Name: Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę csBN-MS do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości przy użyciu krioslicingu. Technika ta umożliwia szczegółową analizę kompleksów białkowych błonowych w różnych tkankach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - Project-ID 403222702 - SFB 1381 oraz w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości CIBSS - EXC-2189 - Project ID 390939984. Dziękujemy Katji Zappe za pomoc techniczną.

1. Preparatywna BN-PAGE
<ol>
	<li>Przygotowanie żelu
	<ol>
		<li>Stosować średnio- i wielkoformatowy pionowy system elektroforezy żelowej (odległość separacji żelu >10 cm; odstęp 14 cm x 11 cm, odstęp 1,5 mm) z efektywnym chłodzeniem ustawionym na 10 °C.</li>
		<li>Odlewać liniowy lub hiperboliczny żel o gradiencie porów (przekładki 1,5-3,0 mm) za pomocą mieszającego dwukomorowego mieszalnika gradientowego napędzanego pompą (patrz Tabela materiałów i odczynników). W przedstawionym przykładzie (liniowy żel gradientowy 1%-13%):
		<ol>
			<li>Przygotować 13 ml roztworu do przedniej komory (mieszania) składającego się z: 13% akrylamidu (z 30% roztworu podstawowego, 37,5:1,0 akrylamid:bisakrylamid), 0,75 M kwasu aminokapronowego, 50 mM Bis-Tris (pH = 7,0) i 10% glicerolu.</li>
			<li>Przygotować 10 ml roztworu do komory zbiornika składającego się z: 1% akrylamidu (z 30% roztworu podstawowego, 37,5:1,0 akryloamidu:bisakryloamidu), 0,75 M kwasu aminokapronowego, 50 mM Bis-Tris (pH = 7,0) i 0,2% detergentu CL-47.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uruchomić mieszadło i dodać 30 mikrolitrów APS (nadtlenodissiarczan amonu, 10% roztwór podstawowy) i 2,5 μl TEMED (N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina) i 2,5 mikrolitrów TEMED do roztworu w komorze przedniej. Uruchom pompę i otwórz przedni zawór (przepływ należy dostosować tak, aby zakończyć odlewanie w ciągu 10 minut). Po upływie 1 minuty dodać 90 μl APS i 5 μl TEMED do roztworu w komorze zbiornika i otworzyć przyłącze komory.</li>
		<li>Pozostawić żel do powolnej, ale dokładnej polimeryzacji przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej (RT), aby wytworzyć jednorodny gradient wielkości porów. Spolimeryzowany żel przechowywany w stanie wilgotnym można przechowywać w pozycji pionowej w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia. 
		UWAGA: Celowo wierzch żelu będzie miał miękką/śluzowatą konsystencję. Zostanie to później usunięte, ale pozwala na płynne wejście białek do żelu, przy minimalnym ryzyku wytrącenia się białka, które w przeciwnym razie może prowadzić do artefaktów migracji (tj. smug lub wytrącania się białek).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i ładowanie próbki
	<ol>
		<li>Przygotuj szczeliny załadowcze, wkładając odpowiednie przekładki (np. rurki silikonowe) między szklane płytki w celu oddzielenia 0,5-2,0 mg białka. Szczeliny powinny mieć co najmniej 3 cm szerokości (lub lepiej 5-6 cm szerokości).</li>
		<li>Rozpuścić ~2,5 mg błony (preparat wzbogacony w endosomy nerki myszy) w 2 ml buforu do rozpuszczania zawierającego 1% (w/v) niedenaturującego detergentu (ComplexioLyte CL-47) przez 30 minut na lodzie. Ultrawirówka (punkt odcięcia sedymentacji = 200 S lub mniej; stosuje się tutaj 130 000 x g/11 min).</li>
		<li>Skoncentrować solubilizat na krótkim gradiencie krokowym sacharozy 50%/20% (w/v, 0,3 ml każdy) przez ultrawirowanie przez 1 godzinę przy 400 000 x g. Ostateczna wydajność białka powinna wynosić co najmniej 1 mg.</li>
		<li>Dodać 0,05% (w/v) Coomassie G-250 do solubilizatu i załadować próbkę na żel. Ogranicz obciążenie białkiem do przekroju poprzecznego pasa żelu 10-15 μg/mm2, aby uzyskać wysoką rozdzielczość i uniknąć artefaktów wynikających z wytrącania się białek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Warunki pracy BN-PAGE
	<ol>
		<li>Do uruchamiania należy przygotować standardowy bufor katodowy składający się z 50 mM tricine, 15 mM Bis-Tris i 0,01% Coomassie G-250. Przygotować wzorcowy bufor anodowy składający się z 50 mM Bis-Tris (pH = 7,0).</li>
		<li>Uruchom preparatywny BN-PAGE w temperaturze 10 °C przez noc, korzystając z trzystopniowego protokołu napięcia13 składającego się z: fazy równoważenia przez 30 minut przy 100 V, a następnie powolnej (3 godziny) rampy do maksymalnego napięcia (40-50 V/cm długości żelu), która jest ostatecznie utrzymywana przez co najmniej 6 godzin w celu skupienia białka w punkcie końcowym. 
		UWAGA: Zaleca się wstrzymanie elektroforezy, gdy front migracji dotrze do środka żelu i wymianę bufora katodowego na świeży bufor bez Coomassie G250. Pomaga to uniknąć artefaktów wytrącania się w żelu wynikających z miejscowego zapadania się struktury porów matrycy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek żelu i trawienie
<ol>
	<li>Wycięcie pasów żelowych
	<ol>
		<li>Po zakończeniu pracy zeskanuj żele w celach dokumentacyjnych, trzymając je między szklanymi płytkami.</li>
		<li>Zdemontuj tablice i wytnij interesujący Cię odcinek (odcinki) pasa ruchu.</li>
		<li>Pobrać próbny pasek pasa do analizy za pomocą 2D BN/SDS-PAGE i barwienia białek lub western blotting (jak pokazano na Rysunek 1B), aby określić obszary zainteresowania, efektywną rozdzielczość rozmiaru zespolonego i obfitość białka.</li>
		<li>Utrwal wybrane pasy żelu dwukrotnie przez co najmniej 30 minut za pomocą 30% (v/v) etanolu i 15% (v/v) kwasu octowego.</li>
		<li>Przenieść próbkę do podłoża zatapiającego i pozostawić do namoczenia i zrównoważenia przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 4 °C, utrzymując płytę żelową w zwolnionym tempie na wytrząsarce orbitalnej. 
		UWAGA: Separacja żelu powinna być dokładnie sprawdzona pod kątem ogólnej jakości separacji i artefaktów migracji. Paseczki żelowe reprezentujące białka dominujące powinny być wolne od zniekształceń i jednorodne pod względem intensywności. Lokalne artefakty na żelu należy wyciąć lub pominąć w analizie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie i krojenie kriomikrotomu 
	UWAGA: Jest to ulepszona wersja procedury osadzania opisanej i udokumentowanej wcześniej na zdjęciach, która pozwala na osadzanie i krojenie szerszych pasów żelu do 8 cm11.
	<ol>
		<li>Najpierw pokrój stałe pasy żelu na sekcje (w tym przypadku 3 cm) dokładnie równolegle do wzorca migracji białka na froncie/prążku. Aby ułatwić obsługę, umieść każdą sekcję na plastikowym wsporniku z folii o równych wymiarach.</li>
		<li>Przenieś pasy do otwartej tuby z korkami (zamkniętej na dole, centralnie perforowanej na górze, obie dokładnie wyrównane z górnym i dolnym końcem sekcji żelowej).</li>
		<li>Zanurz na krótko cylinder w ciekłym azocie, aby szybko zainicjować krzepnięcie. Przezroczyste podłoże do zatapiania zestala się w ciągu kilku sekund i staje się białe.</li>
		<li>Napełnij wnękę medium do zatapiania, na krótko zanurz je w ciekłym azocie i zamroź cylinder w temperaturze -20 °C na kilka godzin. 
		UWAGA: Szybkie chłodzenie butli poprzez zanurzenie jej w ciekłym azocie pomaga uniknąć przemieszczenia płyty żelowej w rurce. Należy unikać zniekształceń, aby zapewnić wysoką rozdzielczość w następującej analizie państwa członkowskiego.</li>
