Name: Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do oceny potencjału błony mitochondrialnej w komórkach macierzystych krwi z wykorzystaniem barwnika TMRM i werapamilu. Protokół poprawia dokładność pomiarów poprzez hamowanie pomp wypływowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wszystkim członkom laboratorium Ito, szczególnie K. Ito i H. Sato, a także Einstein Stem Cell Institute za komentarze, a także Einstein Flow Cytometry and Analytical Imaging (finansowane przez National Cancer Institute grant P30 CA013330) za pomoc w przeprowadzaniu eksperymentów. K.I. jest wspierany przez granty z National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 i R01DK100689) oraz Departament Zdrowia Stanu Nowy Jork jako główny dyrektor Einstein Single-Cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. Ito jest pracownikiem naukowym Towarzystwa Białaczki i Chłoniaka.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Albert Einstein College of Medicine.
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Bufor barwiący (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 2% płodowa surowica bydlęca (FBS)): Dodać 10 ml FBS do 500 ml sterylnego roztworu PBS. 
	nuta: Roztwór ten może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez co najmniej jeden miesiąc w sterylnym stanie. Przed przystąpieniem do poniższych procedur należy umieścić podwielokrotność tego roztworu (50 ml) na lodzie.</li>
	<li>Bufor do lizacji ACK (chlorek amonu i potasu): Przed rozpoczęciem procedury umieścić podwielokrotność buforu lizującego ACK (1 ml) na lodzie. 
	nuta: Aby przygotować ten sam bufor niedostępny w handlu, rozpuść 8,02 g NH4Cl, 1 gKHCO3 i 37,2 mg Na2EDTA w 1 l H2O. Dostosuj pH do 7,2-7,4. Przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pożywka hodowlana: Dodać 50 ng/ml czynnika komórek macierzystych (SCF) i 50 ng/ml trombopoetyny (TPO) do pożywki wolnej od surowicy w celu hodowli i namnażania komórek krwiotwórczych (zalecana jest patrz tabela materiałów dla pożywki komercyjnej).</li>
	<li>Roztwór podstawowy TMRM: Przygotować roztwór TMRM (1 μM), rozpuszczając 5 μg proszku TMRM w 10 ml etanolu. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Roztwór podstawowy werapamilu: Przygotować roztwór werapamilu (50 mM), rozcieńczając 24 mg werapamilu w 1 ml etanolu. Przechowywać ten roztwór w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Roztwór podstawowy FCCP: Przygotować roztwór p-triflouromethoxyfenylhydrazonu karbonilocyjanku (FCCP) (1 M), rozpuszczając 254 mg w 1 ml etanolu. Roztwór należy przechowywać w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem.</li>
</ol>
2. Izolacja szpiku kostnego
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i spryskaj myszy 70% etanolem. 
	nuta: Ten etap zapobiega zanieczyszczeniu komórek będących przedmiotem zainteresowania bez uszczerbku dla wyników eksperymentalnych.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy i ostrych nożyczek wykonaj małe nacięcie w brzusznej skórze myszy i rozciągnij skórę.</li>
	<li>Wyciągnij kość udową i piszczelową, uważając, aby nie przesunąć głów kości udowej, ponieważ zawierają one dużą ilość komórek szpiku kostnego. Umieść usunięte kości na 6-dołkowej płytce wypełnionej 1,5 ml buforu barwiącego. 
	nuta: Ta procedura nie wymaga sterylnego obszaru.</li>
	<li>Usuń mięśnie z kości i odetnij końce kości, umożliwiając wyjście szpiku kostnego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Umieść oczyszczone kości w nowych studzienkach z 1,5 ml buforu barwiącego. 
	nuta: Mięśnie i inne tkanki należy ostrożnie usunąć, aby uniknąć zatkania strzykawki w następnym kroku.</li>
	<li>Wypłukać szpik kostny za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml z igłą 25 G. 
	nuta: Kontynuuj płukanie szpiku kostnego, aż kość stanie się biała (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Zebrać wszystkie komórki do probówki o pojemności 1,5 ml, odwirować przez 5 minut przy 180 x g, a następnie wyrzucić supernatant (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 300 μl lodowatego buforu lizującego ACK bardzo ostrożnie, umieścić na lodzie na 1 minutę i natychmiast nieaktywną lizę, dodając 1 ml buforu barwiącego. Wirować przez 5 minut przy 180 x g. 
	nuta: Kulka komórek wydaje się biała (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Całkowita liczba izolowanych komórek wynosi około 2-4 x 107.</li>
	<li>Ponownie zawiesić granulki w 1 ml buforu barwiącego i przefiltrować za pomocą nasadki sitka (12 x 75 mm2, 5 ml pojemności) z wbudowaną siatką nylonową o grubości 35 μm w celu uzyskania komórek jednojądrzastych. Po zablokowaniu należy utrzymać próbkę na lodzie.</li>
</ol>
3. Barwienie immunologiczne do wykrywania HSC
<ol>
	<li>Przygotuj koktajl Lineage (Lin). Do 400 μl buforu barwiącego dodać 4 μl następujących biotynilowanych przeciwciał przeciwko CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk1.1, IgM i Il7Ra, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:100.</li>
	<li>Przygotuj przeciwciała sprzężone z fluoroforami (Abs). Do 400 μl buforu barwiącego dodać 4 μl następujących Abs, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:100. Streptawidyna-Błękit pacyficzny, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy5.5 i CD34-FITC. Przechowywać w lodowi, chronić przed światłem.</li>
	<li>Odwirować próbkę przez 5 minut przy sile 180 x g, a następnie odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodaj 400 μl roztworu koktajlu Lin do osadu komórek. Szybko dodaj 4 μl biotynilizowanego Ab. Vortex do mieszania i inkubacji przez 30 minut w lodzie.</li>
	<li>Przemyć próbkę, dodając 3 ml buforu barwiącego, odwirowywać przez 5 minut w temperaturze 180 x g i odrzucić sklarowany osad.</li>
	<li>Dodać 400 μl roztworu Abs. Szybko wirować, aby wymieszać i inkubować przez 30 minut na lodzie.</li>
	<li>Przemyć próbki 3 ml buforu barwiącego, wirować przez 5 minut w temperaturze 180 x g i odrzucić supernatant.</li>
</ol>
4. Barwienie TMRM
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór barwiący TMRM. Dodać 2,2 μl roztworu podstawowego TMRM i 1,1 μl Werapamilu (odpowiednio 2 nM i 50 μM jako stężenie końcowe) do 1,1 ml pożywki wolnej od surowicy do hodowli i ekspansji komórek krwiotwórczych (zalecana jest tabela materiałów dla pożywki handlowej) z TPO i SCF. 
