Name: Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2-O-metylowych RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj protokół przygotowania bibliotek małych RNA z mniejszym błędem systematycznym i lepszym wykrywaniem 2'-O-metylowych RNA. Metoda zwiększa czułość detekcji i oferuje elastyczność stosowania odczynników domowych lub komercyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodowe Centrum Badań Naukowych (CNRS), Francuską Komisję ds. Alternatywnych Źródeł Energii i Energii Atomowej (CEA) oraz Uniwersytet Paris-Sud. Wszystkie przygotowania biblioteki, sekwencjonowanie Illumina i analizy bioinformatyczne na potrzeby tego badania zostały przeprowadzone w ośrodku I2BC Next-Generation Sequencing (NGS). Członkowie placówki I2BC NGS są doceniani za krytyczną lekturę manuskryptu i pomocne sugestie.

1. Izolacja małych RNA
<ol>
	<li>Ekstrahować całkowite RNA za pomocą odczynników na bazie fenolu lub dowolnej innej metody. Sprawdź, czy RNA jest dobrej jakości.</li>
	<li>Uruchom wstępnie 15% żel mocznikowy TBE (patrz tabela materiałów) przez 15 minut przy napięciu 200 V.</li>
	<li>Podczas przygotowywania żelu wymieszaj 5-20 μg całkowitego RNA w objętości 5-15 μl z równą objętością barwnika ładującego formamid (patrz Tabela materiałów; 95% dejonizowany formamid, 0,025% błękit bromofenolowy, 0,025% cyjanol ksylenowy, 5 mM EDTA pH 8) w probówce PCR o pojemności 200 μl. Podobnie, zmieszaj 10 μl (200 ng) drabinki z małym RNA (patrz Tabela materiałów) z równą objętością barwnika obciążającego formamid. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 65 °C w termocyklerze z podgrzewaną pokrywą, a następnie natychmiast umieścić probówki na lodzie.</li>
	<li>Załadować drabinkę i próbkę do tego samego żelu z co najmniej jednym pasem między nimi i pracować pod napięciem 200 V, aż błękit bromofenolowy (ciemnoniebieski) przemieści się na około dwie trzecie długości żelu (około 40 minut).</li>
	<li>Przygotuj układ do elucji RNA z żelu w następujący sposób: przekłuć dno wolnej od nukleaz mikroprobówki wirówkowej o pojemności 0,5 ml igłą o rozmiarze 21. Umieść przebitą probówkę o pojemności 0,5 ml w beznukleazowej, okrągłodennej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Usuń żel i inkubuj w temperaturze pokojowej z 3 μl barwnika z żelu kwasu nukleinowego (10 000 x koncentrat; patrz Tabela Materiałów) w 30 ml wody przez 10-15 minut.</li>
	<li>Obejrzyj żel na iluminatorze trans "Dark Reader" (zdecydowanie zaleca się unikanie promieniowania UV, ponieważ może to uszkodzić RNA) i wyciąć próbkę RNA między pasmami drabinkowymi 17 nt i 29 nt. Przenieś kawałek żelu do probówki o pojemności 0,5 ml z kroku 1.5.</li>
	<li>Odwirować probówkę o pojemności 0,5 ml w probówce o pojemności 2 ml w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 2 minuty. Wyjmij probówkę o pojemności 0,5 ml, która powinna być teraz pusta.</li>
	<li>Dodać 300 μl 0,3 M NaCl bez nukleaz do probówki o pojemności 2 ml zawierającej rozdrobniony żel i obracać przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc (16 godzin).</li>
	<li>Przenieść zawiesinę rozdrobnionych kawałków żelu do kolumny wirowej (patrz tabela materiałów) i wirować przez 2 minuty z maksymalną prędkością w mikrowirówce.</li>
	<li>Dodać 1 μl (20 μg/μl) glikogenu (patrz tabela materiałów) i 950 μl 100% etanolu o temperaturze pokojowej. Inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Wirować przez 20 minut z maksymalną prędkością w mikrowirówce w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, przemyć osad 800 μl zimnego 80 % etanolu. Ponownie odwirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć cały sklarowany sklarowany stan. Zawiesić osad RNA w 15 μl wody wolnej od nukleaz. Zazwyczaj należy odzyskać ~5-20 ng małego RNA, w zależności od ilości wejściowego całkowitego RNA (~1 ng małego RNA na 1 μg wejściowego całkowitego RNA).</li>
	<li>Zalecany dodatkowy krok: Sprawdź ilość i jakość odzyskanego sRNA (np. za pomocą elektroforezy w żelu kapilarnym przy użyciu małego zestawu RNA; patrz Tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Przygotowanie adaptera 3' HD z predenylacją
UWAGA: Preadenylacja adaptera HD 3' została przeprowadzona w sposób podobny do protokołu opisanego przez Chen et al18. Zwróć uwagę, że adapter preadenylowany można zamówić bezpośrednio (modyfikacja /5rApp/), ale jest to dość drogie.
<ol>
	<li>Zamów 5' fosforylowany, 3' zablokowany oligonukleotyd adaptera 3' HD. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z kolejnością i modyfikacjami. Należy pamiętać, że "3AmMO" jest grupą modyfikatorów 3' aminokwasów, większość dostawców może produkować oligonukleotyd z tą modyfikacją. Rozcieńczyć w wodzie wolnej od nukleaz do 100 μM.</li>
	<li>Przygotuj 100 μl reakcji zawierającej następujące odczynniki: 10 μl oligo (100 μM), 10 μl buforu ligazy RNA T4 (10x), 10 μl ATP (10 mM), 40 μl 50% PEG8000, 5 μl ligazy T4 RNA 1 (50 jednostek), 25 μl wody wolnej od nukleaz. Inkubować przez noc w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Przeprowadzić klasyczną ekstrakcję fenolowo-chloroformową preadenylowanego oligonukleotydu, a następnie wytrącić etanol. Dodać 100 μl kwasu (pH 4,5) fenolu:chloroform i wirować. Wirować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, maksymalna prędkość. Ostrożnie przenieść 90 μl górnej fazy do nowej probówki; dodać 10 μL 3 M octanu sodu o pH 5,2, 1 μL ultraczystego glikogenu i 250 μL zimnego 100% etanolu.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut. Wirować przez 30 minut przy maksymalnej prędkości 4 °C. Usunąć supernatant, przemyć osad raz 500 μl zimnego 80% etanolu. Jako alternatywę dla ekstrakcji fenolowo-chloroformowej i wytrącania etanolu można zastosować zestaw do usuwania nukleotydów (patrz tabela materiałów). Zawiesić w 25 μl wody.</li>
