Poprawa dokładności cytometrycznej oceny potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych poprzez hamowanie pomp wypływowych
30 lipca 2019
Ksenobiotyczne pompy wypływowe są bardzo aktywne w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) i powodują ekstruzję TMRM, barwnika fluorescencyjnego o potencjale błony mitochondrialnej. W tym miejscu przedstawiamy protokół do dokładnego pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w HSPC za pomocą TMRM w obecności Werapamilu, inhibitora pompy wypływowej.
Funkcja mitochondriów ma kluczowe znaczenie dla samoodnawiania się hematopoetycznych komórek macierzystych. Aktywność mitochondriów jest reflektorem wewnętrznego potencjału błony mitochondrialnej, który można zmierzyć za pomocą TMRM, fluorescencyjnego barwnika kationowego przenikającego komórkę. Ksenobiotyczne pompy wypływowe są wysoce aktywne w HSC i powodują ekstruzję TMRM.
Główną zaletą tego protokołu jest korekta tego efektu z wykorzystaniem Werapamilu, inhibitora pomp wypływowych. Zacznij od wyizolowania szpiku kostnego z kości udowych myszy. Użyj kleszczy i ostrych nożyczek, aby przeciąć dwie tylne łapy.
Następnie wykonaj małe nacięcie w brzusznej skórze myszy i rozciągnij ją. Wyciągnij kość udową i piszczelową, uważając, aby nie usunąć głów kości udowej, a kości umieść na sześciodołkowej płytce, wypełnionej 1,5 mililitra buforu barwiącego. Usuń mięśnie z kości i odetnij końce kości, umożliwiając wydostanie się szpiku kostnego.
Umieść oczyszczone kości w nowych studzienkach z 1,5 mililitra buforu barwiącego. Następnie wypłucz szpik kostny trzymililitrową strzykawką i igłą o rozmiarze 25, aż kość stanie się biała. Zbierz wszystkie komórki w probówce o pojemności 1,5 mililitra i odwiruj je przez pięć minut w temperaturze 180 razy G, a następnie wyrzuć supernatant.
Ostrożnie ponownie zawieś granulki w 300 mikrolitrach lodowatego buforu lizującego ACK i umieść komórki na lodzie na jedną minutę. Następnie natychmiast dezaktywuj lizę, dodając jeden mililitr buforu barwiącego. Wirować komórki przez pięć minut w temperaturze 180 razy G. Ponownie zawiesić osad komórek, który powinien wydawać się biały, w jednym mililitrze buforu barwiącego.
Przefiltrować komórki za pomocą nasadki sitka komórkowego z nylonową siatką o grubości 35 mikrometrów, aby uzyskać komórki jednojądrzaste. Zacznij od przygotowania koktajlu linii i przeciwciał sprzężonych z fluoroforem, zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Utrzymuj przeciwciała na lodzie i chroń przed światłem.
Następnie odwirować próbkę przez pięć minut w temperaturze 180 razy G i odrzucić supernatant. Dodaj 400 mikrolitrów koktajlu linii i cztery mikrolitry biotynylowanych przeciwciał CD135 do osadu komórkowego i zwiruj mieszaninę. Następnie inkubuj go na lodzie przez 30 minut.
Po inkubacji umyć próbkę, dodając trzy mililitry buforu barwiącego, obracając go przez pięć minut przy 180 razy G i odrzucając supernatant. Następnie dodaj 400 mikrolitrów roztworu przeciwciał i zwiruj mieszaninę. Inkubuj go na lodzie przez kolejne 30 minut i powtórz mycie z buforem barwiącym.
Aby przygotować roztwór barwiący TMRM, dodaj 2,2 mikrolitra roztworu podstawowego TMRM i 1,1 mikrolitra werapamilu do 1,1 mililitra pożywki do hodowli krwiotwórczych bez surowicy z trombopoetyną i czynnikiem komórek macierzystych. Ponownie zawiesić szpik kostny w jednym mililitrze roztworu barwiącego TMRM, szybko wirować i inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przefiltrować próbkę za pomocą nasadki sitowej z siatką nylonową o grubości 35 mikrometrów, aby uniknąć zatkania cytometru przepływowego.
