Wysokoprzepustowa metoda in situ do szacowania ploidalności jądrowej hepatocytów u myszy
19 kwietnia 2020
Prezentujemy solidną, opłacalną i elastyczną metodę pomiaru zmian w liczbie hepatocytów i ploidalności jądrowej w stałych/kriokonserwowanych próbkach tkanek, która nie wymaga cytometrii przepływowej. Nasze podejście zapewnia potężną sygnaturę cytologii wątroby obejmującą całą próbkę, idealną do śledzenia postępu uszkodzenia wątroby i choroby.
Metoda ta umożliwia użytkownikowi wygenerowanie profilu zawartości jądrowego DNA hepatocytów z wycinków tkanek 2D w celu zbadania rozwoju, regeneracji i chorób przewlekłych wątroby. To zautomatyzowane, wysokowydajne podejście można zastosować do wszystkich wycinków tkanki wątroby 2D, zapewniając wewnętrznie skalibrowany odczyt ploidalności jądrowej dla wszystkich prostych okrągłych jąder hepatocytów. Zmiany w ploidalności jądrowej hepatocytów są związane ze starzeniem się, przewlekłymi chorobami wątroby i rakiem.
Technika ta zapewnia prosty sposób profilowania ploidalności jądrowej w utrwalonych lub kriokonserwowanych próbkach wątroby. Metody profilowania ploidalności in situ mają znaczny potencjał jako narzędzia badawcze i kliniczne do śledzenia postępu chorób wątroby, ponieważ nie wymagają desegregacji tkanek ani dostępu do świeżego materiału. Po pobraniu próbki tkanki wątroby myszy należy zanurzyć zrazik wątroby w kriomold wypełnionym podłożem o optymalnej temperaturze cięcia i natychmiast umieścić formę na suchym lodzie, aby zapewnić szybkie zamrożenie.
Aby uzyskać wycinki zamrożonej próbki zrazika wątroby, należy podzielić próbkę na kawałki o grubości sześciu mikrometrów, umieszczając oznakowane szkiełko pokryte poliamidem na każdej próbce na pięć sekund, aby każda próbka przykleiła się do szkiełka. Po zebraniu wszystkich wycinków, przed znakowaniem immunologicznym należy pozostawić próbki do zrównoważenia przez trzy do pięciu minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec równoważenia utrwalić skrawki tkanki w dygestorii z jednym mililitrem 4% paraformaldehydu w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Pod koniec utrwalania przepłukać szkiełka trzema trzyminutowymi płukaniami w PBS z delikatnym mieszaniem. Po ostatnim praniu osusz obszar wokół każdego odcinka tkanki i za pomocą hydrofobowego pisaka narysuj okrąg wokół każdej próbki. Aby przepuszczalność próbek, należy traktować skrawki 0,5% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji przemywać próbki przez trzy minuty w PBS dwa razy delikatnym mieszaniem, jak wykazano, przed zablokowaniem niespecyficznego wiązania przefiltrowanym roztworem 1% białka surowicy bydlęcej, 5% surowicy końskiej i 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w PBS przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie inkubować szkiełka z przeciwciałem HHF4-alfa rozcieńczonym w buforze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze barwienia chronionej przed światłem. Następnego ranka przemyć szkiełka czterokrotnie w PBS z delikatnym mieszaniem przed inkubacją z odpowiednim fluorescencyjnym sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym i Hoechstem rozcieńczonym w przefiltrowanym 1% białku surowicy bydlęcej i 0,2% niejonowym środku powierzchniowo czynnym w PBS przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze barwienia chronionej przed światłem.
Pod koniec inkubacji umyć szkiełka cztery razy, jak pokazano, a następnie dwa trzyminutowe płukania w wodzie podwójnie destylowanej z delikatnym mieszaniem. Po ostatnim przemyciu umieścić próbki z dwiema kroplami fluorescencyjnego medium mocującego na szkiełku nakrywkowym i w razie potrzeby delikatnie docisnąć, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Następnie sprawdź szkiełka za pomocą konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego, aby zapewnić dobre utrwalenie i znakowanie immunologiczne.
W celu akwizycji obrazu fluorescencyjnego należy ustawić parametry na platformie obrazowania o wysokiej zawartości, aby uzyskać obrazy fluorescencyjne przy użyciu odpowiedniego wzbudzenia dla zastosowanych fluoroforów. Następnie zeskanuj próbki, aby uzyskać wystarczającą ilość obrazów, aby uzyskać pełne pokrycie przekroju tkanki. Pod koniec skanowania dostosuj parametry segmentacji jądra w oprogramowaniu, aby zapewnić optymalną segregację jąder i zmodyfikuj intensywność progową, aby zapewnić optymalne bramkowanie hepatocytów HNF4-alfa-dodatnich i HNF4-alfa-ujemnych komórek niemiąższowych.