	nuta: Jest to najważniejszy krok protokołu. Dodatek werapamilu jest konieczny do zablokowania pomp wypływowych, które są silnie eksprymowane w HSC i mogą wytłaczać TMRM.</li>
	<li>Zawiesić szpik kostny w 1 ml roztworu barwiącego TMRM, szybko przetrząsnąć i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. 
	nuta: Barwienia TMRM nie mogą być zmywane. Dedykowana dla PE kontrola kompensacyjna jest również ponownie zawieszana w 100 μl roztworu barwiącego TMRM i poddawana inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C po szybkim wirowaniu.</li>
	<li>Przefiltrować próbkę za pomocą nasadki z sitkiem (12 x 75 mm2, 5 ml pojemności) z wbudowaną siatką nylonową o grubości 35 μm, aby uniknąć zatkania cytometru przepływowego. 
	nuta: Barwienie TMRM zwiększa możliwość tworzenia się zatkania w próbce. Zalecana jest filtracja próbki tuż przed testami przepływu.</li>
	<li>Dodać 1 μl 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI), aby wykluczyć martwe komórki za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
5. Akwizycja za pomocą cytometru przepływowego
<ol>
	<li>Uruchom próbkę szpiku kostnego i uzyskaj co najmniej 1 x 106 zdarzeń.</li>
	<li>Ustaw strategię bramkowania, aby zidentyfikować różne populacje krwiotwórcze (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
	<ol>
		<li>Wyświetlić żywe komórki jednojądrzaste szpiku kostnego (BM-MNC), frakcja DAPI−, na wykresie dla Pacific Blue w celu identyfikacji frakcji CD135−Lin− (Lin−) i Lin+.</li>
		<li>Wykreśl frakcję Lin− dla APC/Cy7 (c-kit) w porównaniu z PE/Cy7 (Sca-1), aby zidentyfikować frakcję multipotencjalnych progenitorów (MPP), jako c-kit+ i Sca-1+.</li>
		<li>Wykreśl frakcję MPP dla APC (CD48) w porównaniu z PerCP/Cy5.5 (CD150), aby zidentyfikować frakcję HSC, jako CD150+ i CD48−.</li>
		<li>Wyświetl frakcję HSC dla FITC (CD34), aby podzielić CD34−-HSC i CD34+-HSC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj intensywność TMRM (kanał PE) w każdej populacji.</li>
	<li>Po pobraniu dodać do próbki 1 μl FCCP w celu uzyskania końcowego stężenia 1 mM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, a następnie uzyskać 1 x 10 6 zdarzeń. 
	nuta: FCCP to rozprzęgacz mitochondrialny, który służy do rozpraszania ΔΨm. Jest stosowany jako kontrola eksperymentalna w celu potwierdzenia, że barwienie TMRM działa prawidłowo. Po podaniu FCCP intensywność TMRM powinna zostać drastycznie zmniejszona (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Przeanalizuj dane normalizujące średnią intensywność PE w każdej populacji przez intensywność PE wszystkich BM-MNC.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells%3A+origins%2C+phenotypes%2C+lineage+commitments%2C+and+transdifferentiations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).</li>
<li>Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+in+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms in stem cell biology.</a> Cell. 88 (3), 287-298 (1997).</li>
<li>Wilson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+reversibly+switch+from+dormancy+to+self-renewal+during+homeostasis+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair.</a> Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell%3A+keystone+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+and+a+stepping-stone+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine.</a> Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).</li>
<li>Ito, K., Bonora, M., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+as+master+of+hematopoietic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate.</a> International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+a+purified+Tie2%2B+hematopoietic+stem+cell+population+relies+on+mitochondrial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance.</a> Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).</li>
<li>Bonora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+synthesis+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">ATP synthesis and storage.</a> Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+catalysis+in+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation of catalysis in ATP synthase.</a> Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-potential+compensation+reveals+mitochondrial+volume+expansion+during+HSC+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment.</a> Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).</li>
<li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).</li>
<li>Spangrude, G. J., Johnson, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+and+activated+subsets+of+mouse+multipotent+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).</li>
<li>Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABCG2+transporter+is+an+efficient+Hoechst+33342+efflux+pump+and+is+preferentially+expressed+by+immature+human+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors.</a> Blood. 99 (2), 507-512 (2002).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li>
<li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, 13125(2016).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+lacking+Ott1+display+aspects+associated+with+aging+and+are+unable+to+maintain+quiescence+during+proliferative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress.</a> Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+imaging+of+mitochondrial+structure+and+function+during+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury.</a> Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cyclophilin+with+the+mitochondrial+inner+membrane+and+regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+and+cyclosporin+A-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).</li>
<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomiar potencjału błony mitochondrialnej jest podstawą analizy i oceny mitochondriów, które mają kluczowe znaczenie dla stanu metabolicznego komórki. W tym miejscu opisujemy protokół analizy ΔΨm za pomocą barwienia TMRM. TMRM jest barwnikiem fluorescencyjnym przenikającym komórkę, który gromadzi się w aktywnych mitochondriach dzięki ΔΨm, a jego odpowiednie poziomy pozostają w równowadze między przedziałami zewnątrzkomórkowymi, cytoplazmatycznymi i mitochondrialnymi10. Protokół ten można dostosować...

