Name: Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Poznaj spektrometrię ruchliwości jonów i mas (IM-MS) oraz modelowanie molekularne do analizy oligopeptydów wiążących metale. Ta metoda umożliwia określenie struktury i mechanizmów koordynacji jonów miedzi oraz cynku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten materiał jest oparty na pracach wspieranych przez National Science Foundation w ramach 1764436, wsparciu instrumentów NSF (MRI-0821247), Fundacji Welch (T-0014) oraz zasobach obliczeniowych z Departamentu Energii (TX-W-20090427-0004-50) i L3 Communications. Dziękujemy grupie Bowera z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Barbara za udostępnienie programu Sigma i Ayobami Ilesanmi za zademonstrowanie techniki w filmie.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Hodować Methylosinus trichosporium OB3b, wyizolować mb-OB3b wolny od Cu(I)18,2,23, liofilizować próbkę i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Zsyntetyzować peptydy amb (czystość &gt;98% dla amb1, amb2, amb4; czystość &gt;70% dla amb7), liofilizować próbki i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Zakupić odczynniki o czystości &gt;98%: chlorek manganu(II), chlorek kobaltu(II), chlorek niklu(II), chlorek miedzi(II), azotan miedzi(II), azotan srebra(I), chlorek cynku(II), chlorek żelaza(III) oraz chlorek ołowiu(II).</li>
	<li>Zakupić polimery poli-DL-alaniny stosowane jako kalibratory do pomiaru przekrojów czynnych zderzeń gatunków amb oraz wodorotlenek amonu, lodowaty kwas octowy i acetonitryl o czystości HPLC lub wyższej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu zapasowego
<ol>
	<li>Roztwór zapasowy peptydów
	<ol>
		<li>Odważ dokładnie, z dokładnością do co najmniej trzech cyfr znaczących, masę 10,0–20,0 mg mb-OB3b lub amb do plastikowej probówki o pojemności 1,7 mL. 
		UWAGA: Odważona masa powinna pozwolić na otrzymanie roztworu o stężeniu 12,5 mM lub 1,25 mM, w zależności od rozpuszczalności peptydów, po dodaniu 1,0 mL wody dejonizowanej (DI).</li>
		<li>Za pomocą pipety dodaj 1,0 mL wody dejonizowanej (&gt;17,8 MΩ cm) do odważonej próbki peptydów, aby otrzymać roztwór o stężeniu 12,5 mM lub 1,25 mM. Szczelnie zakręć probówkę i wymieszaj dokładnie, wykonując co najmniej 20 odwrócenia.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety odmierz alikwoty po 50,0 μL z próbki peptydów do oddzielnie oznakowanych probówek o pojemności 1,5 mL i przechowuj je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory zapasowe jonów metali
	<ol>
		<li>Odważ dokładnie, z dokładnością do co najmniej trzech cyfr znaczących, masę 10,0–30,0 mg chlorku metalu lub azotanu srebra do probówki o pojemności 1,7 mL. 
		UWAGA: Odważona masa powinna pozwolić na otrzymanie stężenia 125 mM po dodaniu 1,0 mL wody DI.</li>
		<li>Dodaj 1,0 mL wody DI do odważonej próbki metalu w probówce 1,7 mL, aby otrzymać roztwór o stężeniu 125 mM. Szczelnie zakręć probówkę i wymieszaj dokładnie, wykonując co najmniej 20 odwrócenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory zapasowe wodorotlenku amonu: przygotuj 1,0 M roztwór kwasu octowego, rozcieńczając 57 μL 9,5% roztworu kwasu octowego wodą DI do końcowej objętości 1,0 mL. Przygotuj 1,0 M roztwór wodorotlenku amonu, rozcieńczając 90 μL 21% roztworu wodorotlenku amonu wodą DI do końcowej objętości 1,0 mL. Wykonaj dwa kolejne rozcieńczenia każdego roztworu, pobierając 100 μL roztworów 1,0 M w celu przygotowania roztworów kwasu octowego i wodorotlenku amonu o stężeniach 0,10 M i 0,010 M.</li>
	<li>Roztwór zapasowy poli-DL-alaniny: przygotuj poli-DL-alaninę (PA), odważając 1,0 mg PA i rozpuszczając w 1,0 mL wody DI, aby uzyskać stężenie 1 0 ppm. Wymieszaj dokładnie. Za pomocą mikropipety odmierz alikwoty po 50,0 μL, umieść każdą z nich w probówce 1,7 mL i przechowuj w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Analiza metodą spektrometrii mas z elektromizacją i mobilnością jonową
<ol>
	<li>Dokładnie oczyść przewód wlotowy ESI oraz kapilarę igłową, używając kolejno około 500 μL 0,1 M kwasu octowego lodowatego, 0,1 M wodorotlenku amonu, a na koniec wody DI.</li>
	<li>Rozmroź 50,0 μL alykwot roztworu zapasu PA o stężeniu 1 0 ppm i rozcieńcz go 450 μL wody DI, aby uzyskać PA o stężeniu 10 ppm. Pobierz pipetą 10,0 μL tego roztworu i rozcieńcz go do objętości 1,0 mL, dodając 50 μL wody DI i 50 μL acetonitrylu, aby otrzymać roztwór PA o stężeniu 10 ppm.</li>
	<li>Zarejestruj widma IM-MS dla jonów ujemnych i dodatnich roztworu PA 10 ppm przez 10 min każdy, stosując natywne warunki ESI-IM-MS opisane w sekcji dyskusji.</li>
