Name: Izolacja nienaruszonej gałki ocznej w celu uzyskania integralnej tkanki powierzchni oka do badania histologicznego i immunohistochemii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Poznaj metodę izolacji nienaruszonej gałki ocznej myszy wraz z powiekami i powierzchnią oka do badań histologicznych i immunohistochemicznych. Technika zachowuje integralność nabłonka powierzchni oka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują prof. Rong Ju za krytyczną lekturę manuskryptu, a wszystkim członkom laboratorium za pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC: 31571077; Pekin, Chiny), Projekt Innowacji w Dziedzinie Nauk i Technologii Miasta Kanton (201707020009; Guangzhou, prowincja Guangdong, Chiny), "Plan 100 osób" z Uniwersytetu Sun Yat-sen (8300-18821104; Guangzhou, prowincja Guangdong, Chiny) oraz finansowanie badań z Państwowego Kluczowego Laboratorium Okulistyki w Centrum Okulistycznym Zhongshan (303060202400339; Guangzhou, prowincja Guangdong, Chiny).

Wszystkie procedury związane z wykorzystaniem myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Centrum Okulistycznego Zhongshan i przestrzegały Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.
1. Sekcja gałki ocznej z nienaruszoną powierzchnią oka i powiekami
<ol>
	<li>Rozetnij głowę.
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji myszy w 10. dniu po urodzeniu (P10) i P28 (patrz Tabela materiałów dla szczepów myszy) przez zwichnięcie szyjki macicy, odetnij głowę od szyi za pomocą ostrych nożyczek.</li>
		<li>Przeciąć głowę na pół parą prostych nożyczek wzdłuż strzałkowej linii środkowej, zaczynając od kości międzyciemieniowej rostrycznie do nosa (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B). 
		UWAGA: Kość czaszki twardnieje wraz ze starzeniem się myszy, należy uważać, aby nożyczki cięły wzdłuż linii środkowej tak bardzo, jak to możliwe.</li>
		<li>Umieść każdą połówkę przeciętej na pół głowy na czystej szalce Petriego, najpierw odetnij szczękę i język ostrymi nożyczkami. Uwolnij nerw wzrokowy, odcinając go od mózgu przed lokalizacją skrzyżowania wzrokowego i usuń wszystkie tkanki mózgowe, w tym opuszkę węchową przyczepioną do ściany czaszki.</li>
		<li>Teraz pozostałe tkanki powinny mieć wszystkie kości czaszki/oczodołu związane z gałką oczną (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C,D). Umyj pozostałą część PBS, aby usunąć krew i resztki włosów.</li>
		<li>Przedrostek tkanek z 4% paraformaldehydem (PFA, w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem [PBS], pH 7,4) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze pokojowej (RT) z rotacją. Przybliżony czas utrwalenia jest następujący: ~10 min dla P0 do P7; ~20 min dla P8 do P28; i ~30 min dla P29 i starszych. 
		UWAGA: Prefiksacja zapewnia sztywność tkanki, co ułatwia późniejsze rozwarstwienie. Dodatkowo, prefiksacja pozwala uniknąć pozostawiania świeżej tkanki nieutrwalonej zbyt długo przed zakończeniem sekcji. 
		UWAGA: PFA jest niebezpieczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń czaszkę/kości oczodołu.
	<ol>
		<li>Po prefiksacji szybko umyj wypreparowaną głowę w PBS trzy razy, aby jeszcze bardziej wyeliminować złamane włoski i utrwalacze, aby przystąpić do dalszej sekcji. 
		UWAGA: Narażenie na utrwalacze podczas sekcji może być szkodliwe dla zdrowia.</li>
		<li>Umieść tkankę na 10 cm szalce Petriego, przetnij czaszkę na trzy części wzdłuż płaszczyzn wskazanych w <silna klasa="xfig">Rysunek 1D,E. Gałka oczna w oczodole jest ukryta w środkowej części czaszki pod kośćmi sitowymi, czołowymi i szczękowymi (<silna klasa="xfig">Ryc. 1D,E).</li>
		<li>Użyj dwóch par kleszczy prostych nr 4, aby odkleić kość sitową, aby w pełni odsłonić kości czołowe i szczękowe (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1F).</li>
		<li>Geograficznie podziel powierzchnię czaszki (w tym kości szczękowe i czołowe) na 4 obszary (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F). Włóż końcówkę zakrzywionych kleszczy poziomo w każdy obszar, aby kolejno usunąć kości szczęki i czołowe (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F). 
		UWAGA: Nie można usunąć wszystkich kości szczęki za jednym razem. Cierpliwie analizuj je kawałek po kawałku. Kość czołowa jest bezpośrednio połączona z gałką oczną poprzez miękkie tkanki łączne. Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania go z gałki ocznej, aby zapobiec rozciąganiu gałki ocznej i uszkodzeniu spojówki.</li>
		<li>Po usunięciu częściowej kości szczęki i całej kości czołowej, leżące poniżej kości łzowe i szyjne zostałyby odsłonięte (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). Usuń dwie kości i związane z nimi podskórne mięśnie i tłuszcze otaczające gałkę oczną, przytnij gałkę oczną z dołączonymi powiekami i skórą w mały kwadratowy blok, aby zmniejszyć objętość tkanki i ułatwić orientację tkanki podczas osadzania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1H).</li>
		<li>Umieść gałkę oczną i związane z nią tkanki z powrotem w 4% PFA i kontynuuj utrwalanie przez noc w temperaturze 4 °C. Utrwalona tkanka może być przechowywana przez co najmniej jeden miesiąc w temperaturze 4 °C w PBS z dodatkiem 0,02% NaN3. Alternatywnie natychmiast przystąp do analizy histologicznej. 
		UWAGA: Jeśli tkanka musi być przechowywana przez dłuższy czas, można ją łatwo przechowywać w 70% etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza histologiczna
<ol>
	<li>Wycinek parafinowy i barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)
	<ol>
		<li>Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem opisanym gdzie indziej9, aby wykonać zatapianie i cięcie parafiny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemia (IHC)
	<ol>