Następnie dodaj jeden mikrolitr DAPI i kontynuuj cytometrię przepływową. Uruchom próbkę szpiku kostnego i uzyskaj co najmniej milion zdarzeń. Następnie wyświetl żywe komórki jednojądrzaste szpiku kostnego na wykresie dla błękitu pacyficznego, aby zidentyfikować frakcje Lin-ujemne i Lin-dodatnie CD135.
Wykreślić frakcję Lin-ujemną dla APC/Cy7 w porównaniu z PE/Cy7, aby zidentyfikować multipotencjalny progenitor lub frakcję MPP. Następnie wykreśl frakcję MPP dla APC w porównaniu z PerCP/Cy5.5, aby zidentyfikować frakcję hematopoetycznych komórek macierzystych lub frakcji HSC. Wyświetl frakcję HSC dla FITC lub CD34, aby podzielić ją na ujemne frakcje HSC CD34 i dodatnie frakcje HSC CD34.
Na koniec uzyskaj intensywność TMRM w każdej populacji. Aby upewnić się, że barwienie TMRM zadziałało prawidłowo, dodaj jeden mikrolitr FCCP do próbki, aby uzyskać końcowe stężenie jednego milimola i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie zdobądź milion wydarzeń.
Po dodaniu FCCP intensywność TMRM powinna zostać drastycznie zwiększona. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej w różnych populacjach komórek za pomocą barwnika TMRM. Wykazano, że obecność PBS i FBS w pożywce hodowlanej wpływa na intensywność sygnału TMRM.
Dlatego ważne jest, aby wykonać barwienie TMRM w podłożu ekspandującym bez surowicy. Hematopoetyczne komórki macierzyste wyrażają wysoki poziom aktywności ksenobiotycznych pomp wypływowych, które wytłaczają barwnik TMRM. Tak więc profile TMRM różnią się również w obecności werapamilu lub cyklosporyny H, które blokują pompy.
Aby zweryfikować dokładność barwienia TMRM, FCCP może polegać na depolaryzacji mitochondriów i zmniejszeniu intensywności TMRM. Protokół ten można łatwo dostosować do badania HSC z innym barwnikiem potencjału błony mitochondrialnej, w tym TMRE lub JC-1. A także inne barwniki mitochondrialne, takie jak MitoTracker lub MitoSOX.
Dopiero niedawno zwrócono uwagę na krytyczne problemy dziedziczone przez różną aktywność pomp wypływowych w populacji szpiku kostnego. Tak więc ten protokół ma na celu zmniejszenie rozbieżności między wcześniejszymi ustaleniami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje potencjał błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPCs) z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego TMRM oraz wpływ pomp odpływu ksenobiotyków. Przedstawiono protokół wykorzystujący Verapamil do dokładnego pomiaru poziomu TMRM poprzez hamowanie tych pomp, co pozwala na wiarygodną ocenę funkcji mitochondriów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Dynamika mitochondrialna w komórkach macierzystych
- Komórkowe mechanizmy efleksu
- Pomiar potencjału błonowego
Wstęp
- Znaczenie funkcji mitochondriów w odnowie komórek macierzystych
- Wyzwania związane z pompami effluksu w pomiarach barwników
- Zastosowanie TMRM jako wskaźnika potencjału mitochondrialnego
Zastosowane metody
- Izolacja szpiku kostnego od myszy
- Cytometria przepływowa w analizie populacji komórek
- Hamowanie pomp efleksowych przy użyciu Verapamilu
Główne wyniki
- Skuteczna kwantyfikacja potencjału błony mitochondrialnej w HSPC
- Wykazany wpływ werapamilu na retencję TMRM
- Możliwość adaptacji protokołu do innych barwników mitochondrialnych
Wnioski
- Badanie dostarcza wiarygodnej metody oceny aktywności mitochondrialnej w komórkach macierzystych.
