Name: Wysokoprzepustowa metoda in situ do szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę in situ do szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów u myszy. Technika umożliwia analizę DNA w tkance wątroby bez konieczności rozdzielania komórek, co wspiera badania nad rozwojem i chorobami wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez hiszpański rząd MINECO BFU2014-58686-P (LAN) i SAF-2017-84708-R (DJB). LAN był wspierany przez krajowe stypendium MINECO Ramón y Cajal Fellowship RYC-2012-11700 i nagrodę Plan GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), a FMN przez regionalne stypendium ValI+D Valencian Generalitat ACIF/2016/020. RP dziękuje prof. Ewie K. Paluch za dofinansowanie. Dziękujemy dr Alicii Martínez-Romero (CIPF Cytometry service) za pomoc w korzystaniu z platformy IN Cell Analyzer.

<ol><li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidization+in+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Polyploidization in liver tissue.</a> American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).</li>
<li>Duncan, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ploidy+conveyor+of+mature+hepatocytes+as+a+source+of+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation.</a> Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).</li>
<li>Gentric, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+polyploidy%3A+Dr+Jekyll+or+Mr+Hide%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Liver polyploidy: Dr Jekyll or Mr Hide?</a> Oncotarget. 6 (11), 8430-8431 (2015).</li>
<li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polyploid+State+Restricts+Hepatocyte+Proliferation+and+Liver+Regeneration+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The Polyploid State Restricts Hepatocyte Proliferation and Liver Regeneration in Mice.</a> Hepatology. 69 (3), 1242-1258 (2019).</li>
<li>Wilkinson, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploid+Hepatocytes+Facilitate+Adaptation+and+Regeneration+to+Chronic+Liver+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Polyploid Hepatocytes Facilitate Adaptation and Regeneration to Chronic Liver Injury.</a> The American Journal of Pathology. 189 (6), 1241-1255 (2019).</li>
<li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polyploid+State+Plays+a+Tumor-Suppressive+Role+in+the+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver.</a> Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).</li>
<li>Chao, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clock+regulates+hepatic+polyploidy+by+modulating+Mkp1-Erk1%2F2+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Circadian clock regulates hepatic polyploidy by modulating Mkp1-Erk1/2 signaling pathway.</a> Nature Communications. 8 (1), 2238(2017).</li>
<li>Celton-Morizur, S., Merlen, G., Couton, D., Margall-Ducos, G., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin%2FAkt+pathway+controls+a+specific+cell+division+program+that+leads+to+generation+of+binucleated+tetraploid+liver+cells+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The insulin/Akt pathway controls a specific cell division program that leads to generation of binucleated tetraploid liver cells in rodents.</a> Journal of Clinical Investigation. 119 (7), 1880-1887 (2009).</li>
<li>Wang, M. J., Chen, F., Lau, J. T. Y., Hu, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+polyploidization+and+its+association+with+pathophysiological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte polyploidization and its association with pathophysiological processes.</a> Cell Death & Disease. 8 (5), e2805(2017).</li>
<li>Gentric, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+promotes+pathologic+polyploidization+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress promotes pathologic polyploidization in nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 981-992 (2015).</li>
<li>Toyoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+to+hepatocyte+ploidy+and+binuclearity+profiles+during+human+chronic+viral+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Changes to hepatocyte ploidy and binuclearity profiles during human chronic viral hepatitis.</a> Gut. 54 (2), 297-302 (2005).</li>
<li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+and+Unconventional+Cell+Division+of+Hepatocytes+Underlie+Liver+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy and Unconventional Cell Division of Hepatocytes Underlie Liver Regeneration.</a> Current Biology. 22 (13), 1166-1175 (2012).</li>
<li>Bou-Nader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+spectrum%3A+a+new+marker+in+HCC+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Polyploidy spectrum: a new marker in HCC classification.</a> Gut. , (2019).</li>
<li>Danielsen, H., Lindmo, T., Reith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+determining+ploidy+distributions+in+liver+tissue+by+stereological+analysis+of+nuclear+size+calibrated+by+flow+cytometric+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A method for determining ploidy distributions in liver tissue by stereological analysis of nuclear size calibrated by flow cytometric DNA analysis.</a> Cytometry. 7 (5), 475-480 (1986).</li>
<li>Guidotti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+Cell+Polyploidization%3A+A+Pivotal+Role+for+Binuclear+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liver Cell Polyploidization: A Pivotal Role for Binuclear Hepatocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).</li>
<li>Severin, E., Meier, E. M., Willers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+mouse+hepatocyte+ploidy+-+I.+Preparative+and+mathematical+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of mouse hepatocyte ploidy - I. Preparative and mathematical protocol.</a> Cell and Tissue Research. 238 (3), 643-647 (1984).</li>
<li>Manzano-Núñez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+disrupts+epithelial+repair+and+niche-progenitor+Fgf+signaling+during+chronic+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance disrupts epithelial repair and niche-progenitor Fgf signaling during chronic liver injury.</a> PLoS Biology. 17 (1), e2006972(2019).</li>
<li>Morales-Navarrete, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+pipeline+for+the+multi-scale+digital+reconstruction+and+quantitative+analysis+of+3D+tissue+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture.</a> eLife. 4, e11214(2015).</li>
<li>Baratta, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+of+normal+mouse+liver%3A+A+histological%2C+quantitative+immunocytochemical%2C+and+fine+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular organization of normal mouse liver: A histological, quantitative immunocytochemical, and fine structural analysis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 131 (6), 713-726 (2009).</li>
<li>Pandit, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F8+is+essential+for+polyploidization+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">E2F8 is essential for polyploidization in mammalian cells.</a> Nature Cell Biology. 14 (11), 1181-1191 (2012).</li>
<li>Vinogradov, A. E., Anatskaya, O. V., Kudryavtsev, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+hepatocyte+ploidy+levels+with+body+size+and+growth+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Relationship of hepatocyte ploidy levels with body size and growth rate in mammals.</a> Genome. 44 (3), 350-360 (2001).</li>
<li>Tanami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+zonation+of+liver+polyploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamic zonation of liver polyploidy.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 405-410 (2017).</li>
<li>Kudryavtsev, B. N., Kudryavtseva, M. V., Sakuta, G. A., Stein, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocyte+polyploidization+kinetics+in+the+course+of+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv+B+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Human hepatocyte polyploidization kinetics in the course of life cycle.</a> Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 64 (1), 387-393 (1993).</li>
<li>Gentric, G., Celton-Morizur, S., Desdouets, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+and+liver+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+and+Research+in+Hepatology+and+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Polyploidy and liver proliferation.</a> Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology. 36 (1), 29-34 (2012).</li>
<li>Uhlén, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-based+map+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue-based map of the human proteome.</a> Science. 347 (6220), 1260419(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano wysokozawartościowe, wysokoprzepustowe podejście do analizy przebudowy tkanek i szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów w wątrobie myszy. Po zapoznaniu się z procedurą użytkownik może przetwarzać, obrazować i analizować wiele próbek w ciągu 3-5 dni, generując duże testowalne zestawy danych, które zapewniają szczegółową sygnaturę zdrowia wątroby. Biorąc pod uwagę prostotę metody przygotowania próbki, a także dużą liczbę analizowanych komórek i powierzchni tkanek (średnio 14mm2 na próbkę), wyniki są...

