Mechanistyczny wgląd w rozwój zwłóknienia jelit za pośrednictwem TNBS i ocena hamującego działania rapamycyny

Protokół ten wykazuje wysoce porównywalną patofizjologię zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna u ludzi, a także omawia hamujące działanie rapamycyny na zwłóknienie jelit. Główną zaletą tego protokołu jest to, że opisuje on rozwój zwłóknienia jelit w bardzo krótkim czasie wahającym się od czterech do ośmiu tygodni, co daje nam możliwość zbadania naprawy i regeneracji tkanek. Protokół ten będzie pomocny dla badaczy, którzy spieszą się z poznaniem mechanizmu zwłóknienia i pomoże znaleźć lepszą technologię przewidywania interwencji w przypadku zwłóknienia jelit związanego z chorobą Leśniowskiego-Crohna.

Aby rozpocząć tę procedurę, ogol dorosłe myszy w okolicy szyi, aby wstępnie uwrażliwić je na TNBS poprzez ekspozycję skórną. Następnie nasącz wacik z kotonu TNBS i przyłóż go do ogolonego obszaru szyi myszy. Osiem dni po uczuleniu wywołaj zapalenie jelita grubego przez podanie doodbytnicze raz w tygodniu przez sześć tygodni.

Aby to zrobić, nałóż cztery miligramy TNBS w 25% etanolu za pomocą 100 mikrolitrowej lewatywy za pomocą jednomililitrowej strzykawki przymocowanej do stalowej igły do zgłębnika. Podaj myszom kontrolnym tylko 100 mikrolitrów 25% etanolu. Po znieczuleniu myszy, dootrzewnowo wstrzykuje się rapamycynę w ilości dwóch miligramów na kilogram dziennie lub nośnik, lub jedno i drugie, co dzień powszedni przez trzy do sześciu tygodni zarówno myszom kontrolnym, jak i leczonym TNBS.

Następnie użyj sześciotygodniowych jelit myszy po leczeniu TNBS do analizy testów zewnątrzkomórkowych. Najpierw otwórz okrężnicę wzdłużnie w lodowatym HBSS i umyj okrężnicę w HBSS. Za pomocą sterylnych nożyczek pokrój okrężnicę na małe kawałki, które mają około pięciu centymetrów w HBSS.

Przenieś małe kawałki tkanki okrężnicy do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej 10 mililitrów buforu do wstępnego trawienia. Potrząsaj probówką z prędkością 100 obr./min w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie przepuść zawiesinę przez sitko o średnicy 40 mikrometrów i wyrzuć przyczepiony nabłonek okrężnicy.

Zebrać pozostałą tkankę z sitka i trawić ją dalej w buforze wytrawiającym zawierającym kolagenazę typu IV i DNASE1 w 1X HBSS z 5% FBS przez 20 minut w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 100 obr./min. Następnie należy wirować strawione tkanki przez około 20 sekund i przepuścić je przez sitko do komórek o średnicy 40 mikrometrów, aby uzyskać frakcje blaszki właściwej. Odwiruj frakcje blaszki właściwej w temperaturze 700 razy G i czterech stopniach Celsjusza, aby rozpruć komórki.

Następnie przygotuj 100 mililitrów roztworów gradientowych o gęstości 30% i 70%. Ponownie zawiesić uzyskane komórki w 10 mililitrach 30% roztworu i nałożyć go na pięć mililitrów 70% roztworu w 15-mililitrowej probówce. Odwirować gradient w stanie wolnym od pękania w temperaturze 1 000 razy G i temperaturze pokojowej.

Zbierz fazę białego pierścienia zawierającą limfocyty blaszki właściwej, które będą znajdować się między warstwami gradientu od 30% do 70%. Otrzymane komórki umyć poprzez ponowne zawieszenie ich w lodowatym HBSS i odwirowanie w temperaturze 500 razy G i 10 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie ponownie zawieś komórki w buforze FACS.

Przed barwieniem przeciwciał należy najpierw zablokować powierzchnię komórek blaszki właściwej, inkubując je z anty-mysim blokerem CD16 by 32FC na lodzie przez 15 minut. Następnie inkubuj komórki z przeciwciałami PE anty-CX3CR1 wraz z mikrogranulkami anty-PE na lodzie przez 30 minut, aby uchwycić związane komórki, a następnie przemyj komórki buforem FACS. Przepuść przeciwciało i komórki związane z kulkami przez aktywowaną magnetycznie kolumnę sortowania komórek w polu magnetycznym, aby usunąć niezwiązane komórki.

Umyj komórki trzykrotnie buforem FACS. Następnie usuń kolumnę z pola magnetycznego i wepchnij tłok w kolumnie, aby uzyskać komórki związane z koralikami. Najpierw zablokuj komórki blaszki właściwej za pomocą anty-mysiego blokera CD16 przez 32FC na lodzie.

Odcedź komórki, inkubując z przeciwciałami anty-CD64, CD11c, CD11b, CX3CR1, Ly6C i MHC klasy II, a następnie posortuj komórki za pomocą cytometru przepływowego FACS, jak opisano w protokole tekstowym. Zdaj posortowane komórki w celu przygotowania całkowitego RNA i wykryj cytokiny i markery zwłóknieniowe. Analiza ekspresji mRNA markerów zwłóknieniowych i analiza cytokin zapalnych z izolowanych zawiesin pojedynczych komórek z oczyszczania magnetycznego.

