Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale

Spektrometria mas ruchliwości jonów (IM-MS) identyfikuje różne jony pochodzące z zależnej od pH reakcji wiązania redoks i metylu peptydów. Dzięki modelowaniu molekularnemu ich trzeciorzędowej struktury można określić korelację metali. IM-MS może rozdzielić każdy z jonów poprodukcyjnych i określić ich skład molekularny, jednocześnie mierząc ich czas od masy do ładunku i czasu przybycia oraz odnosząc się do ich stechiometrii, stanu protonacji i struktury konformacyjnej.

Opracowanie klas peptydów chelatujących metale pomoże w opracowaniu metod leczenia chorób związanych z nierównowagą jonów metali, takich jak choroba Menkesa i Wilsona, nowotwory i choroba Alzheimera. Na początek dokładnie wyczyść rurkę wejściową ESI i kapilę igłową około 500 mikrolitrami 0,1 molowego lodowatego kwasu octowego, 0,1 molowego wodorotlenku amonu i na koniec wodą dejonizowaną. Użyj natywnych warunków ESI-IM-MS zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby zebrać widma IM-MS jonów ujemnych i dodatnich roztworu 10 ppm poli-DL-alaniny przez 10 minut każde.

Odpipetować 200,0 mikrolitrów 0,125 milimolowej alternatywnej metanobaktyny lub roztworu amb do fiolki o pojemności 1,7 mililitra. Rozcieńczyć 500 mikrolitrami wody dejonizowanej i dokładnie wymieszać roztwór. Dostosować pH próbki do 3,0, dodając 50 mikrolitrów 1,0-molowego roztworu kwasu octowego.

Dodać 200,0 mikrolitrów 0,125 milimolowego jonu metalu do próbki o dostosowanym pH. Następnie dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać końcową objętość 1,00 mililitra próbki. Dokładnie wymieszać i pozostawić próbkę do zrównoważenia przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Za pomocą strzykawki z nosem pobrać 500 mikrolitrów próbki i zebrać widma jonów ujemnych i dodatnich ESI-IM-MS przez pięć minut każde. Użyj pozostałych 500 mikrolitrów próbki, aby zarejestrować jej końcowe pH za pomocą skalibrowanej mikroelektrody pH. Powtórz te kroki, z wyjątkiem dostosowania pH do pH cztery, pięć, sześć, siedem, osiem, dziewięć lub 10, dodając nowe objętości roztworów kwasu octowego lub wodorotlenku amonu.

Zebrać widma jonów ujemnych i dodatnich ESI-IM-MS otrzymanych roztworów przez 10 minut każde. Na podstawie widm IM-MS zidentyfikuj, które naładowane gatunki alternatywnej metanobaktyny są obecne, dopasowując je do ich teoretycznych wzorców izotopów od masy do ładunku. Aby to zrobić, otwórz MassLynx i kliknij Chromatogram, aby otworzyć okno Chromatogram.

Przejdź do menu Plik i Otwórz, aby zlokalizować i otworzyć plik danych IM-MS. Wyodrębnij widmo IM-MS, klikając prawym przyciskiem myszy, przeciągając po chromatogramie i zwalniając. Otworzy się okno widma pokazujące widmo IM-MS.

W oknie widma kliknij Narzędzia i model izotopowy. W oknie Modelowanie izotopów wprowadź wzór cząsteczkowy gatunku amb, zaznacz pole Pokaż naładowany jon i wprowadź stan naładowania. Kliknij przycisk OK. Powtórz ten proces, aby zidentyfikować wszystkie gatunki w widmie IM-MS i zarejestrować ich zakres izotopów od masy do ładunku.

Dla każdego gatunku amb oddziel wszystkie przypadkowe gatunki od masy do ładunku i wyodrębnij ich rozkłady czasu przybycia lub ATD, wykorzystując ich wzorce izotopów masy do ładunku w celu ich identyfikacji. Otwórz DriftScope i kliknij Plik i Otwórz, aby zlokalizować i otworzyć plik danych IM-MS. Użyj myszki i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby powiększyć wzór izotopów od masy do ładunku gatunków amb.

Użyj narzędzia Zaznaczanie i lewego przycisku myszy, aby wybrać wzór izotopowy. Kliknij przycisk Zaakceptuj bieżący wybór. Aby oddzielić przypadkowe gatunki od masy do ładunku, użyj narzędzia do zaznaczania i lewego przycisku myszy, aby wybrać czas ATD wyrównany z wzorcem izotopowym gatunku amb.

Kliknij przycisk Zaakceptuj bieżący wybór. Aby wyeksportować ATD, przejdź do Plik, Eksportuj do MassLynx. Następnie wybierz opcję Zachowaj czas dryfu i zapisz plik w odpowiednim folderze.

W oknie Chromatogram programu MassLynx otwórz zapisany wyeksportowany plik. Kliknij Proces, Integracja z menu, zaznacz pole ApexTrack Peak Integration i kliknij OK. Zapisać środek ciężkości i zintegrowany obszar ATD. Po powtórzeniu tego procesu dla wszystkich zapisanych plików danych amb i poli-DL-alaniny IM-MS, należy użyć zintegrowanego ATD dla wszystkich wyekstrahowanych gatunków amb jonów dodatnich lub ujemnych w każdym punkcie miareczkowania, aby znormalizować do względnej skali procentowej.

