Izolacja nienaruszonej gałki ocznej w celu uzyskania integralnej tkanki powierzchni oka do badania histologicznego i immunohistochemii
20 października 2019
Ten protokół opisuje metodę izolacji gałki ocznej myszy z powieką, powierzchnią oka, przednimi i tylnymi segmentami w względnie nienaruszonej pozycji.
Nasze laboratorium koncentruje się na rozwoju wzroku i chorobach. Protokół ten opisuje metodę sekwencyjnego usuwania czaszki i kości oczodołu z wypreparowanej głowy myszy. Pozostawiając powieki, powierzchnię oka, soczewkę i siatkówkę razem w jednym kawałku. Protokół przyniesie korzyści okulistom, którzy interesują się dydaktyką powierzchni oka. Nazywam się Dianlel Guo, aby opowiedzieć o technice z prawdopodobną walką, gdy próbuję uniknąć uszkodzenia gałki ocznej, podczas preparowania kości twarzy. Główną zaletą tej materii preparacyjnej jest to, że integralność arkusza nabłonka powierzchni oka jest dobrze zachowana, a różne części powierzchni oka można zbadać za pomocą histologii lub barwienia immunologicznego w jednym odcinku. Pamiętaj, aby odciąć wszystkie małe kości i zanieczyszczenia z tkanek miękkich. Powód, w przeciwnym razie spowoduje to blizny na odcinku tkanki. Po eutanazji myszy użyj prostych nożyczek, aby odciąć głowę i przeciąć ją na pół wzdłuż strzałkowej linii środkowej, zaczynając od kości śródciemieniowej rostralnie do nosa. Umieść każdą połówkę przeciętej na pół głowy na czystej szalce Petriego i ostrymi nożyczkami odetnij szczękę i język. Uwolnij nerw wzrokowy, odcinając go od mózgu przed lokalizacją skrzyżowania wzrokowego. I usuń wszystkie tkanki mózgowe, w tym opuszkę węchową, która jest przymocowana do ściany czaszki. Teraz wszystkie pozostałe tkanki będą miały całą czaszkę i kości oczodołu związane z gałką oczną. Umyj pozostałe części za pomocą PBS, aby usunąć wszelkie resztki krwi i włosów. Wstępnie utrwal tkanki, umieszczając je w 50-mililitrowej probówce zawierającej 4% paraformaldehydu i obracając je w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu prefiksacji szybko umyj rozciętą głowę w PBS trzy razy, aby jeszcze bardziej wyeliminować złamane włoski i utrwalacze. Umieść tkankę na 10-centymetrowej szalce Petriego i przetnij czaszkę na trzy części wzdłuż płaszczyzn wskazanych na rysunku pierwszym protokołu tekstowego. Gałka oczna i oczodół są ukryte w środkowej części czaszki pod kośćmi sitowymi, czołowymi i szczękowymi. Użyj dwóch par kleszczy prostych numer cztery, aby oderwać kość sitową i całkowicie odsłonić kości czołowe i szczękowe. Następnie podziel geograficznie powierzchnię czaszki na cztery obszary. Włóż końcówkę zakrzywionych kleszczy poziomo do każdego obszaru, aby kolejno usunąć kości szczęki i czołowe. Następnie odsłonięte zostaną leżące pod spodem kości łzowe i szyjne. Usuń dwie kości i związane z nimi mięśnie podskórne i tłuszcze otaczające gałkę oczną. Przytnij gałkę oczną z dołączonymi powiekami i skórą w mały, kwadratowy blok, aby zmniejszyć objętość tkanki i ułatwić orientację tkanki podczas osadzania. Umieść gałkę oczną i związane z nią tkanki z powrotem w 4% paraformaldehydzie i kontynuuj utrwalanie przez noc w temperaturze 4
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji gałki ocznej myszy z zachowaniem nienaruszonej powieki i powierzchni oka, co pozwala na utrzymanie anatomii niezbędnej do badań anatomicznych. Technika ta jest szczególnie przydatna dla okulistów zainteresowanych badaniem powierzchni oka bez uszkadzania delikatnych tkanek.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Rozwój oka
- Choroby oczu
- Histologia i immunobarwienie
Wstęp
- Znaczenie zachowania integralności powierzchni oka
- Wyzwania związane z preparowaniem gałek ocznych myszy bez powodowania uszkodzeń
- Zastosowania w edukacji okulistycznej
Zastosowane Metody
- Sekwencyjne usuwanie kości czaszki i oczodołów
- Model mysi
- Zastosowanie paraformaldehydu do utrwalania tkanek
Główne wyniki
- Protokół pozwala na zachowanie warstwy nabłonka powierzchni oka do dalszych badań
- Umożliwia analizę histologiczną lub immunohistochemiczną