		<li>Odparafinować skrawki parafiny ksylenem i ponownie uwodnić skrawki za pomocą serii alkoholowych (100%, 95%, 80%) do wody destylowanej (dH2O).</li>
		<li>Przeprowadzić pobieranie antygenu przez obróbkę mikrofalową szkiełek tkankowych w 0,01 M buforze kwasu cytrynowego (3 g cytrynianu trisodowego, 0,4 g kwasu cytrynowego na 1 l podwójnie destylowanegoH2O) w szklanym szkiełku o niskiej mocy (120 W). Energia powinna być dostarczana z przerwami przez łącznie 5-10 minut, przy czym każda przerwa trwa około 2 minut. 
		UWAGA: Mikrofale o dużej mocy lub stałe podgrzewanie doprowadziłoby do oderwania się skrawków tkanki od szkiełka.</li>
		<li>Wyjmij szkiełka ze szklanego słoika, ostrożnie zetrzyj resztki płynu otaczającego każdą sekcję za pomocą chusteczek do twarzy i umieść je na stojaku na szkiełka w pudełku histologicznym. Narysuj kwadrat wokół każdej sekcji wodoodpornym pisakiem histologicznym. Umieścić 100 μl buforu blokującego (0,1% triton X-100 i 10% surowicy osła w 1x PBS) na każdym kwadracie i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć roztwór blokujący za pomocą próżni, dodać przeciwciało pierwszorzędowe (patrz tabela materiałów) z pożądanym rozcieńczeniem w buforze blokującym i kontynuować inkubację szkiełek w temperaturze 4 °C przez 24 godziny lub dłużej. 
		UWAGA: Stężenie każdego przeciwciała pierwszorzędowego stosowanego w IHC jest różne i musi być testowane w eksperymentach pilotażowych.</li>
		<li>Umyj szkiełka tkankowe PBST (0,1% Triton w PBS) trzy razy, po 10 minut każde. Powtórzyć krok 2.2.4, stosując przeciwciało drugorzędowe (patrz tabela materiałów) wraz z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) zastępującym bufor blokujący. Kontynuuj inkubację przez co najmniej 4 godziny lub dłużej w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Usunąć przeciwciało wtórne, przemyć skrawki tkanek roztworem PBST trzy razy przez 10 minut każda, a następnie przemyć czystym PBS przez kolejne 5 minut.</li>
		<li>Zetrzeć resztki PBS otaczające skrawki tkanki, zamontować szkiełka nakrywkowe na skrawkach z podłożem montażowym. Wykonaj mikroskopię fluorescencyjną, aby uzyskać obrazy (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).</li>
<li>Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Morphology+of+the+Lipid+Layer+of+the+Tear+Film%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film.</a> Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).</li>
<li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+immunology+of+the+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Immunology+and+Allergy%22%5BJournal%5D)">Anatomy and immunology of the ocular surface.</a> Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).</li>
<li>Mizoguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+alkali+injury+damages+meibomian+glands+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice.</a> The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).</li>
<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+of+the+conjunctiva%3A+A+review+of+recent+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).</li>
<li>Nowell, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+inflammation+imposes+aberrant+cell+fate+in+regenerating+epithelia+through+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction.</a> Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).</li>
<li>Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histochemical+study+of+the+development+of+premaxilla+and+maxilla+during+secondary+palate+formation+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Histology+and+Cytology%22%5BJournal%5D)">A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo.</a> Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+MEK+kinase+1+in+TGF-beta%2Factivin-induced+epithelium+movement+and+embryonic+eyelid+closure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure.</a> The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).</li>
<li>Sharov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+overexpression+inhibits+eyelid+opening+by+altering+epidermal+apoptosis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation.</a> The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).</li>
<li>Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+symptoms+are+increased+in+mice+deficient+in+phospholipid+transfer+protein+%28PLTP%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP).</a> The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mastermind-like+transcriptional+co-activator-mediated+Notch+signaling+is+indispensable+for+maintaining+conjunctival+epithelial+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity.</a> Development. 140 (3), 594-605 (2013).</li>
<li>McCauley, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+signaling+inhibits+goblet+cell+differentiation+via+SPDEF+in+conjunctival+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium.</a> Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).</li>
<li>Guo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+pathogenesis+associated+with+precocious+eyelid+opening+and+necrotic+autologous+tissue+in+mouse+with+disruption+of+Prickle+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene.</a> Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jednym z kluczowych przypomnień dotyczących przygotowania nienaruszonej gałki ocznej jest to, że wszystkie kości oczodołu muszą zostać całkowicie usunięte, zwłaszcza kości juga i łzowe, które są małe i znajdują się w pobliżu dna oczodołu. Wszelkie resztki kości mogą skomplikować późniejszą histologię. W przypadku, gdy maleńki kawałek kości nie został przypadkowo całkowicie usunięty z sekcji, można go pobrać z zatapiającego bloku parafiny za pomocą pęsety. Pozostawiony otwór po tej operacji należy wypełnić stopioną parafi...

