Name: Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania i refoldingu samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek z epitopami trymerycznymi. Technika FPLC i dializa umożliwiają uzyskanie natywnych konformacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez umowę o współpracy (W81XWH-11-2-0174) pomiędzy Fundacją Henry'ego M. Jacksona na rzecz Rozwoju Medycyny Wojskowej, Inc., a Departamentem Obrony USA. Przeciwciało anty-HIV-1 gp41 mAb 167-D IV otrzymano od dr Susan Zolla-Pazner za pośrednictwem programu odczynnikowego NIH AIDS.

<ol><li>Karch, C. P., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+technologies%3A+From+whole+organisms+to+rationally+designed+protein+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Vaccine technologies: From whole organisms to rationally designed protein assemblies.</a> Biochemical Pharmacology. 120, 1-14 (2016).</li>
<li>Snapper, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Immunologic+Properties+of+Soluble+Versus+Particulate+Antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct Immunologic Properties of Soluble Versus Particulate Antigens.</a> Frontiers in Immunology. 9, 598(2018).</li>
<li>Kelly, H. G., Kent, S. J., Wheatley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+basis+for+enhanced+immunity+of+nanoparticle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Immunological basis for enhanced immunity of nanoparticle vaccines.</a> Expert Review of Vaccines. , 1-12 (2019).</li>
<li>Yeates, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+Principles+for+Designing+Highly+Symmetric+Self-Assembling+Protein+Nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Geometric Principles for Designing Highly Symmetric Self-Assembling Protein Nanomaterials.</a> Annual Review of Biophysics. 46, 23-42 (2017).</li>
<li>Marcandalli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Potent+Neutralizing+Antibody+Responses+by+a+Designed+Protein+Nanoparticle+Vaccine+for+Respiratory+Syncytial+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Potent Neutralizing Antibody Responses by a Designed Protein Nanoparticle Vaccine for Respiratory Syncytial Virus.</a> Cell. 176 (6), 1420-1431 (2019).</li>
<li>Ross, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decorating+Self-Assembled+Peptide+Cages+with+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Decorating Self-Assembled Peptide Cages with Proteins.</a> ACS Nano. 11 (8), 7901-7914 (2017).</li>
<li>Karch, C. P., Matyas, G. R., Burkhard, P., Beck, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembling+Protein+Nanoparticles%3A+implications+for+HIV-1+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Self-Assembling Protein Nanoparticles: implications for HIV-1 vaccine development.</a> Nanomedicine (Lond). 13 (17), 2121-2125 (2018).</li>
<li>Raman, S., Machaidze, G., Lustig, A., Aebi, U., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+design+of+peptides+that+self-assemble+into+regular+polyhedral+nanoparticles%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Structure-based design of peptides that self-assemble into regular polyhedral nanoparticles).</a> Nanomedicine. 2 (2), 95-102 (2006).</li>
<li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+displaying+HIV-1+Env+V1V2+loop+in+a+native-like+trimeric+conformation+as+vaccine+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of a self-assembling protein nanoparticle displaying HIV-1 Env V1V2 loop in a native-like trimeric conformation as vaccine antigen.</a> Nanomedicine. , (2018).</li>
<li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+P.+falciparum+specific+coiled-coil+domain+to+construct+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+to+prevent+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of a P. falciparum specific coiled-coil domain to construct a self-assembling protein nanoparticle vaccine to prevent malaria.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 62(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-adjuvanted+nanoparticle+based+vaccine+against+infectious+bronchitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A self-adjuvanted nanoparticle based vaccine against infectious bronchitis virus.</a> PLoS One. 13 (9), e0203771(2018).</li>
<li>Wahome, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation-specific+display+of+4E10+and+2F5+epitopes+on+self-assembling+protein+nanoparticles+as+a+potential+HIV+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology+%26+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">Conformation-specific display of 4E10 and 2F5 epitopes on self-assembling protein nanoparticles as a potential HIV vaccine.</a> Chemical Biology & Drug Design. 80 (3), 349-357 (2012).</li>
<li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+a+novel+immunogenic+nanoparticle+platform+for+Toxoplasma+peptide+vaccine+in+HLA+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of a novel immunogenic nanoparticle platform for Toxoplasma peptide vaccine in HLA transgenic mice.</a> Vaccine. 32 (26), 3243-3248 (2014).</li>
<li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonadjuvanted+polypeptide+nanoparticle+vaccine+confers+long-lasting+protection+against+rodent+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A nonadjuvanted polypeptide nanoparticle vaccine confers long-lasting protection against rodent malaria.</a> Journal of Immunology. 183 (11), 7268-7277 (2009).</li>
<li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibody+and+CD8%2B+T-cell+responses+to+the+Plasmodium+falciparum+circumsporozoite+protein+induced+by+a+nanoparticle+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective antibody and CD8+ T-cell responses to the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein induced by a nanoparticle vaccine.</a> PLoS One. 7 (10), e48304(2012).</li>