Hepatocyty w wątrobie ssaków mogą ulegać zahamowanej cytokinezie w celu wytworzenia komórek dwujądrzastych, oraz endoreplikacji DNA w celu wytworzenia poliploidalnych jąder zawierających do 16N zawartości DNA. Ogólny wzrost ploidalności komórkowej i jądrowej podczas rozwoju pourodzeniowego, starzenia się i w odpowiedzi na różne stresy komórkowe1. Proces poliploidyzacji jest dynamiczny i odwracalny2, chociaż jego dokładna funkcja biologiczna pozostaje niejasna3. Zwiększona ploidalność wiąże się ze zmniejszoną zdolnością proliferacyjną4, różnorodność genetyczna2, adaptacja do przewlekłych urazów5 i ochrona przed rakiem6. Zmiany ploidalności hepatocytów występują w wyniku zmienionego rytmu okołodobowego7, oraz weaning8. Przede wszystkim profil ploidalny wątroby jest zmieniany przez uraz i chorobę9, a przekonujące dowody sugerują, że określone zmiany ploidalne, takie jak zwiększona liczba jąder ≥8N lub utrata hepatocytów 2N, dostarczają użytecznych sygnatur do śledzenia postępu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD)3,10, lub różnicowy wpływ infekcji wirusowych11.
Ogólnie rzecz biorąc, uszkodzenie i regeneracja wątroby są związane ze zwiększonym rozmiarem komórek hepatocytów i obszarem jądrowym12, wraz ze zmniejszoną ogólną liczbą hepatocytów, szczególnie tych z zawartością DNA 2N10,11. Uszkodzeniu miąższu wątroby często towarzyszy również ekspansja komórek niemiąższowych (NPC), w tym miofibroblastów zrębu, komórek zapalnych i bipotencjalnych komórek progenitorowych wątroby. Metody wysokoprzepustowe, które zapewniają ilościowy profil cytologiczny liczby komórek miąższowych i ploidii jądrowej, a jednocześnie uwzględniają zmiany w NPC, mają zatem znaczny potencjał jako narzędzia badawcze i kliniczne do śledzenia reakcji wątroby podczas urazu i choroby. Przekonująca niedawna analiza in situ widm ploidalnych w ludzkich próbkach raka wątrobowokomórkowego pokazuje również, że ploidalność jądrowa jest dramatycznie zwiększona w obrębie guzów i jest specyficznie amplifikowana w bardziej agresywnych podtypach nowotworów ze zmniejszonym różnicowaniem i utratą TP5313. W związku z tym istnieje duże prawdopodobieństwo, że postęp metodologiczny w ilościowej ocenie ploidalności jądrowej pomoże w przyszłym profilowaniu prognostycznym raka wątroby.
W tym protokole opisana jest elastyczna metodologia wysokoprzepustowa do analizy porównawczej wycinków tkanki wątroby myszy, która zapewnia szczegółowe profilowanie cytometryczne liczby hepatocytów, odpowiedź NPC i wewnętrznie skalibrowaną metodę szacowania ploidalności jądrowej (Rysunek 1). Hepatocyty odróżnia się od NPC na podstawie znakowania immunologicznego czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α), przed scharakteryzowaniem wielkości jądra i morfometrii jądra. "Minimalną zawartość DNA" szacuje się dla wszystkich okrągłych masek jądrowych poprzez całkowanie średniej intensywności Hoechst 33342 (wskaźnik zastępczy dla gęstości DNA) z interpolowaną trójwymiarową (3D) objętością jądra. Minimalna zawartość DNA w hepatocytach jest następnie kalibrowana za pomocą NPC w celu wygenerowania profilu ploidalności jądrowej.
Akwizycja obrazu, segmentacja jądrowa i analiza obrazu są wykonywane za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości, co umożliwia badanie przesiewowe dużych obszarów dwuwymiarowych (2D) odcinków wątroby zawierających dziesiątki tysięcy komórek. Dostępny jest specjalnie napisany program do automatycznego przetwarzania końcowego danych analizy obrazu o wysokiej zawartości w celu uzyskania profilu ploidalności dla całej próbki dla wszystkich okrągłych jąder hepatocytów. Odbywa się to za pomocą bezpłatnego oprogramowania do obliczania ploidalności jądrowej na podstawie stereologicznej analizy obrazu (SIA)10,11,14,15. Metodologia SIA została wcześniej zwalidowana przez cytometrię przepływową jako dokładna, choć pracochłonna, metoda szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów w wątrobie14, przy założeniu kołowej morfologii jądra i monotonnego związku między wielkością jądra a zawartością DNA. W tym protokole oba parametry jądrowe są mierzone za pomocą oceny morfometrii jądrowej i znakowania Hoechst 33342. Po obliczeniu "minimalnej zawartości DNA" dla każdej maski jądrowej następuje kalibracja ploidalności jądrowej hepatocytów przy użyciu NPC, które mają znaną zawartość DNA 2-4N i dlatego służą jako użyteczna kontrola wewnętrzna.
W porównaniu z konwencjonalnymi metodami cytometrii przepływowej16 opisane podejście umożliwia ocenę ploidalności jądrowej hepatocytów in situ i nie wymaga dostępu do świeżej tkanki ani metod dezagregacji, które mogą zniekształcać wyniki i być trudne do standaryzacji. Podobnie jak w przypadku wszystkich podejść opartych na SIA, podklasy ploidalności jądrowej >2N są niedostatecznie reprezentowane przez próbkowanie 2D ze względu na przekrój większych jąder poza płaszczyznę równikową. Profil ploidalności obejmujący całą tkankę opisuje również minimalną zawartość DNA dla wszystkich okrągłych masek jądrowych hepatocytów i nie rozróżnia bezpośrednio hepatocytów jednojądrzastych i komórek dwujądrzastych, które mają dwa dyskretne ("niestykające się") jądra o tej samej ploidalności. Jednak prostota tego protokołu pozwala na znaczne możliwości jego dostosowania w celu uwzględnienia dodatkowych parametrów, takich jak odstępy międzyjądrowe lub analiza obwodu komórek, co ułatwiłoby identyfikację komórek dwujądrzastych, zapewniając bardziej szczegółową ocenę ploidalności komórkowej.