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) są samoodnawiające się, multipotencjalne i zdolne do powstania wszystkich komórek krwi1,2. Metabolizm komórkowy jest kluczowym regulatorem utrzymania HSC, wraz z czynnikami transkrypcyjnymi, sygnałami wewnętrznymi i mikrośrodowiskiem3,4,5. Właściwa kontrola funkcji i jakości mitochondriów ma zatem kluczowe znaczenie dla utrzymania HSC6,7.
Potencjał błony mitochondrialnej (ΔΨm) jest kluczowym parametrem w ocenie mitochondriów, ponieważ bezpośrednio odzwierciedla ich funkcjonalność, która wynika z równowagi aktywności pompowania protonów w łańcuchu transportu elektronów i przepływu protonów przez syntazę F1/F O ATP. Oba te czynniki są wymagane (w zależności od ekspresji genów i dostępności substratu) do zależnej od tlenu fosforylacji ADP do ATP8,9. Wykorzystując elektroujemność przedziału mitochondrialnego, opracowano różne barwniki potencjometryczne do pomiaru ΔΨm. Jednym z nich jest nadchloran estru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM), który jest szeroko stosowany do pomiaru ΔΨm za pomocą cytometrii przepływowej w różnych komórkach10, w tym w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych11.  
Barwniki mitochondrialne muszą być jednak używane z pewną ostrożnością w HSC, ponieważ wysoka aktywność ksenobiotycznych pomp wypływowych tych komórek może spowodować wytłaczanie barwnika12. Rzeczywiście, ekstruzja barwników mitochondrialnych, takich jak Rhodamine 123, pozwoliła naukowcom wyizolować HSCs13 lub zidentyfikować "populacje boczne" HSC, wykorzystując różnicową ekstruzję barwników Hoechst Blue i Hoechst Red14,15. Wykazano również, że Fumitremorgina C, specyficzny bloker transportera podrodziny G członka 2 (ABCG2) wiążącej ATP, nie wpływa na wzór barwienia MitoTracker w HSPCs16. Po opublikowaniu tych wyników przeprowadzono wiele badań z użyciem barwników mitochondrialnych przy braku ksenobiotycznych inhibitorów pompy wypływowej, co doprowadziło do powszechnego wrażenia, że HSC mają tylko niewielką liczbę mitochondriów o niskim ΔΨm16,17,18.
Ostatnio wykazano jednak, że Verapamil, inhibitor pomp wypływowych o szerokim spektrum działania, znacząco modyfikuje wzór barwienia barwnika mitochondrialnego MitoTracker Green19. Ta rozbieżność jest prawdopodobnie spowodowana faktem, że Fumitremorgina C jest wysoce selektywna dla Abcg2, podczas gdy HSC wyrażają również inne transportery, takie jak Abcb1a (który jest tylko słabo wrażliwy na Fumitremorginę C)19. Informowaliśmy również, że inne barwniki mitochondrialne, takie jak TMRM, oranż nonylowo-akrydynowy i Mitotracker Orange (MTO) wykazują takie same wzorce jak Mitotracker Green. Co ważniejsze, zaobserwowaliśmy, że wzorce cytometrii przepływowej HSPC odzwierciedlają ich ΔΨm oprócz masy mitochondrialnej11.
Spożycie barwnika TMRM ściśle zależy od ujemnego ładunku mitochondriów, ale wynikowa akumulacja barwnika jest w stałej równowadze między jego pobraniem a klirensem przez pompy wypływu20. Różnica w ekspresji ksenobiotycznej pompy wypływowej między HSC a populacjami dojrzałych komórek wpływa na tę równowagę i może prowadzić do stronniczych wyników. Stosowanie dedykowanych inhibitorów, takich jak Werapamil, powinno być brane pod uwagę w analizie ΔΨm za pomocą barwników potencjometrycznych. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowany protokół dokładnego pomiaru ΔΨm za pomocą cytometrii przepływowej opartej na TMRM, która koryguje aktywność transportera ksenobiotyków poprzez zastosowanie dedykowanych inhibitorów.