- Prezentuje skuteczne techniki sekcji oka
Wnioski
- Badanie przedstawia wiarygodną metodę izolacji gałki ocznej myszy wraz z przyległymi strukturami
- Kluczowe dla badań związanych ze zdrowiem i chorobami oczu
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zachowanie integralności płata nabłonka powierzchni oka umożliwia równoległą ocenę spojówki powieki, spojówki gałki ocznej oraz nabłonka rogówki w modelach chorób. Takie podejście wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie jednoczesnej oceny zmian patogennych w połączonych ze sobą tkankach. Zwiększa to pewność predykcyjną w badaniach przedklinicznych, które wymagają nienaruszonej architektury tkankowej do analizy histologicznej i immunohistochemicznej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez zachowanie relacji przestrzennych w obrębie nabłonka powierzchni oka.
- Wartość operacyjna: Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki przygotowaniu nienaruszonych tkanek do równoległego badania histologicznego zmian związanych z chorobą.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych z zachowaną architekturą powierzchni oka do dalszych analiz immunohistochemicznych i histologicznych.
- Wartość operacyjna: Wsparcie standaryzacji analizy poprzez minimalizację deformacji tkanki podczas sekcji, co poprawia powtarzalność między poszczególnymi skrawkami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje integralność systemu istotną z punktu widzenia choroby, umożliwiając translacyjne dopasowanie biomarkerów w połączonych obszarach powierzchni oka.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez zachowanie morfologii tkanki, co pozwala na spójne sekcjonowanie i analizę.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesami badawczymi w biologii odkrywczej, umożliwiając przygotowanie nienaruszonych tkanek do analiz histologicznych i immunohistochemicznych, co wspiera testowanie hipotez oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez zachowanie integralności płata nabłonka, co umożliwia równoległą analizę obszarów spojówki i rogówki.
- Przesiew: Poprawia gotowość do przeprowadzania testów dzięki powtarzalnej izolacji tkanek, co zmniejsza zmienność podczas sekcjonowania histologicznego.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar zmiennych zależnych za pomocą immunobarwienia i histologii na nienaruszonych przekrojach tkanek.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez zachowanie architektury powierzchni oka w celu spójnej oceny patologicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania metody przygotowania powierzchni oka w wielu modelach chorób i kampaniach przesiewowych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki zachowaniu architektury tkanki, co umożliwia jednoczesną analizę wielu przedziałów powierzchni oka.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki spójnemu protokołowi sekcji, minimalizującemu uszkodzenia tkanek i artefakty cięcia.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji go/no-go poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w modelach chorób oczu dzięki ocenie nienaruszonej tkanki.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko, możliwa dzięki wiarygodnym danym histologicznym i immunobarwieniom z nienaruszonych preparatów powierzchni oka.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest biegłość w technikach mikrochirurgicznej dyssekcji, aby uniknąć uszkodzenia tkanek podczas usuwania kości.
- Zależność od ostrych nożyczek i precyzyjnych pęset w celu dokładnego oddzielenia kości czaszki i oczodołu od tkanek miękkich.
- Konieczność zastosowania ustandaryzowanych protokołów utrwalania z użyciem paraformaldehydu w celu zachowania integralności tkanki do cięcia.
- Wymagane są rozważania dotyczące adaptacji metody przy stosowaniu jej w różnych systemach modelowych lub stadiach rozwojowych.
- Ograniczenie praktyczne: skuteczność procedury zależy od całkowitego usunięcia odłamków kostnych, aby zapobiec powstawaniu artefaktów podczas cięcia.
