Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Głównym celem opracowania techniki csBN-MS było uzyskanie kompleksowego dostępu do organizacji i składania kompleksów białkowych, które leżą u podstaw transdukcji sygnału na i w poprzek błony plazmatycznej różnych typów tkanek i narządów. csBN-MS zapewnia obecnie najwyższą wszechstronność rozdzielczości do analizy natywnych kompleksów białkowych i ich składu podjednostek, w szczególności w odniesieniu do białek błonowych. Chociaż technika csBN-MS została opracowana do analizy skompleksowanych mieszanin zespołów białek błonowych w mózgu gryzoni, można ją łatwo dostosować do analizy dowolnego rodzaju próbki biologicznej.

Jednym z kluczowych etapów naszej metody jest zatopienie kawałka żelu i jego prawidłowe wyrównanie do płaszczyzny cięcia przed krojeniem. Należy uważać, aby nie rozerwać ani nie ścisnąć żelu i upewnić się, że nie jest on przechylony do płaszczyzny cięcia, ponieważ zmniejszyłoby to rozdzielczość analizy. Nasza technika csBN-MS składa się z kilku praktycznych kroków, które są kluczowe dla uzyskania dobrych wyników.

Łatwiej jest pokazać, jak wykonać te kroki w szczegółach, niż tylko je opisać. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj mieszającego dwukomorowego mieszalnika gradientowego napędzanego pompą, aby odlać liniowy lub hiperboliczny żel o gradiencie porów. Przygotować roztwory dla przedniej komory mieszania i komory zbiornika, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Uruchom mieszadło i dodaj 30 mikrolitrów APS i 2,5 mikrolitrów TEMED do roztworu w komorze przedniej. Następnie uruchom pompę i otwórz przedni zawór. Po około jednej minucie dodaj 90 mikrolitrów APS i pięć mikrolitrów TEMED do komory zbiornika i otwórz przyłącze komory.

Pozwól żelowi powoli i dokładnie polimeryzować przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej, aby wytworzyć jednorodny gradient wielkości porów. Jeśli jest wilgotny, spolimeryzowany żel można przechowywać w pozycji pionowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Następnie przygotuj szczeliny ładunkowe, umieszczając odpowiednie przestrzenie między szklanymi płytkami do oddzielenia od 0,5 do 2,0 miligramów białka.

Szczeliny powinny mieć co najmniej trzy centymetry szerokości. Do uruchamiania należy przygotować stały bufor katodowy składający się z 50 milimolowych trycyny, 50 milimolowych Bis-Tris i 0,01% Coomassie G-250. Przygotować standardowy bufor anodowy składający się z 50 milimolowych Bis-Tris.

Rozpuścić około 2,5 miligrama membrany i dwa mililitry buforu do rozpuszczania zawierającego 1% niedenaturującego detergentu na lodzie przez 30 minut. Następnie ultrawirować przy 130 000 razy G przez 11 minut. Skoncentrować rozpuszczony sacharoza na krótkim 50%20% gradiencie krokowym przez ultrawirowanie w 400 000 razy G przez jedną godzinę.

Następnie zbierz gradient sacharozy z dna probówki, dodaj 0,05% Coomassie G-250 do solubilizatu i załaduj próbkę na żel. Uruchom preparatywny BN-PAGE w temperaturze 10 stopni Celsjusza przez noc, korzystając z trzystopniowego protokołu napięcia, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po wypuszczeniu żelu zeskanuj żele w celach dokumentacyjnych, trzymając je między szklanymi płytkami.

Sprawdź jakość separacji żelu. Następnie zdemontuj tablice i wytnij interesujące Cię odcinki pasa. Napraw pasy dwukrotnie za pomocą 30% etanolu i 15% kwasu octowego przez co najmniej 30 minut.

Przenieść próbkę podłoża do zatapiania i pozostawić do namoczenia i zrównoważenia przez co najmniej dwie godziny, utrzymując płytę żelową w zwolnionym tempie na wytrząsarce orbitalnej. Następnie pokrój ustalone pasy żelu na sekcje dokładnie równoległe do frontu migracji białka lub wzoru pasma. Umieść każdą sekcję na plastikowym wsporniku foliowym o równych wymiarach, aby ułatwić obsługę.