<table><tbody><tr><td>Dieta 3,5-diethoksykarboksyno-1,4-dihydrokolidynowa (DDC)</td><td>TestDiet</td><td>1810704</td><td>Zmodyfikowana dieta myszy LabDiet 5015 z 0,1% DDC</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anty-kozi IgG osła (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat Leica CM1850 UV</td><td>Leica biosystems</td><td>CM1850 UV</td><td>Sekcja tkanek</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny Medium montażowe</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>Prism 8</td><td>Oprogramowanie statystyczne do wykresów</td></tr><tr><td>danych Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Stężenie końcowe 5 &mikro; Analizator komórek g/mL</td></tr><tr><td>IN 1000</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences Corp</td><td></td><td>System obrazowania i analizy komórkowej o wysokiej zawartości MATLAB</td></tr><tr><td></td><td>MathWorks</td><td>R2019a</td><td>Oprogramowanie do analizy danych do automatycznej analizy ploidalności jądrowej</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe mikroskopu</td><td>VWR International</td><td>630-2864</td><td>Rozmiar 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Speadsheet oprogramowanie</td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Pascual y Furi&oacute;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Panreac AppliChem</td><td>141451.121</td><td></td></tr><tr><td>Długopis do barwienia immunologicznego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe polisynowe</td> o szerokości 5 mm <td>VWR International</td><td>631-0107</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalny królik anty-HNF4&alfa;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-79380</td><td>Rozcieńczenie 1:250 (alternatywnie)</td></tr><tr><td>Rabit poliklonalny anty-HNF4&alfa;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6556</td><td>Rozcieńczenie 1:200 (przeciwciało użyte w badaniu)</td></tr> <tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa metoda in situ do szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów u myszy

