Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1

Protokół ten umożliwia nam monitorowanie dynamiki oddziaływań i rozdzielczości połączenia Hollidaya przez endonukleazę klapową 1 na poziomie pojedynczej cząsteczki i innych układów enzymatycznych. Cóż, niektóre będą uśredniać w całej populacji molekularnej lub zabezpieczają leżące u podstaw poszczególne kroki mechanistyczne i jest. Metody jednocząsteczkowe dostarczają tych szczegółów poprzez monitorowanie zachowania poszczególnych cząsteczek w czasie rzeczywistym.

Metody jednocząsteczkowe mogą skutecznie wykrywać interakcje biomolekularne w zakresie pico i nanomolowym z wysoką specyficznością. Jest to przydatne w wielu praktycznych rozwiązaniach w diagnostyce, sekwencjonowaniu genomu i wykrywaniu. Optyczne i wymuszone metody pomiaru pojedynczych cząsteczek są szeroko stosowane w fizyce, chemii i biologii i udowodniono, że dostarczają szlachetnych obserwacji, które są niedostępne innymi metodami.

Moja rada dla początkujących użytkowników jest taka, aby ściśle przestrzegali szczegółowych kroków określonych w tym protokole. Wizualne ilustracje praktycznej procedury tego protokołu doprowadzą do pomyślnego wdrożenia tej techniki. Aby przygotować jednokanałową komórkę przepływową, zacznij od wywiercenia dwóch otworów o średnicy 1,22 milimetra w środkowej części szkiełka kwarcowego o wymiarach 50 na 20 milimetrów, ze środkami oddalonymi od siebie o 37 milimetrów i 6,5 milimetra od krawędzi szkiełka.

Za pomocą elektronicznego noża wytnij kanał o wymiarach 41 na 2,25 milimetra na kawałek podwójnego arkusza samoprzylepnego o wymiarach 50 na 20 milimetrów i odklej plastikową stronę osłony ochronnej. Dopasuj krawędzie elementu do krawędzi szkiełka kwarcowego i użyj pęsety z politetrafluoroetylenu, aby delikatnie usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza. Odklej papierową stronę kawałka kleju i zamontuj go na funkcjonalnej powierzchni szkiełka nakrywkowego.

Następnie wytnij jeden kawałek rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 1,22 milimetra na długość 11 centymetrów na wlocie i jeden kawałek rurki na 25 centymetrów na wylot. Następnie włóż rurki do wcześniej wywierconych otworów jako rurki wlotowe i wylotowe dla celi przepływowej. I użyj pięciominutowego kleju epoksydowego, aby uszczelnić krawędzie interfejsu kwarcowego szkiełka nakrywkowego w rurach wlotowych i wylotowych.

Gdy komórka wyschnie, użyj strzykawki o średnicy 1 milimetra, aby przepłukać 0,2 mikrometra przefiltrowanego 0,03 miligrama na mililitr awidyny w PBS do komórki za pomocą drugiej strzykawki wypełnionej samym buforem, aby wypłukać nadmiar awidyny pod koniec obfitości. Aby przeprowadzić jednokolorowy eksperyment z fretem, najpierw nałóż jedną kroplę olejku immersyjnego na 100-krotnie całkowity obiektyw fluorescencyjny odbicia wewnętrznego i ustaw mnożenie fotoelektronów na chipie na odpowiednie wzmocnienie, aby zoptymalizować sygnał do tła i zapobiec nasyceniu. Ostrożnie umieść kuwetę przepływową na uchwycie próbki i użyj regulacji kursu, aby stopniowo podnosić obiektyw, aż olej dotknie szkiełka nakrywkowego.

Włącz laser 532 nm i przełącz się na tryb precyzyjnej regulacji obiektywu. Skieruj emisję do portu kamery, aby obserwować obraz na monitorze i wyreguluj wysokość obiektywu, aż funkcjonalizowana powierzchnia szkiełka nakrywkowego stanie się ostra i będzie można ją obserwować na monitorze. Sprawdzić, czy tło z funkcjonalizowanej powierzchni szkiełek nakrywkowych nie przekracza kilku punktów przed spływającym fluorescencyjnie oznakowanym HJ. Gdy system jest gotowy, od 0,2 do 0,5 mikrolitra rozcieńczonego substratu będącego przedmiotem zainteresowania, do 120 mikrolitrów buforu obrazującego z systemem oczyszczania tlenu należy umieścić w probówce o pojemności 0,5 mililitra i podłączyć wylot powolnej komórki do pompy strzykawkowej.

Włóż rurkę wlotową do rurki o pojemności 1,5 mililitra i uruchom pompę strzykawkową z prędkością od 30 do 50 mikrolitrów na minutę, aby pobrać roztwór z probówki. Często obrazuj powierzchnię na krótko za pomocą zielonego lasera, aby potwierdzić dobre pokrycie komórki od 100 do 300 cząstkami jednorodnie rozmieszczonego, dobrze rozmieszczonego podłoża. Jeśli powierzchnia komory przepływowej jest odpowiednio pokryta, przepłukać kolejne 120 mikrolitrów buforu obrazowania z prędkością od 30 do 50 mikrolitrów na minutę, aby zmyć niezwiązany HJ i pozostawić komórkę przepływową na 5 minut, aby umożliwić systemowi separacji tlenu wyczerpanie rozpuszczonego tlenu.

Ustaw czas ekspozycji na około 60 milisekund. Czas cyklu zostanie automatycznie ustawiony przez oprogramowanie na podstawie szybkości przesyłania danych. Określ żądaną liczbę cykli lub klatek na około 400.

