Name: Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Poznaj metodę FRET na poziomie pojedynczych cząsteczek do badania dynamiki rozdzielczości złącza Hollidaya przez białko GEN1 w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Nauki i Technologii Króla Abdullaha poprzez finansowanie podstawowe i Nagrodę za Konkurencyjne Badania (CRG3) dla S. M. H.

<ol><li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> Methods. 25 (1), 78-86 (2001).</li>
<li>Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+spectroscopy+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescence spectroscopy of single biomolecules.</a> Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).</li>
<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do-it-yourself+guide%3A+how+to+use+the+modern+single-molecule+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit.</a> Nature Methods. 5 (6), 475-489 (2008).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).</li>
<li>Kim, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mg2%2B-dependent+conformational+change+of+RNA+studied+by+fluorescence+correlation+and+FRET+on+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mg2+-dependent conformational change of RNA studied by fluorescence correlation and FRET on immobilized single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (7), 4284-4289 (2002).</li>
<li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+folding+transition+time+of+single+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring the folding transition time of single RNA molecules.</a> Biophysical Journal. 92 (9), 3275-3283 (2007).</li>
<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+Gene+Conversion+in+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Genetical+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism for Gene Conversion in Fungi.</a> Genetical Research. 5 (2), 282-304 (1964).</li>
<li>West, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Formation+and+Resolution+of+Holliday+Junctions+during+the+Recombinational+Repair+of+DNA+Damages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Formation and Resolution of Holliday Junctions during the Recombinational Repair of DNA Damages.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , 269-269 (1995).</li>
<li>Cox, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+repairing+stalled+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The importance of repairing stalled replication forks.</a> Nature. 404 (6773), 37-41 (2000).</li>
<li>West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+views+of+recombination+proteins+and+their+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular views of recombination proteins and their control.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (6), 435-445 (2003).</li>
<li>Duckett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+Holliday+junction%2C+and+its+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structure of the Holliday junction, and its resolution.</a> Cell. 55 (1), 79-89 (1988).</li>
<li>Clegg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+analysis+of+the+structure+of+the+four-way+DNA+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction.</a> Biochemistry. 31 (20), 4846-4856 (1992).</li>
<li>McKinney, S. A., Declais, A. C., Lilley, D. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+individual+Holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of individual Holliday junctions.</a> Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2003).</li>
<li>Joo, C., McKinney, S. A., Lilley, D. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+rare+conformational+species+and+ionic+effects+in+DNA+Holliday+junctions+using+single-molecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring rare conformational species and ionic effects in DNA Holliday junctions using single-molecule spectroscopy.</a> Journal of Molecular Biology. 341 (3), 739-751 (2004).</li>
<li>Hyeon, C., Lee, J., Yoon, J., Hohng, S., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+complexity+in+the+isomerization+dynamics+of+Holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hidden complexity in the isomerization dynamics of Holliday junctions.</a> Nature Chemistry. 4 (11), 907-914 (2012).</li>
<li>Ip, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Holliday+junction+resolvases+from+humans+and+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of Holliday junction resolvases from humans and yeast.</a> Nature. 456 (7220), 357-361 (2008).</li>
<li>Rass, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Holliday+junction+resolution+by+the+human+GEN1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein.</a> Genes & Development. 24 (14), 1559-1569 (2010).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structure+of+a+Eukaryotic+GEN1+Resolving+Enzyme+Bound+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Crystal Structure of a Eukaryotic GEN1 Resolving Enzyme Bound to DNA.</a> Cell Reports. 13 (11), 2565-2575 (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., West, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEN1+promotes+Holliday+junction+resolution+by+a+coordinated+nick+and+counter-nick+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GEN1 promotes Holliday junction resolution by a coordinated nick and counter-nick mechanism.</a> Nucleic Acids Research. 43 (22), 10882-10892 (2015).</li>
<li>van Gool, A. J., Hajibagheri, N. M., Stasiak, A., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Escherichia+coli+RuvABC+resolvasome+directs+the+orientation+of+holliday+junction+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Escherichia coli RuvABC resolvasome directs the orientation of holliday junction resolution.</a> Genes & Development. 13 (14), 1861-1870 (1999).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Holliday+junction+resolvase+GEN1+uses+a+chromodomain+for+efficient+DNA+recognition+and+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human Holliday junction resolvase GEN1 uses a chromodomain for efficient DNA recognition and cleavage.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., West, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+the+GEN1+Holliday+junction+resolvase+ensures+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spatial control of the GEN1 Holliday junction resolvase ensures genome stability.</a> Nature Communications. 5, 4844(2014).</li>
<li>Liu, Y., Freeman, A. D., Declais, A. C., Lilley, D. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monovalent+ion+in+the+DNA+binding+interface+of+the+eukaryotic+junction-resolving+enzyme+GEN1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A monovalent ion in the DNA binding interface of the eukaryotic junction-resolving enzyme GEN1.</a> Nucleic Acids Research. 46 (20), 11089-11098 (2018).</li>
<li>Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junction+resolving+enzymes+use+multivalency+to+keep+the+Holliday+junction+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Junction resolving enzymes use multivalency to keep the Holliday junction dynamic.</a> Nature Chemical Biology. 15 (3), 269-275 (2019).</li>
<li>Bellendir, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+preference+of+Gen+endonucleases+highlights+the+importance+of+branched+structures+as+DNA+damage+repair+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Substrate preference of Gen endonucleases highlights the importance of branched structures as DNA damage repair intermediates.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5333-5348 (2017).</li>
<li>Sobhy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+the+Holliday+junction+recombination+intermediate+by+human+GEN1+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Resolution of the Holliday junction recombination intermediate by human GEN1 at the single-molecule level.</a> Nucleic Acids Research. 47 (4), 1935-1949 (2019).</li>
<li>Sobhy, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+single-molecule+multi-color+excitation+and+detection+fluorescence+set-up+for+studying+biomolecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Versatile single-molecule multi-color excitation and detection fluorescence set-up for studying biomolecular dynamics.</a> Review of Scientific Instruments. 82 (11), 113702(2011).</li>