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

Gdy wątroba jest uszkodzona, liczba hepatocytów maleje, podczas gdy rozmiar komórki, rozmiar jądra i ploidalność wzrastają. Ekspansja komórek niemiąższowych, takich jak cholangiocyty, miofibroblasty, komórki progenitorowe i komórki zapalne, również wskazuje na przewlekłe uszkodzenie wątroby, przebudowę tkanek i postęp choroby. W tym protokole opisujemy proste, wysokoprzepustowe podejście do obliczania zmian w składzie komórkowym wątroby, które są związane z urazem, chorobami przewlekłymi i rakiem. Pokazujemy, w jaki sposób informacje uzyskane z dwuwymiarowych (2D) skrawków tkanek można wykorzystać do ilościowego określenia i kalibracji ploidalności jądrowej hepatocytów w próbce oraz umożliwienia użytkownikowi zlokalizowania określonych podzbiorów ploidalnych w wątrobie in situ. Nasza metoda wymaga dostępu do utrwalonego/zamrożonego materiału wątrobowego, podstawowych odczynników immunocytochemicznych oraz dowolnej standardowej platformy obrazowania o wysokiej zawartości. Służy jako potężna alternatywa dla standardowych technik cytometrii przepływowej, które wymagają zakłócenia świeżo pobranej tkanki, utraty informacji przestrzennych i potencjalnego odchylenia dezagregacji.

Metodę tę stosowano do pomiaru wpływu uszkodzenia cholestatycznego na wątróbkę dorosłych myszy poprzez podawanie zwierzętom przez okres 0−21 dni hepatotoksycznej diety zawierającej 0,1% 3,5-dietoksykarbonylo-1,4-dihydrokolidyny (DDC)17. Przewlekłe podawanie DDC prowadzi do uszkodzenia hepatocytów, zwiększenia ploidii oraz periportalnej ekspansji NPC. Należy pamiętać, że w obrębie ploidii jądrowej mogą występować różnice zależne od szczepu i wieku myszy, a wszystkie...

Prezentujemy solidną, opłacalną i elastyczną metodę pomiaru zmian w liczbie hepatocytów i ploidalności jądrowej w stałych/kriokonserwowanych próbkach tkanek, która nie wymaga cytometrii przepływowej. Nasze podejście zapewnia potężną sygnaturę cytologii wątroby obejmującą całą próbkę, idealną do śledzenia postępu uszkodzenia wątroby i choroby.