	<li>Rozmroź 50,0 μL alykwot roztworu zapasu amb o stężeniu 12,5 mM lub 1,25 mM i wykonaj następujące rozcieńczenia wodą DI, aby uzyskać końcowe stężenie amb 0,125 mM. Każde rozcieńczenie dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Pobierz pipetą 10,0 μL roztworu zapasu jonów metali 125 mM, przelej do fiolki o pojemności 1,7 mL i rozcieńcz wodą DI do 1,00 mL, aby uzyskać stężenie jonów metali 12,5 mM. Powtórz czynność dla dwóch kolejnych rozcieńczeń, aby uzyskać końcowe stężenie jonów metali 0,125 mM. Każde rozcieńczenie dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Pobierz pipetą 20,0 μL amb o stężeniu 0,125 mM do fiolki 1,7 mL, rozcieńcz 50 μL wody DI i dokładnie wymieszaj roztwór.</li>
	<li>Dostosuj pH próbki do wartości 3,0, dodając 50 μL 1,0 M roztworu kwasu octowego.</li>
	<li>Dodaj 20,0 μL jonów metali o stężeniu 0,125 mM do próbki o dostosowanym pH. Dolej wodę DI do uzyskania końcowej objętości 1,0 mL próbki, dokładnie wymieszaj i pozostaw próbkę do wyrównania potencjałów przez 10 min w RT.</li>
	<li>Używając strzykawki z tępym końcem, pobierz 50 μL próbki i zarejestruj widma ES-IM-MS dla jonów ujemnych i dodatnich przez 5 min każde. Pozostałe 50 μL próbki wykorzystaj do pomiaru końcowego pH za pomocą skalibrowanej mikroelektrody pH.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.6–3.9, modyfikując krok 3.7 w celu dostosowania pH do wartości 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 lub 10,0 poprzez dodanie odpowiednich objętości roztworów 0,010 M, 0,10 M lub 1,0 M kwasu octowego bądź wodorotlenku amonu.</li>
	<li>Zarejestruj widma ESI-IM-MS dla jonów ujemnych i dodatnich roztworu PA 10 ppm przez 10 min każde.</li>
</ol>
4. Przygotowanie miareczkowania jonami metali próbek amb
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w krokach 3.1–3.5.</li>
	<li>Pipetuj 200,0 μL roztworu amb o stężeniu 0,125 mM do fiolki o pojemności 1,7 mL, rozcieńcz 50,0 μL wody DI i dokładnie wymieszaj roztwór.</li>
	<li>Dostosuj pH próbki do pH = 9,0, dodając 80 μL 0,010 M roztworu wodorotlenku amonu.</li>
	<li>Dodaj 28 μL 0,125 mM roztworu jonów metalu, aby uzyskać 0,14 równoważnika molowego jonów metalu, dodaj wodę DI do uzyskania końcowej objętości próbki 1,0 mL, wymieszaj dokładnie i pozostaw próbkę do osiągnięcia stanu równowagi przez 10 min w RT.</li>
	<li>Używając strzykawki z tępym końcem, pobierz 50 μL próbki i zarejestruj widma ESI-IM-MS dla jonów ujemnych i dodatnich przez 5 min każde. Pozostałe 50 μL próbki wykorzystaj do pomiaru końcowego pH za pomocą skalibrowanej mikroelektrody pH.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.2–4.5, modyfikując krok 4.3 poprzez dodanie odpowiedniej objętości 0,125 mM roztworu jonów metalu, aby uzyskać odpowiednio 0,28, 0,42, 0,56, 0,70, 0,84, 0,98, 1,12, 1,26 lub 1,40 równoważnika molowego.</li>
	<li>Zarejestruj widma IM-MS dla jonów ujemnych i dodatnich dla roztworu PA o stężeniu 10 ppm przez 10 min każde.</li>
</ol>
5. Analiza danych z miareczkowania pH metodą ESI-IM-MS
<ol>
	<li>Na podstawie widm IM-MS zidentyfikuj, jakie naładowane formy amb są obecne, dopasowując je do teoretycznych rozkładów izotopowych m/z.
	<ol>
		<li>Otwórz program MassLynx i kliknij Chromatogram, aby otworzyć okno chromatogramu.</li>
		<li>Przejdź do menu File, wybierz Open, aby zlokalizować i otworzyć plik danych IM-MS.</li>
		<li>Wyodrębnij widmo IM-MS, klikając prawym przyciskiem myszy i przeciągając kursor po chromatogramie, a następnie zwalniając przycisk. Otworzy się okno widma prezentujące widmo IM-MS.</li>
		<li>W oknie widma kliknij Tools, a następnie Isotope model. W oknie modelowania izotopowego wprowadź wzór cząsteczkowy formy amb, zaznacz pole Show charged ion i wprowadź stan naładowania. Kliknij OK.</li>
		<li>Powtórz czynność, aby zidentyfikować wszystkie formy w widmie IM-MS i zapisz zakres izotopowy m/z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla każdej formy amb oddziel ewentualne nakładające się formy o tym samym m/z i wyodrębnij ich rozkłady czasu przyletu (ATD), wykorzystując ich rozkłady izotopowe m/z do ich identyfikacji.
	<ol>
		<li>W programie MassLynx kliknij DriftScope, aby otworzyć program. W DriftScope kliknij File, a następnie Open, aby zlokalizować i otworzyć plik danych IM-MS.</li>
		<li>Użyj myszy i lewego przycisku, aby powiększyć rozkład izotopowy m/z formy amb.</li>
		<li>Użyj narzędzia Selection tool i lewego przycisku myszy, aby zaznaczyć rozkład izotopowy. Kliknij przycisk Accept current selection.</li>
		<li>Aby oddzielić nakładające się formy m/z, użyj narzędzia Selection tool i lewego przycisku myszy, aby zaznaczyć ATD zsynchronizowane czasowo z rozkładem izotopowym formy amb. Kliknij przycisk Accept current selection.</li>