Powierzchnia oka składa się z ciągłego arkusza regionalnego nabłonka, w tym spojówki powiekowej, spojówki opuszkowej i rogówki1. Wiele struktur gruczołowych jest związanych z nabłonkiem powierzchni oka i razem tworzą warstwę filmu łzowego chroniącego powierzchnię rogówki przed wysuszeniem i inwazją środowiska2. Zaburzenie OS prowadziłoby do zapalenia rogówki, zapalenia spojówek lub obu tych rodzajów (zapalenie rogówki i spojówki). Zarówno czynniki genetyczne, jak i drażniące środowisko lub ich interakcje przyczyniają się do patologicznych zmian w OS3,4. W związku z tym do badania procesów chorobowych ludzkiego systemu operacyjnego wykorzystano szereg genetycznie zmodyfikowanych i fizycznie lub chemicznie indukowanych modeli zwierzęcych.
Struktura i funkcja systemu operacyjnego myszy jest pod wieloma względami podobna do ludzkiej. Składniki filmu łzowego wydzielane przez gruczoły oczne są również podobne u myszy i ludzi. Przeprowadzono wiele badań z wykorzystaniem modeli mysich w celu wyjaśnienia mechanizmów chorób ludzkiego systemu operacyjnego5,6,7. W wielu przypadkach kluczowe znaczenie ma analiza globalnych, a nie lokalnych zmian molekularnych OS w celu uzyskania wyczerpujących informacji w ramach tego samego leczenia eksperymentalnego. W związku z tym konieczne jest przygotowanie próbki z dobrą integralnością, aby zapewnić, że każda część systemu operacyjnego będzie analizowana jednocześnie.
Mysi system operacyjny ściśle kojarzy się z gałką oczną, która była osadzona w oczodole/oczodole (kościsty kubek wykonany z kilku różnych kości czaszki) i łączy się z nim za pomocą cienkich tkanek łącznych. Istnieje ogromne wyzwanie związane z wypreparowaniem całej powierzchni oka bez uszkodzenia spojówki powiekowej lub opuszkowej. Wyzwania te wynikają z: (i) system operacyjny jest miękki i cienki oraz przymocowany do fizycznie oddzielonych, ale ruchomych powiek i gałki ocznej, a zatem podatny na zniekształcenia i uszkodzenia; oraz (ii) ograniczona przestrzeń między kośćmi oczodołu a gałką oczną ogranicza operacje preparacji. Wyzwania są znacznie większe dla dorosłej myszy. U myszy embrionalnej kostnienie kości oczodołu nie jest całkowite, a otaczające tkanki są względnie luźne8. Głowę można zdjąć i przeciąć na pół, a następnie bezpośrednio poddać utrwalaniu paraformaldehydu (PFA) i osadzaniu9. Natomiast kości oczodołowe myszy po urodzeniu i u dorosłych myszy są w pełni skostniałe z grubymi otaczającymi tkankami, co sprawia, że penetracja utrwalaczy jest mniej wydajna. Ponadto kości oczodołu/czaszki są twarde i łamliwe, łatwo się łamią podczas krojenia ich w miękkie związki osadzające, takie jak parafina. Złamane kawałki kości jednogłośnie rozerwą pobliskie tkanki, powodując gorszą morfologię tkanek.
Wiele opublikowanych badań często wykazywało częściową powierzchnię oka, co może być wystarczające dla ich szczególnych celów badawczych10,11. Gruntowne badanie literatury wykazało tylko kilka badań pokazujących całą nienaruszoną powierzchnię oka bez szczegółowego opisu protokołów sekcji12,13. W tym protokole szczegółowo opisaliśmy metodę preparacji w celu uzyskania integralnej poporodowej powierzchni oka, w której kości oczodołu i czaszki zostały uporządkowanie usunięte, pozostawiając nietkniętą powierzchnię oka wraz z gałką oczną i powiekami, minimalizując uszkodzenia fizyczne. Następnie zbadaliśmy histologię OS i przeprowadziliśmy immunohistochemię przy użyciu skrawków tkanek przygotowanych za pomocą tego protokołu.