Aby określić ilościowo jądro, ustaw obszar jądra w mikrometrach kwadratowych na podstawie barwienia Hoechsta, głównej intensywności jądrowej Hoechsta, współczynnika wydłużenia jądrowego, średniego wskaźnika okrągłości jądra, statusu HNF4-alfa oraz współrzędnych jądrowych X, Y w oparciu o środek ciężkości. Aby przeprowadzić analizę ploidalności jądrowej hepatocytów, najpierw pobierz i zainstaluj program do analizy ilościowej ploidalności. W MATLAB przejdź do zakładki Aplikacja na pasku narzędzi i kliknij Zainstaluj aplikację.
Otwórz program instalacyjny aplikacji Ploidy Application ML. Pojawi się komunikat potwierdzający pomyślną instalację. Do każdego pliku z analizą danych należy dołączyć arkusz o nazwie Miary komórek, zawierający wszystkie dane wymagane do analizy ploidalności określone w kolumnach, jak wskazano.
Dla każdego warunku doświadczalnego należy podać zestaw danych kontrolnych, który zostanie wykorzystany do obliczenia kontroli wewnętrznej dla kalibracji ploidalności jądrowej od dwóch do czterech N. W przypadku replik biologicznych każdy arkusz kalkulacyjny należy przechowywać w osobnym folderze, stopniowo nadając prefiksom folderów nazwy. Następnie uruchom aplikację Ploidy.
Pojawi się graficzny interfejs użytkownika aplikacji Ploidy. Kliknij przycisk Ścieżka do danych kontrolnych, aby przejść do folderu, w którym znajdują się replikowane dane kontrolne. Ta ścieżka danych pojawi się następnie w interfejsie.
W polu Prefiks folderu wpisz nazwę, która ma zostać nadana plikom wyjściowym. Kliknij przycisk Ścieżka do innych danych i przejdź do folderu, w którym znajdują się replikacje danych porównawczych. Ta ścieżka danych pojawi się następnie w interfejsie.
Następnie kliknij przycisk Uruchom. Po zakończeniu analizy na pasku stanu pojawi się komunikat Analiza zakończona. Po znakowaniu immunologicznym ważne jest, aby sprawdzić wszystkie szkiełka za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej, aby potwierdzić, że uzyskano dobrej jakości utrwalenie i barwienie.
Rozmazywanie lub rozmycie barwnika Hoechst może wskazywać na niewystarczające utrwalenie lub degradację próbki przed utrwaleniem. Segregacja jądrowa i parametry progowe HNF4-alfa powinny być starannie zoptymalizowane przed automatyczną analizą obrazu, aby szeroko odzwierciedlić wizualny wzorzec barwienia immunologicznego obserwowany przez mikroskopię fluorescencyjną. Po analizie obrazu dane powinny odzwierciedlać rosnącą liczbę komórek niemiąższowych oraz niewielkie, ale znaczące, zmniejszenie liczby jąder HNF4-alfa-dodatnich w wątrobie z uszkodzeniem DDC.
W zdrowych wątrobach kontrolnych około 63% jąder HNF4-alfa-dodatnich wykazuje prostą morfometrię kołową. Porównanie względnej ploidalności jądrowej między grupami kontrolnymi i leczonymi DDC powinno odzwierciedlać znaczną utratę jąder hepatocytów 2C i 4C z uszkodzeniem wraz ze zwiększoną liczbą komórek większych niż 8C. Względne informacje o położeniu dla każdej podgrupy ploidalnej można zbadać, pobierając lokalizację 2D poszczególnych podzbiorów hepatocytów w oprogramowaniu do analizy obrazów o wysokiej zawartości.
Znakowanie immunologiczne za pomocą dodatkowych przeciwciał, takich jak Ki-67, można przeprowadzić w celu oceny replikacji komórek, a dane dotyczące morfometrii jądra hepatocytów mogą być dalej badane w celu uzupełnienia analizy ploidalności. Profil ploidalności obejmujący całą tkankę wygenerowany tą metodą opisuje minimalną zawartość DNA dla wszystkich okrągłych jąder hepatocytów, ale nie rozróżnia komórek jednojądrzastych i hepatocytów dwujądrzastych. Metodę tę można potencjalnie dostosować do uwzględniania takich parametrów, jak obwód komórki, w celu ułatwienia identyfikacji komórek dwujądrzastych i zapewnienia dodatkowego odczytu ploidalności komórkowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia solidną i elastyczną metodę pomiaru zmian w liczbie hepatocytów i ploidii jąder w utrwalonych lub krioprezerwowanych próbkach tkanki wątroby. Takie podejście oferuje potężne oznaczenie cytologii wątroby, które jest niezbędne do śledzenia uszkodzeń wątroby i postępu choroby.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Patologia wątroby
Tło
- Ploidia jąder hepatocytów jest kluczowa dla zrozumienia rozwoju i choroby wątroby.