Aby rozpocząć barwienie i analizę powierzchni komórek, ponownie zawieś od 500 000 do 1 miliona izolowanych komórek blaszki właściwej w 15 mililitrach buforu FACS. Inkubować komórki z przeciwciałami anty-CD16 przez 32 przeciwciała w rozcieńczeniu od 1 do 50 na lodzie przez 10 minut. Następnie umyj komórki 500 mikrolitrami lodowatego buforu FACS w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Zawiesiny pojedynczych komórek okrężnicy barwieć powierzchniowo przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie w rozcieńczeniu od 1 do 100 na lodzie przez 30 minut. Umyj znakowane komórki dwukrotnie, aby usunąć niezwiązane przeciwciała, używając 500 mikrolitrów lodowatego buforu FACS do każdego przemycia. Następnie przeanalizuj znakowane komórki jednojądrzaste za pomocą cytometru przepływowego, jak opisano w protokole tekstowym.

Aby rozpocząć barwienie i analizę cytokin wewnątrzkomórkowych, użyj zestawu roztworu do permeabilizacji utrwalania, aby utrwalić i przepuszczalnie wybarwione powierzchniowo komórki zgodnie z instrukcjami producenta. Bramka komórek blaszki właściwej zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby wykryć wewnątrzkomórkowy poziom cytokiny beta IL-1. Następnie umyj komórki, dodając bufor FACS i odwirowując w temperaturze 200 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby usunąć nadmiar buforu utrwalającego.

Powtórz to pranie raz. Aby określić poziom aktyny mięśni gładkich alfa, najpierw przeprowadź przepuszczalność komórek za pomocą zestawu roztworu do permeabilizacji utrwalania. Inkubować komórki z przeciwciałami anty-alfa SMA Alexa Fluor 488 w rozcieńczeniu od 1 do 1000 na lodzie przez 30 minut.

Następnie umyj komórki, dodając bufor FACS i odwirowując w temperaturze 200 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby usunąć nadmiar buforu utrwalającego. Powtórz to pranie raz. Wykonaj analizę FACS i bramkuj komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

W tym badaniu mysi model zapalenia jelita grubego TNBS został przyjęty do badania i wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw zwłóknienia jelit. Po sześciu tygodniach leczenia TNBS można zauważyć, że długość okrężnicy skracała się stopniowo w trakcie leczenia TNBS z około pięciu centymetrów w grupie kontrolnej do około trzech centymetrów w grupie TNBS. Aby upewnić się, że model choroby Leśniowskiego-Crohna TNBS jest porównywalny z ludzkim modelem zwłóknienia Leśniowskiego-Crohna i nie jest artefaktem związanym z metodologią, markery zwłóknienia są analizowane na wielu poziomach w szczegółowym badaniu przebiegu czasowego.

Nagromadzenie komórek alfa mięśni gładkich dodatnich i odkładanie się kolagenu w warstwach podśluzówkowych odnotowano w większości przypadków zwłóknienia i jest uważane za cechę charakterystyczną zdarzeń zwłóknieniowych Aby porównać zwłóknienie TNBS ze zwłóknieniem związanym z chorobą Leśniowskiego-Crohna, analizuje się ekspresję markerów zwłóknienia i cytokin w biopsji świeżej tkanki z jelita krętego pacjentów z aktywną CD lub w remisji. Co ciekawe, obserwuje się wyraźną indukcję pogrubienia dodatnich warstw aktyny mięśni gładkich alfa i zwiększonego odkładania kolagenu w aktywnych odcinkach CD. Analizę Western blot przeprowadza się w celu potwierdzenia indukcji ekspresji aktyny alfa mięśni gładkich w aktywnych próbkach CD.

Ponadto za pomocą analizy qPCR wykrywa się znaczną indukcję markerów zwłóknienia. Działanie rapamycyny, farmakologicznego inhibitora aktywności M4, jest następnie oceniane w celu określenia mechanizmu ograniczającego zwłóknienie TNBS. Myszy są leczone zarówno TNBS, jak i rapamycyną, a poziomy aktyny alfa mięśni gładkich i kolagenu w histologii okrężnicy są analizowane.

Ważne jest, aby pamiętać o zaszczepieniu takiej samej ilości TNBS każdej myszy i jak najszybszym przetworzeniu wyizolowanych komórek blaszki właściwej, aby uniknąć utraty komórek, a także utrzymać ich żywotność. Nasz protokół zawiera szczegółowe informacje na temat zwłóknienia TNBS i remisji zwłóknienia, a także czynnika hamującego rapamycynę w tworzeniu zwłóknienia. Inni badacze mogą być zainteresowani wykorzystaniem tej techniki w celu znalezienia lepszego celu terapeutycznego dla zwłóknienia i raka jelita grubego.

Należy pamiętać, że TNBS działa drażniąco na skórę, a fartuchy laboratoryjne powinny być noszone podczas obsługi, aby uniknąć kontaktu ze skórą.