Wysokoprzepustowa metoda in situ do szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów u myszy

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...

Metoda ta umożliwia użytkownikowi wygenerowanie profilu zawartości jądrowego DNA hepatocytów z wycinków tkanek 2D w celu zbadania rozwoju, regeneracji i chorób przewlekłych wątroby. To zautomatyzowane, wysokowydajne podejście można zastosować do wszystkich wycinków tkanki wątroby 2D, zapewniając wewnętrznie skalibrowany odczyt ploidalności jądrowej dla wszystkich prostych okrągłych jąder hepatocytów. Zmiany w ploidalności jądrowej hepatocytów są związane ze starzeniem się, przewlekłymi chorobami wątroby i rakiem.Technika ta zapewnia prosty sposób profilowania ploidalności jądrowej w utrwalonych lub kriokonserwowanych próbkach wątroby. Metody profilowania ploidalności in situ mają znaczny potencjał jako narzędzia badawcze i kliniczne do śledzenia postępu chorób wątroby, ponieważ nie wymagają desegregacji tkanek ani dostępu do świeżego materiału. Po pobraniu próbki tkanki wątroby myszy należy zanurzyć zrazik wątroby w kriomold wypełnionym podłożem o optymalnej temperaturze cięcia i natychmiast umieścić formę na suchym lodzie, aby zapewnić szybkie zamrożenie.Aby uzyskać wycinki zamrożonej próbki zrazika wątroby, należy podzielić próbkę na kawałki o grubości sześciu mikrometrów, umieszczając oznakowane szkiełko pokryte poliamidem na każdej próbce na pięć sekund, aby każda próbka przykleiła się do szkiełka. Po zebraniu wszystkich wycinków, przed znakowaniem immunologicznym należy pozostawić próbki do zrównoważenia przez trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec równoważenia utrwalić skrawki tkanki w dygestorii z jednym mililitrem 4% paraformaldehydu w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Pod koniec utrwalania przepłukać szkiełka trzema trzyminutowymi płukaniami w PBS z delikatnym mieszaniem. Po ostatnim praniu osusz obszar wokół każdego odcinka tkanki i za pomocą hydrofobowego pisaka narysuj okrąg wokół każdej próbki. Aby przepuszczalność próbek, należy traktować skrawki 0,5% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji przemywać próbki przez trzy minuty w PBS dwa razy delikatnym mieszaniem, jak wykazano, przed zablokowaniem niespecyficznego wiązania przefiltrowanym roztworem 1% białka surowicy bydlęcej, 5% surowicy końskiej i 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w PBS przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować szkiełka z przeciwciałem HHF4-alfa rozcieńczonym w buforze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze barwienia chronionej przed światłem. Następnego ranka przemyć szkiełka czterokrotnie w PBS z delikatnym mieszaniem przed inkubacją z odpowiednim fluorescencyjnym sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym i Hoechstem rozcieńczonym w przefiltrowanym 1% białku surowicy bydlęcej i 0,2% niejonowym środku powierzchniowo czynnym w PBS przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze barwienia chronionej przed światłem.Pod koniec inkubacji umyć szkiełka cztery razy, jak pokazano, a następnie dwa trzyminutowe płukania w wodzie podwójnie destylowanej z delikatnym mieszaniem. Po ostatnim przemyciu umieścić próbki z dwiema kroplami fluorescencyjnego medium mocującego na szkiełku nakrywkowym i w razie potrzeby delikatnie docisnąć, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Następnie sprawdź szkiełka za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego, aby zapewnić dobre utrwalenie i znakowanie immunologiczne.W celu akwizycji obrazu fluorescencyjnego należy ustawić parametry na platformie obrazowania o wysokiej zawartości, aby uzyskać obrazy fluorescencyjne przy użyciu odpowiedniego wzbudzenia dla zastosowanych fluoroforów. Następnie zeskanuj próbki, aby uzyskać wystarczającą ilość obrazów, aby uzyskać pełne pokrycie przekroju tkanki. Pod koniec skanowania dostosuj parametry segmentacji jądra w oprogramowaniu, aby zapewnić optymalną segregację jąder i zmodyfikuj intensywność progową, aby zapewnić optymalne bramkowanie hepatocytów HNF4-alfa-dodatnich i HNF4-alfa-ujemnych komórek niemiąższowych.Aby określić ilościowo jądro, ustaw obszar jądra