Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale
September 7th, 2019
Mobilność jonów-spektrometria mas i techniki modelowania molekularnego mogą scharakteryzować selektywną wydajność chelatacji metali zaprojektowanych peptydów wiążących metale oraz peptydu wiążącego miedź metanobaktyny. Opracowanie nowych klas peptydów chelatujących metale pomoże w opracowaniu metod leczenia chorób związanych z nierównowagą jonów metali.
Spektrometria mas ruchliwości jonów (IM-MS) identyfikuje różne jony pochodzące z zależnej od pH reakcji wiązania redoks i metylu peptydów. Dzięki modelowaniu molekularnemu ich trzeciorzędowej struktury można określić korelację metali. IM-MS może rozdzielić każdy z jonów poprodukcyjnych i określić ich skład molekularny, jednocześnie mierząc ich czas od masy do ładunku i czasu przybycia oraz odnosząc się do ich stechiometrii, stanu protonacji i struktury konformacyjnej.
Opracowanie klas peptydów chelatujących metale pomoże w opracowaniu metod leczenia chorób związanych z nierównowagą jonów metali, takich jak choroba Menkesa i Wilsona, nowotwory i choroba Alzheimera. Na początek dokładnie wyczyść rurkę wejściową ESI i kapilę igłową około 500 mikrolitrami 0,1 molowego lodowatego kwasu octowego, 0,1 molowego wodorotlenku amonu i na koniec wodą dejonizowaną. Użyj natywnych warunków ESI-IM-MS zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby zebrać widma IM-MS jonów ujemnych i dodatnich roztworu 10 ppm poli-DL-alaniny przez 10 minut każde.
Odpipetować 200,0 mikrolitrów 0,125 milimolowej alternatywnej metanobaktyny lub roztworu amb do fiolki o pojemności 1,7 mililitra. Rozcieńczyć 500 mikrolitrami wody dejonizowanej i dokładnie wymieszać roztwór. Dostosować pH próbki do 3,0, dodając 50 mikrolitrów 1,0-molowego roztworu kwasu octowego.
Dodać 200,0 mikrolitrów 0,125 milimolowego jonu metalu do próbki o dostosowanym pH. Następnie dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać końcową objętość 1,00 mililitra próbki. Dokładnie wymieszać i pozostawić próbkę do zrównoważenia przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Za pomocą strzykawki z nosem pobrać 500 mikrolitrów próbki i zebrać widma jonów ujemnych i dodatnich ESI-IM-MS przez pięć minut każde. Użyj pozostałych 500 mikrolitrów próbki, aby zarejestrować jej końcowe pH za pomocą skalibrowanej mikroelektrody pH. Powtórz te kroki, z wyjątkiem dostosowania pH do pH cztery, pięć, sześć, siedem, osiem, dziewięć lub 10, dodając nowe objętości roztworów kwasu octowego lub wodorotlenku amonu.
Zebrać widma jonów ujemnych i dodatnich ESI-IM-MS otrzymanych roztworów przez 10 minut każde. Na podstawie widm IM-MS zidentyfikuj, które naładowane gatunki alternatywnej metanobaktyny są obecne, dopasowując je do ich teoretycznych wzorców izotopów od masy do ładunku. Aby to zrobić, otwórz MassLynx i kliknij Chromatogram, aby otworzyć okno Chromatogram.
Przejdź do menu Plik i Otwórz, aby zlokalizować i otworzyć plik danych IM-MS. Wyodrębnij widmo IM-MS, klikając prawym przyciskiem myszy, przeciągając po chromatogramie i zwalniając. Otworzy się okno widma pokazujące widmo IM-MS.
W oknie widma kliknij Narzędzia i model izotopowy. W oknie Modelowanie izotopów wprowadź wzór cząsteczkowy gatunku amb, zaznacz pole Pokaż naładowany jon i wprowadź stan naładowania. Kliknij przycisk OK. Powtórz ten proces, aby zidentyfikować wszystkie gatunki w widmie IM-MS i zarejestrować ich zakres izotopów od masy do ładunku.
