Name: Metoda elektroporacji do dostarczania in vivo plazmidowego DNA w kresomózgowiu dorosłego danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji do etykietowania pojedynczych komórek ependymoglia w kresomózgowiu Danio rerio. Technika umożliwia długoterminowe monitorowanie i manipulację szlakami sygnałowymi w komórkach dorosłej rybki pręgowanej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Specjalne podziękowania dla Jamesa Copti za redakcję rękopisu. Wyrażamy również wdzięczność za dofinansowanie dla JN przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) przez SFB 870 i SPP "Integrative Analysis of Olfaction" i SPP 1738 "Emerging roles of non-coding RNAs in nervous system development, plasticity & disease" SPP1757 "Glial heterogeneity" oraz Strategię Doskonałości w ramach Monachijskiego Klastra Neurologii Systemowej (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198).

Wszystkie zwierzęta użyte w tym protokole były trzymane w standardowych warunkach hodowlanych, a eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami UE oraz Rządu Górnej Bawarii (AZ 55.2-1-54-2532-0916).
1. Przygotowanie mieszaniny plazmidu do elektroporacji
<ol>
	<li>Rozcieńczyć interesujący nas plazmid w sterylnej wodzie i dodać roztwór podstawowy z szybkim zielonym zabarwieniem [1 mg/ml]. Upewnij się, że końcowe stężenie plazmidu wynosi ∼1 μg/μL. Dodaj barwnik o stężeniu nie większym niż 3%, ponieważ jego jedynym celem jest zabarwienie roztworu i wizualizacja wstrzyknięcia komorowego.</li>
	<li>Po przygotowaniu wymieszać roztwór plazmidu, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół lub stukając palcem. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) do momentu użycia. 
	nuta: W przypadku koelektroporacji dwóch plazmidów w tym samym ogniwie należy upewnić się, że stężenie każdego pojedynczego plazmidu użytego w mieszaninie wynosi co najmniej 0,8 ng/μl przy stosunku molowym 1:1, aby uzyskać 80%–90% wydajności koelektroporacji.</li>
</ol>
2. Przygotowania do iniekcji i zabiegu elektroporacji
<ol>
	<li>Przygotować szklane kapilary (średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm) niezbędne do wstrzyknięcia w aparacie do wyciągania igły.</li>
	<li>W celu wstrzyknięcia odpowiedniej ilości plazmidu (patrz wyżej), pociągnij kapilarnę do temperatury 68,5 °C za pomocą dwóch lekkich i dwóch ciężkich ciężarków (patrz Tabela materiałów dla specyfikacji ściągacza). 
	nuta: W przypadku, gdy używany jest inny ściągacz, skalibruj kapilarę, aby dostarczyć odpowiednią objętość mieszanki do elektroporacji.</li>
	<li>Ręcznie ustaw urządzenie wtryskowe na ciśnienie wtrysku 200 hPa (obracając pokrętło Pi) i stałe ciśnienie 0 hPa. Ręcznie ustaw czas wtrysku na tryb ręczny i kontroluj ciśnienie za pomocą pedału nożnego.</li>
	<li>Ustaw urządzenie do elektroporacji w "trybie LV" z pięcioma impulsami pod napięciem 54–57 V (25 ms każdy w odstępach 1 s). Podłącz elektrody do urządzenia.</li>
	<li>Przygotuj jedno akwarium z czystą wodą dla ryb, w którym ryby zostaną wybudzone ze znieczulenia po zabiegu elektroporacji. Napowietrzaj wodę, trzymając kamień napowietrzający przymocowany do pompy powietrza przez cały okres rekonwalescencji, aż ryba zostanie całkowicie obudzona.</li>
	<li>Weź zwykłą gąbkę kuchenną i wykonaj podłużne nacięcie w gąbce, aby przytrzymać rybę podczas procedury iniekcji i elektroporacji (patrz poprzednia publikacja3). 
	nuta: Gąbkę kuchenną należy regularnie myć lub wymieniać w celu usunięcia potencjalnie toksycznych chemikaliów.</li>
	<li>Umieść niewielką ilość wysoce przewodzącego, wielofunkcyjnego żelu ultradźwiękowego obok zestawu do wstrzykiwań i elektroporacji. 
	nuta: Zapewni to odpowiednią przewodność elektryczną, a co za tym idzie, rozmieszczenie elektroporowanych komórek w całym kresomózgowiu.</li>
</ol>
3. Znieczulenie danio pręgowanego
<ol>
	<li>Przed znieczuleniem należy przygotować podstawowy roztwór znieczulenia z 0,2% MS222 w wodzie destylowanej i dostosować pH do 7 za pomocą buforu Tris-HCl. Rozcieńczyć ten bulion w stosunku 1:10 (tj. do 0,02% MS222) za pomocą wody dla ryb.</li>
	<li>Znieczulij ryby, trzymając je w tym roztworze roboczym, aż ruch ciała i skrzeli ustąpi (zwykle na kilka minut).</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie roztworu plazmidu