w mikrometrach kwadratowych na podstawie barwienia Hoechsta, głównej intensywności jądrowej Hoechsta, współczynnika wydłużenia jądrowego, średniego wskaźnika okrągłości jądra, statusu HNF4-alfa oraz współrzędnych jądrowych X, Y w oparciu o środek ciężkości. Aby przeprowadzić analizę ploidalności jądrowej hepatocytów, najpierw pobierz i zainstaluj program do analizy ilościowej ploidalności. W MATLAB przejdź do zakładki Aplikacja na pasku narzędzi i kliknij Zainstaluj aplikację.Otwórz program instalacyjny aplikacji Ploidy Application ML. Pojawi się komunikat potwierdzający pomyślną instalację. Do każdego pliku z analizą danych należy dołączyć arkusz o nazwie Miary komórek, zawierający wszystkie dane wymagane do analizy ploidalności określone w kolumnach, jak wskazano.Dla każdego warunku doświadczalnego należy podać zestaw danych kontrolnych, który zostanie wykorzystany do obliczenia kontroli wewnętrznej dla kalibracji ploidalności jądrowej od dwóch do czterech N. W przypadku replik biologicznych każdy arkusz kalkulacyjny należy przechowywać w osobnym folderze, stopniowo nadając prefiksom folderów nazwy. Następnie uruchom aplikację Ploidy.Pojawi się graficzny interfejs użytkownika aplikacji Ploidy. Kliknij przycisk Ścieżka do danych kontrolnych, aby przejść do folderu, w którym znajdują się replikowane dane kontrolne. Ta ścieżka danych pojawi się następnie w interfejsie.W polu Prefiks folderu wpisz nazwę, która ma zostać nadana plikom wyjściowym. Kliknij przycisk Ścieżka do innych danych i przejdź do folderu, w którym znajdują się replikacje danych porównawczych. Ta ścieżka danych pojawi się następnie w interfejsie.Następnie kliknij przycisk Uruchom. Po zakończeniu analizy na pasku stanu pojawi się komunikat Analiza zakończona. Po znakowaniu immunologicznym ważne jest, aby sprawdzić wszystkie szkiełka za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej, aby potwierdzić, że uzyskano dobrej jakości utrwalenie i barwienie.Rozmazywanie lub rozmycie barwnika Hoechst może wskazywać na niewystarczające utrwalenie lub degradację próbki przed utrwaleniem. Segregacja jądrowa i parametry progowe HNF4-alfa powinny być starannie zoptymalizowane przed automatyczną analizą obrazu, aby szeroko odzwierciedlić wizualny wzorzec barwienia immunologicznego obserwowany przez mikroskopię fluorescencyjną. Po analizie obrazu dane powinny odzwierciedlać rosnącą liczbę komórek niemiąższowych oraz niewielkie, ale znaczące, zmniejszenie liczby jąder HNF4-alfa-dodatnich w wątrobie z uszkodzeniem DDC.W zdrowych wątrobach kontrolnych około 63% jąder HNF4-alfa-dodatnich wykazuje prostą morfometrię kołową. Porównanie względnej ploidalności jądrowej między grupami kontrolnymi i leczonymi DDC powinno odzwierciedlać znaczną utratę jąder hepatocytów 2C i 4C z uszkodzeniem wraz ze zwiększoną liczbą komórek większych niż 8C. Względne informacje o położeniu dla każdej podgrupy ploidalnej można zbadać, pobierając lokalizację 2D poszczególnych podzbiorów hepatocytów w oprogramowaniu do analizy obrazów o wysokiej zawartości.Znakowanie immunologiczne za pomocą dodatkowych przeciwciał, takich jak Ki-67, można przeprowadzić w celu oceny replikacji komórek, a dane dotyczące morfometrii jądra hepatocytów mogą być dalej badane w celu uzupełnienia analizy ploidalności. Profil ploidalności obejmujący całą tkankę wygenerowany tą metodą opisuje minimalną zawartość DNA dla wszystkich okrągłych jąder hepatocytów, ale nie rozróżnia komórek jednojądrzastych i hepatocytów dwujądrzastych. Metodę tę można potencjalnie dostosować do uwzględniania takich parametrów, jak obwód komórki, w celu ułatwienia identyfikacji komórek dwujądrzastych i zapewnienia dodatkowego odczytu ploidalności komórkowej.

a-high-throughput-situ-method-for-estimation-hepatocyte-nuclear

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

W niniejszej pracy opisujemy wydajną, wysokoprzepustową metodę hybrydyzacji in situ (ISH) służącą do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w przekrojach rozwijającej się tkanki prostaty zarodka myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do wizualizacji wzorców ekspresji mRNA w innych tkankach myszy lub w tkankach innych gatunków.