		<li>Po zdemontowaniu usuń folię z tworzywa sztucznego i przenieś blok z osadzoną sekcją żelową do schłodzonego metalowego cylindra o większej średnicy umieszczonego na płaskim wsporniku (tj. szalce Petriego) i uszczelnionego medium do zatapiania na zewnątrz cylindra. Napełnij cylinder medium do zatapiania i dokładnie zamroź.</li>
		<li>Powtórz tę procedurę z drugą stroną cylindra, aby uzyskać solidny blok o współpłaszczyznowych powierzchniach.</li>
		<li>Wyjmij blok z cylindra, przyklej go medium do zatapiania na wstępnie schłodzonym metalowym uchwycie i włóż uchwyt do maszyny do krioplastowania (kriotomu). Powierzchnia bloku musi być dokładnie wyrównana w stosunku do płaszczyzny krojenia. Pozwól mu zrównoważyć się w temperaturze optymalnej dla procesu krojenia (tutaj -15 °C). 
		UWAGA: Użyj powoli postępującego ręcznego cyklu krojenia w kroku 0.1 mm, aż do uderzenia w powierzchnię osadzonej sekcji żelu, aby zapewnić prawidłowe ustawienie.</li>
		<li>Zbierz plastry żelu jeden po drugim, z ostateczną pożądaną grubością kroku 0,25 mm i przenieś je pojedynczo do probówek reakcyjnych o niskich właściwościach wiązania białek. 
		UWAGA: W tym zestawie można łatwo uzyskać jednolite plastry żelu o grubości zaledwie 0,1 mm i 0,5 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie tryptyczne
	<ol>
		<li>Przeprowadzić trawienie tryptyczne w żelu po intensywnym umyciu plastrów żelu (zaleca się co najmniej trzy dodatkowe rundy płukania w celu usunięcia składników polimerowych z podłoża do zatapiania) zgodnie ze standardową procedurą11.</li>
		<li>Suszyć próżniowo eluowane peptydy i ponownie rozpuścić w 0,5% (v/v) kwasie trifluorooctowym przez wstrząsanie w temperaturze 37 °C (10 min), a następnie sonikację kąpieli (5 min) i krótkie odwirowanie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Spektrometria mas
<ol>
	<li>konfiguracja nanoHPLC i MS
	<ol>
		<li>Załadować strawione próbki do kolumny C18 (wielkość cząstek = 5 μm; średnica = 300 μm) 0,05% (v/v) kwasu trifluorooctowego przy użyciu (nierozszczepionego) nano-HPLC sprzężonego ze spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości.</li>
		<li>Elute wychwycone peptydy o gradiencie wodno-organicznym (eluent A): 5 min 3% B, 120 min od 3% B do 30% B, 20 min od 30% B do 99% B, 5 min 99% B, 5 min od 99% B do 3% B, 15 min 3% B (natężenie przepływu = 300 nL/min). 
		UWAGA: plastry żelu csBN-MS zazwyczaj dają próbki o niskiej lub pośredniej obfitości peptydów i ograniczonym stopniu złożoności. Analiza nanoLC-MS/MS powinna być zatem wykonywana z konfiguracją zapewniającą rozsądną czułość i szybkość sekwencjonowania, wysoką rozdzielczość masy (>100 000) i maksymalny zakres dynamiki (efektywnie 3-4 rzędy wielkości). Nie wymaga jednak długich wymiarów kolumny ani gradientów elucji przekraczających 3 godziny.</li>
		<li>Oddziel eluowane peptydy w emiterze (średnica wewnętrzna 75 μm; końcówka = 8 μm) ręcznie zapakowane około 20 cm materiałem C18 (wielkość cząstek = 3 μm). Próbki należy rozpylać elektrodynamicznie pod napięciem 2,3 kV (tryb jonów dodatnich) do ogrzewanej kapilary transferowej (250 °C) spektrometru mas.</li>
		<li>Wykonuj analizy z następującymi ustawieniami przyrządu11: maksymalny czas wstrzykiwania MS/MS = 400 ms; czas trwania wykluczenia = 60 s; minimalny próg sygnału = 5,000 zliczeń, 10 najlepszych prekursorów pofragmentowanych; szerokość izolacji = 1,0 m/z). 
		UWAGA: Aby ułatwić kalibrację masy, czasu retencji i przypisania sygnałów peptydowych w dużej liczbie zestawów danych lub pomiarów, zaleca się wykonywanie odpowiednich serii pomiarowych MS bez przerw lub zmian parametrów i sprzętu (tj. na tej samej kolumnie/emiterze C18).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja białka (dane MS oceniane zgodnie z wcześniejszym opisem11)
	<ol>
		<li>Wyodrębnij listy pików z widm jonów fragmentowych za pomocą narzędzia "msconvert.exe" (część ProteoWizard).</li>
		<li>Przesunąć wszystkie wartości m/z prekursorów dla każdego zestawu danych o medianę przesunięcia m/z wszystkich peptydów przypisanych do białek we wstępnym przeszukiwaniu bazy danych z tolerancją masy peptydu 50 ppm.</li>
		<li>Przeszukaj poprawione listy pików za pomocą odpowiedniej wyszukiwarki (tutaj, Mascot 2.6.2) wśród wszystkich wpisów myszy w bazie danych UniProtKB/Swiss-Prot (wydanie 2018_11).</li>
		<li>Wybierz "Acetyl (Białko N-termin)", "Karbamidometyl (C)", "Gln | pyro-Glu (N-termin Q), Glu | piro-Glu (N-termin E)", "Utlenianie (M)" i "Propionamid (C)" jako zmienne modyfikacje.</li>
		<li>Ustaw tolerancję masy peptydu i fragmentu odpowiednio na ± 5 ppm i ± 0,8 Da i pozwól na jedno pominięte rozszczepienie tryptyczne. Ustaw wartość graniczną oczekiwanej dla identyfikacji peptydu na 0,5 lub mniej. Użyj wyszukiwania w bazie danych przynęty, aby określić współczynnik wyników fałszywie dodatnich (FDR). Ustaw FDR na 1% lub zastosuj dodatkowe kryteria jakości, aby zapewnić wiarygodną identyfikację. 
		UWAGA: W przedstawionym eksperymencie zidentyfikowano ponad 3500 białek o średnim FDR peptydu wynoszącym 4,4 ± 0,77% (n = 101 próbek warstwowych) lub 3000 białek, gdy peptyd FDR był ustawiony na 1%. Co ważne, zastosowano bardziej rygorystyczne kryteria doboru profilowanych białek (2 568). Obejmował on wszystkie białka, które zostały zidentyfikowane z co najmniej dwoma peptydami, z których co najmniej jeden był specyficzny dla białka, w co najmniej jednej ze 101 próbek plasterków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja białek
	<ol>
		<li>Użyj intensywności sygnału peptydowego (objętości pików [PV]) do kwantyfikacji białek, które uzyskuje się z pełnych skanów FT i koryguj czas retencji i przesunięcia masy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (tutaj, MaxQuant v1.6.3).</li>
		<li>Dopasuj zestawy danych MS jeden po drugim do referencyjnych (całkowitych średnich) czasów elucji peptydów za pomocą regresji LOESS. Przypisz PV do peptydów bezpośrednio (identyfikacja na podstawie MS/MS) lub pośrednio (tj. na podstawie ich dopasowania m/z i czasu elucji w bardzo wąskich tolerancjach). 
		UWAGA: Ten protokół wykorzystuje wewnętrzne oprogramowanie do przypisywania "wstawionych" peptydów nazywanych peptydami. Ustawione parametry skutkują efektywnymi tolerancjami dopasowania m/z i czasu elucji wynoszącymi odpowiednio ± 2 ppm i ± 1 min (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B).</li>
		<li>Skoryguj systematyczne zmiany obciążenia peptydów i wydajności jonizacji między seriami poprzez przeskalowanie intensywności peptydów obliczone na podstawie mediany różnic względnych intensywności peptydów między sąsiednimi próbkami warstw (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Filtrowanie danych PV pod kątem wartości odstających i pozostałych wyników fałszywie dodatnich zidentyfikowanych przez wewnętrzną analizę spójności PV.</li>
		<li>Znormalizuj PV każdego peptydu do ich maksymalnych wartości we wszystkich zestawach danych wycinków, uzyskując względne profile obfitości peptydów.</li>
		<li>Na koniec oblicz względne profile obfitości białek jako średnie z co najmniej dwóch (i do sześciu lub 50%, w zależności od tego, która wartość jest większa) najlepiej korelujących profili peptydowych w oknie trzech kolejnych wycinków. Pozwala to na zniwelowanie brakujących wartości PV i zmniejszenie hałasu. 
		UWAGA: Ostatecznie zaowocowało to 2 545 (z 2 568 wstępnie wybranych) profilami białkowymi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka kompleksów białkowych
	<ol>
