Name: Celowane blokowanie przeciwciał przez dwufunkcyjny koniugat peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę syntezy dwufunkcyjnego koniugatu peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF) do celowanego blokowania przeciwciał. Technika ta umożliwia neutralizację szkodliwych przeciwciał w chorobach takich jak gorączka Dengue i miastenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Fundację Uniwersytetu Tsinghua-Gatesa (nie. OPP1021992), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (nr 21502103, 21877068 i 041301475) oraz Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (nr 2017YFA0505103).

<ol><li>Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhoades%2C+RA+%22Human+Physiology+%284th+ed.%29%22">Human Physiology (4th ed.)</a>. , Thomson Learning. (2003).</li>
<li>Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-enhanced+dengue+virus+infection+in+primate+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes.</a> Nature. 265, 739-741 (1977).</li>
<li>Gammon, G., Sercarz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+some+T+cells+escape+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">How some T cells escape tolerance induction.</a> Nature. 342, 183-185 (1989).</li>
<li>Takada, A., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+enhancement+of+viral+infection%3A+molecular+mechanisms+and+in+vivo+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications.</a> Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).</li>
<li>Boonnak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Dendritic+Cells+in+Antibody-Dependent+Enhancement+of+Dengue+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection.</a> Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).</li>
<li>Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myasthenia+gravis+-+autoantibody+characteristics+and+their+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+neurology%22%5BJournal%5D)">Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy.</a> Nature Reviews neurology. 12, 259(2016).</li>
<li>Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myasthenia+gravis%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Myasthenia gravis: past, present, and future.</a> Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).</li>
<li>Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+a+dengue+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Progress towards a dengue vaccine.</a> The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).</li>
<li>Vikas, K., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+Myasthenia+Gravis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Treatment of Myasthenia Gravis.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-functional+conjugate+of+antigenic+peptide+and+Fc-III+mimetics+%28DCAF%29+for+targeted+antibody+blocking%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking.</a> Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).</li>
<li>Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+taylor-aris+dispersion+for+measurement+of+a+solute+diffusion+coefficient+in+thin+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries.</a> Science. 266, 773-776 (1994).</li>
<li>Fang, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+chemical+synthesis+by+ligation+of+peptide+hydrazides%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie.+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).</li>
<li>Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+chemical+synthesis+of+proteins+by+ligation+of+peptide+hydrazides%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie.+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides.</a> Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).</li>
<li>Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+proteins+using+peptide+hydrazides+as+thioester+surrogates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates.</a> Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy protokół opisuje półsyntezę i wykrywanie DCAF1 przy użyciu podejścia NCL, które pokazano na rysunku 1. Krótko mówiąc, dwa fragmenty DCAF1 są odpowiednio syntetyzowane chemicznie i wyrażane rekombinacyjnie; następnie cząsteczka DCAF1 na całej długości jest składana, modyfikowana i oczyszczana. W przypadku syntezy fragmentów Fc-III pochodzących z hydrazyny dość ważne jest użycie żywicy 2-Cl o niskiej pojemności, ponieważ duża pojemność ma negatywny wpływ na wytwarzanie hydrazyny i pr...

