylko ECFC i pożywki uzupełnionej FBS tylko do kultur sferoidalnych MSC i ECFC-plus-MSC. Następnie umieść każdą płytkę w rejestratorze komórek w czasie rzeczywistym zainstalowanym w inkubatorze do hodowli komórkowych i losowo skup się na pięciu do 10 sferoidach przy 10-krotnym powiększeniu, aby monitorować tworzenie się kiełkowania każdej sferoidy znakowanej fluorescencją co godzinę przez 24 godziny.

Aby określić ilościowo kiełkowanie sferoidów, zaimportuj pliki obrazów do ImageJ i zmierz liczbę i długość kiełków wyrażających odpowiedni sygnał fluorescencyjny z pięciu losowo wybranych sferoid na grupę eksperymentalną. W przypadku sferoid ECFC-plus-MSC liczba kiełków i łączna długość kiełków są znacznie wyższe w porównaniu z sferoidami stosowanymi wyłącznie przez ECFC we wszystkich punktach czasowych. Sferoidy występujące wyłącznie w MSCs nie tworzą pędów, ale wykazują indywidualną migrację MSC poza sferoidy.

Znakowanie ECFC barwnikiem zielonofluorescencyjnym i MSC barwnikiem czerwonofluorescencyjnym przed połączeniem w celu wytworzenia sferoid ECFC-plus-MSC pokazuje, że struktury kiełków, w których pośredniczy ECFC, są pokryte MSC, co sugeruje, że połączone MSCs działają jako komórki okołonaczyniowe podczas tworzenia kiełków, zwiększając stabilność i trwałość kiełków dzięki ścisłemu powiązaniu między dwiema komórkami naczyniowymi. Sferoidy ECFC-plus-MSC poddane wstępnej terapii inhibitorem angiogenezy wykazują zmniejszoną liczbę kiełków i skumulowaną długość kiełków w sposób zależny od dawki w porównaniu ze sferoidami kontrolnymi ECFC-plus-MSC. W równoległych eksperymentach sferoidy tylko z ECFC, wstępnie potraktowane inhibitorem, a następnie stymulowane VEGF, również wykazują zmniejszoną liczbę kiełków wywołanych czynnikiem wzrostu i skumulowaną długość kiełków w sposób zależny od dawki.

Warto zauważyć, że do hamowania sferoid ECFC-plus-MSC potrzebne jest wyższe stężenie inhibitora angiogenezy w porównaniu ze sferoidami zawierającymi tylko ECFC. Wzrost guza jest znacznie zahamowany u zwierząt leczonych inhibitorem angiogenezy w dużych dawkach w porównaniu zarówno ze zwierzętami kontrolnymi, jak i zwierzętami leczonymi inhibitorem angiogenezy w ludzkiej mysiej grupie ksenoprzeszczepu. Stężenie bewacyzumabu w osoczu u myszy leczonych dużą dawką wynosiło 568 plus minus 40,62 mikrogramów na mililitr, co było bliższe wartości IC50 bewacyzumabu w hamowaniu skumulowanej długości kiełków w sferoidach ECFC-plus-MSC, a nie w sferoidach tylko ECFC.

Sugeruje to, że system sferoidalny z kokulturą ECFC-plus-MSC jest odpowiedni do przewidywania efektywnych stężeń w osoczu przed badaniem na zwierzętach. Używanie pipety o pojemności jednego ml z szeroką końcówką do delikatnego mieszania sferoidów, gdy znajdują się one w żelu kolagenowym na lodzie, jest ważne dla ochrony integralności sferoid. Możemy zmodyfikować ten system, aby wprowadzić inne typy komórek, takie jak komórki odpornościowe i inne matryce zewnątrzkomórkowe, aby zbadać przesłuchy komórka-macierz podczas angiogenezy.