- Wyniki pogłębiają zrozumienie biologii komórek macierzystych oraz wpływu czynników farmakologicznych na funkcję mitochondriów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna ocena potencjału błony mitochondrialnej w hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych jest niezbędna do zrozumienia samoodnawiania się komórek macierzystych oraz regulacji metabolicznej. Aktywność pomp eflluksu w tych komórkach może zniekształcać pomiary barwników fluorescencyjnych, prowadząc do błędnych danych, co wpływa na walidację celów oraz niezawodność modeli przedklinicznych. Niniejszy protokół rozwiązuje kluczowe ograniczenie techniczne w analizach opartych na cytometrii przepływowej, poprawiając spójność danych dla dalszych odkryć i zastosowań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji mitochondriów jako celu terapeutycznego w hematopoetycznych komórkach macierzystych poprzez redukcję artefaktów pomiarowych wynikających z wypływu barwnika.
- Wartość operacyjna: Wspiera spójne porównywanie populacji komórek macierzystych i progenitorowych w różnych modelach eksperymentalnych poprzez korekcję zmienności transporterów ksenobiotyków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane układy krwiotwórcze do przesiewania związków, zapewniając, że odczyty potencjału mitochondrialnego odzwierciedlają rzeczywisty stan biologiczny, a nie aktywność efleksu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację testów poprzez zastosowanie inhibitorów pomp efleksowych, takich jak Verapamil, w protokołach barwienia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez dostarczanie wiarygodnych danych o aktywności mitochondrialnej powiązanej ze ścieżkami samoodnawiania komórek macierzystych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez standaryzację kluczowego odczytu funkcjonalnego w różnych systemach modelowych.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, wspierając testowanie hipotez w biologii komórek macierzystych oraz umożliwiając wiarygodne profilowanie funkcjonalne przed podjęciem działań w celu identyfikacji wiodących cząsteczek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację celów mitochondrialnych i wyjaśnianie szlaków w układach krwiotwórczych poprzez minimalizację fałszywie niskich sygnałów wynikających z ekstruzji barwnika.
- Screening: Zapewnia ilościowe, powtarzalne pomiary potencjału mitochondrialnego w warunkach zahamowanego odpływu, co poprawia detekcję efektów działania związków.
- Analityka: Generuje odczyty oparte na cytometrii przepływowej (intensywność TMRM), które umożliwiają porównanie stanów metabolicznych w różnych frakcjach komórek i warunkach traktowania.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi, dostarczając translacyjną metrykę kondycji komórek macierzystych, która koreluje z wynikami funkcjonalnymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat pracy z użyciem cytometrii przepływowej do oceny stanu mitochondriów w modelach komórek macierzystych w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w badaniach nad mechanizmami komórek macierzystych poprzez eliminację głównego źródła zmienności testów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność analiz mitochondrialnych w badaniach nad układem krwiotwórczym.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w procesie walidacji celów poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych związanych z efektem wypływu barwnika.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w zakresie komórek macierzystych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o bardziej dokładne dane funkcjonalne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie cytometrii przepływowej, izolacji komórek macierzystych oraz pracy z barwnikami fluorescencyjnymi.
- Zależność od dostępu do Verapamilu lub alternatywnych inhibitorów pomp eflluksu oraz kompatybilnych buforów barwiących.
- Konieczność standaryzacji działań między zespołami w celu zapewnienia spójności czasu podania i stężenia inhibitora.
- Należy uwzględnić potencjalne efekty pozacelowe Verapamilu na żywotność lub metabolizm komórek w hodowlach długoterminowych.
- Ograniczenie do zastosowań, w których potencjał błony mitochondrialnej jest istotnym odczytem funkcjonalnym, a aktywność eflluksu znana jest z wywoływania interferencji.