		<li>Analizuj profile białek, najpierw wykrywając piki przy użyciu metody maksimów lokalnych, a następnie dopasuj rozkłady normalne do tych pików, uzyskując pozycję (tj. indeks wycinka lub pozorny rozmiar zespolony) ich maksimów i wartości FWHM (pełna szerokość przy połowie maksymalnej intensywności) (wstawka <silna klasa="xfig">Rysunek 4). 
		UWAGA: W zestawie danych profile są analizowane automatycznie przy użyciu skryptów niestandardowych. Najmniejsze wartości FWHM wskazują na efektywną rozdzielczość rozmiaru podejścia (tutaj 6 x 0,25 = 1,5 mm).</li>
		<li>Użyj referencyjnych pików kompleksu białkowego o zdefiniowanej masie cząsteczkowej (zgodnie z informacją zawartą w bazie danych UniProtKB/Swiss-Prot ) do analizy regresji liniowej wartości log10 (przewidywana masa cząsteczkowa) w celu przeliczenia wskaźników liczby wycinków na pozorne rozmiary molekularne (tj. pozorny rozmiar kompleksu w kDa). 
		UWAGA: W tym badaniu wybrano 23 kompleksy markerowe w próbce (<silna klasa="xfig">Rysunek 4) na podstawie (i) monodyspersyjnych kształtów pików profilu, (ii) eksperymentalnego wsparcia mas cząsteczkowych oraz (iii) rozkładów wzdłuż badanych odcinków żelu BN-PAGE.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Majeran, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+C4+Differentiation+for+Chloroplast+Membrane+Proteomes+in+Maize+Mesophyll+and+Bundle+Sheath+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Consequences of C4 Differentiation for Chloroplast Membrane Proteomes in Maize Mesophyll and Bundle Sheath Cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 7, 1609-1638 (2008).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li>
<li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metabolism. 16 (4), 538-549 (2012).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS ONE. 8 (7), e68340(2013).</li>
<li>Wöhlbrand, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+membrane-protein+complexes+of+the+marine+sulfate+reducer+Desulfobacula+toluolica+Tol2+by+1D+blue+native-PAGE+complexome+profiling+and+2D+blue+native-%2FSDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of membrane-protein complexes of the marine sulfate reducer Desulfobacula toluolica Tol2 by 1D blue native-PAGE complexome profiling and 2D blue native-/SDS-PAGE.</a> Proteomics. 16 (6), 973-988 (2016).</li>
<li>Takabayashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCoM-DB+Update%3A+A+Protein+Co-Migration+Database+for+Photosynthetic+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">PCoM-DB Update: A Protein Co-Migration Database for Photosynthetic Organisms.</a> Plant and Cell Physiology. 58 (1), e10(2017).</li>
<li>Senkler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+complexome+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial complexome of Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 89 (6), 1079-1092 (2017).</li>
<li>de Almeida, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+electron+transport+systems+of+an+anammox+bacterium%3A+A+complexome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound electron transport systems of an anammox bacterium: A complexome analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (10), 1694-1704 (2016).</li>
<li>Anand, R., Strecker, V., Urbach, J., Wittig, I., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mic13+Is+Essential+for+Formation+of+Crista+Junctions+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mic13 Is Essential for Formation of Crista Junctions in Mammalian Cells.</a> PLoS ONE. 11 (8), e0160258(2016).</li>
<li>Eydt, K., Davies, K. M., Behrendt, C., Wittig, I., Reichert, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cristae+architecture+is+determined+by+an+interplay+of+the+MICOS+complex+and+the+F1FO+ATP+synthase+via+Mic27+and+Mic10%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Cristae architecture is determined by an interplay of the MICOS complex and the F1FO ATP synthase via Mic27 and Mic10.</a> Microbial Cell. 4 (8), 259-272 (2017).</li>
<li>Müller, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoslicing+Blue+Native-Mass+Spectrometry+%28csBN-MS%29%2C+a+Novel+Technology+for+High+Resolution+Complexome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Cryoslicing Blue Native-Mass Spectrometry (csBN-MS), a Novel Technology for High Resolution Complexome Profiling.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 669-681 (2016).</li>
<li>Castonguay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-pore+channel+TPC1+is+required+for+efficient+protein+processing+through+early+and+recycling+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The two-pore channel TPC1 is required for efficient protein processing through early and recycling endosomes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10038(2017).</li>
<li>Schägger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Banyard, S. H., Stammers, D. K., Harrison, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+density+map+of+apoferritin+at+2.8-A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electron density map of apoferritin at 2.8-A resolution.</a> Nature. 271 (5642), 282-284 (1978).</li>
<li>Dettmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+protein+147+%28TMEM147%29+is+a+novel+component+of+the+Nicalin-NOMO+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transmembrane protein 147 (TMEM147) is a novel component of the Nicalin-NOMO protein complex.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (34), 26174-26181 (2010).</li>
<li>Kimberly, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-secretase+is+a+membrane+protein+complex+comprised+of+presenilin%2C+nicastrin+Aph-1%2C+and+Pen-2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gamma-secretase is a membrane protein complex comprised of presenilin, nicastrin Aph-1, and Pen-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6382-6387 (2003).</li>
<li>Hong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+PIG-U+and+yeast+Cdc91p+are+the+fifth+subunit+of+GPI+transamidase+that+attaches+GPI-anchors+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Human PIG-U and yeast Cdc91p are the fifth subunit of GPI transamidase that attaches GPI-anchors to proteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1780-1789 (2003).</li>
<li>Van Damme, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+ATP6V1E1+or+ATP6V1A+Cause+Autosomal-Recessive+Cutis+Laxa%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in ATP6V1E1 or ATP6V1A Cause Autosomal-Recessive Cutis Laxa.</a> The American Journal of Human Genetics. 100 (2), 216-227 (2017).</li>
<li>Budenholzer, L., Cheng, C. L., Li, Y., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+Structure+and+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteasome Structure and Assembly.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3500-3524 (2017).</li>
<li>Heusel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-centric+proteome+profiling+by+SEC-SWATH-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Complex-centric proteome profiling by SEC-SWATH-MS.</a> Molecular Systems Biology. 15 (1), e8438(2019).</li>
<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Forster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nature Methods. 9 (9), 907-919 (2012).</li>
</ol>