<table><tbody><tr><td>1 i razy; Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Transgen Biotech</td><td>FG701-01</td><td></td></tr><tr><td>50ml probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Adhezyjne szkiełka mikroskopowe</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td>Sugerowane stężenie 1:500 - 1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12380</td><td>Sugerowane stężenie 1:500 - 1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-K12</td><td>Abcam</td><td>ab124975</td><td>Sugerowane stężenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-K14</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td>Sugerowane stężenie 1:800</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slajd okładkowy</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>World Precision Instruments</td><td>14127</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny.</td><td>Olmpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mikroskopy fluorescencyjne</td><td>Zeiss</td><td>AxioImager.Z2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Nośniki montażowe</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparacji z prostym ostrzem</td><td>World Precision Instruments</td><td>503242</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenki mikrofalowe</td><td>Galanz</td><td>P70D20TL-D4</td><td></td></tr><tr><td>Szczepy myszy</td><td>C57 / BL6 i Sv129 mieszane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleszcze proste nr 4</td><td>World Precision Instruments</td><td>501978-6</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehydy (PFA)</td> <td>Różne</td><td></td><td>Przygotuj 4% roztwór w 1 i razy; PBS i filtr o 0,45&mu; m membrana filtracyjna</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBW6818</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja nienaruszonej gałki ocznej w celu uzyskania integralnej tkanki powierzchni oka do badania histologicznego i immunohistochemii