Przenieś pasy do otwartej rurki z korkami, które są zamknięte od dołu i centralnie perforowane od góry, oba dokładnie wyrównane z górnym i dolnym końcem sekcji żelowej. Zanurz na krótko cylinder w ciekłym azocie, aby szybko zainicjować krzepnięcie. Przezroczyste podłoże do zatapiania zestala się w ciągu kilku sekund i staje się białe.

Wypełnij wnękę medium do zatapiania, na krótko zanurz cylinder w ciekłym azocie, a następnie pozwól mu dokładnie zamarznąć w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez kilka godzin. Po zdemontowaniu usuń folię z tworzywa sztucznego i przenieś blok z osadzoną sekcją żelową do schłodzonego metalowego cylindra. Cylinder ma większą średnicę i jest uszczelniony na zewnątrz medium zatapiającym.

Umieszczony jest na płaskim wsporniku. Napełnij cylinder medium do zatapiania i dokładnie zamroź, jak wspomniano wcześniej. Powtórz tę procedurę z drugą stroną cylindra, aby uzyskać solidny blok ze współpłaszczyznową powierzchnią dolną.

Następnie wyjmij blok z cylindra i użyj medium do zatapiania, aby przykleić go do wstępnie schłodzonego metalowego uchwytu. Włóż metalowy uchwyt do krioplastyki. Uchwyt musi być starannie ustawiony w stosunku do płaszczyzny krojenia.

Pozwól, aby blok osiągnął optymalną temperaturę dla procesu krojenia. Po tym zbiorze żel kroi się jeden po drugim o końcowej pożądanej grubości 0,25 milimetra w kroku i przenosi je pojedynczo do probówek reakcyjnych o niskich właściwościach wiązania białek. Następnie plastry poddawane są trawieniu tryptycznemu i analizie spektrometrii mas.

Protokół ten rozszerza zastosowanie profilowania kompleksomu o wysokiej rozdzielczości na błony niemitochondrialne wykazujące ekspresję białek o niskiej liczebności. Złożona separacja pokazuje silnie wybarwione prążki białkowe z bardzo małą ilością artefaktów migracji. Odchylenia sygnałów peptydowych w masie i czasie retencji wskazują na bardzo niski wskaźnik fałszywie dodatniego przypisania objętości piku.

Różnice między uruchomieniami można łatwo wyeliminować przez ponowne skalowanie zestawów danych woluminu szczytowego. Uzyskane w ten sposób informacje o intensywności peptydów są następnie wykorzystywane do rekonstrukcji 2545 profili białkowych o względnej obfitości. Znaczenie wielkości kroku próbkowania żelu dla rozdzielczości kompleksów białkowych oceniono poprzez połączenie zestawów danych sąsiednich warstw.

Separacja wielkości złożonych populacji związanych z TPC1 na poziomie 0,25 milimetra jest dobrze zgodna z wynikami analizy western blot. Łączenie więcej niż dwóch wycinków znosi dyskryminację subpopulacji złożonych TPC1. Wreszcie, analiza dostarcza informacji na temat dobrze scharakteryzowanych kompleksów i wykazuje istnienie nowych podjednostek i złożonych zespołów.

W przypadku ferrytyny profile podjednostek dostosowane do ich względnej liczebności sugerują istnienie co najmniej trzech złożonych izoform z wyraźnymi stechiometriami łańcuchów ciężkich/lekkich. W przeciwieństwie do tego, kompleksy nikalina-nomo1, kompleks rdzeniowy gamma-sekretazy i maszyneria GPI-transamidaza wykazują stałe stosunki obfitości swoich podjednostek rdzeniowych w całym zakresie wielkości i niezależnie od asocjacji z dodatkowymi białkami. Kluczowym parametrem analizy csBN-MS jest efektywna rozdzielczość kompleksów, o której decyduje biochemia próbki, jakość żelu BN, prawidłowe wyrównanie podczas zatapiania i krojenia oraz jakość pozyskanych danych MS.

Połączenie csBN-MS z znakowaniem izotopowym białek i próbek pozwoli na bezpośrednie porównanie kompleksomów w różnych stanach patofizjologicznych, biologicznych lub rozwojowych. Badanie csBN-MS przeprowadzone na błonach z mózgu gryzoni ujawniło ogromną różnorodność receptorów, kanałów jonowych i transporterów w odniesieniu do ich składu podjednostek i funkcji, a także będzie miało zasadnicze znaczenie dla analizy struktury 3D w preparatach natywnych.