<ol>
	<li>Wypełnij przygotowaną szklaną kapilę 10 μl roztworu plazmidu za pomocą końcówek mikroładowacza. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza wewnątrz kapilary.</li>
	<li>Nacisnąć Menu/Zmień kapilar na urządzeniu do wstrzykiwania. Włożyć igłę i zamocować w uchwycie igły.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym o powiększeniu 3,2x lub 4x odetnij tylko końcówkę kapilary za pomocą kleszczyków z cienkimi końcami. Przełącz urządzenie do wstrzykiwania z trybu zmiany kapilary na tryb wstrzykiwania, a następnie naciskaj pedałem nożnym, aby upewnić się, że roztwór plazmidu łatwo wydostaje się z igły i bez przeszkód.</li>
	<li>Przenieś rybę ze zbiornika hodowlanego do pojemnika (plastikowego pudełka) z roztworem znieczulającym. Poczekaj kilka minut, aż ruch skrzeli ustąpi.</li>
	<li>Umieść rybę w wstępnie zwilżonej gąbce grzbietem do góry. Wykonaj wszystkie poniższe etapy iniekcji pod mikroskopem stereoskopowym, aby zapewnić dokładność procedury.</li>
	<li>Za pomocą mikronoża preparacyjnego ze stali nierdzewnej o krawędzi tnącej 40 mm i grubości 0,5 mm wykonaj mały otwór w czaszce ryby po tylnej stronie kresomózgowia (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B), tuż obok granicy z tectum optycznym. 
	nuta: Ten krok należy wykonać ostrożnie, ponieważ otwór powinien być bardzo mały i powierzchowny, przenikający wyłącznie do czaszki, aby uniknąć uszkodzenia mózgu.</li>
	<li>W razie potrzeby przechyl rybę i skieruj końcówkę szklanej kapilary w kierunku czaszki pod odpowiednim kątem, aby ułatwić penetrację końcówki kapilary przez otwór.</li>
	<li>Ostrożnie przełóż końcówkę naczynia włosowatego przez otwór w czaszce, aż dotrze do komory kresomózgowia (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Będzie to wymagało penetracji przez grzbietową warstwę komórek wyściółki. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie wprowadzić naczynia włosowatego zbyt głęboko, aby uniknąć kontaktu z tkanką mózgową. Utrzymuj naczynia włosowate dokładnie między półkulami, pozostając wewnątrz komory tuż po przebiciu grzbietowej warstwy wyściółki. 
	nuta: To bardzo delikatny krok. Dokładność tej procedury jest poprawiona dzięki zmutowanym liniom pigmentacji, takim jak brassy24, co pozwala na lepszą wizualizację położenia szklanych naczyń włosowatych podczas iniekcji.</li>
	<li>Z końcówką kapilarną wewnątrz komory, wstrzyknąć roztwór plazmidu, naciskając pedałem nożnym przez około 10 s, co odpowiada około 1 μl roztworu plazmidu. 
	nuta: W przypadku zmiany ściągacza igieł, kapilar lub wtryskiwacza, system powinien być skalibrowany tak, aby zawsze dostarczał 1 μl roztworu plazmidu. Kalibrację można przeprowadzić, mierząc średnicę kropelki plazmidu wydalanej do oleju mineralnego (np. oleju parafinowego), a następnie obliczając objętość kropli. Po 10 s od wstrzyknięcia do oleju mineralnego powinno zostać wydalone ~1 μL płynu plazmidowego.</li>
	<li>Potwierdź powodzenie poprzedniego kroku, obserwując rozprzestrzenianie się płynu w komorze.</li>
</ol>
5. Elektroporacja
<ol>
	<li>Wyjąć rybę z zestawu do wstrzykiwań, trzymając ją w gąbce.</li>
	<li>Zanurz wewnętrzną stronę końcówki elektrod w żelu ultradźwiękowym.</li>
	<li>Przykryj kresomózgowie ryb niewielką ilością żelu do ultradźwięków.</li>
	<li>Umieść głowę ryby między elektrodami, umieszczając elektrodę dodatnią po brzusznej stronie głowy ryby, a elektrodę ujemną po stronie grzbietowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C), nadal trzymając ciało ryby w gąbce. Wyznacza to kierunek przepływu prądu niezbędnego do elektroportowania wyściółki umieszczonej w strefie podkomorowej.</li>
	<li>Delikatnie i precyzyjnie dociśnij elektrody do kresomózgowia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Zarządzaj prądem za pomocą pedału nożnego. Przytrzymaj elektrody na miejscu, aż wszystkie pięć impulsów zostanie zakończonych.</li>
</ol>
6. Odzyskiwanie ryb
<ol>
	<li>Pozwól rybie dojść do siebie w przygotowanym, stale napowietrzanym zbiorniku, aż się obudzi. Żel lidokainowy można nakładać na czaszkę w celu złagodzenia ewentualnego bólu.</li>
</ol>