Autor, Uwe Schulte, jest pracownikiem i udziałowcem firmy Logopharm GmbH, która produkuje ComplexioLyte 47 wykorzystany w tym badaniu. Firma dostarcza odczynniki ComplexioLyte instytucjom akademickim na zasadzie non-profit.

Prezentowane badanie opierało się na technice csBN-MS, którą wcześniej porównywano z preparatem mitochondrialnym11 i zawierało ulepszenia w przygotowaniu próbek, przetwarzaniu żelu i ocenie danych dotyczących stwardnienia rozsianego. Ukierunkowana analiza fragmentu żelu BN-PAGE do separacji na dużą skalę dostarczyła kompleksowego zestawu danych pokazujących pomiary jakości porównywalne z badaniem z błonami mitochondrialnymi. Błędy masy i czasu retencji, a także wahania między seriami były utrzymywane na bardzo niskim poziomie i stanowiły podstawę do określenia wiarygodnych profili obfitości białka. Rozdzielczość rozmiaru wydawała się być dobra, z połową maksymalnej szerokości piku wynoszącą zaledwie sześć warstw (co odpowiada 1,5 mm, Rysunek 4) i względnymi różnicami wielkości mniejszymi niż 10% rozdzielczości (Rysunek 3, Rysunek 5A). Wartości te nie odpowiadały w pełni jakości rozdzielczości wielkości poprzedniej analizy mitochondriów csBN-MS (pomimo wybranego mniejszego rozmiaru kroku próbkowania żelu), ale są znacznie lepsze niż wydajność konwencjonalnych podejść BN-MS lub MS z wykluczeniem wielkości20 , które stały się ostatnio popularne.
Znaczenie wysokiej efektywnej rozdzielczości rozmiaru kompleksu zostało podkreślone przez eksperyment symulacyjny na rysunku 3 (wykorzystujący kompleksy związane z TPC1), który z trudem może być rozwiązany za pomocą analizy western blot 2D BN/SDS-PAGE (rysunek 1B). Wyniki te sugerują, że krojenie o 0,25 mm w tym przypadku skutkowało pewnym nadpróbkowaniem, ale nadal okazało się to przydatne do eliminacji "szumu kwantyfikacji" bez uszczerbku dla efektywnej rozdzielczości rozmiaru. W związku z tym, zgodnie z poprzednimi wynikami11, ogólnie zalecana jest wielkość kroku pobierania próbek wynosząca ~0,3 mm.
Warto zauważyć, że dyskryminacja kompleksów związanych z TPC1 jest całkowicie utracona przy pobieraniu próbek żelu o średnicy 1 mm, co jest najmniejszym krokiem zapewnionym przez ręczne krojenie w konwencjonalnym BN-MS 5,6. Może to wyjaśniać fakt, że pomimo dostępności potężnych technologii SM, bardzo niewiele kompleksów i podjednostek białkowych zostało zidentyfikowanych de novo za pomocą profilowania kompleksomów. Oprócz dobrej zdolności rozdzielczej, csBN-MS oferuje dużą wszechstronność. Kompleksy związane z błoną i rozpuszczalne kompleksy białkowe w zakresie od 50 kDa do kilku MDa można skutecznie rozwiązać w jednym eksperymencie przy minimalnym odchyleniu11. Kontrastuje to z alternatywnymi technikami separacji stosowanymi do profilowania kompleksomów, takimi jak wykluczanie wielkości lub chromatografia jonowymienna, które działają na podzbiorach rozpuszczalnych białek o określonych zakresach wielkości lub właściwościach ładunku. Z drugiej strony, csBN-MS jest mniej skalowalny (maksymalne obciążenie ~3 mg białka na żel), może być trudny technicznie i nie może być zautomatyzowany.
Ogólnie rzecz biorąc, wyniki pokazują, że profilowanie kompleksomu oparte na csBN-MS może być z powodzeniem stosowane do celów niemitochondrialnych, ale wskazuje również na pewne związane z tym wyzwania. W związku z tym wydajna ekstrakcja i stabilność biochemiczna kompleksów białkowych wymagają większej optymalizacji i etapów czyszczenia i mogą być nadal ograniczone. W badanym oknie wielkości liczba dobrze skoncentrowanych, monodyspersyjnych kompleksów białkowych była rzeczywiście znacznie niższa (dane nie pokazane) w porównaniu z próbką mitochondrialną. Zaleca się również zmniejszenie wsadu próbki BN-PAGE w celu uzyskania akceptowalnej separacji żelu. Większe obciążenia mogą wymagać szerszych pasów żelowych, które są trudniejsze do prawidłowej obróbki w celu krojenia (patrz załączony film). Co więcej, złożoność białek w próbkach była wyższa (około dwukrotnie) niż w przypadku trawienia warstw pochodzących z mitochondriów, co prowadziło do większej liczby brakujących wartości PV i zmniejszonego zakresu dynamiki. W rzeczywistości w analizach brakowało niektórych małych białek, które miały być częścią kompleksów pokazanych na rysunku 5. Problemy te można rozwiązać w przyszłości, stosując szybsze i bardziej czułe instrumenty MS lub tryby akwizycji niezależne od danych.
Przygotowanie próbki ma kluczowe znaczenie dla wydobycia kompleksu białkowego, stabilności i jakości separacji żelu. Parametry i procedury powinny być zoptymalizowane dla każdej tkanki źródłowej, lizatu komórkowego, błony (frakcji) i kompleksu białkowego, który jest przedmiotem zainteresowania. Podano następujące ogólne zalecenia, które mogą pomóc w rozszerzeniu zastosowań csBN-MS:
(i) Przygotowywanie próbek w stanie świeżym i unikanie ocieplania/zamrażania, silnych rozcieńczeń, zmian warunków buforowych i niepotrzebnych opóźnień;
(ii) stosowanie, które są zasadniczo pozbawione soli (zastąpić 500-750 mM betainy lub kwasem aminokapronowym), o pH obojętnym i zawierające do 1% (w/v) detergentu niedenaturującego (stosunek białka do detergentu między 1:4-1:10 do rozpuszczania kompleksów białek błonowych, nie jest wymagany detergent do rozpuszczalnych kompleksów białkowych);
(iii) Staranne testowanie i dostosowywanie warunków detergentu za pomocą analitycznego BN-PAGE, ponieważ mogą one silnie wpływać na efektywność solubilizacji kompleksów, reprezentację kompleksów białek błonowych w próbce, stabilność i jednorodność miceli białkowo-detergentowych. Te ostatnie są warunkiem wstępnym, aby białka skupiły się jako odrębne prążki/złożone populacje w żelach BN-PAGE. Dotychczasowa literatura oferuje szeroką gamę neutralnych detergentów. Jednak DDM (n-dodecyl β-d-maltozyd)1,2,4,5,6 i digitonina 3,5,7,8,9,10,13,18 były do tej pory najpopularniejszymi wyborami do analiz BN-MS. Należy podkreślić, że każdy stan detergentu z konieczności stanowi kompromis między wydajnością solubilizacji a zachowaniem interakcji białkowych i może nie być jednakowo odpowiedni dla wszystkich rodzajów białka docelowego i materiału źródłowego;
(iv) Usuwanie naładowanych polimerów, takich jak fibryle, włókna, polilizyna, DNA i obfite składniki o niższej masie cząsteczkowej (tj. metabolity, lipidy lub peptydy). Można to osiągnąć poprzez ultrawirowanie, filtrację żelową lub dializę. Jest to szczególnie ważne w przypadku całkowitych lizatów komórkowych lub tkankowych;
(v) Dodanie Coomassie G-250 (stężenie końcowe 0,05%-0,1%) i sacharozy (w celu zwiększenia gęstości do obciążenia, stężenie końcowe 10%-20% [w/v]) do próbki tuż przed załadowaniem, w celu oczyszczenia przez krótkie ultrawirowanie, załadować próbkę bez zakłóceń i natychmiast po tym rozpocząć cykl.
W perspektywie przyszłości, profilowanie kompleksomu oparte na csBN-MS oferuje opcje multipleksowania w celu badania dynamiki kompleksów białkowych lub zmian związanych z określonymi warunkami biologicznymi. Połączona separacja próbek znakowanych metabolicznie, zgodnie z propozycją profilowania opartego na wykluczeniuwielkości21 , wydaje się prosta, ale może być utrudniona przez spontaniczną wymianę podjednostek w kompleksach zachodzących niezależnie od zastosowanej metody separacji. Alternatywnie, znakowane próbki mogą być rozpuszczane w sąsiednich pasach żelowych, które mogą być następnie krojone lub łączone po trawieniu w celu analizy różnicowej o wysokiej czułości i wytrzymałości.