<table><tbody><tr><td>Bufor lizujący ACK</td><td>Life Technologies</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>B220-biotyna</td><td>BD Bioscience</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD3e-biotyna</td><td>Life Technologies</td><td>13-0031-85</td><td></td></tr><tr><td>CD4-biotyna</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-biotyna</td> Life <td>Technologies</td><td>13-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-biotyna</td><td>BD Bioscience</td><td>553309</td><td></td></tr><tr><td>CD19-biotyna</td><td>BD Bioscience</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0341-85</td><td></td></tr><tr><td>CD48-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0481-82</td><td></td></tr><tr><td>CD135-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-1351-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-PerCP/Cy5.5&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>115922</td><td></td></tr><tr><td>c-kit-APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>Cyklosporyna H</td><td>Milipore Sigma</td><td>SML1575-1 MG</td><td></td></tr><tr><td>roztwór DAPI (1 mg / ml)</td><td>Life Technologies</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FCCP Millipore Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Gr1-biotyna</td><td>Biolegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>IgM-biotyna</td><td>Life Technologies</td><td>13-5790-85</td><td></td></tr><tr><td>Il7R&alfa;-biotyna</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td></td></tr><tr><td>Nk1.1-biotyna</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553163</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sca-1-PE/Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-5981-81</td><td></td></tr><tr><td>SCF mysi</td><td>PEPROTECH</td><td>250-03-10UG</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM medium</td><td>STEMCELL technologies</td><td>9605</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-Pacific Blue</td><td>eBioscience</td><td>48-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>Ter119-biotyna</td><td>Fischer Scientific</td><td>BDB553672</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5428-25MG</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>315-14-10UG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek werapamilu</td><td>Millipore Sigma</td><td>V4629-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych

Improving the Accuracy of Flow Cytometric Assessment of Mitochondrial Membrane Potential in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Through the Inhibition of Efflux Pumps

Ponieważ metabolizm komórkowy jest kluczowym regulatorem samoodnawiania się hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), różne role odgrywane przez mitochondria w homeostazie hematopoetycznej były intensywnie badane przez badaczy HSC. Poziomy aktywności mitochondriów znajdują odzwierciedlenie w ich potencjałach błonowych (ΔΨm), które można mierzyć za pomocą barwników kationowych przenikających komórkę, takich jak TMRM (tetrametylodamina, ester metylowy). Zdolność pomp wypływowych do wytłaczania tych barwników z komórek może jednak ograniczać ich użyteczność. Wynikający z tego błąd systematyczny pomiaru jest szczególnie istotny przy ocenie HSC, ponieważ transportery ksenobiotyków wykazują wyższy poziom ekspresji i aktywności w HSC niż w komórkach zróżnicowanych. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący werapamil, inhibitor pompy odpływowej, do dokładnego pomiaru ΔΨm w wielu populacjach szpiku kostnego. Wykazano, że wynikające z tego zahamowanie aktywności pompy zwiększa intensywność TMRM w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC), pozostawiając ją stosunkowo niezmienioną w dojrzałych frakcjach. Podkreśla to zwrócenie szczególnej uwagi na aktywność wypływu barwnika, która jest wymagana, gdy stosowane są barwniki zależne od ΔΨm, a jak napisano i zwizualizowano, protokół ten może być wykorzystany do dokładnego porównania różnych populacji w szpiku kostnym lub tej samej populacji w różnych modelach eksperymentalnych.

Opisany powyżej protokół umożliwia łatwą izolację BM-MNCs z modelu mysiego. Rysunek 1 podsumowuje główne etapy procedury: izolację kości, wypłukiwanie szpiku kostnego, lizę erytrocytów oraz barwienie przeciwciałami, po którym następuje barwienie TMRM w celu pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w konkretnej populacji hematopoetycznej.
BM-MNC zawierają kilka populacji komórek, w tym HSC. Koktajle przeciwciał stosowane w niniejszym protokole są dobrze ugruntowan...

Ksenobiotyczne pompy wypływowe są bardzo aktywne w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) i powodują ekstruzję TMRM, barwnika fluorescencyjnego o potencjale błony mitochondrialnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół do dokładnego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w HSPC za pomocą TMRM w obecności Werapamilu, inhibitora pompy wypływowej.

Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych

As cellular metabolism is a key regulator of hematopoietic stem cell (HSC) self-renewal, the various roles played by the mitochondria in hematopoietic ...