<ol><li>Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+neurogenesis+and+regeneration+in+the+non-mammalian+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+Series+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).</li>
<li>Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+telencephalon%3A+a+model+for+comparative+analysis+of+reactive+gliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis.</a> Glia. 60 (3), 343-357 (2012).</li>
<li>Barbosa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 346 (6236), 789-793 (2015).</li>
<li>Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regeneration+in+a+zebrafish+model+of+adult+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury.</a> Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).</li>
<li>Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+adult+zebrafish+brain+from+neurogenic+radial+glia-type+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors.</a> Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).</li>
<li>Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li>
<li>Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokineticin+2+expression+is+associated+with+neural+repair+of+injured+adult+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon.</a> Journal of Neurotrauma. , (2010).</li>
<li>Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+brain+injury+in+adult+zebrafish+stimulates+neurogenesis+and+long-distance+neuronal+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration.</a> Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).</li>
<li>Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+zebrafish+-+from+embryo+to+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult.</a> Neural Development. 8 (3), (2013).</li>
<li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li>
<li>Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+brain+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmetal+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish.</a> Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).</li>
<li>Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+and+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system.</a> Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).</li>
<li>Lyons, D. A., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+development+and+function+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Glial cell development and function in zebrafish.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586(2014).</li>
<li>Obermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Surface+Proteome+of+Adult+Neural+Stem+Cells+in+Zebrafish+Unveils+Long-Range+Cell-Cell+Connections+and+Age-Related+Changes+in+Responsiveness+to+IGF%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF.</a> Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Kusumanto, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+in+vivo+transfer+of+plasmid+DNA+in+muscle%3A+comparison+of+electroporation+versus+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound.</a> Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).</li>
<li>Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gene+transfer+into+the+adult+zebrafish+brain+by+herpes+simplex+virus+1+%28HSV-1%29+and+electroporation%3A+methods+and+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications.</a> Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).</li>
<li>Van Tendeloo, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+gene+delivery+by+mRNA+electroporation+in+human+hematopoietic+cells%3A+superiority+to+lipofection+and+passive+pulsing+of+mRNA+and+to+electroporation+of+plasmid+cDNA+for+tumor+antigen+loading+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells.</a> Blood. 98 (1), 49-56 (2001).</li>
<li>Mars, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotransfection+and+lipofection+show+comparable+efficiency+for+in+vitro+gene+delivery+of+primary+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts.</a> The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).</li>
<li>Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+in+vivo+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+the+zebrafish+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon.</a> Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).</li>
<li>Di Giaimo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Aryl+Hydrocarbon+Receptor+Pathway+Defines+the+Time+Frame+for+Restorative+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis.</a> Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+step+generation+of+customizable+gRNA+vectors+for+multiplex+CRISPR+approaches+through+string+assembly+gRNA+cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR).</a> PLoS One. 13 (4), e0196015(2018).</li>
<li>Barbosa, J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarbosa%2C+JS+%22In+vivo+single+cell+analysis+reveals+distinct+behavior+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+homeostasis+and+regeneration+in+the+adult+brain%22">In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain</a>. , University of Coimbra. Doctoral dissertation (2014).</li>
<li>Kelsh, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+pigmentation+mutations+and+the+processes+of+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development.</a> Development. 123, 369-389 (1996).</li>
<li>Torper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Reprogramming+of+Striatal+NG2+Glia+into+Functional+Neurons+that+Integrate+into+Local+Host+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry.</a> Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).</li>
<li>Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+formation+with+plasmid+DNA+increases+the+cytotoxicity+of+cationic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).</li>
<li>Chapouton, P., Godinho, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChapouton%2C+P+%22Neurogenesis.+Chapter+IV+in+The+Zebrafish%3A+Cellular+and+Developmental+Biology%2C+Part+A+Developmental+Biology%22">Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology</a>. Detrich, H. W. III, Westerfield, M., Zon, L. 100, Academic Press. (2010).</li>
<li>Zhu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Dissection+of+Neuronal+Circuits+in+Zebrafish+using+Viral+Gene+Transfer+and+the+Tet+System%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten protokół elektroporacji jest wiarygodną metodą znakowania in vivo pojedynczych komórek wyściółki mózgowej. Protokół może wymagać dalszej adaptacji w celu oznakowania innych typów komórek, takich jak neurony lub oligodendrocyty. Aby osiągnąć skuteczne znakowanie, można zastosować plazmidy zawierające różne promotory. Promotor beta aktyny kurczaka, eF1alfa, CMV i promotor ubikwityny były wcześniej używane do kierowania ekspresją różnych transgenów w ependymoglia i ich potomstwie23. Zaobserwowano...