Separacja BN-PAGE została po raz pierwszy bezpośrednio sprzężona z analizą LC-MS (BN-MS) przez grupy badawcze Majeran1 i Wessels2 przy użyciu ręcznego krojenia pasów żelowych BN-PAGE. Ich analizy pozwoliły zidentyfikować szereg licznych kompleksów białek błonowych o znanym składzie podjednostek pochodzących odpowiednio z plastydów roślinnych i mitochondriów komórek HEK. Analizy te były jednak dalekie od kompleksowości i nie pozwalały na bezstronną identyfikację nowych zespołów. Od tego czasu wydajność spektrometrów masowych i metod kwantyfikacji bez znaczników znacznie się poprawiła, co umożliwiło kompleksowe analizy BN-MS. W ten sposób ukuto termin "profilowanie kompleksomowe". Na przykład Heide i współpracownicy przeanalizowali mitochondria serca szczura, identyfikując i grupując 464 białka mitochondrialne, potwierdzając w ten sposób wiele znanych zespołów. Ponadto okazało się, że TMEM126B jest nową i kluczową podjednostką określonego kompleksu montażowego3. Porównywalne wyniki (z 437 mitochondrialnymi profilami białkowymi) uzyskano w równoległym badaniu mitochondriów komórek HEK4.
Pomimo tych ulepszeń, pozostało kilka problemów, które ograniczają pełny potencjał BN-MS do profilowania kompleksomów. Głównym ograniczeniem jest efektywna rozdzielczość wielkości kompleksów, która jest określana przez dwa czynniki: (i) jakość separacji BN-PAGE, która zależy od jednorodności gradientu porów matrycy żelowej, jak również stabilność/rozpuszczalność kompleksów próbek, oraz (ii) wielkość kroku pobierania próbek żelu, która wynosi co najwyżej 1 mm przy użyciu konwencjonalnego ręcznego krojenia5, 6. Słaba rozdzielczość rozmiaru nie tylko pomija subtelne złożone izoformy i niejednorodności, ale także negatywnie wpływa na zakres dynamiki i pewność bezstronnego, de novo przypisywania i kwantyfikacji podjednostek.
Inne wyzwania obejmują precyzję kwantyfikacji białek i pokrycie rzeczywistego dynamicznego zakresu obfitości białek w próbce za pomocą analizy spektrometrii mas. W związku z tym zastosowanie profilowania kompleksomu BN-MS pozostało w dużej mierze ograniczone do próbek biologicznych o mniejszej złożoności, wysokiej ekspresji docelowych kompleksów i korzystnych właściwościach solubilizacyjnych (tj. plastydów, mitochondriów i mikroorganizmów)6,7,8,9,10.
Niedawno wprowadziliśmy BN-MS wspomagany kroniem kriomikrotomu (csBN-MS), który łączy precyzyjne submilimetrowe próbkowanie pasów żelowych BN-PAGE z kompleksową analizą MS i skomplikowanym przetwarzaniem danych MS w celu określenia profili białek z wysokim zaufaniem11. Zastosowanie preparatu błony mitochondrialnej z mózgów szczurów wykazało wcześniej niespotykaną efektywną rozdzielczość rozmiaru kompleksu i maksymalne pokrycie podjednostek kompleksu oksydacyjnego łańcucha oddechowego (OXPHOS) (tj. 90 z 90 dostępnych dla MS). W tym przykładzie zidentyfikowano również szereg nowych zespołów białkowych.
Opisane tutaj są zoptymalizowane procedury do separacji kompleksów białkowych w skali preparatywnej BN-PAGE (nie ograniczonej do konkretnego źródła biologicznego), odlewania dużych preparatywnych żeli BN-PAGE, kronia kriomikrotomu szerokich pasów żelu i przetwarzania danych MS. Skuteczność profilowania w wysokiej rozdzielczości wykazano dla preparatu kompleksu białkowego z błon wzbogaconych endosomami nerki myszy. Na koniec omówiono korzyści płynące ze zwiększenia rozdzielczości i precyzji kwantyfikacji spektrometrii mas.