		<li>Aby wyeksportować ATD, przejdź do File | Export to MassLynx, wybierz Retain Drift Time i zapisz plik w odpowiednim folderze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznacz centroid ATD i zintegruj pole pod krzywą ATD jako miarę populacji danej formy.
	<ol>
		<li>W oknie chromatogramu programu MassLynx otwórz zapisany wyeksportowany plik. Z menu wybierz Process | Integrate. Zaznacz pole ApexTrack Peak Integration i kliknij OK.</li>
		<li>Zapisz wartość centroidu ATD (tA) oraz pole zintegrowane, widoczne w oknie Chromatogram. Powtórz czynność dla wszystkich zapisanych plików danych IM-MS dla amb i PA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykorzystaj zintegrowane ATD dla wszystkich wyodrębnionych form amb (jonów dodatnich lub ujemnych) dla każdego punktu miareczkowania, aby znormalizować je do względnej skali procentowej.
	<ol>
		<li>Wprowadź tożsamość form amb oraz ich zintegrowane ATD dla każdego pH do arkusza kalkulacyjnego.</li>
		<li>Dla każdego pH wykorzystaj sumę zintegrowanych ATD, aby znormalizować ATD poszczególnych form amb do skali procentowej.</li>
		<li>Przedstaw intensywności procentowe każdej formy amb w funkcji pH na wykresie, aby pokazać, jak populacja każdej formy zmienia się w zależności od pH.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przekroje czynne zderzeń
<ol>
	<li>Używając arkusza kalkulacyjnego, przelicz wartości CCS (Ω) jonów PA ujemnych25,26 i dodatnich27 zmierzonych w gazie buforowym He28 na skorygowane CCS (Ωc), korzystając z poniższego Równania 1, gdzie: z = ładunek jonu; ec = ładunek elektronu (1,602×10-19 C); mN2 = masa gazu N2 (Da); a mion = masa jonu.29</li>
</ol>
<img alt="Równanie częstotliwości cyklotronowej, wzór na ruch cząstek w polach elektromagnetycznych, równanie." src="/files/ftp_upload/60102/60102equ01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1">
<ol start="2">
	<li>Przelicz średnie czasy dotarcia (tA) kalibrantów PA oraz gatunków amb na czasy dryfu (tD), korzystając z poniższego Równania 2, gdzie: c = współczynnik opóźnienia zwiększonego cyklu pracy (1,41), a m/z to stosunek masy do ładunku jonu peptydowego.</li>
</ol>
<img alt="Wzór spektrometrii mas czasu przelotu służący do obliczania czasu dryfu jonów." src="/files/ftp_upload/60102/60102equ02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2">
<ol start="3">
	<li>Nanieś na wykres tD wzorców PA w funkcji ich Ωc. Następnie, wykorzystując dopasowanie regresji metodą najmniejszych kwadratów zgodnie z Równaniem 3 przedstawionym poniżej, wyznacz wartości A' i B, gdzie: A' jest poprawką na parametry temperatury, ciśnienia i pola elektrycznego, a B kompensuje nieliniowy efekt urządzenia IM.</li>
</ol>
<img alt="Równanie stałej szybkości rozpadu, Omega = A&#x27; * t^B, w badaniach nad analizą szybkości rozpadu." src="/files/ftp_upload/60102/60102equ03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3">
<ol start="4">
	<li>Wykorzystując te wartości A' i B oraz wartość centroidu tD z ATD ambów, wyznacz ich Ωc za pomocą Równania 3 oraz Ω za pomocą Równania 1. Metoda ta pozwala na określenie CCS dla gatunków peptydowych z szacowanymi błędami bezwzględnymi wynoszącymi około 2%25,26,27.</li>
</ol>
7. Metody obliczeniowe
<ol>
	<li>Zastosuj poziom teorii B3LYP/LanL2DZ, obejmujący hybrydowe funkcjonały Becke z 3 parametrami30, bazę funkcyjna Dunninga31 oraz potencjały rdzenia elektronowego32,3,34, aby wyznaczyć zoptymalizowane geometrycznie konformery dla wszystkich możliwych typów koordynacji obserwowanych gatunków amb o danej wartości m/z35. 
	UWAGA: Szczegółowe informacje na temat budowania i przesyłania obliczeń znajdują się w sekcji dotyczącej obsługi programu GaussView w Pliku uzupełniającym.</li>
	<li>Porównaj przewidywaną energię swobodną każdego z konformerów i oblicz ich teoretyczne wartości CCS, wykorzystując metodę Lennarda-Jonesa (LJ) ze skalowaniem jonowym z programu Sigma36.</li>
	<li>Na podstawie konformerów o najniższej energii swobodnej określ, który z nich wykazuje wartość LJ CCS zgodną z wartością CCS zmierzoną metodą IM-MS, aby zidentyfikować strukturę trzeciorzędową oraz typ koordynacji dla konformerów zaobserwowanych w eksperymencie.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kroki krytyczne: zachowanie zachowań w fazie roztworu do zbadania za pomocą ESI-IM-MS Należy użyć natywnych ustawień instrumentalnych ESI, które zachowują stechiometrię peptydów, stan ładunku i strukturę konformacyjną. W przypadku warunków natywnych warunki w źródle ESI, takie jak napięcia stożka, temperatury i przepływy gazów, muszą być zoptymalizowane. Ponadto należy sprawdzić ciśnienie i napięcia w źródle, pułapce, ruchliwości jonów i przenoszeniu fal przemieszczających (zwłaszcza polaryzacji puł...