<li>Kapanidis, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-aided+molecule+sorting%3A+analysis+of+structure+and+interactions+by+alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).</li>
<li>Lee, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
<li>Rashid, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+state+of+DNA-Dye+complex+sets+the+stage+for+protein+induced+fluorescence+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Initial state of DNA-Dye complex sets the stage for protein induced fluorescence modulation.</a> Nature Communications. 10 (1), 2104(2019).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+ethanol+precipitation+of+DNA+in+microcentrifuge+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Standard ethanol precipitation of DNA in microcentrifuge tubes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+limits+of+single-molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the limits of single-molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophysical Journal. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li>
<li>Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L. Jr, Wiggins, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+rates+and+states+from+biophysical+time+series%3A+a+Bayesian+approach+to+model+selection+and+single-molecule+FRET+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Learning rates and states from biophysical time series: a Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data.</a> Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).</li>
<li>Kou, S. C., Cherayil, B. J., Min, W., English, B. P., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+Michaelis-Menten+equations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Single-molecule Michaelis-Menten equations.</a> Journal of Physical Chemistry B. 109 (41), 19068-19081 (2005).</li>
<li>Clegg, R. M., Murchie, A. I., Lilley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solution+structure+of+the+four-way+DNA+junction+at+low-salt+conditions%3A+a+fluorescence+resonance+energy+transfer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The solution structure of the four-way DNA junction at low-salt conditions: a fluorescence resonance energy transfer analysis.</a> Biophysical Journal. 66 (1), 99-109 (1994).</li>
<li>Pohler, J. R., Duckett, D. R., Lilley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+four-way+DNA+junctions+containing+a+nick+in+one+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of four-way DNA junctions containing a nick in one strand.</a> Journal of Molecular Biology. 238 (1), 62-74 (1994).</li>
<li>Fogg, J. M., Lilley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensuring+productive+resolution+by+the+junction-resolving+enzyme+RuvC%3A+large+enhancement+of+the+second-strand+cleavage+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ensuring productive resolution by the junction-resolving enzyme RuvC: large enhancement of the second-strand cleavage rate.</a> Biochemistry. 39 (51), 16125-16134 (2000).</li>
<li>Sobhy, M. A., Joudeh, L. I., Huang, X., Takahashi, M., Hamdan, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+multistep+substrate+interrogation+provides+the+scaffold+for+specificity+in+human+flap+endonuclease+1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Sequential and multistep substrate interrogation provides the scaffold for specificity in human flap endonuclease 1.</a> Cell Reports. 3 (6), 1785-1794 (2013).</li>
<li>Rashid, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+unveils+induced-fit+mechanism+for+substrate+selectivity+in+flap+endonuclease+1%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET unveils induced-fit mechanism for substrate selectivity in flap endonuclease 1.</a> eLife. 6, e21884(2017).</li>
<li>Zaher, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missed+cleavage+opportunities+by+FEN1+lead+to+Okazaki+fragment+maturation+via+the+long-flap+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Missed cleavage opportunities by FEN1 lead to Okazaki fragment maturation via the long-flap pathway.</a> Nucleic Acids Research. 46 (6), 2956-2974 (2018).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29%3A+designs+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31 (5), 1106-1116 (2001).</li>
<li>Toseland, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+and+modification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling and modification of proteins.</a> Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+pH+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W tym badaniu zastosowano różne techniki smFRET w celu określenia kinetyki rozdzielczości HJ przez GEN130. Podobne podejścia smFRET zastosowano do śledzenia wymogu konformacyjnego i rozszczepienia DNA z podwójną płatową endonukleazą płatową replikacji i naprawy DNA 1 42,43,44. W tym miejscu omówiono krytyczne kroki w tym protokole. Reakcja silanizacji powinna być wolna od jakichkolwiek śladów wilgoci. Roztwór pegylacyjny należy szybko nałożyć na szkło silanizowane po rozpuszczeniu PEG, aby uniknąć hydrolizy. W wielokanałowej komorze przepływowej należy usunąć powietrze uwięzione w arkuszu kleju, aby uniknąć wycieków między sąsiednimi kanałami. Roztwór PCA powinien być świeżo przygotowany, ponieważ z czasem utlenia się. Dodawanie 10 N NaOH powinno odbywać się kroplami, z wirowaniem pomiędzy nimi. Tło fluorescencyjne w szkiełku nakrywkowym powinno być minimalne przed wypłynięciem znakowanego fluorescencyjnie HJ. Obrazowanie w komorze przepływowej powinno być wykonywane w jednym kierunku, aby uniknąć obrazowania wybielonych obszarów. W eksperymentach ALEX moc czerwonego lasera powinna być zmniejszona, aby uniknąć szybkiego bielenia akceptora. W eksperymentach poklatkowych czas cyklu musi być krótszy niż najszybsze zdarzenie.
smFRET to czuła technika, która może dostarczyć cennych informacji w czasie rzeczywistym na temat reakcji biomolekularnych. Metoda ta wiąże się jednak z kilkoma wyzwaniami technicznymi, wśród których jest osiągnięcie mierzalnej zmiany FRET podczas reakcji biochemicznej. Jest to konieczne do uzyskania dobrze rozdzielonych cech na histogramach i możliwych do rozróżnienia stanów w śladach czasowych. W wielu przypadkach smFRET wymaga starannego zaprojektowania substratów, doboru par fluoroforów i ich pozycji oraz amplifikacji zmian FRET w substracie DNA ze względu na niewielkie zmiany strukturalne w podłożu45. Innym podejściem do wykonywania FRET jest użycie znakowanych białek46. Okno obserwacyjne w FRET jest ograniczone przez stabilność akceptora, takiego jak Cy5 lub Alexa Fluor 647, który ma tendencję do wybielania się szybciej niż dawca (w tym przypadku Cy3). W związku z tym FRET wymaga ciągłych poszukiwań stabilnych fluoroforów, aby przedłużyć czas trwania eksperymentu oraz wysiłków na rzecz opracowania systemów oczyszczania tlenu w celu przedłużenia sygnału fluorescencji i maksymalizacji stosunku sygnału do szumu47,48.
Wśród wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów w smFRET jest zrównoważenie kilku parametrów związanych z obrazowaniem, takich jak moc lasera, czas ekspozycji, czas cyklu i liczba cykli, aby zmaksymalizować emisję fluorescencji, wydłużyć czas trwania eksperymentu i osiągnąć odpowiednie odstępy próbkowania dla dynamiki enzymu. Dłuższe czasy obserwacji i minimalne efekty fotowybielania są niezbędne do uzyskania rozkładów czasu przebywania o wysokiej wierności, które reprezentują dynamikę enzymu. ALEX generuje lepsze histogramy, ponieważ ta metoda jest poddawana mniejszemu udziałowi cząstek fotobielonych w porównaniu z jednokolorowym FRET. Jednak rozdzielczość czasowa w ALEX jest niższa niż w jednokolorowym FRET.
Wreszcie, nacisk smFRET na wykrywanie zmian konformacyjnych/strukturalnych w poszczególnych cząsteczkach w czasie rzeczywistym wypełnia lukę między technikami strukturalnymi o wysokiej rozdzielczości (tj. krystalografią rentgenowską, magnetycznym rezonansem jądrowym, mikroskopią elektronową), która zapewnia szczegóły strukturalne o rozdzielczości atomowej w warunkach statycznych i metodami masowymi, które dają średnią zespołową mierzalnej właściwości. Pod wieloma względami smFRET okazał się potężną techniką badania systemów biologicznych w czasie rzeczywistym.