Danio pręgowany to doskonałe modele zwierzęce do badania regeneracji mózgu po zranieniu kłutym. W porównaniu ze ssakami, na drabinie ewolucyjnej, mniej rozwinięte gatunki, takie jak danio pręgowany, na ogół wykazują wyższe wskaźniki konstytutywnej neurogenezy i szersze obszary pobytu dorosłych nerwowych komórek macierzystych, co prowadzi do ciągłego generowania nowych neuronów w większości obszarów mózgu w dorosłym życiu. Ta cecha wydaje się korelować ze znacznie wyższą zdolnością regeneracyjną danio pręgowanego w porównaniu ze ssakami1, ponieważ danio pręgowany ma niezwykły potencjał do efektywnego generowania nowych neuronów w większości badanych modeli uszkodzeń mózgu2,3,4,5,6,7,8. Tutaj badana jest telecefalon danio pręgowanego, ponieważ jest to obszar mózgu z wyraźną neurogenezą w wieku dorosłym. Te strefy neurogenezy dorosłego ssaka są homologiczne do stref neurogennych w mózgu dorosłego ssaka9,10,11.
Liczne obszary neurogenne w kresomózgowiu danio pręgowanego są obecne dzięki istnieniu promienistych komórek glejowych lub komórek ependymoglii. Komórki wyściółki działają jak dorosłe nerwowe komórki macierzyste i są odpowiedzialne za generowanie nowych neuronów zarówno w nienaruszonym, jak i regenerującym się mózgu3,5. Eksperymenty ze śledzeniem linii wykazały, że wyściółka komorowa reaguje na uraz, a następnie namnaża się i generuje nowe neuroblasty, które migrują do miejsca uszkodzenia5. Ze względu na nieustanny charakter kresomózgowia danio pręgowanego, komórki wyściółki wyściełają powierzchnię komory i budują brzuszną ścianę komory. Ściana komory grzbietowej jest utworzona przez grzbietową warstwę komórek wyściółki (ryc. 1A). Co ważne, ependymoglia danio pręgowanego ucieleśniają cechy zarówno promienistego gleju jak i komórek wyściółki ssaków. Długie wyrostki promieniowe są typową cechą promieniowych komórek glejowych, podczas gdy rozszerzenia komórkowe i ścisłe połączenia (a także ich pozycje komorowe) są typowymi cechami komórek wyściółki12,13,14. Dlatego komórki te są określane jako komórki wyściółki.
Aby śledzić in vivo zachowanie pojedynczych komórek ependymoglialnych podczas regeneracji, muszą one być niezawodnie oznaczone. Wcześniej opisano różne metody znakowania komórek in vivo do mikroskopii fluorescencyjnej, takie jak endogenne reportery lub barwniki lipofilowe15. Metody te, w przeciwieństwie do elektroporacji, mogą wymagać dłuższych okresów czasu i często nie oferują możliwości znakowania pojedynczych komórek lub trwałego, długoterminowego śledzenia. Jednak elektroporacja (oprócz znakowania pojedynczych komórek) daje możliwość wprowadzenia nowego DNA do komórki gospodarza. Co więcej, w porównaniu z innymi metodami transferu DNA do komórek, wykazano, że elektroporacja jest jedną z najbardziej wydajnych metod16,17,18,19.
Prezentowany tutaj jest protokół elektroporacji, który został udoskonalony w celu oznaczania pojedynczych komórek ependymoglialnych u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego. Protokół ten pozwala na znakowanie pojedynczych komórek wyściółki w celu śledzenia ich przez długi czas20 lub manipulowania określonymi szlakami w sposób autonomiczny dla komórki21,22.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik/Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>Do barwienia roztworu plazmidu</td></tr><tr><td>MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>MS222 należy przechowywać w temperaturze pokojowej (do dwóch tygodni) i chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Żel do ultradźwięków</td><td>SignaGel, Parker laboratories INC.</td><td>15-60</td><td>Elektroda Żel</td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa powietrza</td><td>TetraTec APS 50, 10l-60l</td><td></td><td>Można kupić w sklepach zoologicznych</td></tr><tr><td>BTX Pęsety Elektrody</td><td>Platynowa Pęseta, BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0486</td><td>Średnica 1 mm</td></tr><tr><td>Urządzenie do elektroporacji</td><td>BTX ECM830 System elektroporacji fali prostokątnej, BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0662</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie iniekcyjne</td><td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td><td>5252000013</td><td></td></tr><tr><td>Standardowa ścianka kapilarna ze szkła borokrzemianowego</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0766</td><td>Model nr: G100-4</td></tr><tr><td>Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Mikronóż</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator joysticka</td><td>Narishige Japan</td><td>MN - 151</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igłę</td><td>FemtoJet 4i, Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>Uchwyt na igłę dostarczany w zestawie z urządzeniem do wstrzykiwania</td></tr><tr><td>Urządzenie do wyciągania igieł</td><td>Narishige Japonia</td><td>Model nr: PC-10</td><td>PC-10 został wycofany przez Narishige w 2017 roku i zastąpiony przez</td></tr><tr><td>szalki Petriego</td> PC-100 <td>Greiner Bio-One International</td><td>633161</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda elektroporacji do dostarczania in vivo plazmidowego dna w kresomózgowiu dorosłego danio pręgowanego