Jony miedzi i są niezbędne dla organizmów żywych i mają kluczowe znaczenie dla procesów takich jak ochrona oksydacyjna, wzrost tkanek, oddychanie, cholesterol, metabolizm glukozy i odczytywanie genomu1. Aby umożliwić te funkcje, grupy takie jak tiolan Cys, imidazol klasy His2,3, (rzadziej) tioeter metioniny i karboksylan Glu i Asp selektywnie włączają metale jako kofaktory do miejsc aktywnych metaloenzymów. Podobieństwo tych grup koordynacyjnych rodzi intrygujące pytanie dotyczące tego, w jaki sposób ligandy His i Cys selektywnie włączają Cu(I/II) lub Zn(II), aby zapewnić prawidłowe funkcjonowanie.
Selektywne wiązanie jest często realizowane przez pozyskiwanie i transport peptydów, które kontrolują stężenia jonów Zn(II) lub Cu(I/II)4. Cu(I/II) jest wysoce reaktywny i powoduje uszkodzenia oksydacyjne lub przypadkowe wiązanie się z enzymami, więc jego wolne stężenie jest ściśle regulowane przez miedziane białka opiekuńcze i białka regulujące miedź, które bezpiecznie transportują go do różnych miejsc w komórce i ściśle kontrolują jego homeostazę5,6. Zakłócenie metabolizmu lub homeostazy miedzi jest bezpośrednio związane z chorobą Menkesa i Wilsona7, a także nowotworami7 i zaburzeniami neuronalnymi, takimi jak prion8 i choroba Alzheimera9.
Choroba Wilsona wiąże się ze zwiększonym poziomem miedzi w oczach, wątrobie i częściach mózgu, gdzie reakcje redoks Cu(I/II) wytwarzają reaktywne formy tlenu, powodując zwyrodnienie wątroby i neurologiczne. Istniejące terapie chelatacyjne to mały tiol, aminokwas, penicylamina i trietylenotetramina. Alternatywnie, metanotroficzne peptydy nabywające miedź metanobaktyna (mb)10,11 wykazują potencjał terapeutyczny ze względu na ich wysokie powinowactwo wiązania do Cu(I)12. Kiedy metanobaktyna (mb-OB3b) z Methylosinus trichosporium OB3b była badana na zwierzęcym modelu choroby Wilsona, miedź została skutecznie usunięta z wątroby i wydalona przez żółć13. Eksperymenty in vitro potwierdziły, że mb-OB3b może chelatować miedź z metalotioneiny miedzi zawartej w cytozolu wątrobowym13. Techniki obrazowania spektrometrii mas plazmy sprzężonej indukcyjnie z ablacją laserową zbadały przestrzenny rozkład miedzi w próbkach wątroby z chorobą Wilsona14,15,16 i wykazały, że mb-OB3b usuwa miedź za pomocą krótkich okresów leczenia wynoszących zaledwie 8 dni17.
mb-OB3b będzie również wiązać się z innymi jonami metali, w tym Ag(I), Au(III), Pb(II), Mn(II), Co(II), Fe(II), Ni(II) i Zn(II)18,19. Konkurencja o fizjologiczne miejsce wiązania Cu(I) jest wykazywana przez Ag(I), ponieważ może wypierać Cu(I) z kompleksu mb-OB3b, przy czym zarówno Ag(I), jak i Ni(II) wykazują również nieodwracalne wiązanie z Mb, które nie może być przemieszczone przez Cu(I)19. Ostatnio zbadano szereg alternatywnych oligopeptydów metanobaktyny (amb) z motywem wiązania 2His-2Cys20,21 i scharakteryzowano ich właściwości wiązania Zn(II) i Cu(I/II). Ich podstawowe sekwencje aminokwasów są podobne i wszystkie zawierają motyw 2His-2Cys, Pro i acetylowany N-koniec. Różnią się one od mb-OB3b przede wszystkim tym, że motyw 2His-2Cys zastępuje dwa miejsca wiązania entiolu oksazolonu mb-OB3b.
Jonizacja elektrorozpylania w połączeniu ze spektrometrią mas ruchliwości jonów (ESI-IM-MS) dostarcza potężnej techniki instrumentalnej do określania właściwości peptydów wiążących metale, ponieważ mierzy ich masę do ładunku (m/z) i przekrój zderzenia (CCS), zachowując jednocześnie ich masę, ładunek i kształt konformacyjny z fazy roztworu. M/z i CCS odnoszą się do stechiometrii peptydów, stanu protonacji i kształtu konformacyjnego. Stechiometria jest określana, ponieważ tożsamość i liczba każdego pierwiastka obecnego w gatunku jest wyraźnie zidentyfikowana. Całkowity ładunek kompleksu peptydowego odnosi się do stanu protonacji miejsc kwaśnych i zasadowych oraz stopnia utlenienia jonów metali. CCS dostarcza informacji o konformacyjnym kształcie kompleksu peptydowego, ponieważ mierzy uśredniony rozmiar rotacyjny, który odnosi się do trzeciorzędowej struktury kompleksu. Ogólny stan naładowania kompleksu jest również funkcją pH i wpływa na powinowactwo peptydu do wiązania jonów metali, ponieważ zdeprotonowane miejsca zasadowe lub kwasowe, takie jak karboksyl, His, Cys i Tyr, są również potencjalnymi miejscami wiązania jonu metalu. Do analiz peptyd i jon metalu przygotowuje się w roztworach wodnych o pH dostosowanym za pomocą rozcieńczonego wodnego kwasu octowego lub wodorotlenku amonu. Pozwala to na określenie zależności pH i selektywności jonów metali dla peptydu. Co więcej, m/z i CCS wyznaczone przez ESI-IM-MS mogą być wykorzystane z modelowaniem molekularnym B3LYP/LanL2DZ w celu odkrycia rodzaju koordynacji jonów metali i struktury trzeciorzędowej kompleksu. Wyniki przedstawione w tym artykule ujawniają, w jaki sposób ESI-IM-MS może scharakteryzować selektywną wydajność chelatacyjną zestawu peptydów amb i porównać je z peptydem wiążącym miedź mb-OB3b.