Przeciwciała odgrywają ważną rolę w humoralnej odpowiedzi immunologicznej na neutralizację chorobotwórczych bakterii i wirusów1. Jednak niektóre przeciwciała wykazują szkodliwy wpływ na organizmy, takie jak przeciwciała reagujące krzyżowo w efekcie ADE podczas infekcji DENV i nadmiernie reaktywne przeciwciała w miastenii, która jest chorobą autoimmunologiczną<klasa sup="xref">2,<klasa sup="xref">3. Efekt ADE jest pośredniczony przez przeciwciała reagujące krzyżowo, które tworzą most łączący komórki prezentujące receptor DENV i Fc4,5, podczas gdy miastenia jest spowodowana nadmiarem przeciwciał, które atakują receptory acetylocholiny między połączeniami komórka-komórka w tkance mięśniowej6,7. Chociaż opracowano częściowo skuteczne metody leczenia tych chorób8,9, bez wątpienia bezpośrednia eliminacja tych szkodliwych przeciwciał przyczyniłaby się do postępu w interwencjach.
Ostatnio, cząsteczki DCAF, które mają podwójne grupy funkcyjne, zostały opracowane do celowanego blokowania przeciwciał10. DCAF to długi peptyd, który składa się z 3 części: 1) części antygenu, która może specyficznie rozpoznać pokrewne przeciwciało, 2) znacznika Fc-III lub Fc-III-4C do silnego wiązania się z regionem Fc przeciwciała w celu zahamowania receptora Fc lub białek składowych dopełniacza, 3) długiego α-helisowego łącznika, który sprzęga te dwie grupy funkcyjne10. Część łącznikowa, zaprojektowana z domeny Moesin FERM, została zoptymalizowana przez oprogramowanie Rosseta, aby zapewnić, że część antygenowa i część Fc-III w cząsteczce DCAF mogą jednocześnie wiązać się z regionami Fab i Fc IgG. Cztery cząsteczki DCAF zostały zsyntetyzowane w celu ukierunkowania na 4 różne przeciwciała, wśród których DCAF1 został użyty do wyeliminowania przeciwciała 4G2, które jest przeciwciałem reagującym krzyżowo podczas infekcji DENV, przyczyniając się do efektu ADE; a DACF4 został zaprojektowany do ratowania receptorów acetylocholiny poprzez blokowanie przeciwciała mab35 w miastenii gravis10.
W obecnym badaniu, biorąc za przykład DCAF1, pokazaliśmy protokoły syntezy cząsteczki DCAF i wykrywania interakcji między DCAF a pokrewnym przeciwciałem. DCAF1 jest częściowo syntetyzowany przez NCL approach11,12,13,14, który sprzęga ze sobą pochodną hydrazyny peptydu Fc-III i wyrażonymi częściami antygenu łącznikowego. Podejście NCL ma znaczące zalety w porównaniu z pełną syntezą chemiczną i w pełni rekombinowaną ekspresją syntezy DCAF1, ponieważ obie te metody prowadzą do niskiej wydajności i wysokich kosztów. Obecne podejście jest nie tylko najbardziej opłacalnym sposobem uzyskania pełnowymiarowego DCAF, ale także może utrzymać konformację części łącznika podobną do jej natywnej formy. Ponieważ różne cząsteczki DCAF mają podobne sekwencje, z wyjątkiem części antygenu, nasze metody syntezy DCAF1 i testu interakcji między przeciwciałami DCAF1 i 4G2 można zastosować do innych cząsteczek DCAF w celu celowanego zablokowania ich pokrewnych przeciwciał.