Metody jednocząsteczkowe oparte na detekcji fluorescencyjnej zapewniają wysoki stosunek sygnału do szumu1. FRET to technika spektroskopowa, która może mierzyć odległości w zakresie 1–10 nm, co daje tę technikę jako molekularną linijkę do pomiaru odległości w zakresie nanometrów2,3. Widmo absorpcyjne akceptora częściowo pokrywa się widmowo z widmem emisyjnym dawcy na krótszym końcu fali. FRET odbywa się za pośrednictwem bezpromieniowego transferu energii między parą donora i akceptora, podczas gdy efektywność transferu energii zależy od odległości i orientacji akceptora4.
Zastosowano kilka podejść mających na celu zminimalizowanie tła i poprawę skuteczności wykrywania sygnału fluorescencji5,6. Jednym z podejść jest mikroskopia konfokalna, w której otwór otworkowy ogranicza miejsce wzbudzenia do rozmiaru poniżej limitu dyfrakcji7. Innym podejściem jest fluorescencja całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), która jest techniką oświetlenia o szerokim polu, w której światło jest kierowane poza oś powyżej kąta krytycznego8. Światło jest następnie całkowicie wewnętrznie odbijane na granicy faz między szkłem a roztworem wodnym, generując ulotną falę, która oświetla tylko fluorofory przyczepione do powierzchni szkła i zapobiega powstawaniu tła dla fluoroforów w pozostałej części roztworu.
W mikroskopii konfokalnej cząsteczki mogą być albo swobodnie dyfukowalne, albo unieruchomione powierzchniowo. Osiągnięta rozdzielczość czasowa może wynosić od mikrosekund do kilku milisekund9. Detekcja konfokalna pojedynczej cząsteczki jest wykonywana za pomocą jednofotonowej diody lawinowej () i skanowania punkt po punkcie obszaru zainteresowania10. W TIRF szereg czasowy kilkuset cząsteczek unieruchomionych na powierzchni jest rejestrowany przez czuły na położenie dwuwymiarowy detektor sprzężony z ładunkiem (CCD). Przetwornik CCD wzmacnia sygnał fluorescencji za pomocą zintensyfikowanego ekranu fosforowego i płytki mikrokanałowej lub wbudowanego w układ zwielokrotnienia fotoelektronów (EMCCD). Rozdzielczość czasowa jest zależna od prędkości odczytu i wydajności kwantowej CCD i zwykle rzędu kilkudziesięciu milisekund6.
HJ jest centralnym produktem pośrednim w naprawie i rekombinacji DNA11,12,13,14. HJ ma dwie ciągłe i dwie przecinające się nici, które łączą się między ciągłymi pasmami bez przecinania się. HJ występuje w roztworze jako konformery X-stacked, które ulegają ciągłej izomeryzacji przez ciągłe nici, które stają się skrzyżowane, a przecinające się nici stają się ciągłe w drugim konformerze15. Preferencja izomerów HJ jest zależna od sekwencji rdzenia i środowiska jonowego i została szeroko zbadana przez FRET16,17,18,19.
GEN120 jest białkiem monomerycznym w roztworze21 i wymaga dimeryzacji w celu rozszczepienia HJ, umożliwiając w ten sposób prawidłowe rozdzielenie rekombinowanych nici22,23. Preferencja konwersantu układającego HJ wpływa na wynik rekombinacji genetycznej poprzez ustawienie orientacji rozdzielczości przez resolwazy HJ24. Zrozumienie, w jaki sposób GEN1 wiąże HJ, koordynuje dwa nacięcia i zapewnia jego pełną rozdzielczość, wszystko to było przedmiotem intensywnych badań21,22,23,25,26,27,28,29,30.
W tym badaniu użyto obiektywnej konfiguracji TIRF, jak opisano wcześniej31. Dwukolorowe wzbudzenie naprzemienne (ALEX) stosuje się w celu określenia zmian konformacyjnych po oddziaływaniu GEN1 z HJ znakowanym fluoroforem. ALEX tworzy histogramy 2D w oparciu o dwa parametry ratiometryczne: wydajność FRET E, która jest zależna od odległości donor-akceptor, oraz parametr stechiometryczny S, który mierzy stechiometrię donor-akceptor32. ALEX umożliwia sortowanie gatunków fluorescencyjnych na podstawie stechiometrii fluoroforów, w tym subpopulacji tylko dawców, tylko akceptorów i subpopulacji. ALEX może rozszerzyć zastosowanie FRET na pełny zakres i może wykrywać różnice w jasności fluoroforu i oligomeryzacji, a także monitorować interakcje makrocząsteczka-ligand33.
Stwierdzono, że GEN1 konsekwentnie udaje się rozwiązać HJ w czasie życia kompleksu GEN1-HJ. Zależne od czasu zmiany konformacyjne wyprowadza się ze śladów czasowych poszczególnych cząsteczek, podczas gdy histogramy reprezentują rozmieszczenie podstawowych populacji. Za pomocą jednokolorowego FRET w trybie poklatkowym wykazano szybkie i powolne tempo wyłączania dimeru GEN1, co zwiększa powinowactwo zmontowanego dimeru GEN1 przy pierwszym produkcie nacięcia.