<table><tbody><tr><td>acetonitryl klasy HPLC</td><td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td><td>A998SK-4</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek amonu (klasa metali śladowych)</td><td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td><td>A512-P500</td><td></td></tr><tr><td>sześciowodny chlorek kobaltu(II) 99,99%</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>255599-5G</td><td></td></tr><tr><td>chlorek miedzi(II) 99,999%</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>203149-10G</td><td></td></tr><tr><td>hydrat azotanu miedzi(II) 99,99%</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>229636-5G</td><td></td></tr><tr><td>zaprojektowane peptydy amb1,2,3,4,5,6,7</td> Peptydy zaprojektowane <td>przez Neo BioLab (neobiolab.com)</td><td></td> <td>zostały zsyntetyzowane na zamówienie</td></tr><tr><td>zaprojektowane peptydy AMB5B,C,D,E,F</td><td>Peptydy zaprojektowane przez PepmicCo (www.pepmic.com)</td><td></td> <td>zostały zsyntetyzowane według kolejności</td></tr><tr><td>Driftscope 2.1 oprogramowanie</td><td>Waters (www.waters.com)</td><td></td><td>program do analizy oprogramowania</td></tr><tr><td>Liofilizowany, oczyszczony, wolny od Cu(I) mb-OB3b</td><td></td><td></td><td>hodowany i izolowany w laboratorium dr DongWon Choi (Wydział Biologii, Texas A& M-Commerce)</td></tr> <tr><td>lodowaty kwas octowy (klasa Optima)</td> <td>Fisher Scientific (www.Fishersci.com)</td> <td>A465-250</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek żelaza(III) bezwodny 98% +</td> <td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td> <td>12357-09</td><td></td></tr><tr><td>azotan ołowiu(II) Klasa ACS</td><td>Avantor (www.avantormaterials.com)</td><td>128545-50G</td><td></td></tr><tr><td>czterowodny chlorek manganu(II) 99,99%</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>203734-5G</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx 4.1</td><td>Waters (www.waters.com)</td><td></td><td>program do analizy</td></tr><tr><td>oprogramowania chlorek niklu sześciowodny 99,99%</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>203866-5G</td><td></td></tr><tr><td>poli-DL-alanina</td><td>Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)</td><td>P9003-25MG</td><td></td></tr><tr><td>azotan srebra 99,9%+</td><td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td><td>11414-06</td><td></td></tr><tr><td>Waters Synapt G1 HDMS</td><td>Waters (www.waters.com)</td><td></td><td>kwadrupol - ruchliwość jonów - spektrometr masowy czasu przelotu</td></tr><tr><td>chlorek bezwodny</td><td>Alfa Aesar (www.alfa.com)</td><td>A16281</td><td></td></tr></tbody></table>

techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Jonizacja elektronatryskowa (ESI) może przenieść peptyd lub kompleks peptydowy w fazie wodnej do fazy gazowej, zachowując przy tym jego masę, ogólny ładunek, interakcje wiążące metale i kształt konformacyjny. Sprzężenie ESI ze spektrometrią ruchliwości jonów i mas (IM-MS) zapewnia technikę instrumentalną, która pozwala na jednoczesny pomiar masy do ładunku peptydu (m/z) i przekroju czynnego zderzenia (CCS), które odnoszą się do jego stechiometrii, stanu protonacji i kształtu konformacyjnego. Całkowity ładunek kompleksu peptydowego jest kontrolowany przez protonowanie 1) kwaśnych i zasadowych miejsc peptydu oraz 2) stopnia utlenienia jonów metali. Dlatego ogólny stan naładowania kompleksu jest funkcją pH roztworu, który wpływa na powinowactwo wiązania jonów metali peptydów. Do analiz ESI-IM-MS roztwory peptydów i jonów metali przygotowuje się z roztworów wodnych, których pH dostosuje się rozcieńczonym wodnym roztworem kwasu octowego lub wodorotlenku amonu. Pozwala to na określenie zależności pH i selektywności jonów metali dla określonego peptydu. Co więcej, m/z i CCS kompleksu peptydowego mogą być używane z modelowaniem molekularnym B3LYP/LanL2DZ w celu rozpoznania miejsc wiązania koordynacji jonów metali i trzeciorzędowej struktury kompleksu. Wyniki pokazują, w jaki sposób ESI-IM-MS może scharakteryzować selektywną wydajność chelatacyjną zestawu alternatywnych peptydów metanobaktyny i porównać je z peptydem wiążącym miedź metanobaktyną.