	<li>Zmierz stężenie łącznika za pomocą zestawu do specyficznego wykrywania jednoniciowego DNA (patrz Tabela materiałów). Rozcieńczyć do 80 ng/μL (10 μM). </li>
	<li>Zalecany dodatkowy krok: Sprawdź skuteczność preadenylacji poprzez migrację 1 μl adaptera 10 μM na 15% żelu TBE-mocznik (tabela materiałów) wraz z nieleczonym oligonukleotydem. Preadenylowany adapter powinien migrować nieco wolniej niż nieleczony oligonukleotyd. W razie potrzeby wstępnie przygotowany adapter można oczyścić żelem; Postępuj zgodnie z powyższym opisem (kroki 1.2-1.12).</li>
</ol>
3. Przygotowanie biblioteki - Protokół TS5
UWAGA: Prezentujemy tutaj zmodyfikowany protokół TS 'TS5', który opisaliśmy wcześniej12 i który może być wykonany zarówno z odczynnikami z zestawu, jak i z odczynnikami dostarczonymi przez siebie. Należy zauważyć, że podobne lub nawet nieco lepsze wyniki uzyskaliśmy przy użyciu innego protokołu, 'TS7'. Jednak w przypadku TS7 trudniej jest wyeliminować ściemniacze adapterów. Dlatego woleliśmy szczegółowo opisać TS5, ale po TS7 można po prostu wymienić adaptery. W przypadku TS7 należy użyć sekwencji adaptera "MidRand-Like (MRL)" (tabela 1). Zauważ, że tutaj losowe regiony znajdują się w środku adapterów. Startery do odwrotnej transkrypcji i PCR będą hybrydyzować z sekwencjami poniżej randomizowanego regionu w adapterze 3' i przed randomizowanym regionem w adapterze 5'. Sekwencjonowanie rozpocznie się od pierwszego randomizowanego nukleotydu w adapterze 5'.
<ol>
	<li>Podwiązanie adaptera 3'.
	<ol>
		<li>Połącz 1 μl wstępnie adenylowanego adaptera 3' HD (10 μM) z 1 μl oczyszczonego małego RNA (~0,1-1 μM) w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 0,2 ml. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 72 °C w termocyklerze, a następnie umieścić bezpośrednio na lodzie.</li>
		<li>Dodać 4 μl 50% PEG 8000 (lepki roztwór; pipetować powoli), 1 μl buforu ligazy RNA (10x), 1 μlH2O, 1 μl ligazy T4 RNA2 skróconej i 1 μl inhibitora RNazy. Inkubować przez noc w temperaturze 16 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eliminacja nieligowanego adaptera 3'
	<ol>
		<li>Dodaj 10 μl wody bez nukleaz i dobrze wymieszaj. Dodać 6 μl 3 M NaOAc o pH 5,2 lub "roztworu do zubożenia adaptera" z zestawu Nf (tabela materiałów) i dobrze wymieszać. Dodać 40 μl magnetycznych kulek oczyszczających (tabela materiałów) i 60 μl izopropanolu i dobrze wymieszać. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieść próbkę w stojaku magnetycznym, aż roztwór stanie się klarowny. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.</li>
		<li>Dodać 180 μl świeżo przygotowanego 80 % etanolu. Inkubować przez ~30 s, a następnie wyjąć. Uważaj, aby używać świeżo przygotowanego 80% etanolu i nie inkubować z 80% etanolem przez dłuższy czas.</li>
		<li>Krótko obróć rurkę i usuń resztki płynu, które mogły zebrać się na dnie studzienki. Pozostaw kulki do wyschnięcia na 2 minuty, a następnie ponownie zawieś w 22 μl 10 mM Tris pH 8 lub buforze do reprodukcji z zestawu Nf. Inkubować przez 2 minuty, a następnie namagnesować próbkę, aż roztwór stanie się klarowny.</li>
		<li>Dodać 6 μl 3 M NaOAc pH 5,2 lub "roztworu do zubożenia adaptera" z zestawu Nf (tabela materiałów) do nowej probówki. Przenieść 20 μl supernatantu z poprzedniego etapu do nowej probówki i wymieszać pipetując. Dodać 40 μl kulek magnetycznych i 60 μl 100% izopropanolu i dobrze wymieszać pipetując. Inkubować przez 5 minut.</li>
		<li>Namagnesuj próbkę, aż roztwór stanie się klarowny, a następnie usuń i wyrzuć supernatant.</li>
		<li>Dodać 180 μl świeżo przygotowanego 80 % etanolu. Inkubować przez ~30 s, a następnie wyjąć. Należypamiętać o używaniu świeżo przygotowanego 80% etanolu i nie inkubować z 80% etanolem przez dłuższy czas.</li>
		<li>Krótko obróć rurkę i usuń resztki płynu, które mogły zebrać się na dnie studzienki. Pozostaw kulki do wyschnięcia na 2 minuty i ponownie zamieszaj w 10 μl wody wolnej od nukleaz. Inkubować przez 2 minuty, a następnie namagnesować próbkę, aż roztwór stanie się klarowny.</li>
		<li>Przenieść 9 μl supernatantu do nowej probówki. Dodać 1 μL buforu ligazy T4 RNA (10x) i 1 μL wody. Alternatywnie dodaj 2 μl buforu ligazy z zestawu TS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwiązanie adaptera 5'.
	<ol>
		<li>Dodaj 1 μl adaptera 5' HD (10 μM; Tabela 1) do probówki PCR o pojemności 200 μl w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 70 °C, a następnie umieścić probówkę bezpośrednio na lodzie.</li>
		<li>Dodać 1 μl 10 mM ATP i 1 μl ligazy T4 RNA 1. Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując. Dodać 3 μl tej mieszaniny do 3' ligowanego RNA z kroku 3.2.9 i wymieszać pipetując. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 28 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja (RT)
	<ol>