<table><tbody><tr><td>30% roztwór akrylamidu/bis, 37,5:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610158</td><td>Zalecany do gradientowych roztworów żelowych akryloamidu do 13%</td></tr><tr><td>30% Roztwór akrylamidu/bis, 19:1</td><td>Bio Rad</td><td>#1610154</td><td>Zalecany do gradientowych roztworów żelowych akryloamidu >13%</td></tr><tr><td>SYPRO Barwnik białkiem rubinowym</td><td>Bio Rad</td><td>#1703127</td><td>Całkowite barwienie białkowe na błonach blotów; czułe i kompatybilne z immunodetekcją</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>Serva</td><td>no. 35050</td><td>Odwirować roztwory podstawowe przed użyciem</td></tr><tr><td>ComplexioLyte 47</td><td>Logopharm</td><td>CL-47-01</td><td>Gotowy do użycia bufor detergentowy (1%) do łagodnej solubilizacji białek błonowych</td></tr><tr><td>Medium do zatapiania / Medium do zamrażania tkanek</td><td>Leica Biosystems</td><td>14020108926</td><td>Podłoże do zatapiania skrawków żelu do krojenia za pomocą kriomikrotomu</td></tr><tr><td>Membrana Immobilon-P, PVDF, 0,45 &mikro; m</td><td>Odczynnik do</td><td></td> wykrywania blottingu ECL Prime IPVH00010 <td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa strzykawka z gumowym korkiem, 20-30 ml</td><td>b.a.n.a.dowolny</td><td></td> <td>dostawca, ważny do produkcji żelu narzędzie do zatapiania sekcji żelu</td></tr><tr><td>szeroka żyletka</td><td>b.a.n.a.dowolny</td><td></td> <td>dostawca, do przycinania żelu BN-PAGE / wycinania pasów</td></tr><tr><td>metalowa rurka / cylinder, ok. 4 cm długa</td> forma <td>n.a.n.a.mold</td><td></td> <td>do zatapiania i zamrażania próbek żelu</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubes, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>Nr. 0030108116</td><td>zdecydowanie zaleca się zminimalizowanie utraty białka/peptydu z powodu</td></tr><tr><td>zmodyfikowanej trypsyny do sekwencjonowania</td> absorpcyjnego <td>Prekolumna Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>C18 PepMap100, wielkość cząstek 5 i mikro; m</td><td>Emiter Dionex / Thermo Scientific</td><td>P/N 160454</td><td></td></tr><tr><td>PicoTip (i.d. 75 &micro; m; Wskazówka 8 & mikro; m)</td> <td>Nowy obiektyw</td><td>FS360-75-8</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 &micro; m)</td> <td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r13.93.</td><td>Kolumny pakowane ręcznie</td></tr><tr><td>królicze przeciwciało anty-TPC1</td><td>Gramsch Laboratories</td><td>produkcja na zamówienie</td><td>opisana w Castonguay, et al., 2017 (odniesienie 12)</td></tr><tr><td>Cy3-biotynylowane kozie przeciwciało anty-królicze IgG</td><td>Vector</td><td>Laboratories CY-1300</td><td>opisane w Castonguay, et al., 2017 (odniesienie 12)</td></tr><tr><td>biotynylowana lektyna Lotus tetragonolobus, FITC-sprzężone</td><td>Vector Laboratories</td><td>#B1325</td><td>opisane w Castonguay, et al., 2017 ( Odniesienie 12)</td></tr> <tr><td>kriomikrotom Leica CM1950</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047743905</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean II Cell z modułem wetblot</td><td>Bio Rad</td><td>n.a.</td> <td>dla SDS-PAGE i Westernblot (już nie sprzedawany)</td></tr> <tr><td>System elektroforezy Penguin Midi Gel</td><td>PeqLab</td><td>n.a.</td> <td>dla BN-PAGE (już nie sprzedawany)</td></tr> <tr><td>Mikroskop Zeiss Axiovert 200 M + Fotometria Aparat cyfrowy Coolsnap 2</td><td>Zeiss / Fotometria</td><td>n.a.pompa</td><td></td></tr> <tr><td>perystaltyczna (IP wysoka precyzja wielokanałowa)</td><td>Ismatec</td><td>ISM940</td><td>do odlewania gradientowych żeli poliakrylamidowych</td></tr><tr><td>mieszalnik gradientowy z mieszaniem (dwie komory)</td><td>własnej roboty, alternatywnie Bio Rad</td><td>1652000 lub 1652001</td><td>do odlewania gradientowych żeli poliakrylamidowych, ręczny dostarcza instrukcje do odlewania liniowych lub hiperbolicznych żeli gradientowych (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)</td></tr><tr><td>ultrawirówka Sorvall M120 z wirnikiem S80 AT3</td><td>Sorvall / Thermo Scientific</td><td>n.a.</td> <td>do przygotowania próbek (już nie sprzedawana)</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano HPLC</td><td>Dionex / Thermo Scientific</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Elite spektrometr masowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMAZQ</td><td></td></tr></tbody></table>

profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy bn-ms metodą krioslicingu

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Białka zazwyczaj pełnią funkcje biologiczne poprzez interakcje z innymi białkami, zarówno w dynamicznych zespołach białkowych, jak i jako część stabilnie utworzonych kompleksów. Ten ostatni można elegancko rozdzielić w zależności od wielkości cząsteczki za pomocą natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). Sprzężenie takich separacji z czułą spektrometrią mas (BN-MS) jest dobrze znane i teoretycznie pozwala na wyczerpującą ocenę ekstrahowalnego kompleksomu w próbkach biologicznych. Jednak takie podejście jest dość pracochłonne i zapewnia ograniczony złożony rozmiar, rozdzielczość i czułość. Ponadto jego zastosowanie pozostało ograniczone do obfitych białek mitochondrialnych i plastydowych. W związku z tym w przypadku większości białek nadal brakuje informacji na temat integracji w stabilne kompleksy białkowe. Przedstawiono zoptymalizowane podejście do profilowania kompleksomu, obejmujące separację BN-PAGE w skali preparatywnej, submilimetrowe pobieranie próbek szerokich pasów żelu za pomocą kropienia kriomikrotomu oraz analizę spektrometryczną mas z kwantyfikacją białek bez znaczników. Szczegółowo opisano procedury i narzędzia dla krytycznych etapów. Jako zastosowanie, raport opisuje analizę kompleksomową rozpuszczonej frakcji błonowej wzbogaconej w endosomy z nerek myszy, z łącznie 2545 profilowanymi białkami. Wyniki wskazują na identyfikację jednorodnych białek błonowych o niskiej liczebności, takich jak wewnątrzkomórkowe kanały jonowe, a także złożonych wzorców składania białek o wysokiej rozdzielczości, w tym izoform glikozylacji. Wyniki są zgodne z niezależnymi analizami biochemicznymi. Podsumowując, metodologia ta pozwala na kompleksową i bezstronną identyfikację (super)kompleksów białkowych i ich składu podjednostek, stanowiąc podstawę do badania stechiometrii, składania i dynamiki interakcji kompleksów białkowych w dowolnym systemie biologicznym.