Dla każdego gatunku amb oddziel wszystkie przypadkowe gatunki od masy do ładunku i wyodrębnij ich rozkłady czasu przybycia lub ATD, wykorzystując ich wzorce izotopów masy do ładunku w celu ich identyfikacji. Otwórz DriftScope i kliknij Plik i Otwórz, aby zlokalizować i otworzyć plik danych IM-MS. Użyj myszki i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby powiększyć wzór izotopów od masy do ładunku gatunków amb.
Użyj narzędzia Zaznaczanie i lewego przycisku myszy, aby wybrać wzór izotopowy. Kliknij przycisk Zaakceptuj bieżący wybór. Aby oddzielić przypadkowe gatunki od masy do ładunku, użyj narzędzia do zaznaczania i lewego przycisku myszy, aby wybrać czas ATD wyrównany z wzorcem izotopowym gatunku amb.
Kliknij przycisk Zaakceptuj bieżący wybór. Aby wyeksportować ATD, przejdź do Plik, Eksportuj do MassLynx. Następnie wybierz opcję Zachowaj czas dryfu i zapisz plik w odpowiednim folderze.
W oknie Chromatogram programu MassLynx otwórz zapisany wyeksportowany plik. Kliknij Proces, Integracja z menu, zaznacz pole ApexTrack Peak Integration i kliknij OK. Zapisać środek ciężkości i zintegrowany obszar ATD. Po powtórzeniu tego procesu dla wszystkich zapisanych plików danych amb i poli-DL-alaniny IM-MS, należy użyć zintegrowanego ATD dla wszystkich wyekstrahowanych gatunków amb jonów dodatnich lub ujemnych w każdym punkcie miareczkowania, aby znormalizować do względnej skali procentowej.
Aby to zrobić, wprowadź do arkusza kalkulacyjnego tożsamość gatunków amb i ich zintegrowane ATD przy każdym pH. Dla każdego pH należy użyć sumy zintegrowanych ATD, aby znormalizować ATD poszczególnych gatunków amb do skali procentowej. Wykreśl procentową intensywność każdego gatunku amb w funkcji pH, aby pokazać, jak zmienia się populacja każdego gatunku w funkcji pH.
Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, przelicz przekroje czynne zderzeń jonów ujemnych i dodatnich poli-DL-alaniny zmierzonych w gazie buforowym helu na skorygowane przekroje czynne zderzenia. Następnie przelicz średnie czasy przybycia kalibrantów poli-DL-alaniny i gatunków amb na czasy dryftu. Zatkaj czasy dryftu kalibrów poli-DL-alaniny w stosunku do ich skorygowanych przekrojów kolizyjnych.
Następnie, korzystając z dopasowania regresji metodą najmniejszych kwadratów, należy określić wartości pierwsze A i B, gdzie liczba pierwsza A jest poprawką parametrów temperatury, ciśnienia i pola elektrycznego, a B kompensuje efekt nieliniowy urządzenia IM. Korzystając z tych wartości A i B z wartością czasów dryftu środka ciężkości, określ ich skorygowane przekroje kolizyjne i ich przekroje kolizyjne. Metoda ta zapewnia przekroje czynne zderzeń dla gatunków peptydów z szacowanymi błędami bezwzględnymi wynoszącymi około 2%Korzystając z Gaussa z GaussView i poziomem teorii B3LYP LanL2DZ, zlokalizuj zoptymalizowane pod kątem geometrii konformery dla wszystkich możliwych typów koordynacji obserwowanych gatunków amb od masy do ładunku.
Poziom teorii B3LYP LanL2DZ składa się z trzech obwodowych funkcjonałów hybrydowych Beckego, zbioru bazowego Dunninga i potencjałów rdzenia elektronowego. Wyodrębnij analizy termochemiczne każdego ze zoptymalizowanych konformerów z pliku wyjściowego Gaussa i oblicz ich teoretyczne przekroje czynne zderzeń przy użyciu metody Lennarda-Jonesa w skali jonowej z programu Sigma. Na podstawie konformerów o najniższej energii swobodnej określ, który konformer wykazuje przekrój czynny zderzenia Lennarda-Jonesa, który zgadza się z przekrojem zderzenia zmierzonym przez IM-MS.