		<li>Przenieś 6 μl zligowanego RNA 3' i 5' adaptera do nowej probówki PCR o pojemności 200 μl (pozostałe ~8 μl należy przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania, jeśli to konieczne). Dodać 1 μl startera RT (10 μM; Tabela 1) i wymieszać pipetując. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 70 °C, a następnie umieścić probówkę bezpośrednio na lodzie.</li>
		<li>Dodaj następujące odczynniki do RT: 2 μl 5x buforu pierwszej nici, 0,5 μl 12,5 mM mieszanki dNTP, 1 μl 100 mM DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl odwrotnej transkryptazy (tabela materiałów). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja PCR
	<ol>
		<li>Do 12,5 μl mieszaniny reakcyjnej RT dodać następujące odczynniki: 10 μl buforu polimerazy PCR, 2 μl uniwersalnego startera P5 (10 μM; Tabela 1), 2 μl startera o indeksie P7 (10 μM; Tabela 1), 1 μl 12,5 mM dNTP, 0,5 μl polimerazy DNA (tabela materiałów) i 22 μl wody. Utrzymuj reakcję na lodzie do czasu użycia.</li>
		<li>Uruchom następujący program PCR: 98 °C przez 30 s, 11 cykli (98 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 15 s) i 72 °C przez 10 s. Po zakończeniu utrzymuj reakcję w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Jeśli chodzi o liczbę cykli PCR: zazwyczaj wykonujemy 11 cykli, ale powinno to być zoptymalizowane przez użytkownika. Postaraj się wykonać jak najmniejszą liczbę cykli PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie żelu
	<ol>
		<li>Uruchom 5, 10 i 20 μl produktu PCR na natywnym 6% żelu TBE (patrz Tabela Materiałów) wraz z odpowiednią drabinką (patrz Tabela Materiałów). Uruchom żel przez około 1 godzinę pod napięciem 145 V (do momentu, gdy błękit bromofenolowy dotrze do dna; barwnik ten migruje w pozycji 65 pz).</li>
		<li>Usuń żel i inkubuj z barwnikiem z żelu z kwasem nukleinowym (patrz tabela materiałów) w wodzie przez 10-15 minut.</li>
		<li>Obejrzyj żel na iluminatorze trans "Dark Reader" (zdecydowanie zaleca się unikanie promieniowania UV, ponieważ może to uszkodzić RNA) i wyciąć pasmo biblioteki przy 150 pz. Przygotuj system do elucji RNA z żelu, jak opisano w kroku 1.5 i przenieś kawałek żelu do probówki o pojemności 0,5 ml.</li>
		<li>Wirować w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 2 minuty. Wyjmij probówkę o pojemności 0,5 ml, która powinna być teraz pusta.</li>
		<li>Dodać 300 μl wody wolnej od nukleaz do probówki o pojemności 2 ml zawierającej rozdrobniony żel i obracać przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę rozdrobnionych kawałków żelu w wodzie do kolumny wirowej i wirować przez 2 minuty z maksymalną prędkością.</li>
		<li>Dodać 1 μl (20 μg/μL) glikogenu, 30 μL 3 M NaOAc i 975 μl lodowatego 100% etanolu. Wirować przez 20 minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zawiesić osad w 20 μl 10 mM Tris pH8. Użyj 1 μl do pomiaru stężenia i 1 μl do kontroli jakości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
UWAGA: Opisana poniżej procedura analizy danych jest oparta na systemie operacyjnym Linux Ubuntu 16.04 LTS.
<ol>
	<li>Postępowanie z surowymi plikami sekwencji
	<ol>
		<li>Pobierz plik(i) sekwencji FASTQ wygenerowany podczas sekwencjonowania. W razie potrzeby wykonaj demultipleksowanie za pomocą bcl2fastq2 (wersja V2.2.18.12; instrukcję można pobrać z następującego linku: http://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software/documentation.html). 
		Użyj następującego polecenia: 
		nohup Pathway_of_bcl2fastq/bcl2fastq --runfolder-dir Pathway_of_Run --ignore-missing-bcl --output-dir Pathway_of_Output_Directory --błędy-kodów kreskowych 1 --zagregowane-kafelki AUTO -r 16 -d 16 -p 16 -w 16</li>
		<li>Usuń sekwencje adapterów za pomocą Cutadapt19 wersja 1.15. Instrukcję można pobrać tutaj: https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/guide.html. 
		Użyj następującego polecenia: 
		Pathway_to_cutadapt/cutadapt -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG -n 5 -O 4 -m 10 -j 0 --nextseq-trim 10 -o Output_File_Read1_cutadapt.fastq.gz Input_File_Read1.fastq.gz 
		Zauważ, że sekwencja w poleceniu odpowiada adapterowi 3' HD bez 4 losowych nukleotydów; W związku z tym nie zostaną one usunięte na tym etapie.</li>
		<li>Użyj seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) do usunięcia końcowych losowych nukleotydów w odczytach sekwencjonowania. Użyj następującego polecenia (nazwy zmiennych są pogrubione): 
		seqtk trimfq -b 4 -e 4 Output_File_Read1_cutadapt.fastq > Output_File_Read1_trimmed.fastq</li>
		<li>Użyj następującego polecenia awk, aby odrzucić sekwencje krótsze niż 10 nt: 
		awk 'BEGIN {FS = "\t" ; OFS = "\n"} {nagłówek = $0 ; getline seq ; getline qheader ; getline qseq ; if (length(seq) >= 10) {print header, seq, qheader, qseq}}' Output_File_Read1_trimmed.fastq > Length_Filtered.fastq</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mapowanie przyciętych sekwencji
	<ol>
		<li>Pobierz bazę danych odpowiadającą badanemu organizmowi z miRBazy w następujący sposób. Przejdź do http://www.mirbase.org/ftp.shtml i pobierz plik "mature.fa". Należy pamiętać, że sekwencje są wskazane w notacji RNA. Zastąp pozostałości U przez T za pomocą następującego polecenia: 
		sed -i '/^>/! s/U/T/g' mature.fa 
		UWAGA: W ten sposób uzyskasz pełną listę wszystkich miRNA w miRBazie, pochodzących z różnych organizmów.</li>
		<li>Wybierz sekwencje miRNA interesującego Cię organizmu za pomocą następującego polecenia: 