<table><tbody><tr><td>Żywica 2-chlorotrytylowa</td><td>Tianjin Nankai HECHENG S& T</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-[Bis(dimetyloamino)metyleno]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pirydyny heksafluorofosforan 3-tlenek</td><td>GL Biochem</td><td>00703</td><td></td></tr><tr><td>2-(6-chloro-1H-benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametyloaminoheksofluorofosforan</td><td>GL Biochem</td><td>00706</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-ylo)propan] dichlorowodorek</td><td>J& K Scientific</td><td>503236</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało 4G2</td><td>Thermo</td><td>MA5-24387</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 4-merkaptenofeniooctowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>H27658</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania</td><td>NEST</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A955</td><td>MS Grade</td></tr><tr><td>AgOAc</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>30164324</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-GST</td><td>Abclonal</td><td>AE001</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysie IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężonych z HRP</td><td></td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD spektrometr</td><td>Applied Photophysics Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Torba do dializy</td><td>Sbjbio</td><td>SBJ132636</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>80047360</td><td></td></tr><tr><td>eter dietylowy</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10009318</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu DNA</td><td>Beyotime</td><td>D0056</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Fusion Lumos</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH Sepharose</td><td>GE Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>Odczynnik</td> <td>chemiczny Sinopharm</td><td></td>30095516</tr><tr><td>Hydrat hydrazyny</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>80070418</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10011018</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>SIGMA</td><td>12399-100G</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-tiogalaktozyd</td><td>SIGMA</td><td>5502-5G</td><td></td></tr><tr><td>kanamycyna</td><td>Beyotime</td><td>ST101</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A456</td><td>MS Grade</td></tr><tr><td>N, N-diizopropyloetyloamina</td><td>GL Biochem</td><td>90600</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimetyloformamid</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>8100771933</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Thermo</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>PBS Bufor</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd BEH C18 Wody kolumnowe</td><td></td><td>186003625</td><td></td></tr><tr><td>piperydyna</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>80104216</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do ekstrakcji plazmidu Zestaw</td><td>Sangon Biotech</td><td>B611253-0002</td><td></td></tr><tr><td>QIAexpress QIAGEN</td><td></td><td>32149</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiej ligacji DNA</td><td>Beyotime</td><td>D7002</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrat diwodorofosforanu sodu</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>20040718</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny</td><td>10019762</td><td></td></tr><tr><td>Azotyn sodu</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10020018</td><td></td></tr><tr><td>sód&nbsp; chlorek</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>Standard Aminokwasy chronione Fmoc</td><td>Garnek sterylizacyjny GL Biochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tomy</td><td>SX-700</td><td></td></tr><tr><td>SUMO Protease</td><td>Thermo Fisher</td><td>12588018</td><td></td></tr><tr><td>roztwór zatrzymujący</td><td>Biolegend</td><td>423001</td><td></td></tr><tr><td>całą sekwencję genu, która może wyrażać antygen SUMO-linker</td><td>Taihe Biotechnology Compay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMB odczynnik</td><td>Biolegend</td><td>421101</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>SIGMA</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Triizopropylosilan</td><td>GL Biochem</td><td>91100</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfiny</td><td>Aladdin</td><td>T107252-5g</td><td></td></tr><tr><td>trypton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Solarbio</td><td>T8220</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>Termiczna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pompa próżniowa</td><td>YUHUA</td><td>SHZ-95B</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Thermo</td><td>IVGN0086</td><td></td></tr><tr><td>ekstrakt drożdżowy</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

celowane blokowanie przeciwciał przez dwufunkcyjny koniugat peptydu antygenowego i mimetyki fc-iii (dcaf)

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Eliminacja szkodliwych przeciwciał z organizmów jest cennym podejściem do interwencji chorób związanych z przeciwciałami, takich jak denga, gorączka krwotoczna i choroby autoimmunologiczne. Ponieważ we krwi krążą tysiące przeciwciał o różnych epitopach, nie zgłoszono żadnej uniwersalnej metody, z wyjątkiem dwufunkcyjnego koniugatu peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF), która byłaby ukierunkowana na określone szkodliwe przeciwciała. Opracowanie cząsteczek DCAF w znacznym stopniu przyczynia się do postępu terapii celowanej, w której, jak wykazano, eliminują efekt wzmocnienia zależnego od przeciwciał (ADE) w modelu zakażenia wirusem dengi (DENV) oraz zwiększają aktywność receptora acetylocholiny w modelu miastenii. W tym miejscu opisujemy protokół syntezy cząsteczki DCAF (DCAF1), która może selektywnie blokować przeciwciało 4G2 w celu osłabienia efektu ADE podczas infekcji wirusem dengi i ilustrujemy wiązanie przeciwciała DCAF1 z 4G2 za pomocą testu ELISA. W naszej metodzie DCAF1 jest syntetyzowany przez koniugację pochodnej hydrazyny peptydu Fc-III i rekombinantu wyrażanego przez długą α-helisę z sekwencją antygenową poprzez natywną ligację chemiczną (NCL). Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do DCAF1, a także innych cząsteczek DCAF w celu ukierunkowania na pokrewne przeciwciała.

Schemat blokowy drogi syntezy poprzez natywną ligację chemiczną opisaną w niniejszym artykule przedstawiono na Rysunku 1. Rysunki 2-6 przedstawiają odpowiednio chromatogramy (A) i widma masowe (B) chemicznie zsyntetyzowanej pochodnej hydrazyny peptydu Fc-III, rekombinacyjnie wyrażonego łącznika i części antygenowej, produktu oczyszczonego z reakcji NCL, produktu oczyszczonego z reakcji desulfuryzacji oraz oczyszczonego produktu końcowego DCA...