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)Kwas -6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano-2-karboksylowy (Trolox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M bufor wodorowęglanu sodu</td><td>Fisher</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>10 % Novex Tris-Boran-EDTA żel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6275BOX</td><td></td></tr><tr><td>100 X obiektyw TIRF</td><td>Olympus</td><td>NAPO 1.49</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 3,4-dihroksybenzoesowy (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5630</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropylotrietoksysilan (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>741442</td><td></td></tr><tr><td>6% żel Novex Tris-Boran-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz samoprzylepny</td><td>Grace bio-labs</td><td>SA-S-1L</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>Z605212</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotyna-PEG-SVA 5000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31307</td><td></td></tr><tr><td>kolumna kationowymienna</td><td>GE healthcare</td><td>MonoS (4.6/100)Dystruptor</td><td></td></tr> <tr><td>komórek</td><td>System stałego rozbijania komórek</td><td>TS5/40/CE/GA</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>MP Biomedicals</td><td>808274</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisji Cy3</td><td>Filtr emisji Chroma</td><td>HQ600/40M-25</td><td></td></tr><tr><td>Cy5/Alexa Fluor 647</td><td>Chroma</td><td>HQ700/40M-25</td><td></td></tr><tr><td>Dichroik do kostki filtra DV2</td><td>Fotometria</td><td>630dcxr-18x26</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka</td><td>Dremel</td><td>200-1/21</td><td></td></tr><tr><td>Nóż elektroniczny</td><td>Copam</td><td>CP-2500</td><td></td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Klej epoksydowy</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td></td></tr><tr><td>FPLC Adapter UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td>28406268</td><td></td></tr><tr><td>GelQuant.NET oprogramowanie</td><td>biochemlabsolutions.com</td><td>Wersja 1.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Wektor wejściowy GEN1</td><td>Harvard repozytorium plazmidów</td><td>HSCD00399935</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Life Science</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>zielony laser (emisja 532 nm)</td><td>Koherentny</td><td>kompas 315M-100</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna heparyny</td><td>GE healthcare</td><td>HiTrap Kolumna</td><td></td>heparynowa</tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>BDH4162</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz obrazu</td><td>Fotometria</td><td>Dualview (DV2)</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Izopropylo-&szlig;-D-tiogalaktozyd (IPTG)</td><td>Goldbio.</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>Skaner laserowy</td><td>GE healthcare</td><td>Typhoon Trio</td><td></td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy 532nm</td><td>Semrock</td><td>LPD02-532RU-25</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma Life Science</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>mPEG-SVA 5000</td><td></td></tr><tr><td>Neutrawidyna</td><td>Kolumna Pierce</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>GE healthcare</td><td>HisTrap FF</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 10% żele Bis-Tris</td><td>Technologie Novex Life</td><td>NP0301BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 10% Bis-Tris Żele białkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0302PK2</td><td></td></tr><tr><td>Origin</td><td>Oprogramowanie OriginLab Corporation</td><td>Wersja 8.5</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluorek (PMSF)</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-184-G025</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>GIBCO</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Rurki polietylenowe (ID 0,76 mm OD 1,22 mm)</td><td>Fisher (Becton Dickinson)</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Protokatechuat 3,4-dioksygenaza (3,4-PCD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td></td></tr><tr><td>Czterozakresowy dichroiczny</td><td>Chroma Inc</td><td>Z405/ 488/532/640RPC</td><td></td></tr><tr><td>Czerwony laser (emisja 640 nm)</td><td>Koherentna</td><td>kostka 640 100C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall RC-6 plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvard</td><td>70-3007</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta teflonowa</td><td>Rubis</td><td>K35A</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>Membrana ultrafiltracyjna</td><td>Millipore</td><td>UFC90300</td><td></td></tr></tbody></table>