		awk 'name_of_the_organism{print; nr[NR+1]; następny}; NR w nr' mature.fa > mature_name_of_the_organism_mirs.fa</li>
		<li>Zmapuj odczyty do wyżej utworzonego pliku za pomocą Bowtie220 (wersja 2.3.0), nie dopuszczając żadnych niezgodności. Najpierw utwórz indeks dla pliku za pomocą następującego polecenia: 
		bowtie2-build mature_name_of_the_organism_mirs.fa mature_name_of_the_organism_mirs</li>
		<li>Dopasuj odczyty sekwencjonowania do bazy danych, wymagając, aby odczyt był całkowicie mapowany na miRNA bazy danych, bez żadnych niezgodności. W tym celu użyj następującego narzędzia: 
		muszka2 -N 0 -L 10 --score-min C,0,0 --end-to-end --time -x mature_name_of_the_organism_mirs -U Length_Filtered.fastq -S Length_Filtered_ALIGNMENT.sam 
		UWAGA: Opcja: --score-min C,0,0 zapewnia, że wyrównanie jest bez żadnych niezgodności. Aby uzyskać wyjaśnienie różnych parametrów w narzędziu, odwiedź następującą stronę internetową: http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml</li>
		<li>Aby odrzucić odczyty, które nie zostały wyrównane, użyj następującego polecenia: 
		samtools view -F 4 Length_Filtered_ALIGNMENT.sam > Reads_aligned_to_Mirs.sam 
		UWAGA: W wyniku tych kroków powinieneś teraz uzyskać wyrównane odczyty, odpowiadające miRNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Chang, T. C., Mendell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs+in+vertebrate+physiology+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">microRNAs in vertebrate physiology and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+expression+profiling+by+high-throughput+sequencing%3A+implications+of+enzymatic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation.</a> Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358(2012).</li>
<li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).</li>
<li>Munafo, D. B., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+enzymatic+reaction+conditions+for+generating+representative+pools+of+cDNA+from+small+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA.</a> RNA. 16, 2537-2552 (2010).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17, 1697-1712 (2011).</li>
<li>Sorefan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+ligation+bias+of+small+RNAs+in+libraries+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Silence%22%5BJournal%5D)">Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing.</a> Silence. 3, 4(2012).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bias-reducing+strategy+in+profiling+small+RNAs+using+Solexa%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa.</a> RNA. 17, 2256-2262 (2011).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39, 141(2011).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3%27-adapter+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40, 54(2012).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10, 0126049(2015).</li>
<li>Dard-Dascot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+small+RNA+library+preparation+protocols+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing.</a> BMC Genomics. 19, 118(2018).</li>
<li>Van Nieuwerburgh, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bias+in+Illumina+TruSeq+and+a+novel+post+amplification+barcoding+strategy+for+multiplexed+DNA+and+small+RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing.</a> PLoS One. 6, 26969(2011).</li>
<li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stimulated+ligation%3A+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).</li>
<li>Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+ligation+dependent+artifacts+in+T4+RNA+ligase+to+achieve+high+efficiency+and+low+bias+microRNA+capture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture.</a> PLoS One. 9, 94619(2014).</li>
<li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14, 109(2013).</li>
<li>Barberan-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreasing+miRNA+sequencing+bias+using+a+single+adapter+and+circularization+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach.</a> Genome Biology. 19, 105(2018).</li>
<li>Chen, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+method+for+Illumina+small+RNA-Seq+library+preparation+using+T4+RNA+ligase+1+adenylated+adapters%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters.</a> Plant Methods. 8, 41(2012).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. , (2011).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25(2009).</li>
<li>Shore, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+Library+Preparation+Method+for+Next-Generation+Sequencing+Using+Chemical+Modifications+to+Prevent+Adapter+Dimer+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation.</a> PLoS One. 11, 0167009(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przygotowanie małej biblioteki RNA pozostaje wyzwaniem ze względu na odchylenia, które pojawiają się głównie na etapach ligacji adaptera. RNA z modyfikacją 2'-OMe na końcu 3', takie jak miRNA roślinne, piRNA u owadów, nicieni i ssaków oraz małe interferujące RNA (siRNA) u owadów i roślin, są szczególnie trudne do zbadania, ponieważ modyfikacja 2'-OMe hamuje ligację adaptera 3'. W literaturze zaproponowano szereg rozwiązań mających na celu ulepszenie protokołów przygotowania bibliotek sRNA, ale większość dostępnych na ryn...

