Celowane blokowanie przeciwciał przez dwufunkcyjny koniugat peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF)

Może to pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące sposobu syntezy cząsteczek DCAF z ukierunkowaną neutralizacją przeciwciał. Technika ta zapewnia najprostszy sposób syntezy cząsteczek DCAF z wysoką wydajnością. Świat decyduje, że cząsteczki DCAF mają potencjalne interwencje w stosunku do przeciwciała w przypadku chorób takich jak gorączka denga i miastenia.

Metodę tę można zastosować do innych cząsteczek DCAF o różnych epitopach w celu celowania w pokrewne przeciwciała. Procedurę zademonstruje Xue Bai, starszy technik z mojego laboratorium. Aby przekształcić żywicę 2-chlorową w żywicę 2-chlorową pochodzącą z hydrazyny, z górnej części naczynia do syntezy peptydów dodaj pięć mililitrów DMF do 0,25 milimoli żywicy 2-chlorowej.

Załóż nakrętkę z powrotem, delikatnie potrząsaj naczyniem przez 15 sekund, a następnie odcedź je na żelaznym stojaku. Powtórz mycie DKZ jeszcze dwa razy. Następnie dodaj pięć mililitrów DCM do naczynia, załóż z powrotem nakrętkę, delikatnie potrząsaj naczyniem przez 15 sekund, a następnie odcedź je na żelaznym stojaku.

Powtórz mycie DCM jeszcze dwa razy, a następnie powtórz mycie DKZ jeszcze trzy razy. Następnie dodaj sześć mililitrów DMF o stężeniu 50% objętościowym nad DCM, aby spęczniać żywicę przez 30 minut, a następnie ją odcedzić. Teraz przenieś sześć mililitrów 5% stężenia objętościowego hydrazyny i DMF do naczynia reakcyjnego.

Umieść go na wytrząsarce z prędkością 120 obr./min i 30 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie spuść roztwór za pomocą pompy próżniowej. Aby oczyścić pochodną hydrazyny peptydu Fc-III, należy użyć systemu HPLC do oczyszczenia peptydu przez 30-minutową elucję aluzyjną gradientu przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę. Po oczyszczeniu białka zgodnie z rękopisem dodaj do nowej probówki dwa mililitry jednego miligrama na mililitr białka znakowanego SUMO, jeden mililitr proteazy SUMO, jeden mililitr buforu proteazy 10X SUMO i sześć mililitrów podwójnie destylowanej wody w celu przygotowania roztworu reakcyjnego.

Inkubuj mieszaninę przez 12 do 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie podzielić mieszaninę na osiem 1,5-mililitrowych probówek Eppendorfa i odwirować mieszaninę w temperaturze 15 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj pipety, aby wyrzucić kruszywa na dnie, a następnie do 10 mililitrowych oczyszczonych supernatantów dodaj 0,5 mililitra 50% zawiesiny kulek niklu NTA w 50 milimolowym PBS.

Umieść probówkę w wytrząsarce obrotowej z prędkością 200 obr./min i czterema stopniami Celsjusza, aby delikatnie mieszać przez 60 minut. Następnie załaduj lisadę i mieszaninę niklu NTA do kolumny z dolną nasadką wylotową. Zdejmij dolną nasadkę i zachowaj przepływ do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Białko HIS TAG SUMO wiąże się z kolumną. Część antygenu łącznikowego, która zaczyna się od CIS dla natywnej reakcji ligacji chemicznej, znajduje się w przepływie. Teraz odważ 1,8 miligrama pochodnej hydrazyny peptydu Fc-III do dwumililitrowej probówki Eppendorfa i dodaj 0,8 mililitra sześciomolowego chlorku guanidyny w 0,2 molowym roztworze fosforanu monosodowego o pH 3.

Wirować, aby rozpuścić proszek. Po odwirowaniu probówki o temperaturze 7, 200 razy G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej przenieść supernatant do nowej probówki. Dodaj mieszadło do probówki i umieść probówkę w lodowej kąpieli solnej na mieszadle magnetycznym, aby delikatnie mieszać roztwór przez 15 minut.