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Elektroporacja to metoda transfekcji, w której pole elektryczne jest przykładane do komórek, aby stworzyć tymczasowe pory w błonie komórkowej i zwiększyć jej przepuszczalność, umożliwiając w ten sposób wprowadzenie różnych cząsteczek do komórki. W niniejszej pracy elektroporacja jest stosowana do wprowadzania plazmidów do komórek wyściółki, które wyściełają strefę komorową dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego. Frakcja tych komórek wykazuje właściwości komórek macierzystych i generuje nowe neurony w mózgu danio pręgowanego; Dlatego badanie ich zachowania jest niezbędne do określenia ich roli w neurogenezie i regeneracji. Wprowadzenie plazmidów za pomocą elektroporacji umożliwia długoterminowe znakowanie i śledzenie pojedynczej komórki eścigomogliicznej. Co więcej, plazmidy, takie jak rekombinaza Cre lub Cas9, mogą być dostarczane do pojedynczych komórek wyściółkowo-moglialnych, co umożliwia rekombinację genów lub edycję genów i daje unikalną możliwość oceny autonomicznej funkcji genów komórki w kontrolowanym, naturalnym środowisku. Wreszcie, ten szczegółowy, krok po kroku protokół elektroporacji jest używany do uzyskania udanego wprowadzenia plazmidów do dużej liczby pojedynczych komórek wyściółkiowych.