Małe RNA (sRNA) biorą udział w kontroli różnorodnych procesów biologicznych1. Eukariotyczne regulatorowe sRNA mają zwykle wielkość od 20 do 30 nt; trzy główne typy to mikroRNA (miRNA), RNA oddziałujące z piwi (piRNA) i małe interferujące RNA (siRNA). Nieprawidłowe poziomy ekspresji miRNA są związane z różnymi chorobami2. Podkreśla to znaczenie miRNA w zdrowiu i chorobie oraz zapotrzebowanie na dokładne, ilościowe narzędzia badawcze do wykrywania sRNA w ogóle.
Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest powszechnie stosowaną metodą badania sRNA. Główne zalety NGS w porównaniu z innymi podejściami, takimi jak ilościowy PCR lub techniki mikromacierzy (qPCR), polegają na tym, że nie wymaga on a priori wiedzy na temat sekwencji sRNA, a zatem może być wykorzystany do odkrywania nowych RNA, a ponadto w mniejszym stopniu cierpi z powodu efektów sygnału tła i nasycenia. Co więcej, może wykrywać różnice między pojedynczymi nukleotydami i ma wyższą przepustowość niż mikromacierze. Jednak NGS ma również pewne wady; Koszt sekwencjonowania pozostaje stosunkowo wysoki, a wieloetapowy proces wymagany do przekształcenia próbki w bibliotekę do sekwencjonowania może powodować błędy systematyczne. W typowym procesie przygotowania biblioteki sRNA, adapter 3' jest najpierw ligowany do sRNA (często oczyszczony żelem z całkowitego RNA) przy użyciu skróconej wersji ligazy RNA 2 (RNL2) i predenylowanego adaptera 3' (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) przy braku ATP. Zwiększa to skuteczność ligacji adaptera sRNA i ogranicza powstawanie reakcji ubocznych, takich jak cyrkularyzacja lub konkategoryzacja sRNA. Następnie adapter 5' jest ligowany przez ligazę RNA 1 (RNL1), a następnie odwrotną transkrypcję (RT) i amplifikację PCR. Wszystkie te kroki mogą wprowadzić bias3,4. W związku z tym odczytane liczby mogą nie odzwierciedlać rzeczywistych poziomów ekspresji sRNA, co prowadzi do sztucznych, zależnych od metody wzorców ekspresji. Określone sRNA mogą być nadreprezentowane lub niedostatecznie reprezentowane w bibliotece, a silnie niedostatecznie reprezentowane sRNA mogą uniknąć wykrycia. Sytuacja jest szczególnie skomplikowana w przypadku roślinnych miRNA, siRNA u owadów i roślin oraz piRNA u owadów, nicieni i ssaków, w których końcowy nukleotyd 3' ma modyfikację 2'-O-metylu (2'-OMe)1. Modyfikacja ta silnie hamuje ligację adaptera 3'5, co sprawia, że przygotowanie biblioteki dla tego typu RNA jest trudnym zadaniem.
Poprzednie prace wykazały, że ligacja adaptera wprowadza poważne odchylenia, ze względu na efekty sekwencji/struktury RNA6,7,8,9,10,11. Etapy następujące po podwiązaniu adaptera, takie jak odwrotna transkrypcja i PCR, nie przyczyniają się znacząco do stronniczości6,11,12. Błąd ligacji jest prawdopodobny ze względu na fakt, że cząsteczki adaptera o danej sekwencji będą oddziaływać z cząsteczkami sRNA w mieszaninie reakcyjnej, tworząc fałdy, co może prowadzić do korzystnych lub niekorzystnych konfiguracji ligacji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Dane z Sorefan et al7 sugerują, że RNL1 preferuje kontekst jednoniciowy, podczas gdy RNL2 preferuje dwuniciowy do ligacji. Fakt, że struktury współfałdowania adaptera/sRNA są determinowane przez określone sekwencje adaptera i sRNA, wyjaśnia, dlaczego określone sRNA są nadreprezentowane lub niedostatecznie reprezentowane w danym zestawie adapterów. Ważne jest również, aby pamiętać, że w serii bibliotek sRNA, które mają być porównywane, należy używać tych samych sekwencji adapterów. Rzeczywiście, wcześniej zaobserwowano, że zmiana adapterów poprzez wprowadzenie różnych sekwencji kodów kreskowych zmienia profile miRNA w bibliotekach sekwencjonowania9,13.
Randomizacja sekwencji adaptera w pobliżu złącza ligacji prawdopodobnie zmniejsza te odchylenia. Sorefan i współpracownicy7 użyli adapterów z 4 losowymi nukleotydami na ich końcach, oznaczonych jako adaptery "High Definition" (HD) i wykazali, że użycie tych adapterów prowadzi do bibliotek, które lepiej odzwierciedlają prawdziwe poziomy ekspresji sRNA. Nowsze prace potwierdziły te obserwacje i ujawniły, że randomizowany region nie musi przylegać do złącza ligacji11. Ten nowatorski typ adapterów został nazwany adapterami "MidRand". Łącznie wyniki te pokazują, że ulepszona konstrukcja adaptera może zmniejszyć odchylenia.
Zamiast modyfikować adaptery, stronniczość może być tłumiona poprzez optymalizację warunków reakcji. Wykazano, że glikol polietylenowy (PEG), makromolekularny środek tłumiący, o którym wiadomo, że zwiększa skuteczność ligacji14, znacznie zmniejsza odchylenie15,16. Na podstawie tych wyników na rynku pojawiło się kilka zestawów "low bias". Należą do nich zestawy, które wykorzystują PEG w reakcjach podwiązywania, w połączeniu z klasycznymi adapterami lub adapterami HD. Inne zestawy całkowicie unikają ligacji i używają poliadenylacji 3' i przełączania szablonów odpowiednio do dodawania adaptera 3' i 5'12. W jeszcze innej strategii, po podwiązaniu adaptera 3' następuje etap cyrkularyzacji, pomijając w ten sposób podwiązanie adaptera 5'17.
W poprzednim badaniu szukaliśmy protokołu przygotowania biblioteki sRNA o najniższym możliwym poziomie odchylenia i najlepszej detekcji 2'-OMe RNAs12. Przetestowaliśmy niektóre z wyżej wymienionych zestawów o "niskim odchyleniu", które miały lepszą detekcję 2'-OMe RNA niż standardowy protokół (TS). Co zaskakujące, po modyfikacji (zastosowanie randomizowanych adapterów, PEG w reakcjach ligacji i usunięcie nadmiaru adaptera 3' przez oczyszczanie) te ostatnie przewyższyły inne protokoły wykrywania RNA 2'-OMe. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół oparty na protokole TS "TS5", który miał najlepszą ogólną detekcję 2'-OMe RNA. Protokół można stosować przy użyciu odczynników z zestawu TS i jednego odczynnika z zestawu "Nf" lub, aby zaoszczędzić pieniądze, przy użyciu odczynników domowej roboty, o jednakowej wydajności. Zapewniamy również szczegółowy protokół oczyszczania sRNA z całkowitego RNA i przygotowania preadenylowanego adaptera 3'.

