Ocena dojrzałości ludzkich komórek jajowych i jej zastosowanie kliniczne

W praktyce klinicznej przyjmuje się, że każdy oocyt wykazujący ciało polarne jest gotowy do zapłodnienia. Obrazowanie życia dojrzewania ludzkich oocytów ujawnia, że ciało polarne staje się widoczne na długo przed zmontowaniem dwubiegunowego wrzeciona metafazy II, co stwarza ryzyko przedwczesnego wstrzyknięcia plemnika. Mikroskopia światła spolaryzowanego umożliwia nieinwazyjną wizualizację wrzeciona mejotycznego w ludzkich oocytach i może być bezpiecznie stosowana w IFV do oceny dojrzałości komórki jajowej przed docytoplazmatycznym wstrzyknięciem plemnika.

Optymalizacja czasu ICSI jest szczególnie ważna w przypadku złego rokowania w cyklach IVF, przy małej liczbie oocytów dostępnych do zapłodnienia. Ta procedura kliniczna jest techniką uzupełniającą standardowe leczenie in vitro i powinna być wykonywana przez doświadczony personel, zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi. 35 do 36 godzin po wstrzyknięciu ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej należy zebrać pobrane kompleksy cumulus-oocyty w podłożu niezależnym od dwutlenku węgla.

Utrzymuj równowagę oocytów przez 10 do 15 minut w inkubatorze niezależnym od dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wystawić oocyty na działanie roztworu hialuronidazy o wysokiej zawartości hialuronidazy, rozcieńczonego w pożywce. Po 30 sekundach użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby mechanicznie usunąć komórki wzgórkowo-koronowe.

Oceń liczbę i status rozwojowy ogołoconych oocytów w zależności od obecności lub braku jądra i pierwszego ciała polarnego. Umieścić stadium pęcherzyka rozrodczego oraz oocyty fazy I i metafazy II w pojedynczych kropelkach pożywki hodowlanej niezależnej od dwutlenku węgla, pokrytych olejem mineralnym. Następnie umieść oocyty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla i 6% tlenu w wilgotności przez 3 do 4 godzin.

Aby przygotować płytki hodowlane do hodowli zarodków, należy dodać odpowiednią ilość wstępnie zbilansowanej pożywki hodowlanej do poszczególnych studzienek na płytce hodowlanej o odpowiedniej wielkości. Przykryj kropelki zrównoważonym olejem mineralnym, oznacz płytkę niepowtarzalnym identyfikatorem i umieść ją w inkubatorze zależnym od dwutlenku węgla na co najmniej 20 minut. Aby przygotować danie ICSI, dodaj 5 mikrolitrów kropelek wstępnie podgrzanego podłoża dla każdego oocytu wyświetlającego ciało polarne i jedną dodatkową kroplę do mycia igłami do czystego plastikowego naczynia.

Dodaj dodatkową kroplę roztworu PVP do unieruchomienia plemników przed docytoplazmatycznym wstrzyknięciem plemnika i nałóż kropelki wstępnie podgrzanym olejem mineralnym. Pamiętaj, aby oznaczyć danie. Następnie umieść naczynie do wstrzykiwania nasienia w inkubatorze niezależnym od dwutlenku węgla na co najmniej 20 minut.

Podczas gdy płytka się równoważy, dodaj 5 mikrolitrów kropelek wstępnie podgrzanej pożywki dla każdego oocytu wyświetlającego ciało polarne do naczynia hodowlanego ze szklanym dnem. Zalej wszystkie kropelki wstępnie podgrzanym olejem mineralnym. Pamiętaj, aby oznaczyć danie.

Następnie umieścić płytkę w inkubatorze niezależnym od emisji dwutlenku węgla na co najmniej 20 minut. Podczas gdy płytki się równoważą, włącz podgrzewany stolik w odwróconym mikroskopie i umieść sterylną igłę do trzymania i wstrzykiwania nasienia w uchwytach do mikroiniekcji. Ustaw ostrość igieł i wybierz odpowiedni obiektyw, uważając, aby kondensator znajdował się w pozycji jasnego pola.

Włóż zielony filtr interferencyjny i ustaw suwak analizy ciekłokrystalicznej w pozycji roboczej. Ustaw migawkę na około 50% i wyreguluj polaryzator kołowy, aby zmniejszyć szumy tła. Aby skonfigurować komputer do badania mikroskopią w świetle spolaryzowanym, uruchom oprogramowanie do obrazowania i wybierz Wideo, Źródło wideo i polarAIDE w menu Wideo.

Następnie przełącz się na wideo na żywo, przechodząc do strony Wideo i wybierz ikonę, aby aktywować analizę wrzeciona i strefy. Aby określić dojrzałość każdego oocytu, przenieś wszystkie oocyty do pojedynczych kropelek na przygotowanym naczyniu ze szklanym dnem i umieść odsłonięte naczynie pod przygotowanym mikroskopem odwróconym. Ustaw ostrość pierwszego oocytu i obserwuj wykryty obraz dwójłomności oocytów, ponieważ jest on przetwarzany komputerowo i wyświetlany w czasie rzeczywistym na ekranie komputera.

Użyj igieł do przytrzymywania i wstrzykiwań nasienia, aby obrócić oocyt tak, aby ciało polarne znajdowało się w pozycji godziny 12 i skup się na ciele biegunowym. Jeśli dwójłomność wrzeciona nie jest wyraźnie widoczna na pierwszy rzut oka w pobliżu PB, lekko dotknij osłonki przejrzystej i delikatnie obróć oocyt wokół każdej osi, aby zapewnić wyrównanie spolaryzowanego światła z włóknami wrzeciona matrycy. Po zidentyfikowaniu wszystkich wrzecionowatych oocytów, przenieś oocyty do pojedynczych kropelek w przygotowanym naczyniu ICSI i poddaj oocyty docytoplazmatycznemu wstrzyknięciu plemnika zgodnie ze standardowymi protokołami.

Jeśli oocyty nie wykazują wykrywalnego sygnału wrzeciona metafazy II, umieść miskę mikroskopu ze spolaryzowanym światłem w inkubatorze niezależnym od dwutlenku węgla na 2 do 3 godzin. Przed ponownym przygotowaniem badania mikroskopowego w świetle spolaryzowanym, jak pokazano, po wstrzyknięciu należy przenieść oocyty na przygotowane płytki do hodowli zarodków w celu ich hodowli, aż do osiągnięcia stadium blastocysty. Należy upewnić się, że wszystkie mikromanipulacje ludzkiego oocytu są przeprowadzane w środowisku kontrolnym, w temperaturze 37 stopni, w optymalnym pH pożywki hodowlanej.

Obrazowanie wrzecionowe pozwala na odróżnienie w pełni dojrzałych oocytów zatrzymanych w fazie metafazy II, od tych, które przechodzą ważne przejście dojrzałościowe. W opóźnionych rozwojowo oocytach wytłaczających ciała polarne in vitro brak sygnału wrzeciona metafazy II niekoniecznie musi odzwierciedlać zaburzenie komórkowe, ale może wskazywać na progresję oocytu z etapu metafazy I do etapu metafazy II. Obecność wrzeciona mejotycznego jest pozytywnym markerem kompetencji rozwojowych jaj.

Odroczenie ICSI zapewnia opóźnionym rozwojowo oocytom dodatkowy czas na zakończenie procesu dojrzewania i złożenie wrzeciona metafazy II przed ich wstrzyknięciem. Dzięki takiemu podejściu nawet niedojrzałe oocyty, które są rutynowo odrzucane, mogą być wykorzystane klinicznie i doprowadzić do udanej ciąży.