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Powierzchnia oka (OS) składa się z arkusza nabłonka z trzema połączonymi częściami: spojówką powiekową, spojówką opuszkową i nabłonkiem rogówki. Zaburzenie OS prowadziłoby do zapalenia rogówki, zapalenia spojówek lub obu tych rodzajów (zapalenie rogówki i spojówki). W eksperymentalnych modelach zwierzęcych z pewnymi modyfikacjami genetycznymi lub sztucznymi operacjami przydatne jest zbadanie wszystkich części arkusza nabłonka OS w celu oceny względnych zmian patogenetycznych każdej części równolegle. Jednak sekcja tkanki OS jako całości bez zniekształceń lub uszkodzeń była wyzwaniem, przede wszystkim ze względu na miękkość i cienkość OS przymocowanego do fizycznie oddzielonych, ale ruchomych powiek i gałki ocznej. Dodatkowo głęboki oczodół utworzony przez twardą czaszkę/kości oczodołu jest w całości zajęty przez gałkę oczną, pozostawiając ograniczoną przestrzeń do wykonywania sekcji operacyjnych. W rezultacie, bezpośrednie rozwarstwienie gałki ocznej wraz z powiązanymi tkankami OS od strony twarzy często prowadziłoby do uszkodzeń tkanek, zwłaszcza powiekowej i opuszkowej spojówki. W tym protokole opisaliśmy metodę sekwencyjnego usuwania czaszki i kości oczodołu z przeciętej na pół głowy myszy, pozostawiając powieki, powierzchnię oka, soczewkę i siatkówkę całkowicie w jednym kawałku. Integralność arkusza OS była dobrze zachowana i mogła być badana za pomocą histologii lub barwienia immunologicznego w jednym przekroju.

Główne kości czaszki ukazane z różnych perspektyw przedstawiono na Rysunku 1A-E, gdzie kolory oznaczają poszczególne kości. Do demonstracji procesów sekcji wykorzystano czterotygodniowe zwierzęta. Po wykonaniu kroków sekcji 1.1.1-1.1.3 oraz krótkiej prefiksacji (krok 1.1.4), gałka oczna wraz z powiązanymi kośćmi twarzy została przedstawiona na Rysunku 1E. Dalsze przycinanie w celu usunięcia kości...

Ten protokół opisuje metodę izolacji gałki ocznej myszy z powieką, powierzchnią oka, przednimi i tylnymi segmentami w względnie nienaruszonej pozycji.

Izolacja nienaruszonej gałki ocznej w celu uzyskania integralnej tkanki powierzchni oka do badania histologicznego i immunohistochemii

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Nasze laboratorium koncentruje się na rozwoju wzroku i chorobach. Protokół ten opisuje metodę sekwencyjnego usuwania czaszki i kości oczodołu z wypreparowanej głowy myszy. Pozostawiając powieki, powierzchnię oka, soczewkę i siatkówkę razem w jednym kawałku. Protokół przyniesie korzyści okulistom, którzy interesują się dydaktyką powierzchni oka. Nazywam się Dianlel Guo, aby opowiedzieć o technice z prawdopodobną walką, gdy próbuję uniknąć uszkodzenia gałki ocznej, podczas preparowania kości twarzy. Główną zaletą tej materii preparacyjnej jest to, że integralność arkusza nabłonka powierzchni oka jest dobrze zachowana, a różne części powierzchni oka można zbadać za pomocą histologii lub barwienia immunologicznego w jednym odcinku. Pamiętaj, aby odciąć wszystkie małe kości i zanieczyszczenia z tkanek miękkich. Powód, w przeciwnym razie spowoduje to blizny na odcinku tkanki. Po eutanazji myszy użyj prostych nożyczek, aby odciąć głowę i przeciąć ją na pół wzdłuż strzałkowej linii środkowej, zaczynając od kości śródciemieniowej rostralnie do nosa. Umieść każdą połówkę przeciętej na pół głowy na czystej szalce Petriego i ostrymi nożyczkami odetnij szczękę i język. Uwolnij nerw wzrokowy, od

isolation-intact-eyeball-to-obtain-integral-ocular-surface-tissue-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie zademonstrujemy, jak izolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i hodować je in vitro w celu uzyskania klonalnych sfer siatkówkowych. Izolowane sfery posiadają kluczowe właściwości komórek macierzystych: zdolność do samoodnowy oraz wielopotencjalność.