<table><tbody><tr><td>Przyrząd do bioanalizowania 2100&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4,5 (z IAA, 125:24:1)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-5'-trifosforan (ATP)</td><td>Nex England Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Zestaw DNA o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer Mały zestaw RNA</td><td>Agilent</td><td>5067-1548</td><td></td></tr><tr><td>Filtry probówkowe wirówki Corning Costar Spin-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS8162-96EA</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader transilluminator</td><td>różne dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotStart PCR Kit, z dNTP</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex mały zestaw RNA-seq V3</td><td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-5132-05</td><td>opcjonalnie</td></tr><tr><td>żele Novex TBE 6%</td><td>ThermoFisher</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>Novex TBE Żele mocznikowe 15%</td><td>ThermoFisher</td><td>EC6885BOX</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania nukleotydów QIAquick</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>28304</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw startowy do oznaczania ilościowego Qubit 4</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33227</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania ssDNA Qubit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel RNA (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący żel RNA (2X)</td><td>Inhibitor</td> RNazy <td>ThermoFisher R0641</td><td></td></tr><tr><td>, mysi&nbsp;</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Odwrotna transkryptaza</td><td>ThermoFisher</td><td>18090200</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym</td><td>ThermoFisher</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza RNA 1 (ligaza ssRNA)</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligaza 2, skrócona</td><td>Nex England Biolabs</td><td>M0242S</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 50 pz DNA drabinka</td><td>ThermoFisher</td><td>10488043</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Zestaw do przygotowania małej biblioteki RNA</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012/24/36/48</td><td>opcjonalnie</td></tr><tr><td>UltraPure</td><td>Glycogen ThermoFisher</td><td>10814010</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell</td><td>ThermoFisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>ZR mała drabinka RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R1090</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ostatnie dwie cyfry odpowiadają zestawowi indeksów</td></tr></tbody></table>