Metoda wysokoprzepustowej hybrydyzacji in situ do charakteryzacji wzorców ekspresji mRNA w dolnym odcinku dróg moczowo-płciowych płodu myszy

Jądra komórek serca są izolowane metodą sedymentacji gęstościowej i znakowane immunologicznie przeciwciałami przeciwko materiałowi pericentriolarnemu 1 (PCM-1) w celu identyfikacji i sortowania jąder kardiomiocytów za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

To badanie pokazuje przeprogramowanie komórek somatycznych w kierunku pluripotencji in vivo bez generowania potworniaków. Zastosowaliśmy hydrodynamiczne wstrzyknięcie do żyły ogonowej plazmidowego DNA kodującego czynniki Yamanka, aby indukować przeprogramowanie in vivo dorosłych hepatocytów na komórki o zwiększonej pluripotencji.

In vivo (in vivo) Przeprogramowanie dorosłych komórek somatycznych na pluripotencję przez nadekspresję czynników Yamanaka

Kwantyfikacja obrotu kardiomiocytów jest wyzwaniem. Opisany tutaj protokół w istotny sposób przyczynia się do rozwiązania tego wyzwania, umożliwiając dokładne i czułe określenie ilościowe wytwarzania jąder neokardiomiocytów i ploidalności jąder.

Jednoczesna ocena syntezy i ploidalności DNA kardiomiocytów: metoda wspomagająca ilościowe określanie regeneracji i obrotu kardiomiocytów

Tutaj prezentujemy protokół generowania ludzkiego chimerycznego mysiego modelu hipercholesterolemii rodzinnej wątroby przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hepatocytów. Jest to cenny model do testowania nowych terapii hipercholesterolemii.

Rodzinny model myszy chimerycznej wątroby hipercholesterolemii przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych

Tłumaczenie oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) umożliwia szybką i efektywną izolację mRNA translującego specyficznego dla typu komórki. Tutaj demonstrujemy metodę, która łączy hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej w mysim modelu ponownego zasiedlania wątroby i TRAP w celu zbadania profilu ekspresji repopulujących hepatocytów.

Profilowanie ekspresji genów specyficzne dla typu komórki w wątrobie myszy

Ten protokół opisuje techniki izolowania pierwotnych mysich hepatocytów z wątroby i elektroportowania CRISPR-Cas9 jako rybonukleoprotein i mRNA w celu zakłócenia terapeutycznego genu docelowego związanego z dziedziczną chorobą metaboliczną wątroby. Opisane metody skutkują wysoką żywotnością i wysokim poziomem modyfikacji genów po elektroporacji.

Dostarczanie rybonukleoprotein Cas9 i mRNA za pośrednictwem elektroporacji do świeżo izolowanych pierwotnych hepatocytów myszy

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia ortotopowych ksenoprzeszczepów raka wątrobowokomórkowego z podwiązaniem tętnicy wątrobowej i bez niej oraz wykonywania nieinwazyjnego obrazowania hipoksji guza za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) przy użyciu [18F]Fluoromisonidazolu ([18F]FMISO) i [18F]Fluorodeoksyglukozy ([18F]FDG).

Nieinwazyjne obrazowanie PET/MR w ortotopowym mysim modelu raka wątrobowokomórkowego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji jąder z błyskawicznie zamrożonych, zarchiwizowanych tkanek wątroby dla jednojądrowego sekwencjonowania RNA, sekwencji ATAC i multiomiki stawów (sekwencja RNA i sekwencja ATAC).

Izolacja jąder z zamrożonej tkanki wątroby w celu multiomiki jednokomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Poznaj wysokoprzepustową metodę in situ do szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów u myszy. Technika umożliwia analizę DNA w tkance wątroby bez konieczności rozdzielania komórek, co wspiera badania nad rozwojem i chorobami wątroby.

Wysokoprzepustowa metoda in situ do szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów u myszy

Przeglądaj więcej filmów