Wiązanie metali przez amb1 
Badanie IM-MS20 amb1 (Rycyna 1A) wykazało, że zarówno jony miedzi, jak i cynku wiązały się z amb1 w sposób zależny od pH (Rycyna 2). Jednak miedź i cynk wiązały się z amb1 poprzez różne mechanizmy reakcji w różnych miejscach koordynacji. Na przykład dodanie Cu(II) do amb1 doprowadziło do utlenienia amb1 (amb<s...

Mobilność jonów-spektrometria mas i techniki modelowania molekularnego mogą scharakteryzować selektywną wydajność chelatacji metali zaprojektowanych peptydów wiążących metale oraz peptydu wiążącego miedź metanobaktyny. Opracowanie nowych klas peptydów chelatujących metale pomoże w opracowaniu metod leczenia chorób związanych z nierównowagą jonów metali.

Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Spektrometria mas ruchliwości jonów (IM-MS) identyfikuje różne jony pochodzące z zależnej od pH reakcji wiązania redoks i metylu peptydów. Dzięki modelowaniu molekularnemu ich trzeciorzędowej struktury można określić korelację metali. IM-MS może rozdzielić każdy z jonów poprodukcyjnych i określić ich skład molekularny, jednocześnie mierząc ich czas od masy do ładunku i czasu przybycia oraz odnosząc się do ich stechiometrii, stanu protonacji i struktury konformacyjnej.Opracowanie klas peptydów chelatujących metale pomoże w opracowaniu metod leczenia chorób związanych z nierównowagą jonów metali, takich jak choroba Menkesa i Wilsona, nowotwory i choroba Alzheimera. Na początek dokładnie wyczyść rurkę wejściową ESI i kapilę igłową około 500 mikrolitrami 0,1 molowego lodowatego kwasu octowego, 0,1 molowego wodorotlenku amonu i na koniec wodą dejonizowaną. Użyj natywnych warunków ESI-IM-MS zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby zebrać widma IM-MS jonów ujemnych i dodatnich roztworu 10 ppm poli-DL-alaniny przez 10 minut każde.Odpipetować 200,0 mikrolitrów 0,125 milimolowej alternatywnej metanobaktyny lub roztworu amb do fiolki o pojemności 1,7 mililitra. Rozcieńczyć 500 mikrolitrami wody dejonizowanej i dokładnie wymieszać roztwór. Dostosować pH próbki do 3,0, dodając 50 mikrolitrów 1,0-molowego roztworu kwasu octowego.Dodać 200,0 mikrolitrów 0,125 milimolowego jonu metalu do próbki o dostosowanym pH. Następnie dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać końcową objętość 1,00 mililitra próbki. Dokładnie wymieszać i pozostawić próbkę do zrównoważenia przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Za pomocą strzykawki z nosem pobrać 500 mikrolitrów próbki i zebrać widma jonów ujemnych i dodatnich ESI-IM-MS przez pięć minut każde. Użyj pozostałych 500 mikrolitrów próbki, aby zarejestrować jej końcowe pH za pomocą skalibrowanej mikroelektrody pH. Powtórz te kroki, z wyjątkiem dostosowania pH do pH cztery, pięć, sześć, siedem, osiem, dziewięć lub 10, dodając nowe objętości roztworów kwasu octowego lub wodorotlenku amonu.Zebrać widma jonów ujemnych i dodatnich ESI-IM-MS otrzymanych roztworów przez 10 minut każde. Na podstawie widm IM-MS zidentyfikuj, które naładowane gatunki alternatywnej metanobaktyny są obecne, dopasowując je do ich teoretycznych wzorców izotopów od masy do ładunku. Aby to zrobić, otwórz MassLynx i kliknij Chromatogram, aby otworzyć okno Chromatogram.Przejdź do menu Plik i Otwórz, aby zlokalizować i otworzyć plik danych IM-MS. Wyodrębnij widmo IM-MS, klikając prawym przyciskiem myszy, przeciągając po chromatogramie i zwalniając. Otworzy się okno widma pokazujące widmo IM-MS.W oknie widma kliknij Narzędzia i model izotopowy. W oknie Modelowanie izotopów wprowadź wzór cząsteczkowy gatunku amb, zaznacz pole Pokaż naładowany jon i wprowadź stan naładowania. Kliknij przycisk OK. Powtórz ten proces, aby zidentyfikować wszystkie gatunki w widmie IM-MS i zarejestrować ich zakres izotopów od masy do ładunku.Dla każdego gatunku amb oddziel wszystkie przypadkowe gatunki od masy do ładunku i wyodrębnij ich rozkłady czasu przybycia lub ATD, wykorzystując ich wzorce izotopów masy do ładunku w celu ich identyfikacji. Otwórz DriftScope i kliknij Plik i Otwórz, aby zlokalizować i otworzyć plik danych IM-MS. Użyj myszki i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby powiększyć wzór izotopów od masy do ładunku gatunków amb.Użyj narzędzia Zaznaczanie i lewego przycisku myszy, aby wybrać wzór izotopowy. Kliknij przycisk Zaakceptuj bieżący wybór. Aby oddzielić przypadkowe gatunki od masy do ładunku, użyj narzędzia do zaznaczania i lewego przycisku myszy, aby wybrać czas ATD wyrównany z wzorcem izotopowym gatunku amb.Kliknij przycisk Zaakceptuj bieżący wybór. Aby wyeksportować ATD, przejdź do Plik, Eksportuj do MassLynx. Następnie wybierz opcję Zachowaj czas dryfu i zapisz plik w odpowiednim folderze.W oknie Chromatogram programu MassLynx otwórz zapisany wyeksportowany plik. Kliknij Proces, Integracja z menu, zaznacz pole ApexTrack Peak Integration i kliknij OK. Zapisać środek ciężkości i zintegrowany obszar ATD. Po powtórzeniu tego procesu dla wszystkich zapisanych plików danych amb i poli-DL-alaniny IM-MS, należy użyć zintegrowanego ATD dla wszystkich wyekstrahowanych gatunków amb jonów dodatnich lub ujemnych w każdym punkcie miareczkowania, aby znormalizować do względnej skali procentowej.Aby to zrobić, wprowadź do arkusza kalkulacyjnego tożsamość gatunków amb i ich zintegrowane ATD przy każdym pH. Dla każdego pH należy użyć sumy zintegrowanych ATD, aby znormalizować ATD poszczególnych gatunków amb do skali procentowej. Wykreśl procentową intensywność każdego gatunku amb w funkcji pH, aby pokazać, jak zmienia się populacja każdego gatunku w funkcji pH.Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, przelicz przekroje czynne zderzeń jonów ujemnych i dodatnich poli-DL-alaniny zmierzonych w gazie buforowym helu na skorygowane przekroje czynne zderzenia. Następnie przelicz średnie czasy przybycia kalibrantów poli-DL-alaniny i gatunków amb na czasy dryftu. Zatkaj czasy dryftu kalibrów poli-DL-alaniny w stosunku do ich skorygowanych przekrojów kolizyjnych.Następnie, korzystając z dopasowania regresji metodą najmniejszych kwadratów, należy określić wartości pierwsze A i B, gdzie liczba pierwsza A jest poprawką parametrów temperatury, ciśnienia i pola elektrycznego, a B kompensuje efekt nieliniowy urządzenia IM. Korzystając z tych wartości A i B z wartością czasów dryftu środka ciężkości, określ ich skorygowane przekroje kolizyjne i ich przekroje kolizyjne. Metoda ta zapewnia przekroje czynne zderzeń dla gatunków peptydów z szacowanymi błędami bezwzględnymi wynoszącymi około 2%Korzystając z Gaussa z GaussView i poziomem teorii B3LYP LanL2DZ, zlokalizuj zoptymalizowane pod kątem geometrii konformery dla wszystkich możliwych typów koordynacji obserwowanych gatunków amb od masy do ładunku.Poziom teorii B3LYP LanL2DZ składa się z trzech obwodowych funkcjonałów hybrydowych Beckego, zbioru bazowego Dunninga i potencjałów rdzenia elektronowego. Wyodrębnij analizy termochemiczne każdego ze zoptymalizowanych konformerów z pliku wyjściowego Gaussa i oblicz ich teoretyczne przekroje czynne zderzeń przy użyciu metody Lennarda-Jonesa w skali jonowej z programu Sigma. Na podstawie konformerów o najniższej energii swobodnej określ, który konformer wykazuje przekrój czynny zderzenia Lennarda-Jonesa, który zgadza się z przekrojem zderzenia zmierzonym przez IM-MS.Proces ten identyfikuje trzeciorzędową strukturę i rodzaj koordynacji dla konformerów obserwowanych w eksperymencie. Modelowanie molekularne wymaga porównania energii swobodnej i przekrojów czynnych zderzeń konformerów z różnymi miejscami chelatacji metali, wiązaniami cis i transpeptydowymi, mostkami solnymi, wiązaniami wodorowymi i oddziaływaniami kationowymi. Badanie IM-MS alternatywnej metanobaktyny wykazało, że chelatuje ona zarówno jony miedzi, jak i w sposób zależny od pH, ale poprzez różne mechanizmy reakcji i miejsca koordynacji.Wiązanie(II) obserwowano przy pH większym niż sześć, tworząc przede wszystkim pojedynczy ujemnie naładowany kompleks, co wskazuje, że(II) był czterościennie koordynowany przez dwa imidazole i dwa tiolany. Wiązaniu miedzi(II) towarzyszyły tiole tworzące mostek dwusiarczkowy. Przy pH większym niż sześć powstał pojedynczy ujemnie naładowany kompleks miedzi(II), co wskazuje, że imidazol i dwa zdeprotonowane azoty amidowe koordynowały miedź(II)Jednak poniżej pH sześciu, dodanie miedzi(II) również utworzyło pojedynczy dodatnio naładowany kompleks miedzi(I), a także pojedynczy dodatnio naładowany kompleks miedzi(II)powyżej pH sześciu.Badania IM-MS amb 2 i AMB 4 pokazują również, że w reakcjach miedzi uzyskano produkty różniące się liczbą między- lub wewnątrzcząsteczkowych mostków dwusiarczkowych, liczbą jonów miedzi(I) lub miedzi(II) oraz liczbą miejsc deprotonacji, które zmieniały się w funkcji pH. Wynik IM-MS z modelowaniem molekularnym wykazał, że alternatywne metanobaktyny mogą koordynować do trzech jonów miedzi za pośrednictwem grup tiolanowych, imidazolowych i karboksylowych. Ustawienia instrumentalne IM-MS muszą być starannie dobrane, aby zachować stechiometrię, rozkłady ładunków i struktury konformacyjne peptydów, jak opisano w tekście.Połączenie szerszego zakresu rozmiarów, które będą miały wpływ na koordynację metali, takich jak tyrozyna w kwasie asparaginowym, pozwoli lepiej zrozumieć związek między strukturą a funkcją. IM-MS z modelowaniem molekularnym stały się alternatywnymi technikami przyspieszającymi krystalografię i spektroskopię NMR do określania struktur konformacyjnych białek, DNA, lipidów i ich kompleksów.