Emisja z fluoroforów donorowych i akceptorowych jest dzielona na kanały kolorów za pomocą urządzenia rozdzielającego obraz. Wybierz odpowiedni obszar na powierzchni, dostosuj wysokość obiektywu, aby ustawić ostrość obrazu, a następnie nagraj i zapisz film w 16-bitowym formacie tiff. Następnie przejdź do nowego obszaru.

Przepłukać komórkę 120 mikrolitrami buforu obrazowego uzupełnionego o wskazane stężenia GEN1 przy natężeniu przepływu 30 mikrolitrów na minutę, po jednym stężeniu na raz. W rozdzielczości eksperymentu rozszczepienia HJ dostosuj natężenie przepływu do 110 mikrolitrów na minutę i rozpocznij nagrywanie na 5 do 10 sekund przed wejściem enzymu do komory przepływowej. Obrazowanie, które rozpocznie się na 5 do 10 sekund przed wejściem enzymu do komórki przepływowej, zmaksymalizuje liczbę zdarzeń.

Po przetestowaniu wszystkich stężeń należy użyć stałego szkiełka fluorescencyjnego, aby odwzorować cząstki donorowe i akceptorowe względem siebie w urządzeniu do dzielenia obrazu. Po zainstalowaniu odpowiedniego pakietu oprogramowania do wygenerowania macierzy transformacji, otwórz nagrany film ze slajdami koralików i wybierz pozycje poszczególnych ściegów w kanałach donorowym i akceptorowym. Gdy macierz została wygenerowana ze szkiełka ze stałym ściegiem, kliknij Załaduj TFORM i wybierz plik macierzy transformacji.

W menu rozwijanym filtra kanałów kliknij opcję D&A, aby wybrać cząstki oznaczone zarówno dawcą, jak i akceptorem. Następnie wprowadź plotTimetraceCW zgodnie z instrukcją w instrukcji, aby wygenerować ślady czasowe dla każdej cząsteczki. Aby przeprowadzić eksperyment ALEX FRET, nagraj film złożony z następujących po sobie klatek emisji donorowej i akceptorowej przez bezpośrednie wzbudzenia za pomocą zielonego i czerwonego lasera.

Otwórz pozyskane filmy ALEX i ustaw odpowiedni próg detekcji na około 300 dla każdej emisji donorowej spowodowanej wzbudzeniem donora, emisji akceptorowej spowodowanej wzbudzeniem dawcy i emisji akceptora spowodowanej kanałami bezpośredniego wzbudzenia. Zastosuj odpowiednie filtry kanałów, aby wybrać cząstki, które były zarówno donorem, jak i akceptorem, i połącz od 200 do 300 cząstek w każdym z trzech kanałów. Użyj kodu plotHistALEX MATLAB, aby wygenerować histogramy ALEX pasujące do różnych pików w funkcjach histogramu i użyj odpowiedniego programu do tworzenia wykresów i analizy, aby określić procent obszaru pod krzywą dla każdej populacji.

Następnie użyj kodu plotTimetraceALEX MATLAB, aby wygenerować ślad czasowy dla każdej cząsteczki pokazujący emisję donora przez bezpośrednie wzbudzenie w emisjach akceptorowych spowodowanych FRET i bezpośrednim wzbudzeniem. Ten reprezentatywny histogram naprzemiennego wzbudzenia FRET sąsiedniej etykiety X-0 pokazuje dwa piki, które odpowiadają zamianie bardziej obfitych i mniej obfitych izomerów. Szybkości izomeryzacji uzyskane z histogramów czasu przebywania izomerów są zgodne z tymi zgłoszonymi wcześniej.

Histogramy pojedynczej cząsteczki FRET sąsiedniego złącza X-0 znacznika przy różnych stężeniach GEN1 uzyskanych przez ALEX, ujawniają jeden pik odpowiadający wolnemu izomerowi o wysokiej zawartości FRET i jeden pik odpowiadający związanej populacji HJ po odjęciu udziału mniej obfitego izomeru od niskiego piku FRET. Przy nasyconym stężeniu GEN1 histogram FRET X-0 ma tylko jeden niski pik FRET odpowiadający GEN1 związany z dowolnym izomerem HJ, zgodnie z przewidywaniami modelu. Wiązanie monomeru GEN1 z HJ, a następnie tworzenie dimerów jest unikalną cechą eukariotycznej resolwazy HJ GEN1 w porównaniu z resolwadami prokariotycznymi, które występują w postaci dimerycznej w roztworze.

Kolejnym dowodem na to, że monomer GEN1 wiąże i zniekształca HJ, jest obserwacja znacznej liczby śladów nierozszczepionych cząstek o stabilnym niskim stanie FRET w obecności magnezu przy niskich stężeniach GEN1. Jednoczesne odejście dawcy i akceptora po stabilnym stanie niskiego FRET w śladach rozdzielczego X-0, który występuje bez pojawienia się produktu pośredniego, wskazuje, że pełna rozdzielczość następuje w czasie życia kompleksu GEN1 HJ. Należy pamiętać, że tło z funkcjonalizowanej powierzchni szkła nie powinno przekraczać kilku plam, a równomiernie rozłożone cząstki są niezbędne do uzyskania dobrych wyników.

Podczas przygotowywania obrazu serializacji należy zawsze używać środków ochrony osobistej i dygestoria. Podczas pracy z laserami należy nosić okulary ochronne dostosowane do długości fal. Inne metody, takie jak cryo ap, magnetyczny rezonans jądrowy, mogą zapewnić szczegóły strukturalne na poziomie atomowym.

Informacje te są niezbędne do projektowania i interpretacji eksperymentów z pojedynczą cząsteczką FRET. Pojedyncze cząsteczki FRET otwierają nowe perspektywy w dziedzinie replikacji DNA, co skutkuje głębszym zrozumieniem mechanizmów działania helikaz i nukleaz.