Opracowanie dwufunkcyjnego koniugatu peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF) jest nowatorskie dla eliminacji szkodliwych przeciwciał. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół syntezy cząsteczki DCAF1, która może selektywnie blokować przeciwciało 4G2 w celu wyeliminowania efektu wzmocnienia zależnego od przeciwciał podczas infekcji wirusem dengi.

Celowane blokowanie przeciwciał przez dwufunkcyjny koniugat peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Może to pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące sposobu syntezy cząsteczek DCAF z ukierunkowaną neutralizacją przeciwciał. Technika ta zapewnia najprostszy sposób syntezy cząsteczek DCAF z wysoką wydajnością. Świat decyduje, że cząsteczki DCAF mają potencjalne interwencje w stosunku do przeciwciała w przypadku chorób takich jak gorączka denga i miastenia.Metodę tę można zastosować do innych cząsteczek DCAF o różnych epitopach w celu celowania w pokrewne przeciwciała. Procedurę zademonstruje Xue Bai, starszy technik z mojego laboratorium. Aby przekształcić żywicę 2-chlorową w żywicę 2-chlorową pochodzącą z hydrazyny, z górnej części naczynia do syntezy peptydów dodaj pięć mililitrów DMF do 0,25 milimoli żywicy 2-chlorowej.Załóż nakrętkę z powrotem, delikatnie potrząsaj naczyniem przez 15 sekund, a następnie odcedź je na żelaznym stojaku. Powtórz mycie DKZ jeszcze dwa razy. Następnie dodaj pięć mililitrów DCM do naczynia, załóż z powrotem nakrętkę, delikatnie potrząsaj naczyniem przez 15 sekund, a następnie odcedź je na żelaznym stojaku.Powtórz mycie DCM jeszcze dwa razy, a następnie powtórz mycie DKZ jeszcze trzy razy. Następnie dodaj sześć mililitrów DMF o stężeniu 50% objętościowym nad DCM, aby spęczniać żywicę przez 30 minut, a następnie ją odcedzić. Teraz przenieś sześć mililitrów 5% stężenia objętościowego hydrazyny i DMF do naczynia reakcyjnego.Umieść go na wytrząsarce z prędkością 120 obr./min i 30 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie spuść roztwór za pomocą pompy próżniowej. Aby oczyścić pochodną hydrazyny peptydu Fc-III, należy użyć systemu HPLC do oczyszczenia peptydu przez 30-minutową elucję aluzyjną gradientu przy natężeniu przepływu jednego mililitra na minutę. Po oczyszczeniu białka zgodnie z rękopisem dodaj do nowej probówki dwa mililitry jednego miligrama na mililitr białka znakowanego SUMO, jeden mililitr proteazy SUMO, jeden mililitr buforu proteazy 10X SUMO i sześć mililitrów podwójnie destylowanej wody w celu przygotowania roztworu reakcyjnego.Inkubuj mieszaninę przez 12 do 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie podzielić mieszaninę na osiem 1,5-mililitrowych probówek Eppendorfa i odwirować mieszaninę w temperaturze 15 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj pipety, aby wyrzucić kruszywa na dnie, a następnie do 10 mililitrowych oczyszczonych supernatantów dodaj 0,5 mililitra 50% zawiesiny kulek niklu NTA w 50 milimolowym PBS.Umieść probówkę w wytrząsarce obrotowej z prędkością 200 obr./min i czterema stopniami Celsjusza, aby delikatnie mieszać przez 60 minut. Następnie załaduj lisadę i mieszaninę niklu NTA do kolumny z dolną nasadką wylotową. Zdejmij dolną nasadkę i zachowaj przepływ do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Białko HIS TAG SUMO wiąże się z kolumną. Część antygenu łącznikowego, która zaczyna się od CIS dla natywnej reakcji ligacji chemicznej, znajduje się w przepływie. Teraz odważ 1,8 miligrama pochodnej hydrazyny peptydu Fc-III do dwumililitrowej probówki Eppendorfa i dodaj 0,8 mililitra sześciomolowego chlorku guanidyny w 0,2 molowym roztworze fosforanu monosodowego o pH 3.Wirować, aby rozpuścić proszek. Po odwirowaniu probówki o temperaturze 7, 200 razy G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej przenieść supernatant do nowej probówki. Dodaj