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Głównym celem opracowania techniki csBN-MS było uzyskanie kompleksowego dostępu do organizacji i składania kompleksów białkowych, które leżą u podstaw transdukcji sygnału na i w poprzek błony plazmatycznej różnych typów tkanek i narządów. csBN-MS zapewnia obecnie najwyższą wszechstronność rozdzielczości do analizy natywnych kompleksów białkowych i ich składu podjednostek, w szczególności w odniesieniu do białek błonowych. Chociaż technika csBN-MS została opracowana do analizy skompleksowanych mieszanin zespołów białek błonowych w mózgu gryzoni, można ją łatwo dostosować do analizy dowolnego rodzaju próbki biologicznej.Jednym z kluczowych etapów naszej metody jest zatopienie kawałka żelu i jego prawidłowe wyrównanie do płaszczyzny cięcia przed krojeniem. Należy uważać, aby nie rozerwać ani nie ścisnąć żelu i upewnić się, że nie jest on przechylony do płaszczyzny cięcia, ponieważ zmniejszyłoby to rozdzielczość analizy. Nasza technika csBN-MS składa się z kilku praktycznych kroków, które są kluczowe dla uzyskania dobrych wyników.Łatwiej jest pokazać, jak wykonać te kroki w szczegółach, niż tylko je opisać. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj mieszającego dwukomorowego mieszalnika gradientowego napędzanego pompą, aby odlać liniowy lub hiperboliczny żel o gradiencie porów. Przygotować roztwory dla przedniej komory mieszania i komory zbiornika, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Uruchom mieszadło i dodaj 30 mikrolitrów APS i 2,5 mikrolitrów TEMED do roztworu w komorze przedniej. Następnie uruchom pompę i otwórz przedni zawór. Po około jednej minucie dodaj 90 mikrolitrów APS i pięć mikrolitrów TEMED do komory zbiornika i otwórz przyłącze komory.Pozwól żelowi powoli i dokładnie polimeryzować przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej, aby wytworzyć jednorodny gradient wielkości porów. Jeśli jest wilgotny, spolimeryzowany żel można przechowywać w pozycji pionowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Następnie przygotuj szczeliny ładunkowe, umieszczając odpowiednie przestrzenie między szklanymi płytkami do oddzielenia od 0,5 do 2,0 miligramów białka.Szczeliny powinny mieć co najmniej trzy centymetry szerokości. Do uruchamiania należy przygotować stały bufor katodowy składający się z 50 milimolowych trycyny, 50 milimolowych Bis-Tris i 0,01% Coomassie G-250. Przygotować standardowy bufor anodowy składający się z 50 milimolowych Bis-Tris.Rozpuścić około 2,5 miligrama membrany i dwa mililitry buforu do rozpuszczania zawierającego 1% niedenaturującego detergentu na lodzie przez 30 minut. Następnie ultrawirować przy 130 000 razy G przez 11 minut. Skoncentrować rozpuszczony sacharoza na krótkim 50%20% gradiencie krokowym przez ultrawirowanie w 400 000 razy G przez jedną godzinę.Następnie zbierz gradient sacharozy z dna probówki, dodaj 0,05% Coomassie G-250 do solubilizatu i załaduj próbkę na żel. Uruchom preparatywny BN-PAGE w temperaturze 10 stopni Celsjusza przez noc, korzystając z trzystopniowego protokołu napięcia, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Po wypuszczeniu żelu zeskanuj żele w celach dokumentacyjnych, trzymając je między szklanymi płytkami.Sprawdź jakość separacji żelu. Następnie zdemontuj tablice i wytnij interesujące Cię odcinki pasa. Napraw pasy dwukrotnie za pomocą 30% etanolu i 15% kwasu octowego przez co najmniej 30 minut.Przenieść próbkę podłoża do zatapiania i pozostawić do namoczenia i zrównoważenia przez co najmniej dwie godziny, utrzymując płytę żelową w zwolnionym tempie na wytrząsarce orbitalnej. Następnie pokrój ustalone pasy żelu na sekcje dokładnie równoległe do frontu migracji białka lub wzoru pasma. Umieść każdą sekcję na plastikowym wsporniku foliowym o równych wymiarach, aby ułatwić obsługę.Przenieś pasy do otwartej rurki z korkami, które są zamknięte od dołu i centralnie perforowane od góry, oba dokładnie wyrównane z górnym i dolnym końcem sekcji żelowej. Zanurz na krótko cylinder w ciekłym azocie, aby szybko zainicjować krzepnięcie. Przezroczyste podłoże do zatapiania zestala się w ciągu kilku sekund i staje się białe.Wypełnij wnękę medium do zatapiania, na krótko zanurz cylinder w ciekłym azocie, a następnie pozwól mu dokładnie zamarznąć w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez kilka godzin. Po zdemontowaniu usuń folię z tworzywa sztucznego i przenieś blok z osadzoną sekcją żelową do schłodzonego metalowego cylindra. Cylinder ma większą średnicę i jest uszczelniony na zewnątrz medium zatapiającym.Umieszczony jest na płaskim wsporniku. Napełnij cylinder medium do zatapiania i dokładnie zamroź, jak wspomniano wcześniej. Powtórz tę procedurę z drugą stroną cylindra, aby uzyskać solidny blok ze współpłaszczyznową powierzchnią dolną.Następnie wyjmij blok z cylindra i użyj medium do zatapiania, aby przykleić go do wstępnie schłodzonego metalowego uchwytu. Włóż metalowy uchwyt do krioplastyki. Uchwyt musi być starannie ustawiony w stosunku do płaszczyzny krojenia.Pozwól, aby blok osiągnął optymalną temperaturę dla procesu krojenia. Po tym zbiorze żel kroi się jeden po drugim o końcowej pożądanej grubości 0,25 milimetra w kroku i przenosi je pojedynczo do probówek reakcyjnych o niskich właściwościach wiązania białek. Następnie plastry poddawane są trawieniu tryptycznemu i analizie spektrometrii mas.Protokół ten rozszerza zastosowanie profilowania kompleksomu o wysokiej rozdzielczości na błony niemitochondrialne wykazujące ekspresję białek o niskiej liczebności. Złożona separacja pokazuje silnie wybarwione prążki białkowe z bardzo małą ilością artefaktów migracji. Odchylenia sygnałów peptydowych w masie i czasie retencji wskazują na bardzo niski wskaźnik fałszywie dodatniego przypisania objętości piku.Różnice między uruchomieniami można łatwo wyeliminować przez ponowne skalowanie zestawów danych woluminu szczytowego. Uzyskane w ten sposób informacje o intensywności peptydów są następnie wykorzystywane do rekonstrukcji 2545 profili białkowych o względnej obfitości. Znaczenie wielkości kroku próbkowania żelu dla rozdzielczości kompleksów białkowych oceniono poprzez połączenie zestawów danych sąsiednich warstw.Separacja wielkości złożonych populacji związanych z TPC1 na poziomie 0,25 milimetra jest dobrze zgodna z wynikami analizy western blot. Łączenie więcej niż dwóch wycinków znosi dyskryminację subpopulacji złożonych TPC1. Wreszcie, analiza dostarcza informacji na temat dobrze scharakteryzowanych kompleksów i wykazuje istnienie nowych podjednostek i złożonych zespołów.W przypadku ferrytyny profile podjednostek dostosowane do ich względnej liczebności sugerują istnienie co najmniej trzech złożonych izoform z wyraźnymi stechiometriami łańcuchów ciężkich/lekkich. W przeciwieństwie do tego, kompleksy nikalina-nomo1, kompleks rdzeniowy gamma-sekretazy i maszyneria GPI-transamidaza wykazują stałe stosunki obfitości swoich podjednostek rdzeniowych w całym zakresie wielkości i niezależnie od asocjacji z dodatkowymi białkami. Kluczowym parametrem analizy csBN-MS jest efektywna rozdzielczość kompleksów, o której decyduje biochemia próbki, jakość żelu BN, prawidłowe wyrównanie podczas zatapiania i krojenia oraz jakość pozyskanych danych MS.Połączenie csBN-MS z znakowaniem izotopowym białek i próbek pozwoli na bezpośrednie porównanie kompleksomów w różnych stanach patofizjologicznych, biologicznych lub rozwojowych. Badanie csBN-MS przeprowadzone na błonach z mózgu gryzoni ujawniło ogromną różnorodność receptorów, kanałów jonowych i transporterów w odniesieniu do ich składu podjednostek i funkcji, a także będzie miało zasadnicze znaczenie dla analizy struktury 3D w preparatach natywnych.

high-resolution-complexome-profiling-by-cryoslicing-bn-ms-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Spektrometria mas okazała się cennym narzędziem do analizy dużych kompleksów białkowych. Metoda ta umożliwia uzyskanie wglądu w skład, stechiometrię i ogólną architekturę wielopodjednostkowych kompleksów. W niniejszej pracy opisujemy krok po kroku, jak przeprowadzić strukturalną analizę spektrometryczną oraz scharakteryzować struktury makromolekularne.

Analiza dużych kompleksów białkowych za pomocą strukturalnej spektrometrii mas

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Przedstawiono protokół profilowania metabolicznego próbek biologicznych za pomocą elektroforezy kapilarnej - spektrometrii mas z wykorzystaniem projektu interfejsu porowatej końcówki bez osłony.

Elektroforeza kapilarna bez osłonki – spektrometria mas do profilowania metabolicznego próbek biologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Szczegółowy protokół jest opisany do separacji, identyfikacji i charakterystyki proteoform w próbkach białek za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej-elektrorozpylania jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (CZE-ESI-MS/MS). Protokół może być wykorzystany do charakterystyki proteoform w prostych próbkach białkowych w wysokiej rozdzielczości oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomów.

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących przygotowania próbki podczas planowania eksperymentów z użyciem MALDI MSI, aby zmaksymalizować wykrywanie metaboliczne i molekularne w próbkach biologicznych.

Przygotowanie próbki do profilowania metabolicznego przy użyciu obrazowania spektrometrii mas MALDI

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Poznaj metodę csBN-MS do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości przy użyciu krioslicingu. Technika ta umożliwia szczegółową analizę kompleksów białkowych błonowych w różnych tkankach.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Przeglądaj więcej filmów