Proces ten identyfikuje trzeciorzędową strukturę i rodzaj koordynacji dla konformerów obserwowanych w eksperymencie. Modelowanie molekularne wymaga porównania energii swobodnej i przekrojów czynnych zderzeń konformerów z różnymi miejscami chelatacji metali, wiązaniami cis i transpeptydowymi, mostkami solnymi, wiązaniami wodorowymi i oddziaływaniami kationowymi. Badanie IM-MS alternatywnej metanobaktyny wykazało, że chelatuje ona zarówno jony miedzi, jak i w sposób zależny od pH, ale poprzez różne mechanizmy reakcji i miejsca koordynacji.
Wiązanie(II) obserwowano przy pH większym niż sześć, tworząc przede wszystkim pojedynczy ujemnie naładowany kompleks, co wskazuje, że(II) był czterościennie koordynowany przez dwa imidazole i dwa tiolany. Wiązaniu miedzi(II) towarzyszyły tiole tworzące mostek dwusiarczkowy. Przy pH większym niż sześć powstał pojedynczy ujemnie naładowany kompleks miedzi(II), co wskazuje, że imidazol i dwa zdeprotonowane azoty amidowe koordynowały miedź(II)Jednak poniżej pH sześciu, dodanie miedzi(II) również utworzyło pojedynczy dodatnio naładowany kompleks miedzi(I), a także pojedynczy dodatnio naładowany kompleks miedzi(II)powyżej pH sześciu.
Badania IM-MS amb 2 i AMB 4 pokazują również, że w reakcjach miedzi uzyskano produkty różniące się liczbą między- lub wewnątrzcząsteczkowych mostków dwusiarczkowych, liczbą jonów miedzi(I) lub miedzi(II) oraz liczbą miejsc deprotonacji, które zmieniały się w funkcji pH. Wynik IM-MS z modelowaniem molekularnym wykazał, że alternatywne metanobaktyny mogą koordynować do trzech jonów miedzi za pośrednictwem grup tiolanowych, imidazolowych i karboksylowych. Ustawienia instrumentalne IM-MS muszą być starannie dobrane, aby zachować stechiometrię, rozkłady ładunków i struktury konformacyjne peptydów, jak opisano w tekście.
Połączenie szerszego zakresu rozmiarów, które będą miały wpływ na koordynację metali, takich jak tyrozyna w kwasie asparaginowym, pozwoli lepiej zrozumieć związek między strukturą a funkcją. IM-MS z modelowaniem molekularnym stały się alternatywnymi technikami przyspieszającymi krystalografię i spektroskopię NMR do określania struktur konformacyjnych białek, DNA, lipidów i ich kompleksów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie wykorzystuje spektrometrię ruchliwości jonowej (IM-MS) i modelowanie molekularne do analizy zdolności chelatacji metali przez zaprojektowane peptydy, w tym metanobaktyna. Wyniki mają na celu wspieranie rozwoju terapii chorób związanych z dysfunkcją jonów metali.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Spektrometria mas
Tło
- Dysfunkcja jonów metali jest związana z różnymi chorobami.
- Peptydy mogą być zaprojektowane tak, aby selektywnie wiązały jony metali.
- IM-MS może charakteryzować skład molekularny tych peptydów.
- Rozumienie wiązania metali może prowadzić do terapeutycznych osiągnięć.
Cel badania
- Charakteryzowanie działania peptydów wiązających metale.
- Zbadanie potencjału tych peptydów w leczeniu chorób związanych z jonami metali.
- Wykorzystanie IM-MS do szczegółowej analizy interakcji peptydów.
Zastosowanie metod
- Spektrometria ruchliwości jonowej (IM-MS) do identyfikacji jonów produktów.
- Modelowanie molekularne do określania struktur peptydów.
- Analiza reakcji redoks i wiązania metylu zależnych od pH.
- Zbieranie spektrów IM-MS w warunkach naturalnych.
Główne wyniki
- IM-MS skutecznie rozdziela jony produktów i identyfikuje ich skład.
- Struktury peptydów korelują z ich zdolnościami wiązania metali.
- Wyniki wspierają rozwój nowych peptydów chelatujących metale.
- Potencjalne zastosowania terapeutyczne w chorobach takich jak Alzheimer i nowotwory.