Opisana metoda elektroporacji umożliwia wprowadzenie plazmidowego DNA do komórek ependymoglialnych, które znajdują się powierzchownie w telencefalonie rybki danio-ostrego, tuż pod grzbietową warstwą komórek ependymalnych (Rycina 1A).
Jeśli wynik elektroporacji jest pozytywny, spośród innych komórek ependymoglialnych (białe w Ryc. 2A,B) można zaobserwować znakowane pojedyncze komórki...

Przedstawiona tutaj jest metoda elektroporacji do dostarczania plazmidowego DNA i znakowania komórek ependymoglialnych u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego. Protokół ten jest szybką i skuteczną metodą wizualizacji i śledzenia pojedynczych komórek eścidendomoglialnych i otwiera nowe możliwości zastosowania elektroporacji w szerokim zakresie manipulacji genetycznych.

Metoda elektroporacji do dostarczania in vivo plazmidowego DNA w kresomózgowiu dorosłego danio pręgowanego

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...

Protokół ten umożliwia znakowanie pojedynczych komórek wyściółki w kresomózgowiu danio pręgowanego, aby umożliwić ich długoterminowe monitorowanie, a także manipulowanie określonymi szlakami w sposób autonomiczny dla komórki. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona szybkie i skuteczne znakowanie pojedynczych komórek, a także edycję genów i manipulację szlakiem sygnałowym w sposób autonomiczny dla komórki. Metoda ta pozwala na badanie podstawowych zagadnień biologii komórki, na przykład dotyczących delaminacji komórek, utrzymania homeostazy nabłonka i symetrii podziału komórki.Zacznij od użycia aparatu do wyciągania igieł do przygotowania szklanych naczyń włosowatych. Użyj końcówek mikroładowarki, aby wypełnić przygotowaną szklaną kapilę dziesięcioma mikrolitrami roztworu plazmidu. Następnie naciśnij menu zmień kapilarę" na urządzeniu do wstrzykiwań, aby umożliwić załadowanie igły do uchwytu igły.Następnie przełącz urządzenie iniekcyjne z trybu zmiany kapilary na tryb wstrzykiwania. Następnie, za pomocą mikroskopu stereoskopowego z czterokrotnym powiększeniem i kleszczykami Findena, przeciąć tylko końcówkę naczynia włosowatego. Następnie dociśnij pedał nożny, aby upewnić się, że roztwory plazmidowe łatwo wychodzą z igły bez przeszkód.Gdy igła będzie gotowa, przenieś danio pręgowanego ze zbiornika hodowlanego do pojemnika z roztworem znieczulającym. I poczekaj kilka minut, aż ruch skrzeli ustąpi. Dociśnij uspokojoną rybę grzbietową stroną do góry na wstępnie zwilżoną gąbkę pod mikroskopem stereoskopowym i użyj mikronoża do preparowania ze stali nierdzewnej z 40-milimetrową krawędzią tnącą i grubością 0,5 milimetra, aby ostrożnie utworzyć mały otwór w czaszce ryby po tylnej stronie kresomózgowia, tuż obok granicy tektum optycznego.W razie potrzeby przechyl rybę i skieruj końcówkę szklanej kapilary w kierunku czaszki pod odpowiednim kątem, aby ułatwić penetrację końcówki kapilary przez otwór. Następnie bardzo ostrożnie włóż końcówkę