poprawa sekwencji małych rna: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-o-metylowych rna

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

Badanie małych RNA (sRNA) za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS) napotyka na problemy z błędami podczas przygotowywania biblioteki. Kilka typów sRNA, takich jak mikroRNA roślinne (miRNA), przenosi modyfikację 2'-O-metylu (2'-OMe) w swoim końcowym nukleotydzie 3'. Ta modyfikacja dodaje kolejną trudność, ponieważ hamuje podwiązanie adaptera 3'. Wcześniej wykazaliśmy, że zmodyfikowane wersje protokołu "TruSeq (TS)" mają mniejsze odchylenie i lepszą detekcję 2'-OMe RNA. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół "TS5", który wykazał się najlepszą ogólną wydajnością. TS5 można stosować przy użyciu odczynników domowej roboty lub odczynników z zestawu TS, z równą wydajnością.

Kluczowymi etapami są izolacja frakcji małego RNA z wyjściowego materiału całkowitego RNA (Rycina 3) oraz pożądany końcowy produkt biblioteki (Rysunek 4). Oba etapy obejmują oczyszczanie za pomocą żelu poliakrylamidowego; małe RNA jest izolowane z 15% żeli TBE z mocznikiem, natomiast końcowe biblioteki są izolowane z 6% natywnych żeli TBE. Małe RNA izolowane z żelu można analizować za pomocą chipa do elektroforezy kapilarnej małych RNA (Tabela materiałów...

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...

Małe RNA regulują wiele procesów biologicznych. Dlatego ważne jest, aby opracować czułe i bezstronne metody ich wykrywania. Nasz protokół protokołu zapewnia kroki naprzód w kierunku tego celu.Nasz protokół cierpi na mniej problemów z błędami systematycznymi niż klasyczne metody przywłaszczania małych bibliotek RNA, a co ważne, pozwala na bardziej czułe wykrywanie dwóch bolców lub mezo-RNA. Takich jak mikro-RNA roślinne. Po ekstrakcji całkowitego RNA zgodnie ze standardowymi protokołami.Uruchom wstępnie żel mocznikowy 15% TBE przez piętnaście minut przy napięciu 200 woltów. I wymieszaj od pięciu do dwudziestu mikrogramów całkowitego RNA w objętości od pięciu do piętnastu mikrolitrów z równą objętością barwnika ładującego formamid w probówce o pojemności 200 mikrolitrów. Po pięciu minutach w temperaturze 65 stopni Celsjusza, w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką, natychmiast umieść probówki na lodzie i załaduj je oraz próbkę do żelu z co najmniej jednym paskiem między nimi.Następnie uruchom żel pod napięciem 200 woltów, aż bromofenol przeniesie się na około dwie trzecie długości żelu. Aby załadować RNA, najpierw przebij spód wolnej od nukleaz mikroprobówki wirówkowej o pojemności 0,5 mililitra igłą o rozmiarze 21 i umieść nakłutą probówkę w dwumililitrowej mikroprobówce wirówkowej bez nukleaz z okrągłym dnem. Następnie inkubuj żel w temperaturze pokojowej z barwnikiem z żelu kwasu nukleinowego w wodzie przez dziesięć do piętnastu minut, zanim obejrzysz żel na transiluminatorze.Wyciąć próbkę RNA między 17 a 29 pasmami drabinki nukleotydowej i przenieść kawałek żelu do przebitej probówki. Odwiruj żel w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez dwie minuty i wyjmij probówkę o pojemności 0,5 mililitra, która powinna być teraz pusta. Do rozdrobnionego żelu dodać 300 mikrolitrów 0,3-molowego chlorku sodu bez nukleaz i umieścić probówkę na rotatorze na co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej.Pod koniec zakończenia inkubacji przenieść zawiesinę rozdrobnionych kawałków żelu do kolumny wirowej i wirować przez dwie minuty z maksymalną prędkością w mikrowirówce. W celu eliminacji nieligowanych trzech głównych adaptorów dokładnie wymieszaj dziesięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz z wyekstrahowaną próbką RNA i dodaj sześć mikrolitrów trzymolowego octanu sodu z mieszaniem. Dodaj 40 mikrolitrów magnetycznych kulek oczyszczających i 60 mikrolitrów izopropanolu do próbki po dokładnym wymieszaniu.I inkubować zawiesinę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umieścić próbkę na stojaku magnetycznym, aż roztwór stanie się klarowny. Usuń klarowny supernatant i dodaj 180 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu do kulek.Po 30 sekundach usuń etanol i krótko zakręć rurką. Usunąć wszelkie resztki płynu, który mógł zebrać się na dnie probówki i pozostawić kulki do wyschnięcia na dwie minuty przed ponownym zawiesieniem próbki w 22 mikrolitrach 10-milimolowych Tris. Po dwóch minutach namagnesuj próbkę, aż roztwór stanie się klarowny.Następnie wymieszaj 20 mikrolitrów klarownego supernatantu z sześcioma mikrolitrami trzymolowego octanu sodu w nowej probówce i dodaj 40 mikrolitrów kulek magnetycznych i 60 mikrolitrów 100% izopropanolu. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej namagnesuj próbkę, aż roztwór stanie się klarowny, przed usunięciem supernatantu. Potraktuj próbkę 180 mikrolitrami świeżo przygotowanego 80% etanolu przez 30 sekund przed usunięciem etanolu, odwirowaniem próbki i usunięciem resztek cieczy, które nagromadziły się na dnie probówki.Po pozostawieniu kulek do wyschnięcia na dwie minuty, ponownie zawiesić je w 10 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz na dwie minuty, przed namagnesowaniem próbki, aż roztwór stanie się klarowny. Następnie przenieś dziewięć mikrolitrów supernatantu do nowej probówki i dodaj jeden mikrolitr buforu ligazy RNA T4 i jeden mikrolitr wody do próbki. W celu oczyszczenia żelu uruchom pięć, dziesięć i dwadzieścia mikrolitrów produktu PCR na natywnym żelu 6% TBE przez około godzinę.Inkubuj gotowy żel z barwieniem żelu kwasu nukleinowego w wodzie przez dziesięć do piętnastu minut i view żel na transiluminatorze, aby umożliwić ekstrakcję pasma biblioteki 150 par zasad. Ponieważ trudno jest wyizolować reprezentujące je pasmo 150 par zasad, są to nasza biblioteka, ze względu na obecność ściśle migrujących produktów ubocznych, będziesz musiał bardzo ostrożnie przeciąć żel. Następnie wyizoluj RNA, jak właśnie pokazano.W celu modyfikacji pliku sekwencji raw pobierz pliki sekwencji fastq wygenerowane podczas sekwencjonowania i w razie potrzeby przygotuj demultipleksowanie za pomocą bcl2fastq2. Usuń sekwencje adapterów za pomocą cutodapt i użyj polecenia, jak pokazano. Użyj seqtk, jak wskazano, aby usunąć końcowe losowe nukleotydy w odczytywanych sekwencjach.Następnie użyj polecenia awk, jak wskazano, aby odrzucić sekwencje krótsze niż 10 nukleotydów. Aby zmapować przycięte sekwencje, otwórz miRBase i pobierz dojrzały plik fa. Użyj polecenia, jak wskazano, aby zastąpić reszty U resztami T, aby uzyskać pełną listę wszystkich mikro RNA w bazie danych, pochodzących z różnych organizmów.Wybierz sekwencje mikro RNA interesującego organizmu, wykonując polecenie zgodnie ze wskazaniami, i zmapuj odczyty do pliku za pomocą bowtie2, nie dopuszczając żadnych niezgodności. Użyj tego narzędzia, aby wyrównać odczytane sekwencje do bazy danych, wymagając, aby odczyt był całkowicie odwzorowywany na mikro RNA bazy danych, bez żadnych niezgodności, jak wskazano. Następnie użyj polecenia, aby odrzucić odczyty, które nie zostały wyrównane.Po załadowaniu na żel coraz większej ilości biblioteki amplifikowanej metodą PCR, jak pokazano, można wyekstrahować produkty odpowiadające oczekiwanemu rozmiarowi. Po elucji oczyszczoną bibliotekę można sprawdzić na chipie do elektroforezy w żelu kapilarnym. Oprócz oczekiwanego iloczynu 150 par zasad i rosnącego udziału 130 gatunków par zasad odpowiadających dimerom adaptera, zwykle obserwuje się wraz z ładowaniem coraz większej ilości produktu PCR.Podobne wyniki uzyskuje się, gdy biblioteki z mieszanki syntetycznych małych RNA są przygotowywane przy użyciu odczynników z zestawów lub innych materiałów. Dla porównania pokazano wcześniej opublikowane wyniki dla tej samej mieszanki małych RNA. W tym miejscu przedstawiono porównanie wydajności protokołu TS5 ze standardowym protokołem TS do wykrywania niezmodyfikowanych ludzkich i dwóch pierwotnych mikro RNA roślinnych modyfikowanych O-metalem.Przetestowano również wykrywanie dwóch pierwotnych zmodyfikowanych O-metalu piRNA w próbkach ludzkich. Jak zaobserwowano, TS5 uformował się znacznie lepiej niż TS do wykrywania dwóch głównych O-metalicznych RNA, ale nie do niezmodyfikowanych RNA. Przygotuj biblioteki replik dla każdej próbki w różnych terminach.Zazwyczaj różnice między replikami wykonanymi jednocześnie są niewielkie, a między bibliotekami przygotowanymi w różnych terminach mogą występować znaczne różnice.