metody transferu energii rezonansu förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza hollidaya przez gen1

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Metody masowe mierzą zespołowe zachowanie molekuł, w których poszczególne szybkości reakcji podstawowych etapów są uśredniane w całej populacji. Jednocząsteczkowy rezonansowy transfer energii Förstera (smFRET) zapewnia zapis zmian konformacyjnych zachodzących przez poszczególne cząsteczki w czasie rzeczywistym. Dlatego smFRET jest skuteczny w pomiarze zmian strukturalnych w enzymie lub substracie podczas wiązania i katalizy. W pracy przedstawiono protokół obrazowania pojedynczych cząsteczek oddziaływania czterokierunkowego połączenia Hollidaya (HJ) i endonukleazy szczelinowej I (GEN1), cytozolowego enzymu rekombinacji homologicznej. Zaprezentowano również jednokolorowe i dwukolorowe protokoły eksperymentalne smFRET z naprzemiennym wzbudzeniem (ALEX), które śledzą rozdzielczość HJ przez GEN1 w czasie rzeczywistym. Kinetyka dimeryzacji GEN1 jest określana w HJ, co sugeruje się, że odgrywa kluczową rolę w rozdzielczości HJ i do tej pory pozostawało nieuchwytne. Opisane tutaj techniki mogą być szeroko stosowane w celu uzyskania cennych mechanistycznych wglądów w wiele układów enzymatycznych DNA.