Funkcja mitochondriów ma kluczowe znaczenie dla samoodnawiania się hematopoetycznych komórek macierzystych. Aktywność mitochondriów jest reflektorem wewnętrznego potencjału błony mitochondrialnej, który można zmierzyć za pomocą TMRM, fluorescencyjnego barwnika kationowego przenikającego komórkę. Ksenobiotyczne pompy wypływowe są wysoce aktywne w HSC i powodują ekstruzję TMRM.Główną zaletą tego protokołu jest korekta tego efektu z wykorzystaniem Werapamilu, inhibitora pomp wypływowych. Zacznij od wyizolowania szpiku kostnego z kości udowych myszy. Użyj kleszczy i ostrych nożyczek, aby przeciąć dwie tylne łapy.Następnie wykonaj małe nacięcie w brzusznej skórze myszy i rozciągnij ją. Wyciągnij kość udową i piszczelową, uważając, aby nie usunąć głów kości udowej, a kości umieść na sześciodołkowej płytce, wypełnionej 1,5 mililitra buforu barwiącego. Usuń mięśnie z kości i odetnij końce kości, umożliwiając wydostanie się szpiku kostnego.Umieść oczyszczone kości w nowych studzienkach z 1,5 mililitra buforu barwiącego. Następnie wypłucz szpik kostny trzymililitrową strzykawką i igłą o rozmiarze 25, aż kość stanie się biała. Zbierz wszystkie komórki w probówce o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj je przez pięć minut w temperaturze 180 razy G, a następnie wyrzuć supernatant.Ostrożnie ponownie zawieś granulki w 300 mikrolitrach lodowatego buforu lizującego ACK i umieść komórki na lodzie na jedną minutę. Następnie natychmiast dezaktywuj lizę, dodając jeden mililitr buforu barwiącego. Wirować komórki przez pięć minut w temperaturze 180 razy G. Ponownie zawiesić osad komórek, który powinien wydawać się biały, w jednym mililitrze buforu barwiącego.Przefiltrować komórki za pomocą nasadki sitka komórkowego z nylonową siatką o grubości 35 mikrometrów, aby uzyskać komórki jednojądrzaste. Zacznij od przygotowania koktajlu linii i przeciwciał sprzężonych z fluoroforem, zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Utrzymuj przeciwciała na lodzie i chroń przed światłem.Następnie odwirować próbkę przez pięć minut w temperaturze 180 razy G i odrzucić supernatant. Dodaj 400 mikrolitrów koktajlu linii i cztery mikrolitry biotynylowanych przeciwciał CD135 do osadu komórkowego i zwiruj mieszaninę. Następnie inkubuj go na lodzie przez 30 minut.Po inkubacji umyć próbkę, dodając trzy mililitry buforu barwiącego, obracając go przez pięć minut przy 180 razy G i odrzucając supernatant. Następnie dodaj 400 mikrolitrów roztworu przeciwciał i zwiruj mieszaninę. Inkubuj go na lodzie przez kolejne 30 minut i powtórz mycie z buforem barwiącym.Aby przygotować roztwór barwiący TMRM, dodaj 2,2 mikrolitra roztworu podstawowego TMRM i 1,1 mikrolitra werapamilu do 1,1 mililitra pożywki do hodowli krwiotwórczych bez surowicy z trombopoetyną i czynnikiem komórek macierzystych. Ponownie zawiesić szpik kostny w jednym mililitrze roztworu barwiącego TMRM, szybko wirować i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przefiltrować próbkę za pomocą nasadki sitowej z siatką nylonową o grubości 35 mikrometrów, aby uniknąć zatkania cytometru przepływowego.Następnie dodaj jeden mikrolitr DAPI i kontynuuj cytometrię przepływową. Uruchom próbkę szpiku kostnego i uzyskaj co najmniej milion zdarzeń. Następnie wyświetl żywe komórki jednojądrzaste szpiku kostnego na wykresie dla błękitu pacyficznego, aby zidentyfikować frakcje Lin-ujemne i Lin-dodatnie CD135.Wykreślić frakcję Lin-ujemną dla APC/Cy7 w porównaniu z PE/Cy7, aby zidentyfikować multipotencjalny progenitor lub frakcję MPP. Następnie wykreśl frakcję MPP dla APC w porównaniu z PerCP/Cy5.5, aby zidentyfikować frakcję hematopoetycznych komórek macierzystych lub frakcji HSC. Wyświetl frakcję HSC dla FITC lub CD34, aby podzielić ją na ujemne frakcje HSC CD34 i dodatnie frakcje HSC CD34.Na koniec uzyskaj intensywność TMRM w każdej populacji. Aby upewnić się, że barwienie TMRM zadziałało prawidłowo, dodaj jeden mikrolitr FCCP do próbki, aby uzyskać końcowe stężenie jednego milimola i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie zdobądź milion wydarzeń.Po dodaniu FCCP intensywność TMRM powinna zostać drastycznie zwiększona. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej w różnych populacjach komórek za pomocą barwnika TMRM. Wykazano, że obecność PBS i FBS w pożywce hodowlanej wpływa na intensywność sygnału TMRM.Dlatego ważne jest, aby wykonać barwienie TMRM w podłożu ekspandującym bez surowicy. Hematopoetyczne komórki macierzyste wyrażają wysoki poziom aktywności ksenobiotycznych pomp wypływowych, które wytłaczają barwnik TMRM. Tak więc profile TMRM różnią się również w obecności werapamilu lub cyklosporyny H, które blokują pompy.Aby zweryfikować dokładność barwienia TMRM, FCCP może polegać na depolaryzacji mitochondriów i zmniejszeniu intensywności TMRM. Protokół ten można łatwo dostosować do badania HSC z innym barwnikiem potencjału błony mitochondrialnej, w tym TMRE lub JC-1. A także inne barwniki mitochondrialne, takie jak MitoTracker lub MitoSOX.Dopiero niedawno zwrócono uwagę na krytyczne problemy dziedziczone przez różną aktywność pomp wypływowych w populacji szpiku kostnego. Tak więc ten protokół ma na celu zmniejszenie rozbieżności między wcześniejszymi ustaleniami.

