Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Małe RNA regulują wiele procesów biologicznych. Dlatego ważne jest, aby opracować czułe i bezstronne metody ich wykrywania. Nasz protokół protokołu zapewnia kroki naprzód w kierunku tego celu.

Nasz protokół cierpi na mniej problemów z błędami systematycznymi niż klasyczne metody przywłaszczania małych bibliotek RNA, a co ważne, pozwala na bardziej czułe wykrywanie dwóch bolców lub mezo-RNA. Takich jak mikro-RNA roślinne. Po ekstrakcji całkowitego RNA zgodnie ze standardowymi protokołami.

Uruchom wstępnie żel mocznikowy 15% TBE przez piętnaście minut przy napięciu 200 woltów. I wymieszaj od pięciu do dwudziestu mikrogramów całkowitego RNA w objętości od pięciu do piętnastu mikrolitrów z równą objętością barwnika ładującego formamid w probówce o pojemności 200 mikrolitrów. Po pięciu minutach w temperaturze 65 stopni Celsjusza, w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką, natychmiast umieść probówki na lodzie i załaduj je oraz próbkę do żelu z co najmniej jednym paskiem między nimi.

Następnie uruchom żel pod napięciem 200 woltów, aż bromofenol przeniesie się na około dwie trzecie długości żelu. Aby załadować RNA, najpierw przebij spód wolnej od nukleaz mikroprobówki wirówkowej o pojemności 0,5 mililitra igłą o rozmiarze 21 i umieść nakłutą probówkę w dwumililitrowej mikroprobówce wirówkowej bez nukleaz z okrągłym dnem. Następnie inkubuj żel w temperaturze pokojowej z barwnikiem z żelu kwasu nukleinowego w wodzie przez dziesięć do piętnastu minut, zanim obejrzysz żel na transiluminatorze.

Wyciąć próbkę RNA między 17 a 29 pasmami drabinki nukleotydowej i przenieść kawałek żelu do przebitej probówki. Odwiruj żel w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez dwie minuty i wyjmij probówkę o pojemności 0,5 mililitra, która powinna być teraz pusta. Do rozdrobnionego żelu dodać 300 mikrolitrów 0,3-molowego chlorku sodu bez nukleaz i umieścić probówkę na rotatorze na co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Pod koniec zakończenia inkubacji przenieść zawiesinę rozdrobnionych kawałków żelu do kolumny wirowej i wirować przez dwie minuty z maksymalną prędkością w mikrowirówce. W celu eliminacji nieligowanych trzech głównych adaptorów dokładnie wymieszaj dziesięć mikrolitrów wody wolnej od nukleaz z wyekstrahowaną próbką RNA i dodaj sześć mikrolitrów trzymolowego octanu sodu z mieszaniem. Dodaj 40 mikrolitrów magnetycznych kulek oczyszczających i 60 mikrolitrów izopropanolu do próbki po dokładnym wymieszaniu.

I inkubować zawiesinę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umieścić próbkę na stojaku magnetycznym, aż roztwór stanie się klarowny. Usuń klarowny supernatant i dodaj 180 mikrolitrów świeżo przygotowanego 80% etanolu do kulek.

Po 30 sekundach usuń etanol i krótko zakręć rurką. Usunąć wszelkie resztki płynu, który mógł zebrać się na dnie probówki i pozostawić kulki do wyschnięcia na dwie minuty przed ponownym zawiesieniem próbki w 22 mikrolitrach 10-milimolowych Tris. Po dwóch minutach namagnesuj próbkę, aż roztwór stanie się klarowny.

Następnie wymieszaj 20 mikrolitrów klarownego supernatantu z sześcioma mikrolitrami trzymolowego octanu sodu w nowej probówce i dodaj 40 mikrolitrów kulek magnetycznych i 60 mikrolitrów 100% izopropanolu. Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej namagnesuj próbkę, aż roztwór stanie się klarowny, przed usunięciem supernatantu. Potraktuj próbkę 180 mikrolitrami świeżo przygotowanego 80% etanolu przez 30 sekund przed usunięciem etanolu, odwirowaniem próbki i usunięciem resztek cieczy, które nagromadziły się na dnie probówki.