Prezentowany tutaj jest protokół do wykonywania transferu energii rezonansu Förstera dla pojedynczej cząsteczki w celu zbadania rozdzielczości HJ. Dwukolorowe wzbudzenie przemienne służy do wyznaczania stałych dysocjacji. Jednokolorowy smFRET poklatkowy jest następnie stosowany w testach rozszczepienia w czasie rzeczywistym w celu uzyskania rozkładu czasu przebywania przed rozdzielczością HJ.

Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1

Bulk methods measure the ensemble behavior of molecules, in which individual reaction rates of the underlying steps are averaged throughout the ...

Protokół ten umożliwia nam monitorowanie dynamiki oddziaływań i rozdzielczości połączenia Hollidaya przez endonukleazę klapową 1 na poziomie pojedynczej cząsteczki i innych układów enzymatycznych. Cóż, niektóre będą uśredniać w całej populacji molekularnej lub zabezpieczają leżące u podstaw poszczególne kroki mechanistyczne i jest. Metody jednocząsteczkowe dostarczają tych szczegółów poprzez monitorowanie zachowania poszczególnych cząsteczek w czasie rzeczywistym.Metody jednocząsteczkowe mogą skutecznie wykrywać interakcje biomolekularne w zakresie pico i nanomolowym z wysoką specyficznością. Jest to przydatne w wielu praktycznych rozwiązaniach w diagnostyce, sekwencjonowaniu genomu i wykrywaniu. Optyczne i wymuszone metody pomiaru pojedynczych cząsteczek są szeroko stosowane w fizyce, chemii i biologii i udowodniono, że dostarczają szlachetnych obserwacji, które są niedostępne innymi metodami.Moja rada dla początkujących użytkowników jest taka, aby ściśle przestrzegali szczegółowych kroków określonych w tym protokole. Wizualne ilustracje praktycznej procedury tego protokołu doprowadzą do pomyślnego wdrożenia tej techniki. Aby przygotować jednokanałową komórkę przepływową, zacznij od wywiercenia dwóch otworów o średnicy 1,22 milimetra w środkowej części szkiełka kwarcowego o wymiarach 50 na 20 milimetrów, ze środkami oddalonymi od siebie o 37 milimetrów i 6,5 milimetra od krawędzi szkiełka.Za pomocą elektronicznego noża wytnij kanał o wymiarach 41 na 2,25 milimetra na kawałek podwójnego arkusza samoprzylepnego o wymiarach 50 na 20 milimetrów i odklej plastikową stronę osłony ochronnej. Dopasuj krawędzie elementu do krawędzi szkiełka kwarcowego i użyj pęsety z politetrafluoroetylenu, aby delikatnie usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza. Odklej papierową stronę kawałka kleju i zamontuj go na funkcjonalnej powierzchni szkiełka nakrywkowego.Następnie wytnij jeden kawałek rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 1,22 milimetra na długość 11 centymetrów na wlocie i jeden kawałek rurki na 25 centymetrów na wylot. Następnie włóż rurki do wcześniej wywierconych otworów jako rurki wlotowe i wylotowe dla celi przepływowej. I użyj pięciominutowego kleju epoksydowego, aby uszczelnić krawędzie interfejsu kwarcowego szkiełka nakrywkowego w rurach wlotowych i wylotowych.Gdy komórka wyschnie, użyj strzykawki o średnicy 1 milimetra, aby przepłukać 0,2 mikrometra przefiltrowanego 0,03 miligrama na mililitr awidyny w PBS do komórki za pomocą drugiej strzykawki wypełnionej samym buforem, aby wypłukać nadmiar awidyny pod koniec obfitości. Aby przeprowadzić jednokolorowy eksperyment z fretem, najpierw nałóż jedną kroplę olejku immersyjnego na 100-krotnie całkowity obiektyw fluorescencyjny odbicia wewnętrznego i ustaw mnożenie fotoelektronów na chipie na odpowiednie wzmocnienie, aby zoptymalizować sygnał do tła i zapobiec nasyceniu. Ostrożnie umieść kuwetę przepływową na uchwycie próbki i użyj regulacji kursu, aby stopniowo podnosić obiektyw, aż olej dotknie szkiełka nakrywkowego.Włącz laser 532 nm i przełącz się na tryb precyzyjnej regulacji obiektywu. Skieruj emisję do portu kamery, aby obserwować obraz na monitorze i wyreguluj wysokość obiektywu, aż funkcjonalizowana powierzchnia szkiełka nakrywkowego stanie się ostra i będzie można ją obserwować na monitorze. Sprawdzić, czy tło z funkcjonalizowanej powierzchni szkiełek nakrywkowych nie przekracza kilku punktów przed spływającym fluorescencyjnie oznakowanym HJ. Gdy system jest gotowy, od 0,2 do 0,5 mikrolitra rozcieńczonego substratu będącego przedmiotem zainteresowania, do 120 mikrolitrów buforu obrazującego z systemem oczyszczania tlenu należy umieścić w probówce o pojemności 0,5 mililitra i podłączyć wylot powolnej komórki do pompy strzykawkowej.Włóż rurkę wlotową do rurki o pojemności 1,5 mililitra i uruchom pompę strzykawkową z prędkością od 30 do 50 mikrolitrów na minutę, aby pobrać roztwór z probówki. Często obrazuj powierzchnię na krótko za pomocą zielonego lasera, aby potwierdzić dobre pokrycie komórki od 100 do 300 cząstkami jednorodnie rozmieszczonego, dobrze rozmieszczonego podłoża. Jeśli powierzchnia komory przepływowej jest odpowiednio pokryta, przepłukać kolejne 120 mikrolitrów buforu obrazowania z prędkością od 30 do 50 mikrolitrów na minutę, aby zmyć niezwiązany HJ i pozostawić komórkę przepływową na 5 minut, aby umożliwić systemowi separacji tlenu wyczerpanie