<li>Seth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+self-assembling+protein+nanoparticle+vaccine+targeting+Plasmodium+falciparum+Circumsporozoite+Protein+delivered+in+three+Army+Liposome+Formulation+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Development of a self-assembling protein nanoparticle vaccine targeting Plasmodium falciparum Circumsporozoite Protein delivered in three Army Liposome Formulation adjuvants.</a> Vaccine. 35 (41), 5448-5454 (2017).</li>
<li>Kaba, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+protein+nanoparticles+with+built-in+flagellin+domains+increases+protective+efficacy+of+a+Plasmodium+falciparum+based+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Self-assembling protein nanoparticles with built-in flagellin domains increases protective efficacy of a Plasmodium falciparum based vaccine.</a> Vaccine. 36 (6), 906-914 (2018).</li>
<li>El Bissati, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+nanovaccine+confers+robust+immunity+against+Toxoplasma%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Protein nanovaccine confers robust immunity against Toxoplasma.</a> NPJ Vaccines. 2, 24(2017).</li>
<li>Karch, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+self-adjuvanted+protein+nanoparticles+provides+protection+against+lethal+influenza+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Vaccination with self-adjuvanted protein nanoparticles provides protection against lethal influenza challenge.</a> Nanomedicine. 13 (1), 241-251 (2017).</li>
<li>Haynes, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-correlates+analysis+of+an+HIV-1+vaccine+efficacy+trial%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-correlates analysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial.</a> New England Journal of Medicine. 366 (14), 1275-1286 (2012).</li>
<li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> New England Journal of Medicine. 361 (23), 2209-2220 (2009).</li>
<li>O' Connell, R. J., Kim, J. H., Excler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+gp120+V1V2+loop%3A+structure%2C+function+and+importance+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 gp120 V1V2 loop: structure, function and importance for vaccine development.</a> Expert Review of Vaccines. 13 (12), 1489-1500 (2014).</li>
<li>Babapoor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Vaccine+Using+Nanoparticle+Platform+to+Present+Immunogenic+M2e+against+Avian+Influenza+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">A Novel Vaccine Using Nanoparticle Platform to Present Immunogenic M2e against Avian Influenza Infection.</a> Influenza Research and Treatment. 2011, 126794(2011).</li>
<li>Indelicato, G., Burkhard, P., Twarock, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+self-assembling+protein+nanoparticle+architectures+for+applications+in+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Classification of self-assembling protein nanoparticle architectures for applications in vaccine design.</a> Royal Society Open Science. 4 (4), 161092(2017).</li>
<li>Indelicato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+Governing+the+Self-Assembly+of+Coiled-Coil+Protein+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Principles Governing the Self-Assembly of Coiled-Coil Protein Nanoparticles.</a> Biophysical Journal. 110 (3), 646-660 (2016).</li>
<li>Doll, T. A., Raman, S., Dey, R., Burkhard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+assemblies+and+their+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Nanoscale assemblies and their biomedical applications.</a> Journal of the Royal Society Interface. 10 (80), 20120740(2013).</li>
<li>Rey, F. A., Lok, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+Features+of+Enveloped+Viruses+and+Implications+for+Immunogen+Design+for+Next-Generation+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Common Features of Enveloped Viruses and Implications for Immunogen Design for Next-Generation Vaccines.</a> Cell. 172 (6), 1319-1334 (2018).</li>
<li>Bacterial Endotoxins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22United+States+Pharmacopeia+%28USP%29%22">United States Pharmacopeia (USP)</a>. , Ch. 85 (2011).</li>
<li>Points to Consider (PTC) in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals. , Food and Drug Adminstration. Maryland. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/media/76255/download">https://www.fda.gov/media/76255/download</a> (1993).</li>
</ol>

Wyrażone poglądy są poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące stanowisko armii amerykańskiej lub Departamentu Obrony. Peter Burkhard ma udziały w firmie o nazwie Alpha-O Peptides AG i posiada patenty na tę technologię. Pozostali autorzy nie są powiązani ani zaangażowani finansowo z żadną firmą mającą interes finansowy w tematyce przedstawionej w niniejszym artykule.

Nanotechnologia zapewnia wiele korzyści i rozwiązań w zakresie opracowywania szczepionek podjednostkowych. Nanoszczepionki mogą wielokrotnie prezentować antygeny w postaci cząstek stałych układowi odpornościowemu gospodarza, zwiększając immunogenność26. Chociaż istnieje wiele różnych rodzajów nanoszczepionek, uważamy, że te składające się z białka zaprojektowanego de novo wydają się być najsilniejszym podejściem do opracowania szczepionki1. Można je zaprojektować bez żadnej homologii sekwencji do białek gospodarza i prezentować interesujący antygen w konformacji zbliżonej do natywnej, zapewniając jednocześnie niskie koszty produkcji i wysoką wydajność produktu. Doskonałym przykładem takiego podejścia jest technologia SAPN, którą zastosowaliśmy do szczepionek przeciwko wielu chorobom zakaźnym7. Rozwiązując trudności w opracowywaniu szczepionki przeciwko HIV-1, zaprojektowaliśmy unikalny rdzeń SHB-SAPN, aby skutecznie prezentować antygen V1V2 w natywnej konformacji trimerycznej9. Wiele szczepionek, szczególnie przeciwko chorobom wirusowym, występuje w postaci trimerów27. Zjawisko to wskazuje, że nasz projekt SAPN ma szerokie implikacje dla rozwoju szczepionek podjednostkowych.