improving-small-rna-seq-less-bias-better-detection-2-o-methyl

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Ten protokół dostarcza badaczom nowego narzędzia do monitorowania wierności transkrypcji w wielu organizmach modelowych.

Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół metody sekwencjonowania opartej na LC-MS, która może być używana jako bezpośrednia metoda sekwencjonowania krótkiego RNA (&lt;35 nt na przebieg) bez pośredniego cDNA, oraz jako ogólna metoda sekwencjonowania różnych modyfikacji nukleotydów w pojedynczym badaniu z precyzją pojedynczej zasady.

2D-HELS MS Seq: Ogólna metoda oparta na LC-MS do bezpośredniego i de novo sekwencjonowania mieszanin RNA z różnymi modyfikacjami nukleotydów

Szybkie wykrywanie i wiarygodna ilościowa identyfikacja zdarzeń edycjonujących RNA na skalę genomową pozostają wyzwaniem i obecnie opierają się na bezpośrednich metodach sekwencjonowania RNA. Opisany tutaj protokół wykorzystuje elektroforezę żelową z gradientem mikrotemperatury (μTGGE) jako prostą, szybką i przenośną metodę wykrywania edycji RNA.

Podejście niesekwencjonujące do szybkiego wykrywania edycji RNA

Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Protokół ten umożliwia początkową kontrolę jakości eksperymentów RNA-seq dla biologów laboratoryjnych z ograniczonym doświadczeniem w bioinformatyce.

Rup (RNA-seq Benchmark Assessment Pipeline) – Kontrola jakości eksperymentów masowych RNA-seq u eukariontów

Poznaj protokół przygotowania bibliotek małych RNA z mniejszym błędem systematycznym i lepszym wykrywaniem 2'-O-metylowych RNA. Metoda zwiększa czułość detekcji i oferuje elastyczność stosowania odczynników domowych lub komercyjnych.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Przeglądaj więcej filmów