rozpuszczonego tlenu.Ustaw czas ekspozycji na około 60 milisekund. Czas cyklu zostanie automatycznie ustawiony przez oprogramowanie na podstawie szybkości przesyłania danych. Określ żądaną liczbę cykli lub klatek na około 400.Emisja z fluoroforów donorowych i akceptorowych jest dzielona na kanały kolorów za pomocą urządzenia rozdzielającego obraz. Wybierz odpowiedni obszar na powierzchni, dostosuj wysokość obiektywu, aby ustawić ostrość obrazu, a następnie nagraj i zapisz film w 16-bitowym formacie tiff. Następnie przejdź do nowego obszaru.Przepłukać komórkę 120 mikrolitrami buforu obrazowego uzupełnionego o wskazane stężenia GEN1 przy natężeniu przepływu 30 mikrolitrów na minutę, po jednym stężeniu na raz. W rozdzielczości eksperymentu rozszczepienia HJ dostosuj natężenie przepływu do 110 mikrolitrów na minutę i rozpocznij nagrywanie na 5 do 10 sekund przed wejściem enzymu do komory przepływowej. Obrazowanie, które rozpocznie się na 5 do 10 sekund przed wejściem enzymu do komórki przepływowej, zmaksymalizuje liczbę zdarzeń.Po przetestowaniu wszystkich stężeń należy użyć stałego szkiełka fluorescencyjnego, aby odwzorować cząstki donorowe i akceptorowe względem siebie w urządzeniu do dzielenia obrazu. Po zainstalowaniu odpowiedniego pakietu oprogramowania do wygenerowania macierzy transformacji, otwórz nagrany film ze slajdami koralików i wybierz pozycje poszczególnych ściegów w kanałach donorowym i akceptorowym. Gdy macierz została wygenerowana ze szkiełka ze stałym ściegiem, kliknij Załaduj TFORM i wybierz plik macierzy transformacji.W menu rozwijanym filtra kanałów kliknij opcję D&A, aby wybrać cząstki oznaczone zarówno dawcą, jak i akceptorem. Następnie wprowadź plotTimetraceCW zgodnie z instrukcją w instrukcji, aby wygenerować ślady czasowe dla każdej cząsteczki. Aby przeprowadzić eksperyment ALEX FRET, nagraj film złożony z następujących po sobie klatek emisji donorowej i akceptorowej przez bezpośrednie wzbudzenia za pomocą zielonego i czerwonego lasera.Otwórz pozyskane filmy ALEX i ustaw odpowiedni próg detekcji na około 300 dla każdej emisji donorowej spowodowanej wzbudzeniem donora, emisji akceptorowej spowodowanej wzbudzeniem dawcy i emisji akceptora spowodowanej kanałami bezpośredniego wzbudzenia. Zastosuj odpowiednie filtry kanałów, aby wybrać cząstki, które były zarówno donorem, jak i akceptorem, i połącz od 200 do 300 cząstek w każdym z trzech kanałów. Użyj kodu plotHistALEX MATLAB, aby wygenerować histogramy ALEX pasujące do różnych pików w funkcjach histogramu i użyj odpowiedniego programu do tworzenia wykresów i analizy, aby określić procent obszaru pod krzywą dla każdej populacji.Następnie użyj kodu plotTimetraceALEX MATLAB, aby wygenerować ślad czasowy dla każdej cząsteczki pokazujący emisję donora przez bezpośrednie wzbudzenie w emisjach akceptorowych spowodowanych FRET i bezpośrednim wzbudzeniem. Ten reprezentatywny histogram naprzemiennego wzbudzenia FRET sąsiedniej etykiety X-0 pokazuje dwa piki, które odpowiadają zamianie bardziej obfitych i mniej obfitych izomerów. Szybkości izomeryzacji uzyskane z histogramów czasu przebywania izomerów są zgodne z tymi zgłoszonymi wcześniej.Histogramy pojedynczej cząsteczki FRET sąsiedniego złącza X-0 znacznika przy różnych stężeniach GEN1 uzyskanych przez ALEX, ujawniają jeden pik odpowiadający wolnemu izomerowi o wysokiej zawartości FRET i jeden pik odpowiadający związanej populacji HJ po odjęciu udziału mniej obfitego izomeru od niskiego piku FRET. Przy nasyconym stężeniu GEN1 histogram FRET X-0 ma tylko jeden niski pik FRET odpowiadający GEN1 związany z dowolnym izomerem HJ, zgodnie z przewidywaniami modelu. Wiązanie monomeru GEN1 z HJ, a następnie tworzenie dimerów jest unikalną cechą eukariotycznej resolwazy HJ GEN1 w porównaniu z resolwadami prokariotycznymi, które występują w postaci dimerycznej w roztworze.Kolejnym dowodem na to, że monomer GEN1 wiąże i zniekształca HJ, jest obserwacja znacznej liczby śladów nierozszczepionych cząstek o stabilnym niskim stanie FRET w obecności magnezu przy niskich stężeniach GEN1. Jednoczesne odejście dawcy i akceptora po stabilnym stanie niskiego FRET w śladach rozdzielczego X-0, który występuje bez pojawienia się produktu pośredniego, wskazuje, że pełna rozdzielczość następuje w czasie życia kompleksu GEN1 HJ. Należy pamiętać, że tło z funkcjonalizowanej powierzchni szkła nie powinno przekraczać kilku plam, a równomiernie rozłożone cząstki są niezbędne do uzyskania dobrych wyników.Podczas przygotowywania obrazu serializacji należy zawsze używać środków ochrony osobistej i dygestoria. Podczas pracy z laserami należy nosić okulary ochronne dostosowane do długości fal. Inne metody, takie jak cryo ap, magnetyczny rezonans jądrowy, mogą zapewnić szczegóły strukturalne na poziomie atomowym.Informacje te są niezbędne do projektowania i interpretacji eksperymentów z pojedynczą cząsteczką FRET. Pojedyncze cząsteczki FRET otwierają nowe perspektywy w dziedzinie replikacji DNA, co skutkuje głębszym zrozumieniem mechanizmów działania helikaz i nukleaz.