Aby to zrobić, wprowadź do arkusza kalkulacyjnego tożsamość gatunków amb i ich zintegrowane ATD przy każdym pH. Dla każdego pH należy użyć sumy zintegrowanych ATD, aby znormalizować ATD poszczególnych gatunków amb do skali procentowej. Wykreśl procentową intensywność każdego gatunku amb w funkcji pH, aby pokazać, jak zmienia się populacja każdego gatunku w funkcji pH.

Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, przelicz przekroje czynne zderzeń jonów ujemnych i dodatnich poli-DL-alaniny zmierzonych w gazie buforowym helu na skorygowane przekroje czynne zderzenia. Następnie przelicz średnie czasy przybycia kalibrantów poli-DL-alaniny i gatunków amb na czasy dryftu. Zatkaj czasy dryftu kalibrów poli-DL-alaniny w stosunku do ich skorygowanych przekrojów kolizyjnych.

Następnie, korzystając z dopasowania regresji metodą najmniejszych kwadratów, należy określić wartości pierwsze A i B, gdzie liczba pierwsza A jest poprawką parametrów temperatury, ciśnienia i pola elektrycznego, a B kompensuje efekt nieliniowy urządzenia IM. Korzystając z tych wartości A i B z wartością czasów dryftu środka ciężkości, określ ich skorygowane przekroje kolizyjne i ich przekroje kolizyjne. Metoda ta zapewnia przekroje czynne zderzeń dla gatunków peptydów z szacowanymi błędami bezwzględnymi wynoszącymi około 2%Korzystając z Gaussa z GaussView i poziomem teorii B3LYP LanL2DZ, zlokalizuj zoptymalizowane pod kątem geometrii konformery dla wszystkich możliwych typów koordynacji obserwowanych gatunków amb od masy do ładunku.

Poziom teorii B3LYP LanL2DZ składa się z trzech obwodowych funkcjonałów hybrydowych Beckego, zbioru bazowego Dunninga i potencjałów rdzenia elektronowego. Wyodrębnij analizy termochemiczne każdego ze zoptymalizowanych konformerów z pliku wyjściowego Gaussa i oblicz ich teoretyczne przekroje czynne zderzeń przy użyciu metody Lennarda-Jonesa w skali jonowej z programu Sigma. Na podstawie konformerów o najniższej energii swobodnej określ, który konformer wykazuje przekrój czynny zderzenia Lennarda-Jonesa, który zgadza się z przekrojem zderzenia zmierzonym przez IM-MS.

Proces ten identyfikuje trzeciorzędową strukturę i rodzaj koordynacji dla konformerów obserwowanych w eksperymencie. Modelowanie molekularne wymaga porównania energii swobodnej i przekrojów czynnych zderzeń konformerów z różnymi miejscami chelatacji metali, wiązaniami cis i transpeptydowymi, mostkami solnymi, wiązaniami wodorowymi i oddziaływaniami kationowymi. Badanie IM-MS alternatywnej metanobaktyny wykazało, że chelatuje ona zarówno jony miedzi, jak i w sposób zależny od pH, ale poprzez różne mechanizmy reakcji i miejsca koordynacji.

Wiązanie(II) obserwowano przy pH większym niż sześć, tworząc przede wszystkim pojedynczy ujemnie naładowany kompleks, co wskazuje, że(II) był czterościennie koordynowany przez dwa imidazole i dwa tiolany. Wiązaniu miedzi(II) towarzyszyły tiole tworzące mostek dwusiarczkowy. Przy pH większym niż sześć powstał pojedynczy ujemnie naładowany kompleks miedzi(II), co wskazuje, że imidazol i dwa zdeprotonowane azoty amidowe koordynowały miedź(II)Jednak poniżej pH sześciu, dodanie miedzi(II) również utworzyło pojedynczy dodatnio naładowany kompleks miedzi(I), a także pojedynczy dodatnio naładowany kompleks miedzi(II)powyżej pH sześciu.

Badania IM-MS amb 2 i AMB 4 pokazują również, że w reakcjach miedzi uzyskano produkty różniące się liczbą między- lub wewnątrzcząsteczkowych mostków dwusiarczkowych, liczbą jonów miedzi(I) lub miedzi(II) oraz liczbą miejsc deprotonacji, które zmieniały się w funkcji pH. Wynik IM-MS z modelowaniem molekularnym wykazał, że alternatywne metanobaktyny mogą koordynować do trzech jonów miedzi za pośrednictwem grup tiolanowych, imidazolowych i karboksylowych. Ustawienia instrumentalne IM-MS muszą być starannie dobrane, aby zachować stechiometrię, rozkłady ładunków i struktury konformacyjne peptydów, jak opisano w tekście.

Połączenie szerszego zakresu rozmiarów, które będą miały wpływ na koordynację metali, takich jak tyrozyna w kwasie asparaginowym, pozwoli lepiej zrozumieć związek między strukturą a funkcją. IM-MS z modelowaniem molekularnym stały się alternatywnymi technikami przyspieszającymi krystalografię i spektroskopię NMR do określania struktur konformacyjnych białek, DNA, lipidów i ich kompleksów.