naczynia włosowatego do otworu przez grzbietową warstwę komórek wyściółki, aż dotrze do komory kresomózgowia i naciskaj na pedał nożny przez około 10 sekund, aby dostarczyć około 1 mikrolitra roztworu plazmidu. Powodzenie porodu można potwierdzić, obserwując rozprowadzanie się zielonego płynu po całej komorze.Przykryj kresomózgowie ryb niewielką ilością żelu do ultradźwięków. W celu elektroporacji zwierzęcia, któremu wstrzyknięto plazmid, należy wyjąć gąbkę z zestawu do wstrzykiwań i zanurzyć wewnętrzną stronę elektrokońcówek w żelu ultradźwiękowym. Umieść głowę ryby między elektrodami, tak aby elektroda dodatnia znajdowała się po brzusznej stronie głowy, a elektroda ujemna po stronie grzbietowej.Następnie, nadal trzymając ciało ryby w gąbce, delikatnie i precyzyjnie dociśnij elektrody do kresomózgowia i podawaj prąd za pomocą pedału nożnego, przytrzymując elektrody na miejscu, aż wszystkie pięć impulsów zostanie zakończonych. Jeśli elektroporacja się powiedzie, pojedyncze komórki epredymoglialne znakowane plazmidem można zaobserwować wśród komórek ependymoglialnych znakowanych plazmidem. W zależności od skuteczności procesu elektroporacji można znakować większą lub mniejszą liczbę komórek wyściółkomoglialnych.Niemniej jednak zademonstrowany protokół daje większą liczbę znakowanych komórek niż poprzednio opublikowane protokoły. Należy zauważyć, że największa gęstość znakowanych komórek ma tendencję do pojawiania się głównie po wewnętrznej stronie komór obu półkul ze względu na sposób, w jaki wstrzyknięty płyn plazmidowy rozprowadza się między półkulami. Na tym filmie jedna półkula kresomózgowia danio pręgowanego jest przedstawiona w 3D, gdzie komórki wyściółki z procesami radiowymi są w kolorze purpurowym, gdy obserwuje się je z boku.Poprzez koelektroporację z innym plazmidem, który znakuje jądra, można zaobserwować podział komórek wyściółkomoglii. Nieudana elektroporacja skutkuje bardzo małą liczbą lub brakiem znakowanych komórek wyściółkomoglialnych. Jednak komórki wyściółki grzbietowej są najbardziej prawdopodobne do znakowania.Ich soma jest większa w prostopadłościanie i nie posiadają procesów wydłużonych promieniowo, jak widać z boku warstwy komórek wyściółki. Komórki znakowane tdTomato-mem to najprawdopodobniej komórki wyściółki, które znajdują się powyżej warstwy wyściółki. W przeciwieństwie do tego, wprowadzenie plazmidu eksprymującego tdTomato-mem do poszczególnych komórek wyściółki powoduje ekspresję tdTomato-mem oprócz początkowego znakowania komórek.Najważniejsze rzeczy, o których należy pamiętać, to przecięcie tylko końcówki naczynia włosowatego i penetracja warstwy wyściółki podczas wstrzykiwania, tak aby płyn rozszedł się po całej komorze. Technika ta umożliwia długoterminowe monitorowanie pojedynczych komórek wyściółki mózgowej za pomocą obrazowania in vivo, a tym samym ustalenie ich roli w regeneracji mózgu, a także ich rozległego powiązania genetycznego in vivo.