mieszadło do probówki i umieść probówkę w lodowej kąpieli solnej na mieszadle magnetycznym, aby delikatnie mieszać roztwór przez 15 minut.Następnie dodaj 40 mikrolitrów 0,5-molowego azotynu sodu do roztworu, aby utlenić grupę hydrazynową. Delikatnie mieszaj roztwór przez kolejne 15 minut w lodowej kąpieli solnej. Odważyć 11 miligramów oczyszczonej i liofilizowanej części antygenu łącznikowego HPLC oraz 13,6 miligrama MPAA do probówki reakcyjnej w kąpieli soli lodowej.Mieszaj przez pięć minut, a następnie dostosuj wartość pH do 6,8 do 7,0 w temperaturze pokojowej z sześciomolowym wodorotlenkiem sodu. Najważniejszym krokiem dla natywnej ligacji chemicznej jest staranne dostosowanie wartości pH w celu zainicjowania reakcji ligacji. Po 12 godzinach w kąpieli soli lodowej dodaj 0,4 mililitra 0,1 molowego roztworu obojętnego TCEP do układu reakcyjnego i mieszaj przez 20 minut, aby zakończyć reakcję.Po odwirowaniu i oczyszczeniu metodą HPLC otrzymać sprzężony pik III do odsiarczenia. Rozpuść go w 50 mikrolitrach sześciomolowego chlorku guanidyny w 0,2-molowym roztworze fosforanu monosodowego. Następnie dodaj 50 mikrolitrów jednego molowego TCEP, 10 mikrolitrów tert-butylotiolu i pięć mikrolitrów 0,1 molowego VAO na cztery roztwory.Dostosuj końcowe pH roztworu do 6,9 i utrzymuj roztwór w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce przez około pięć godzin. Odwirować i ponownie oczyść. Przygotowany peptyd rozpuścić w 200 mikrolitrach 32-milimolowego octanu srebra, a następnie mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej przez cztery godziny.Aby przekształcić tiolany srebra na peptydzie w wolne tiole, dodaj trzy mikrolitry jednego molowego DTT w sześciu molowym chlorku guanidyny i 0,2 molowego fosforanu monosodowego o pH 7. Uruchom spektrometr mas w trybie pełnego skanowania i ustaw zakres m/z na 300 do 2 000, a rozdzielczość na 60 000. Otwórz dane widm masowych i znajdź piki produktu na każdym kroku, aby potwierdzić, że reakcja chemiczna została pomyślnie przeprowadzona.Aby wykonać test ELISA interakcji między przeciwciałem DCAF1 i 4G2, pokryj każdą studzienkę 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej jednym pikomolem przeciwciała anty-GST w 100 mikrolitrach buforu powlekającego. Uszczelnij płytkę taśmami uszczelniającymi i inkubuj ją w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc na shakerze. Rano zablokuj każdą studzienkę 200 mikrolitrami 1% BSA i PBS.Zamknij płytkę i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez godzinę na shakerze. Następnie użyj PBS z 0,05%Tween 20, aby umyć każdą studzienkę cztery razy. W protokole tym do półsyntezy cząsteczki DCAF1 zastosowano natywną metodę ligacji chemicznej.Widmo masowe pokazuje, że końcowa cząsteczka DCAF1 ma dekonwolucyjną masę cząsteczkową 11 053. Podczas testu ELISA peptyd antygenowy Fc-III i DCAF1 kompetycyjnie hamują wiązanie przeciwciał 4G2. Zarówno peptyd antygenowy, jak i DCAF1 istotnie blokowały wiązanie 4G2, podczas gdy peptyt Fc-III nie wpływał na interakcję przeciwciał antygenowych.Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę do interwencji w przypadku szkodliwych chorób związanych z przeciwciałami. Wiele regionów wykorzystywanych do syntezy peptydów i natywnej ligacji chemicznej jest wysoce toksycznych. Upewnij się, że przeprowadziłeś te eksperymenty w swoim kapturze chemicznym.

targeted-antibody-blocking-dual-functional-conjugate-antigenic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano techniki analizowania mechanizmów leżących u podstaw wydzielania HIV-1 Nef w egzosomach. Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z transfekcji Nef i białka wykorzystano do określenia struktury, funkcji i partnerów wiążących region modyfikacji wydzielania Nef. Procedury te mają ogólne znaczenie w wielu badaniach mechanistycznych.

Identyfikacja motywów funkcjonalnych i ich partnerów wiążących w oparciu o peptydy

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Peptydy pochodzenia wirusowego sprzężone z koniugatami przeciwciał (AC) to podejście, które nabiera rozpędu ze względu na potencjał dostarczania ładunków molekularnych ze zwiększoną akumulacją komórek nowotworowych. Wykorzystując powszechne metody oceny koniugacji peptydów, akumulacji wewnątrzkomórkowej AC i ładunku oraz celowania w guz, protokół ten pomaga naukowcom w kluczowych początkowych fazach rozwoju.

Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz

Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.

Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji bispecyficznego przeciwciała GPC3-S-Fab w Escherichia coli. Oczyszczony GPC3-S-Fab ma silną cytotoksyczność wobec komórek raka wątroby GPC3-dodatnich.

Bispecyficzne przeciwciało ukierunkowane na GPC3, GPC3-S-Fab, o silnej cytotoksyczności

Włączenie pochodnej cyklopropenu lizyny do przeciwciał pozwala na specyficzne dla miejsca, szybkie i efektywne połączenie cząsteczek zawierających tetrazynę w celu wytworzenia koniugatów przeciwciało-lek.

Kodowanie genetyczne niekanonicznego aminokwasu do wytwarzania koniugatów przeciwciało-lek w drodze szybkiej reakcji bioortogonalnej

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalizacji in vivo przeciwciał w modelach ksenoprzeszczepów guza myszy.

Analiza rozmieszczenia nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego

Protokół do badania zdarzeń wywołanych przez FcγRIIIa przez przeciwciała terapeutyczne w ludzkich komórkach NK jest opisany tutaj. Ta platforma sztucznej stymulacji umożliwia badanie dalszych funkcji efektorowych, takich jak degranulacja, produkcja chemokin/cytokin i szlaki sygnałowe, w których pośredniczą części FcγRIIIa i Fc przeciwciał zaangażowanych w wiązanie.

Ocena zdarzeń związanych z ludzkimi komórkami NK wywołanych zaangażowaniem FcγRIIIa w obecności przeciwciał terapeutycznych

Opisujemy protokół chemicznej koniugacji modelowego antygenu albuminy jaja kurzego z przeciwciałem specyficznym dla receptora endocytozy do celowania in vivo w komórki dendrytyczne. Protokół obejmuje oczyszczenie przeciwciała, chemiczne sprzęgnięcie antygenu, a także oczyszczenie koniugatu i weryfikację sprawnej koniugacji.

Chemiczna koniugacja oczyszczonego przeciwciała skierowanego przeciwko DEC-205 z białkiem o pełnej długości do celowania w mysie komórki dendrytyczne in vitro i in vivo

Kilka aptamerów 2’-Fluoro RNA przeciwko HIV-1Ba-L gp120 o powinowactwie nanomolowym zostało wyizolowanych z biblioteki RNA za pomocą procedury in vitro SELEX. Stworzono nową chimerę aptamer-siRNA o podwójnej funkcji hamującej przeciwko gp120, która wykazuje znaczny potencjał w systemowej terapii przeciw HIV.

Opracowanie specyficznych dla typu komórek aptamerów przeciwko gp120 HIV do dostarczania siRNA

Poznaj metodę syntezy dwufunkcyjnego koniugatu peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF) do celowanego blokowania przeciwciał. Technika ta umożliwia neutralizację szkodliwych przeciwciał w chorobach takich jak gorączka Dengue i miastenia.

Celowane blokowanie przeciwciał przez dwufunkcyjny koniugat peptydu antygenowego i mimetyki Fc-III (DCAF)

Przeglądaj więcej filmów