Następnie dodaj 40 mikrolitrów 0,5-molowego azotynu sodu do roztworu, aby utlenić grupę hydrazynową. Delikatnie mieszaj roztwór przez kolejne 15 minut w lodowej kąpieli solnej. Odważyć 11 miligramów oczyszczonej i liofilizowanej części antygenu łącznikowego HPLC oraz 13,6 miligrama MPAA do probówki reakcyjnej w kąpieli soli lodowej.

Mieszaj przez pięć minut, a następnie dostosuj wartość pH do 6,8 do 7,0 w temperaturze pokojowej z sześciomolowym wodorotlenkiem sodu. Najważniejszym krokiem dla natywnej ligacji chemicznej jest staranne dostosowanie wartości pH w celu zainicjowania reakcji ligacji. Po 12 godzinach w kąpieli soli lodowej dodaj 0,4 mililitra 0,1 molowego roztworu obojętnego TCEP do układu reakcyjnego i mieszaj przez 20 minut, aby zakończyć reakcję.

Po odwirowaniu i oczyszczeniu metodą HPLC otrzymać sprzężony pik III do odsiarczenia. Rozpuść go w 50 mikrolitrach sześciomolowego chlorku guanidyny w 0,2-molowym roztworze fosforanu monosodowego. Następnie dodaj 50 mikrolitrów jednego molowego TCEP, 10 mikrolitrów tert-butylotiolu i pięć mikrolitrów 0,1 molowego VAO na cztery roztwory.

Dostosuj końcowe pH roztworu do 6,9 i utrzymuj roztwór w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce przez około pięć godzin. Odwirować i ponownie oczyść. Przygotowany peptyd rozpuścić w 200 mikrolitrach 32-milimolowego octanu srebra, a następnie mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez cztery godziny.

Aby przekształcić tiolany srebra na peptydzie w wolne tiole, dodaj trzy mikrolitry jednego molowego DTT w sześciu molowym chlorku guanidyny i 0,2 molowego fosforanu monosodowego o pH 7. Uruchom spektrometr mas w trybie pełnego skanowania i ustaw zakres m/z na 300 do 2 000, a rozdzielczość na 60 000. Otwórz dane widm masowych i znajdź piki produktu na każdym kroku, aby potwierdzić, że reakcja chemiczna została pomyślnie przeprowadzona.

Aby wykonać test ELISA interakcji między przeciwciałem DCAF1 i 4G2, pokryj każdą studzienkę 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej jednym pikomolem przeciwciała anty-GST w 100 mikrolitrach buforu powlekającego. Uszczelnij płytkę taśmami uszczelniającymi i inkubuj ją w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc na shakerze. Rano zablokuj każdą studzienkę 200 mikrolitrami 1% BSA i PBS.

Zamknij płytkę i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez godzinę na shakerze. Następnie użyj PBS z 0,05%Tween 20, aby umyć każdą studzienkę cztery razy. W protokole tym do półsyntezy cząsteczki DCAF1 zastosowano natywną metodę ligacji chemicznej

Widmo masowe pokazuje, że końcowa cząsteczka DCAF1 ma dekonwolucyjną masę cząsteczkową 11 053. Podczas testu ELISA peptyd antygenowy Fc-III i DCAF1 kompetycyjnie hamują wiązanie przeciwciał 4G2. Zarówno peptyd antygenowy, jak i DCAF1 istotnie blokowały wiązanie 4G2, podczas gdy peptyt Fc-III nie wpływał na interakcję przeciwciał antygenowych.

Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę do interwencji w przypadku szkodliwych chorób związanych z przeciwciałami. Wiele regionów wykorzystywanych do syntezy peptydów i natywnej ligacji chemicznej jest wysoce toksycznych. Upewnij się, że przeprowadziłeś te eksperymenty w swoim kapturze chemicznym.