electroporation-method-for-vivo-delivery-plasmid-dna-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Rozdzielczość czasowa i przestrzenna manipulacji genetycznych determinuje spektrum zjawisk biologicznych, na które mogą one oddziaływać. W niniejszej pracy wykorzystujemy dyskretną czasowo i przestrzennie elektroporację in vivo, w połączeniu z transgenicznymi liniami danio pręgowanego, aby indukować ekspresję transgenu GFP specyficznie w neuronach rozwijającej się opolśnij węchowej.

Targetowanie neuronów opłaty węchowej z wykorzystaniem połączonej elektroporacji in vivo oraz linii ryb danio-ostroskrzelnych typu enhancer trap opartych na Gal4

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Opisujemy metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego podczas regeneracji płetwy u dorosłych ryb zebrafish. Technika ta polega na mikroiniekcji i elektroporacji antysensownych oligonukleotydów morpholino do tkanki płetwy, co pozwala na badanie roli białka w różnych etapach regeneracji płetwy, w tym podczas gojenia rany, tworzenia blastemy oraz regeneracyjnego wzrostu.

In vivo elektroporacja morfolin do regenerującej płetwy ogonowej dorosłego zebrafisha

Ten film opisuje elektroporację in vivo, która jest techniką dostarczania DNA do komórek ependymoglialnych u dorosłych ryb pręgowanych.

In vivo (in vivo) Elektroporacja: specyficzna dla danego miejsca metoda transfekcji danio pręgowanego

Ten film opisuje technikę wstrzykiwania domięśniowego w celu dostarczania związków do mięśni grzbietowych dorosłego danio pręgowanego.

Wstrzyknięcie domięśniowe (IM): Podanie związku do mięśnia grzbietowego dorosłego danio pręgowanego

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Aby rzucić światło na komórkowe i molekularne mechanizmy neurogenezy i regeneracji dorosłego danio pręgowanego, opracowaliśmy protokół inwazyjnej chirurgii powodującej mechaniczne urazy u dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego i późniejszego monitorowania zmian w ugodzonej półkuli za pomocą immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ.

Rana kłuta dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego: metoda badania neurogenezy i regeneracji mózgu kręgowców

Przedstawiamy skuteczny i łatwy w użyciu protokół do przygotowania pierwotnych hodowli komórkowych zarodków danio pręgowanego do transfekcji i obrazowania żywych komórek, a także protokół do przygotowania pierwotnych komórek z mózgu dorosłego danio pręgowanego.

Hodowla i transfekcja komórek pierwotnych danio pręgowanego

Tutaj opisujemy protokół immunizacji dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) szczepionką opartą na DNA i pokazujemy walidację udanego szczepienia. Metoda ta jest odpowiednia do przedklinicznych badań przesiewowych kandydatów na szczepionki w różnych modelach infekcji.

Uodparnianie dorosłych ryb danio pręgowanego do przedklinicznych badań przesiewowych szczepionek opartych na DNA

Opisano nową metodę iniekcji dootrzewnowej (IP) u dorosłych ryb pręgowanych. W przypadku stosowania związków toksycznych, takich jak doksorubicyna, procedura ta jest bardziej skuteczna niż dwie wcześniej opisane metody IP. Technika ta została zaprojektowana tak, aby mogła być łatwo zaadoptowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w modelowaniu danio pręgowanego.

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

Poznaj metodę elektroporacji do etykietowania pojedynczych komórek ependymoglia w kresomózgowiu Danio rerio. Technika umożliwia długoterminowe monitorowanie i manipulację szlakami sygnałowymi w komórkach dorosłej rybki pręgowanej.

Metoda elektroporacji do dostarczania in vivo plazmidowego DNA w kresomózgowiu dorosłego danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów