Sekcja, hodowla i analiza pierwotnych komórek grzebienia nerwowego czaszki od myszy w celu zbadania delaminacji i migracji komórek grzebienia nerwowego
October 3rd, 2019
Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszki z modeli mysich, głównie do badania migracji komórek. Opisujemy stosowane techniki obrazowania na żywo oraz analizę zmian prędkości i kształtu komórek.
Ten dobrze zdefiniowany protokół przygląda się pierwotnej migracji grzebieni nerwowych u ssaków. Używamy pierwotnej migracji grzebienia nerwowego w celu zbadania wad wrodzonych, które wpływają na grzebień nerwowy. Takie podejście pozwala nam przyjrzeć się bliżej komórkom grzebienia nerwowego, gdy wyłaniają się z płytki nerwowej.
Badanie zachowań komórek w tkankach niosących zmutowane geny lub po leczeniu farmakologicznym pozwala na badanie przesiewowe stanu zdrowia pod kątem skutków leczenia farmakologicznego lub zmian środowiskowych podczas rozwoju embrionalnego. Podobne podejście można zastosować do badania komórek grzebienia nerwowego, które migrują do serca lub jelit, lub do badania przerzutowych komórek nowotworowych. Prawidłowe odgadnięcie anatomii zarodka jest trudne.
Jego tkanki zmieniają się bardzo szybko we wczesnym okresie rozwoju. Sugerujemy przećwiczenie mikrodysekcji przed podjęciem dużego eksperymentu. Ponieważ zarodki są żywe i trójwymiarowe, szybkość i precyzja mają kluczowe znaczenie.
W 8,5 dniu embrionalnym użyj sterylnych narzędzi i roztworów, aby pobrać macicę do pojemnika z lodowatym PBS. Przetnij mezometrium, aby oddzielić każdy zarodek. Ostrożnie wypreparuj macicę, oddzielając każdy obrzęk dziesiętny.
Pobranie zarodka we właściwym stadium rozwoju ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia zmienności i zwiększenia sukcesu w przyleganiu eksplantatu do matrycy, a także migracji komórek. Wsuń kleszcze między warstwę mięśniową a tkankę dziesiętną zarodka i użyj drugiej pary kleszczy, aby usunąć warstwę mięśniową. Użyj kleszczy, aby przebić decidua na krawędziach pociągnięcia mesometrialnego i użyj drugiej pary kleszczy, aby rozerwać tkankę prostopadle do pociągnięcia.
Oderwij tkankę dziesiętną za pomocą kleszczy, aby uwidocznić błonę ricarts przed ostrożnym usunięciem błony. Sak z żółtka trzewnego stanie się widoczna, a zarodek będzie obserwowany w środku. Usuń żółtko trzewne i anion i ustaw zarodek tak, aby umożliwić wizualizację fałdu głowy.
Przetnij fałd głowy nad sercem i zeskrob leżącą pod nim mezodermę, aby uzyskać czystą płytkę nerwową. Następnie należy wypreparować granice płytki nerwowej. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś wypreparowaną płytkę nerwową na naczynie pokryte hydrożelem wypełnione kondycjonowanym podłożem grzebienia nerwowego i delikatnie obracaj naczyniem, aby umieścić płytkę nerwową na środku studzienki.
Następnie inkubuj płytkę nerwową w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez odpowiedni okres eksperymentu. Po 24 godzinach od eksplantacji umieść naczynie do hodowli tkankowej w uchwycie na próbkę mikroskopu kontrastowego i przyklej taśmą pokrywę płytki i igłę dwutlenku węgla, aby zapobiec wstrząsom podczas pobierania wielu dołków. Następnie skup się na komórkach grzebienia nerwowego czaszki w 10-krotnym powiększeniu z pasującym pierścieniem fazowym w wybranym kondensatorze.
Aby określić ilościowo zdolność migracji komórek grzebienia nerwowego, ustaw mikroskop tak, aby rejestrował jedną klatkę co pięć minut przy 10-krotnym powiększeniu. Aby określić ilościowo morfologię komórki, ustaw mikroskop tak, aby rejestrował jedną klatkę na minutę przy 40-krotnym powiększeniu. Aby określić ilościowo dynamikę lamellipodiów, ustaw mikroskop tak, aby rejestrował jedną klatkę co 10 sekund przez 10 minut przy 40-krotnym powiększeniu.
W przypadku obrazowania wielodołkowego ustaw stolik mechaniczny tak, aby poruszał się między wybranymi pozycjami X, Y i potwierdź, że komórki grzebienia nerwowego czaszki są ostre i że pozycje stopnia są prawidłowe. Następnie kliknij przycisk pobierz, aby rozpocząć obrazowanie poklatkowe. W przypadku śledzenia pojedynczej komórki otwórz obraz J i zaimportuj dane jako pliki stosu tiff.
Zmień orientację, poziomy jasności i kontrastu, a następnie kliknij przycisk Analizuj i ustaw skalę, aby skalibrować pliki kropkowe w mikrometrach pikseli zgodnie z ustawieniami mikroskopu. Kliknij wtyczki, śledzenie i śledzenie ręczne, aby otworzyć wtyczkę ręcznego śledzenia komórek obrazu J i wybierz dodaj ścieżkę, aby rozpocząć śledzenie komórek. Następnie śledź komórki przez wszystkie klatki filmów poklatkowych, używając jądra jako punktu odniesienia.
Aby ocenić zdolność migracji grzebienia neuronowego, otwórz odpowiedni program do analizy migracji i kliknij kartę importuj dane, aby zaimportować dane śledzenia komórek jako plik dot txt. W obszarze Zestawy danych i inicjalizacja wybierz liczbę wycinków lub ramek do analizy i ustaw kalibrację X, Y oraz interwał czasu między klatkami. Wybierz pozycję Zastosuj ustawienia, aby zapisać ustawienia.
Następnie wybierz symbol wykreślenia danych, aby utworzyć wykresy trajektorii i wybierz symbol statystyczny, aby określić ilościowo miary odległości i prędkości. Aby określić ilościowo obszar komórki grzebienia nerwowego i okrągłość, otwórz obraz J i w obszarze analizuj i ustaw pomiary, kliknij, aby wybrać parametry kształtu komórki, obszar komórki, obwód i deskryptor kształtu. Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby ręcznie narysować kontur wokół każdej komórki, używając granic błony komórkowej jako przewodnika.
Naciśnij Control+B na klawiaturze, aby zachować nakładkę konturu komórki na obrazie i powtórz te czynności dla każdej komórki w każdej klatce poklatkowej. Kliknij nakładkę obrazu i aby dotrzeć do menedżera zainteresowań i wybierz interesujące komórki. Następnie kliknij przycisk zmierz, aby uzyskać wartości dla wybranych parametrów kształtu komórki, które Cię interesują.
W ciągu 24 godzin od eksplantatu i hodowli można wyraźnie zaobserwować obszar przedmigracyjnego nabłonkowego grzebienia nerwowego czaszki otaczający eksplantat płytki nerwowej. Co więcej, subpopulacja komórek grzebienia nerwowego przejdzie przejście nabłonkowe do mezenchymalnego i będzie wyglądać w pełni mezenchymalnie. Hodowle eksplantatów posiane na hydrożelu lub fibronektynie na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej tworzą podobne struktury eksplantacyjne składające się z przedmigracyjnego grzebienia nerwowego płytki i migrujących komórek grzebienia nerwowego.
Jednak eksplantaty posiane fibronektyną wytwarzają komórki z bardziej widocznymi blaszkami na krawędzi czołowej komórki, pozornie bardziej spolaryzowane w kierunku migracji. Mikroskopia poklatkowa umożliwia śledzenie współrzędnych X, Y poszczególnych komórek oraz analizę migracji komórek grzebienia nerwowego i analizę dynamiki morfologii komórek grzebienia nerwowego czaszki w czasie. Poprzez obrysowanie poszczególnych błon komórkowych, pomiary powierzchni i obwodu komórek mogą być obliczane ze wszystkich klatek filmów, aby umożliwić późniejszą kwantyfikację obszaru komórki i kołowości poszczególnych komórek i grup komórek.
Należy zauważyć, że gdy komórki migrują z dala od eksplantatu, obszar komórki znacznie się zwiększa, podczas gdy okrągłość komórek pozostaje względnie stała, co sugeruje, że gdy komórki odchodzą od krawędzi nabłonka i tracą kontakty komórka-komórka, wykazują zwiększoną powierzchnię rozprzestrzeniania się komórek. Zwróć szczególną uwagę na zeskrobanie leżącej pod spodem mezodermy w celu uzyskania czystej płytki nerwowej, ponieważ sprzyja to migracji komórek grzebienia nerwowego z dala od tkanki. Wiele innych technik, takich jak barwienie immunologiczne, RTPCR lub analiza pojedynczych komórek, można przeprowadzić w celu analizy różnych białek lub genów będących przedmiotem zainteresowania w różnych populacjach komórek hodowlanych.
Jesteśmy zainteresowani rolkami rozwojowymi niektórych kluczowych genów nerwiaka zarodkowego, które mogą być zaangażowane w migrację komórek grzebienia nerwowego oraz wykorzystaniem tego podejścia do badania genów chorób u ludzi.
Przegląd
Ten protokół opisuje dysekcję i hodowlę komórek grzebienia nerwowego czaszkowego z modeli mysich, koncentrując się na technikach migracji komórek i obrazowania na żywo.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwoju
Tło
- Komórki grzebienia nerwowego odgrywają kluczową rolę w rozwoju zarodkowym.
- Rozumienie ich migracji może dostarczyć wglądu w wady wrodzone.
- Techniki obrazowania na żywo pozwalają na obserwację zachowań komórek w czasie rzeczywistym.
- Istnieją wyzwania w dokładnym dysekcji i hodowli tych komórek.
Cel badania
- Badanie pierwotnej migracji komórek grzebienia nerwowego u ssaków.
- Badanie wpływu mutacji genetycznych i leków na zachowanie komórek.
- Analiza dynamiki migracji i morfologii komórek grzebienia nerwowego czaszkowego.
Zastosowane metody
- Mikrodysekcja zarodków w 8.5 dniu embrionalnym.
- Hodowla komórek grzebienia nerwowego w pożywce uwarunkowanej.
- Mikroskopia time-lapse do śledzenia migracji komórek.
- Analiza obrazów do ilościowej oceny morfologii komórek i zdolności migracyjnych.
Główne wyniki
- Komórki grzebienia nerwowego przechodzą przemianę nabłonkową na mezenchymalną.
- Różne podłoża wpływają na morfologię komórek i dynamikę migracji.
- Zdjęcia time-lapse umożliwiają szczegółowe śledzenie ruchów pojedynczych komórek.
- Analiza ilościowa ujawnia wgląd w zachowanie komórek w różnych warunkach.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia ramy do badania migracji komórek grzebienia nerwowego.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia procesów rozwojowych i potencjalnych wad wrodzonych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach, aby zbadać inne aspekty biologii grzebienia nerwowego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct observation of neural crest cell delamination and migration, providing a reductionist system to interrogate mechanisms underlying neurocristopathies. By isolating cranial neural crest cells from mouse embryos, researchers can assess the impact of genetic or pharmacological perturbations on epithelial-mesenchymal transition and motility. The approach supports early-stage target validation by linking molecular changes to phenotypic outputs in a disease-relevant developmental context.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by linking genetic mutants to EMT and migration phenotypes.
- Operational Value: Establish causal relationships between gene function and neural crest cell behaviors.
- Strategic Value: De-risk targets by confirming functional relevance in a primary cell model of developmental pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare standardized explant cultures for consistent assessment of compound effects on cell migration.
- Operational Value: Enable quantitative, time-resolved readouts of lamellipodia dynamics and cell morphology.
- Strategic Value: Support assay scalability for screening libraries against migratory phenotypes in a primary system.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Model human neurocristopathy mechanisms using patient-derived mutations in a murine primary cell context.
- Operational Value: Bridge in vitro findings to in vivo relevance through conserved EMT and migration pathways.
- Strategic Value: Inform preclinical candidate selection by predicting effects on developmental signaling networks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery, supporting target validation through phenotypic screening of cranial neural crest cell behaviors prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in neural crest induction, EMT, and migration.
- Screening: Delivers assay-ready primary cultures with quantifiable outputs for compound or genetic perturbation analysis.
- Analytics: Generates trajectory, speed, distance, area, and circularity measurements to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects developmental mechanisms to disease models via conserved migratory and morphological phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying neural crest-related targets across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into target function through direct observation of EMT and migration.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized explant culture and live imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing ambiguity in target phenotype relationships.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on developmental pathway modulation.
Implementation Considerations
- Expertise in embryonic dissection and microsurgery at E8.5.
- Access to phase-contrast and fluorescence microscopy with environmental control.
- Standardized hydrogel or fibronectin coating for consistent explant adhesion.
- Adaptability to genetic mutants and pharmacological treatments via culture medium supplementation.
- Limitations include embryo availability, dissection variability, and the need for live-cell imaging infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Early Somite Stage Embryo Dissection (Day 1)
3:12
Live Cell Imaging of Murine Cranial Neural Crest Cells (Day 2)
4:36
Neural Crest Single Cell Tracking
5:22
Quantification of Neural Crest Cell Migratory Capacity
6:04
Quantification of Neural Crest Cell Area and Circularity
7:00
Results: Representative Cranial Neural Crest Cell Migration and Cell Shape Dynamics Analyses
8:43
Conclusion