- Zmiany w ploidii jąder są związane ze starzeniem się, przewlekłymi chorobami wątroby i rakiem.
- Tradycyjne metody często wymagają cytometrii przepływowej i świeżych próbek tkanki.
- Ta metoda pozwala na profilowanie bez dezintegracji tkanki.
Cel badania
- Opracowanie metody profilowania zawartości DNA jąder hepatocytów w 2D sekcjach tkanki.
- Dostarczenie podejścia wysokowydajnego, które można zastosować do różnych próbek tkanki wątroby.
- Ułatwienie śledzenia postępu choroby wątroby w badaniach i ustawieniach klinicznych.
Stosowane metody
- Automatyczna analiza wysokowydajna 2D sekcji tkanki wątroby.
- Wewnętrznie skalibrowane odczytywanie ploidii jąder dla okrągłych jąder hepatocytów.
- Szybkie zamrażanie próbek wątroby przy użyciu optymalnego medium temperatury cięcia.
- Profilowanie ploidii in situ bez konieczności świeżego materiału.
Główne wyniki
- Metoda zapewnia niezawodny profil ploidii jąder hepatocytów.
- Może być zastosowana do utrwalonych lub krioprezerwowanych próbek wątroby.
- Wykazuje potencjał do śledzenia postępu choroby wątroby.
- Oferuje prosty sposób oceny zmian ploidii jąder związanych z różnymi stanami.
Wnioski
- Ta metoda jest cennym narzędziem dla badaczy zajmujących się patologią wątroby.
- Zwiększa zdolność do monitorowania uszkodzeń wątroby i choroby w czasie.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować diagnostykę kliniczną i monitorowanie leczenia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput, spatially resolved quantification of hepatocyte nuclear ploidy from fixed or cryopreserved liver tissue, supporting target validation in liver disease models. By preserving tissue architecture and avoiding disaggregation bias, it provides internally calibrated, reproducible readouts of polyploidization events linked to disease progression. The approach enhances predictive confidence in preclinical studies by linking nuclear DNA content changes to pathophysiological states without requiring fresh tissue or flow cytometry.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating hepatocyte nuclear ploidy shifts with liver injury, regeneration, and disease models.
- Operational Value: Supports biological de-risking through internal calibration using control datasets, reducing variability in ploidy measurements across experiments.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying dose- or genotype-dependent increases in >8C hepatocyte nuclei as a biomarker of pathological polyploidization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, imaging-based readouts of nuclear area, Hoechst intensity, elongation, roundness, and HNF4-alpha status for high-content screening applications.
- Operational Value: Enables assay standardization via optimized nuclear segmentation and threshold gating parameters, improving reproducibility across users and sites.
- Scalability: Compatible with standard high-content imaging platforms, allowing scalable analysis of numerous tissue sections without specialized equipment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Preserves spatial information, enabling retrieval of 2D locations of specific ploidy subsets (e.g., 2C, 4C, >8C) within liver lobules for regional disease correlation.
- Preclinical Model Relevance: Detects significant loss of 2C/4C nuclei and increase in >8C cells following DDC injury, mirroring clinical observations in chronic liver disease and cancer.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides a mechanistic readout to support go/no-go decisions by quantifying polyploidization as a feature of maladaptive repair or neoplastic transformation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical profiling, offering a reusable platform for assessing liver cytology in disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking changes in hepatocyte nuclear DNA content to pathway modulation in injury and cancer models.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs through automated image acquisition and segmentation, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Generates ploidy profiles based on Hoechst staining and HNF4-alpha status, providing quantitative comparisons between control and treated conditions.
- Translational Research: Maintains histological context, allowing correlation of ploidy shifts with fibrosis, inflammation, or tumorigenic regions in liver sections.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, transferable capability for ploidy profiling across multiple liver disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in hepatocyte ploidy changes during disease progression.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and imaging protocols compatible with frozen tissue archives.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, spatially resolved biomarkers of liver pathology, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate pathological polyploidization in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, fluorescence microscopy, and high-content image analysis software.
- Dependent on access to cryostat, fluorescence microscope or high-content imaging system, and MATLAB-based ploidy quantification tool.
- Necessitates cross-team standardization of nuclear segmentation and HNF4-alpha threshold settings to ensure consistent gating across datasets.
- Adaptation considerations include adjusting parameters for non-circular nuclei or binuclear hepatocytes to improve specificity in certain models.
- Practical limitations include inability to distinguish mononuclear from binuclear hepatocytes and reliance on optimal circular morphometry for accurate ploidy estimation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:14
Cyrosectioning
1:54
Fluorescence Immunolabelling
3:55
Fluorescence Image Acquisition and Automated Fluorescence Image Analysis
4:55
Data Analysis
6:24
Results: Representative Murine Hepatocyte Nuclear Ploidy Estimation
8:03
Conclusion