improving-accuracy-flow-cytometric-assessment-mitochondrial-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwnik JC-1 do oceny potencjału błony mitochondrialnej komórek po wystawieniu na hipoksję/reoksygenację z lub bez środka ochronnego.

Test oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w miocytach serca po niedotlenieniu/reoksygenacji

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

Hematopoetyczne komórki progenitorowe (HSPC) przechodzą ze stanu spoczynku do stanu różnicowania dzięki ich plastyczności metabolicznej podczas tworzenia krwi. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę pomiaru oddychania mitochondrialnego i glikolizy HSPC.

Analiza metabolizmu krwiotwórczych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy wiarygodną metodę pomiaru masy mitochondriów i potencjału błonowego w hodowanych ex vivo hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T.

Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej

Adaptacja metaboliczna jest fundamentalna dla limfocytów T, ponieważ decyduje o różnicowaniu, trwałości i cytotoksyczności. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół monitorowania oddychania mitochondrialnego w ludzkich pierwotnych limfocytach T różnicowanych ex vivo cytokinami.

Monitorowanie oddychania mitochondrialnego w ludzkich pierwotnych limfocytach T różnicowanych cytokinami

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Ta technika opisuje efektywny przepływ pracy do wizualizacji i ilościowego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych w komórkach HeLa za pomocą obrazowania na żywo opartego na fluorescencji.

Kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej i poziomów ponadtlenkowych na podstawie fluorescencji przy użyciu obrazowania na żywo w komórkach HeLa

Metody badania bioenergetyki mitochondriów pod fizjologicznie istotnymi stężeniami substratów w komórkach odpornościowych są ograniczone. Zapewniamy szczegółowy protokół, który wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian w odpowiedzi potencjału błony mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w ludzkich limfocytach T, monocytach i obwodowych komórkach jednojądrzastych.

Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do oceny potencjału błony mitochondrialnej w komórkach macierzystych krwi z wykorzystaniem barwnika TMRM i werapamilu. Protokół poprawia dokładność pomiarów poprzez hamowanie pomp wypływowych.

Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych (Wideo) | JoVE Journal

Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych

Przeglądaj więcej filmów