Wnioski
- Peptydy chelatujące metale wykazują obiecujące zastosowania terapeutyczne.
- IM-MS jest cennym narzędziem do charakteryzacji peptydów.
- Potrzebne są dalsze badania, aby zbadać zastosowania kliniczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) combined with molecular modeling enables biopharma R&D to characterize metal-binding peptide interactions with high structural resolution, supporting target validation for metalloprotein-related diseases. This approach provides quantitative collision cross section (CCS) and mass-to-charge (m/z) data that inform binding stoichiometry, protonation states, and conformational changes, facilitating mechanistic de-risking in early discovery. By linking pH-dependent metal coordination to functional output, IM-MS aids in prioritizing peptide candidates with selective chelating properties for therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Resolves metal-bound peptide species by m/z and CCS to identify stoichiometry and protonation states under varying pH conditions.
- Scientific Value: Distinguishes coordination sites (e.g., imidazole, thiolate, amide) through correlation of IM-MS data with B3LYP/LanL2DZ-modeled conformers.
- Scientific Value: Identifies pH-dependent switching between Cu(I) and Cu(II) complexes, revealing redox-active binding mechanisms relevant to oxidative stress pathways.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Enables normalization of ion arrival time distributions (ATDs) across pH titrations to quantify relative populations of peptide-metal complexes.
- Operational Value: Uses poly-DL-alanine calibrants to correct CCS measurements, ensuring reproducible and comparable data across experimental runs.
- Operational Value: Supports high-confidence peak integration via ApexTrack in MassLynx, improving assay precision for low-abundance species.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links peptide structural motifs (e.g., imidazole, thiolate, carboxylate) to metal-binding capacity, informing structure-function relationships for lead optimization.
- Translational Value: Demonstrates capacity to coordinate up to three Cu(I) ions via thiolate, imidazole, and carboxylate groups, suggesting multivalent buffering potential relevant to neurodegenerative metal homeostasis.
- Translational Value: Differentiates Zn(II) and Cu(II) binding mechanisms (tetrahedral vs. disulfide-bridged), enabling selective targeting in diseases like Wilson’s and Alzheimer’s.
Pipeline & Workflow Integration
IM-MS with molecular modeling fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling data-driven progression to lead identification by providing mechanistic insights into metal-peptide interactions.
- Discovery Biology: Tests how pH influences metal binding affinity and coordination geometry, clarifying structure-activity relationships in metallopeptide design.
- Screening: Delivers quantitative CCS and m/z outputs that allow comparison of metal-binding affinity and specificity across peptide variants.
- Analytics: Provides drift time and ATD measurements that, when calibrated, yield accurate CCS values for comparing experimental and theoretical conformers.
- Translational Research: Connects observed coordination environments (e.g., Zn(II) tetrahedral, Cu(I) thiolate-rich) to disease-relevant metal dysregulation pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for metal-peptide characterization that can be applied across multiple target classes and peptide libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating experimental IM-MS data with theoretical collision cross sections from low-energy conformers.
- Operational Value: Ensures reproducibility through native ESI conditions, pH-controlled sample preparation, and instrument calibration using poly-DL-alanine standards.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying peptides with selective, pH-responsive metal binding, reducing off-target effects in metallotherapeutic design.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated metal coordination sites and redox behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native ESI-IM-MS operation, ion mobility calibration, and spectral interpretation using MassLynx and DriftScope.
- Dependence on high-resolution IM-MS instrumentation capable of resolving ATDs for overlapping m/z species.
- Needs access to molecular modeling software (Gaussian/GaussView) and collision cross section prediction tools (Sigma, ion-scaled Lennard-Jones).
- Must maintain strict pH control during sample preparation to accurately probe metal-binding dependencies.
- Limited to gas-phase stable complexes; may not capture solution-phase dynamics or transient intermediates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
Electrospray-ion Mobility-Mass Spectrometry Analysis
3:02
Analysis of ESI-IM-MS pH Titration Data
6:11
Collision Cross-Sections and Computational Methods
8:30
Results: Reaction Mechanisms and Coordination Sites of the Alternative Methanobactin Complexes
10:00
Conclusion