Po pozostawieniu kulek do wyschnięcia na dwie minuty, ponownie zawiesić je w 10 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz na dwie minuty, przed namagnesowaniem próbki, aż roztwór stanie się klarowny. Następnie przenieś dziewięć mikrolitrów supernatantu do nowej probówki i dodaj jeden mikrolitr buforu ligazy RNA T4 i jeden mikrolitr wody do próbki. W celu oczyszczenia żelu uruchom pięć, dziesięć i dwadzieścia mikrolitrów produktu PCR na natywnym żelu 6% TBE przez około godzinę.

Inkubuj gotowy żel z barwieniem żelu kwasu nukleinowego w wodzie przez dziesięć do piętnastu minut i view żel na transiluminatorze, aby umożliwić ekstrakcję pasma biblioteki 150 par zasad. Ponieważ trudno jest wyizolować reprezentujące je pasmo 150 par zasad, są to nasza biblioteka, ze względu na obecność ściśle migrujących produktów ubocznych, będziesz musiał bardzo ostrożnie przeciąć żel. Następnie wyizoluj RNA, jak właśnie pokazano.

W celu modyfikacji pliku sekwencji raw pobierz pliki sekwencji fastq wygenerowane podczas sekwencjonowania i w razie potrzeby przygotuj demultipleksowanie za pomocą bcl2fastq2. Usuń sekwencje adapterów za pomocą cutodapt i użyj polecenia, jak pokazano. Użyj seqtk, jak wskazano, aby usunąć końcowe losowe nukleotydy w odczytywanych sekwencjach.

Następnie użyj polecenia awk, jak wskazano, aby odrzucić sekwencje krótsze niż 10 nukleotydów. Aby zmapować przycięte sekwencje, otwórz miRBase i pobierz dojrzały plik fa. Użyj polecenia, jak wskazano, aby zastąpić reszty U resztami T, aby uzyskać pełną listę wszystkich mikro RNA w bazie danych, pochodzących z różnych organizmów.

Wybierz sekwencje mikro RNA interesującego organizmu, wykonując polecenie zgodnie ze wskazaniami, i zmapuj odczyty do pliku za pomocą bowtie2, nie dopuszczając żadnych niezgodności. Użyj tego narzędzia, aby wyrównać odczytane sekwencje do bazy danych, wymagając, aby odczyt był całkowicie odwzorowywany na mikro RNA bazy danych, bez żadnych niezgodności, jak wskazano. Następnie użyj polecenia, aby odrzucić odczyty, które nie zostały wyrównane.

Po załadowaniu na żel coraz większej ilości biblioteki amplifikowanej metodą PCR, jak pokazano, można wyekstrahować produkty odpowiadające oczekiwanemu rozmiarowi. Po elucji oczyszczoną bibliotekę można sprawdzić na chipie do elektroforezy w żelu kapilarnym. Oprócz oczekiwanego iloczynu 150 par zasad i rosnącego udziału 130 gatunków par zasad odpowiadających dimerom adaptera, zwykle obserwuje się wraz z ładowaniem coraz większej ilości produktu PCR.

Podobne wyniki uzyskuje się, gdy biblioteki z mieszanki syntetycznych małych RNA są przygotowywane przy użyciu odczynników z zestawów lub innych materiałów. Dla porównania pokazano wcześniej opublikowane wyniki dla tej samej mieszanki małych RNA. W tym miejscu przedstawiono porównanie wydajności protokołu TS5 ze standardowym protokołem TS do wykrywania niezmodyfikowanych ludzkich i dwóch pierwotnych mikro RNA roślinnych modyfikowanych O-metalem

Przetestowano również wykrywanie dwóch pierwotnych zmodyfikowanych O-metalu piRNA w próbkach ludzkich. Jak zaobserwowano, TS5 uformował się znacznie lepiej niż TS do wykrywania dwóch głównych O-metalicznych RNA, ale nie do niezmodyfikowanych RNA. Przygotuj biblioteki replik dla każdej próbki w różnych terminach.

Zazwyczaj różnice między replikami wykonanymi jednocześnie są niewielkie, a między bibliotekami przygotowanymi w różnych terminach mogą występować znaczne różnice.