single-molecule-frster-resonance-energy-transfer-methods-for-real

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawiamy nowatorską i wydajną integrację nanofotoniki (QD-FRET) oraz mikrofluidyki w celu zbadania procesu tworzenia polipreksów polielektrolitowych, co w przyszłości powinno zapewnić lepszą kontrolę oraz syntezę jednorodnych i dostosowanych do potrzeb polipreksów stosowanych w terapiach opartych na kwasach nukleinowych.

Połączenie QD-FRET i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

To badanie przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną do pomiaru dynamiki pętli dwuniciowego DNA za pomocą jednocząsteczkowego transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). Protokół opisuje również, w jaki sposób wyodrębnić zapętloną gęstość prawdopodobieństwa zwaną współczynnikiem J.

Badanie pętli DNA za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Opracowano systemy obserwacji w czasie rzeczywistym oparte na transferze energii rezonansu fluorescencji reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51. Korzystając z przedstawionych tutaj protokołów, jesteśmy w stanie wykryć powstawanie produktów pośrednich reakcji i ich przekształcanie w produkty, jednocześnie analizując kinetykę enzymatyczną reakcji.

Obserwacja w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51

Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku, jak wykonać w pełni poprawione, dokładne pomiary FRET na indywidualnych, swobodnie dyfuzujących biomolekułach za pomocą niedrogiego smfBoxa o otwartym kodzie źródłowym, od włączenia, przez wyrównanie i skupienie, aż po zbieranie i analizę danych.

Wykonywanie precyzyjnych i dokładnych pomiarów fret pojedynczych cząsteczek za pomocą smfBox typu Open-Source

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Badanie szczegółowo opisuje metodologię mapowania FRET, w tym wybór miejsc etykietowania, wybór barwników, akwizycję i analizę danych. Metodologia ta jest skuteczna w określaniu miejsc wiązania, zmian konformacyjnych i ruchów dynamicznych w układach białkowych i jest najbardziej użyteczna, jeśli jest wykonywana w połączeniu z istniejącymi informacjami strukturalnymi 3D.

Mapowanie transferu energii rezonansu Förster: nowa metodologia wyjaśniająca globalne cechy strukturalne

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Poznaj metodę FRET na poziomie pojedynczych cząsteczek do badania dynamiki rozdzielczości złącza Hollidaya przez białko GEN1 w czasie rzeczywistym.

Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1 (Wideo) | JoVE Journal

Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1

Przeglądaj więcej filmów