ion-mobility-mass-spectrometry-techniques-for-determining-structure

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Spektrometria mas sprzężona z mobilnością jonów to rozwijająca się technologia fazy gazowej, która rozdziela jony na podstawie ich przekroju czynnego zderzeń oraz masy. Metoda ta dostarcza trójwymiarowych informacji o ogólnej topologii i kształcie kompleksów białkowych. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy podstawową procedurę konfiguracji i optymalizacji instrumentu, kalibracji czasów dryfu oraz interpretacji danych.

Spektrometria mas z mobilnością jonów w polu falowym T: podstawowe procedury eksperymentalne w analizie kompleksów białkowych

Struktura roztworu NMR peptydu modelowego metalochaperonu z Cu (I) została określona, a szczegółowy protokół od przygotowania próbki i zbierania danych 1D i 2D do struktury trójwymiarowej jest opisany.

Oznaczanie struktury i koordynacji kompleksów peptyd-metal metodą 1D i 2D 1H NMR

Chromatografia wykluczania wielkości z łącznikiem plazmy sprzężonej indukcyjnie - spektrometria mas (ICP-MS) to potężne narzędzie do pomiaru zmian w obfitości metaloprotein bezpośrednio z próbek biologicznych. W tym miejscu opisujemy zestaw wzorców metaloprotein używanych do szacowania masy cząsteczkowej i ilości metalu związanego z nieznanymi białkami.

Standardy ilościowej analizy metaloproteomicznej z wykorzystaniem wykluczenia wielkości ICP-MS

Opisany jest protokół ręcznej syntezy oligo-peptoidów, po którym następuje analiza sekwencji za pomocą spektrometrii mas.

Synteza i analiza oligo-peptoidów za pomocą spektrometrii mas

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania metodą chromatografii z immobilizowanym metalem metodą powinowactwa do metalu, a następnie odtworzenia oznaczonej polihistydyną, niehemowej dioksygenazy wiążącej żelazo, odpowiedniej dla laboratorium nauczania na studiach licencjackich.

Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania dyskretnych klastrów tlenu metali, polioksometalanów (POM), na granicy pojedynczej cząsteczki za pomocą biologicznej platformy elektronicznej opartej na nanoporach. Metoda ta stanowi komplementarne podejście do tradycyjnych narzędzi chemii analitycznej stosowanych w badaniu tych cząsteczek.

Charakterystyka fizyczna pojedynczych nanocząstek metalicznych w wysokiej rozdzielczości

Prezentujemy test do łatwej kwantyfikacji metali wprowadzonych do próbek przygotowanych za pomocą chromatografii powinowactwa do metali unieruchomionych. Metoda wykorzystuje błękit hydroksynaftolowy jako kolorymetryczny wskaźnik metalu i spektrofotometr UV-Vis jako detektor.

Kwantyfikacja wymywania metali w chromatografii powinowactwa do unieruchomionych metali

Ten artykuł skupia się na wykorzystaniu elektronicznej spektroskopii absorpcyjnej i izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do badania i ilościowego określania termodynamiki wiązania Cu(II) z peptydami i białkami.

Kwantyfikacja oddziaływań wiążących między Cu(II) a resztą peptydowymi w obecności i bez chromoforów

Ten artykuł opisuje eksperymentalny protokół wykorzystujący elektrorozpylanie, ruchliwość jonów, spektrometrię mas, półempiryczne obliczenia kwantowe i dysocjację wywołaną zderzeniem progu o rozdzielczości energetycznej do pomiaru względnej termochemii dysocjacji powiązanych kompleksów metali trójskładnikowych.

Badania termochemiczne trójskładnikowych kompleksów Ni(II) i Zn(II) z wykorzystaniem spektrometrii ruchliwości jonów i mas

Poznaj spektrometrię ruchliwości jonów i mas (IM-MS) oraz modelowanie molekularne do analizy oligopeptydów wiążących metale. Ta metoda umożliwia określenie struktury i mechanizmów koordynacji jonów miedzi oraz cynku.

Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale (Wideo) | JoVE Journal

Techniki spektrometrii ruchliwości jonów i mas do określania struktury i mechanizmów rozpoznawania jonów metali i aktywności redoks oligopeptydów wiążących metale

Przeglądaj więcej filmów