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

W pracy opisano uproszczoną technikę wycinania rogówki oraz ewizceracji tkanek siatkówki z gałki ocznej ludzkich dawców pośmiertnych. Opisana tutaj technika pozwala na pobranie wysokiej jakości tkanek do celów transplantacyjnych, chirurgicznych lub badawczych bez uszkadzania pozostałych struktur gałki ocznej.

Uproszczona technika wycięcia rogówki in situ oraz ewakuacji tkanki siatkówki z ludzkiego gałki ocznej

Ten film demonstruje metodę wywoływania zapalenia powierzchni oka i dysfunkcji gruczołów Meiboma w modelu mysim. Stymulacja układu odpornościowego myszy za pomocą immunogenu, a następnie ponowna stymulacja tym samym immunogenem sprzyja zapaleniu powierzchni oka, które powoduje zatkanie wydzielania gruczołów Meiboma przez aggNET wytwarzane przez neutrofile i prowadzi do zespołu suchego oka.

Metoda wywoływania stanu zapalnego powierzchni oka w modelu mysim

Celem tego protokołu jest pokazanie skutecznej techniki izolowania całego, nienaruszonego rdzenia i kory ciała szklistego z pośmiertnych wyłuszczonych oczu świń.

Sekcja całego ciała szklistego do analizy witreodynamicznej

Odsłonięta normalna powierzchnia oka składa się z rogówki i spojówki. Komórki nabłonkowe, komórki kubkowe i komórki odpornościowe są obecne w spojówce. W tym miejscu opisano nieinwazyjną technikę cytologii wyciskowej z wykorzystaniem urządzenia do cytologii wyciskowej i cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w spojówce.

Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie nowego modelu neurodegeneracji jaskry opartej na 360° termicznej kauteryzacji rąbkowego splotu naczyniowego, wywołującej podostre nadciśnienie oczne.

Kauteryzacja pełnego koła rąbka splotu naczyniowego w przypadku jaskry wywołanej chirurgicznie u gryzoni

Ten artykuł przedstawia protokół mikropreparacji oka u gryzoni. Proces ten polega na wyłuszczeniu gałki ocznej wraz z błoną naszywkową (tj. Trzecią powieką). Następnie następuje oddzielenie tylnej i przedniej części gałki ocznej.

Mikrodysekcja oka gryzonia

Ten protokół opisuje procedurę pozyskiwania i hodowli pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z lokalnie pozyskiwanych oczu świń. Komórki te służą jako wysokiej jakości alternatywa dla komórek macierzystych i nadają się do badań siatkówki in vitro.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki świń do modelowania in vitro

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół izolowania komórek Müllera glejowych siatkówki od oczu myszy. Protokół rozpoczyna się od enukleacji i sekcji oczu myszy, po której następuje izolacja, wysiew i hodowla komórek Müllera.

Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Dokładne ubruttowienie i standaryzowane przekroje kul nienowotworowych są ważne dla uzyskania wysokiej jakości powtarzalnych przekrojów histopatologicznych. Wytyczne dotyczące standaryzowanego ubruttowienia kul nienowotworowych dla dorosłych i płodów są podane w niniejszym dokumencie. Zademonstrowano i omówiono różne opcje podziału na kule ziemskie, w tym kryteria podejmowania decyzji w oparciu o konkretne przypadki.

Ubruttowienie kul nienowotworowych, w tym oczu płodu

To badanie przedstawia metodologię dostarczania leków do siatkówki i nerwów wzrokowych dorosłego szczura. Dodatkowo wprowadzono unikalną metodę pobierania tkanek w celu odgórnego pobrania en bloc nerwu wzrokowego i siatkówki u dorosłego szczura.

Terapeutyczne dostarczanie do oczu i zaawansowane pobieranie tkanek u dorosłych szczurów

Poznaj metodę izolacji nienaruszonej gałki ocznej myszy wraz z powiekami i powierzchnią oka do badań histologicznych i immunohistochemicznych. Technika zachowuje integralność nabłonka powierzchni oka.

Izolacja nienaruszonej gałki ocznej w celu uzyskania integralnej tkanki powierzchni oka do badania histologicznego i immunohistochemii (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja nienaruszonej gałki ocznej w celu uzyskania integralnej tkanki powierzchni oka do badania histologicznego i immunohistochemii

Przeglądaj więcej filmów