Metoda elektroporacji do dostarczania in vivo plazmidowego DNA w kresomózgowiu dorosłego danio pręgowanego

Protokół ten umożliwia znakowanie pojedynczych komórek wyściółki w kresomózgowiu danio pręgowanego, aby umożliwić ich długoterminowe monitorowanie, a także manipulowanie określonymi szlakami w sposób autonomiczny dla komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona szybkie i skuteczne znakowanie pojedynczych komórek, a także edycję genów i manipulację szlakiem sygnałowym w sposób autonomiczny dla komórki. Metoda ta pozwala na badanie podstawowych zagadnień biologii komórki, na przykład dotyczących delaminacji komórek, utrzymania homeostazy nabłonka i symetrii podziału komórki.

Zacznij od użycia aparatu do wyciągania igieł do przygotowania szklanych naczyń włosowatych. Użyj końcówek mikroładowarki, aby wypełnić przygotowaną szklaną kapilę dziesięcioma mikrolitrami roztworu plazmidu. Następnie naciśnij menu zmień kapilarę" na urządzeniu do wstrzykiwań, aby umożliwić załadowanie igły do uchwytu igły.

Następnie przełącz urządzenie iniekcyjne z trybu zmiany kapilary na tryb wstrzykiwania. Następnie, za pomocą mikroskopu stereoskopowego z czterokrotnym powiększeniem i kleszczykami Findena, przeciąć tylko końcówkę naczynia włosowatego. Następnie dociśnij pedał nożny, aby upewnić się, że roztwory plazmidowe łatwo wychodzą z igły bez przeszkód.

Gdy igła będzie gotowa, przenieś danio pręgowanego ze zbiornika hodowlanego do pojemnika z roztworem znieczulającym. I poczekaj kilka minut, aż ruch skrzeli ustąpi. Dociśnij uspokojoną rybę grzbietową stroną do góry na wstępnie zwilżoną gąbkę pod mikroskopem stereoskopowym i użyj mikronoża do preparowania ze stali nierdzewnej z 40-milimetrową krawędzią tnącą i grubością 0,5 milimetra, aby ostrożnie utworzyć mały otwór w czaszce ryby po tylnej stronie kresomózgowia, tuż obok granicy tektum optycznego.

W razie potrzeby przechyl rybę i skieruj końcówkę szklanej kapilary w kierunku czaszki pod odpowiednim kątem, aby ułatwić penetrację końcówki kapilary przez otwór. Następnie bardzo ostrożnie włóż końcówkę naczynia włosowatego do otworu przez grzbietową warstwę komórek wyściółki, aż dotrze do komory kresomózgowia i naciskaj na pedał nożny przez około 10 sekund, aby dostarczyć około 1 mikrolitra roztworu plazmidu. Powodzenie porodu można potwierdzić, obserwując rozprowadzanie się zielonego płynu po całej komorze.

Przykryj kresomózgowie ryb niewielką ilością żelu do ultradźwięków. W celu elektroporacji zwierzęcia, któremu wstrzyknięto plazmid, należy wyjąć gąbkę z zestawu do wstrzykiwań i zanurzyć wewnętrzną stronę elektrokońcówek w żelu ultradźwiękowym. Umieść głowę ryby między elektrodami, tak aby elektroda dodatnia znajdowała się po brzusznej stronie głowy, a elektroda ujemna po stronie grzbietowej.

Następnie, nadal trzymając ciało ryby w gąbce, delikatnie i precyzyjnie dociśnij elektrody do kresomózgowia i podawaj prąd za pomocą pedału nożnego, przytrzymując elektrody na miejscu, aż wszystkie pięć impulsów zostanie zakończonych. Jeśli elektroporacja się powiedzie, pojedyncze komórki epredymoglialne znakowane plazmidem można zaobserwować wśród komórek ependymoglialnych znakowanych plazmidem. W zależności od skuteczności procesu elektroporacji można znakować większą lub mniejszą liczbę komórek wyściółkomoglialnych.

Niemniej jednak zademonstrowany protokół daje większą liczbę znakowanych komórek niż poprzednio opublikowane protokoły. Należy zauważyć, że największa gęstość znakowanych komórek ma tendencję do pojawiania się głównie po wewnętrznej stronie komór obu półkul ze względu na sposób, w jaki wstrzyknięty płyn plazmidowy rozprowadza się między półkulami. Na tym filmie jedna półkula kresomózgowia danio pręgowanego jest przedstawiona w 3D, gdzie komórki wyściółki z procesami radiowymi są w kolorze purpurowym, gdy obserwuje się je z boku.

Poprzez koelektroporację z innym plazmidem, który znakuje jądra, można zaobserwować podział komórek wyściółkomoglii. Nieudana elektroporacja skutkuje bardzo małą liczbą lub brakiem znakowanych komórek wyściółkomoglialnych. Jednak komórki wyściółki grzbietowej są najbardziej prawdopodobne do znakowania.

Ich soma jest większa w prostopadłościanie i nie posiadają procesów wydłużonych promieniowo, jak widać z boku warstwy komórek wyściółki. Komórki znakowane tdTomato-mem to najprawdopodobniej komórki wyściółki, które znajdują się powyżej warstwy wyściółki. W przeciwieństwie do tego, wprowadzenie plazmidu eksprymującego tdTomato-mem do poszczególnych komórek wyściółki powoduje ekspresję tdTomato-mem oprócz początkowego znakowania komórek.

Najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to przecięcie tylko końcówki naczynia włosowatego i penetracja warstwy wyściółki podczas wstrzykiwania, tak aby płyn rozszedł się po całej komorze. Technika ta umożliwia długoterminowe monitorowanie pojedynczych komórek wyściółki mózgowej za pomocą obrazowania in vivo, a tym samym ustalenie ich roli w regeneracji mózgu, a także ich rozległego powiązania genetycznego in vivo.