W tej metodzie pokazujemy, jak wytwarzać SHB-SAPN w systemie ekspresji E. coli . Stwierdziliśmy wysoką wydajność białka (około 6 mg/100 ml hodowli). Białko zawierało 10 histydyn i było łatwe do oczyszczenia za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa do metali z kolumną Ni2+ . Stwierdzono, że ta długość His-Tag jest optymalna dla najwyższego uzysku białka. Oczyszczone białko zawierało całą długość zaprojektowanego białka, na co wskazuje obecność zarówno N-końcowego HisTag, jak i C-końcowego powtórzenia heptadowego. Wykorzystaliśmy powszechnie akceptowane techniki i zoptymalizowaliśmy je pod kątem ekspresji, produkcji i charakterystyki rdzenia SHB-SAPN. Brak produkcji białka o pełnej długości podczas opracowywania SAPN zawierającego nowy epitop białkowy może wskazywać na problem z ekspresją genu w komórce gospodarza. Jeśli tak się stanie, gen i system ekspresji muszą zostać przeprojektowane i dostosowane do opisanego protokołu. Modyfikacja czasu lub intensywności sonikacji może również zwiększyć stężenie przewidywanego białka o pełnej długości.
Ponownie sfałdowane cząstki mieściły się w oczekiwanym zakresie wielkości (od 20 do 100 nm)8,24,25, zgodnie z DLS i analizą śledzenia nanocząstek. Wyniki te zostały dodatkowo potwierdzone przy użyciu TEM. Jeśli na tym etapie występują problemy, zwykle jest to spowodowane problemem z pH lub siłą jonową buforu do ponownego fałdowania. Gdy cząstki o dużych rozmiarach są wykrywane w technikach wymiarowania cząstek, wskazuje to na agregację, której można uniknąć, zwiększając pH buforu do ponownego fałdowania. Jeśli cząstki nie zostaną wykryte przez DLS, należy sprawdzić stężenie białka i sprawdzić pH buforu. Końcowe stężenie białka dla DLS powinno wynosić co najmniej 100 μg/ml. Jeśli stężenie nie jest problemem, wskazuje na obfitość małych, nie do końca uformowanych cząstek, których stężenie można zmniejszyć poprzez obniżenie pH. Alternatywnie, stężenie chlorku sodu można dostosować do optymalnego zakresu, aby zminimalizować obecność cząstek o niepożądanej wielkości.
Wreszcie, stosując etap płukania izopropanolem podczas oczyszczania, byliśmy w stanie zmniejszyć zanieczyszczenie LPS od gospodarza E. coli do 0,01 EU/μg SAPN, co jest poniżej limitu Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) wynoszącego 5 EU/kg masy ciała dla produktów do wstrzykiwań28. Poziom ten można dodatkowo obniżyć, stosując kolumnę wymiany anionów, znaną również jako kolumna Q. Jeśli wysoki poziom endotoksyn jest nadal obecny, sprawdź wszystkie materiały, które zostały użyte do przygotowania buforu. Pamiętaj, aby w tej metodzie używać wyłącznie szkła odpylonego i wyrobów z tworzyw sztucznych wolnych od endotoksyn.
Wyniki te wskazują, że udało nam się opracować metodę wytwarzania rdzenia SHB-SAPN, który może być wykorzystany do przedklinicznych badań immunizacji. Metoda ta, z niewielkimi modyfikacjami, jeśli takie istnieją, może być stosowana do oczyszczania SHB-SAPN po dodaniu antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Przyjmując tę metodę jako punkt wyjścia, jedną z głównych zmian jest etap elucji. Różne białka eluują przy różnych stężeniach imidazolu, które należy określić doświadczalnie. Inną istotną różnicą może być skład bufora do ponownego składania. Optymalizacja wymagałaby przetestowania różnych warunków pH, a także siły jonowej.
Biorąc pod uwagę przyszłe prace, potrzebne są tylko dwie niewielkie modyfikacje, aby umożliwić stosowanie SHB-SAPN przez ludzi. Pierwszym z nich jest to, że wektor ekspresji musi zostać zmieniony na marker selektywny oporności na kanamycynę z powodu alergii na ampicylinę u ludzi29. Innym ważnym wymogiem związanym z produkcją białek stosowanych u ludzi jest wytwarzanie SHB-SAPN w pożywkach niezawierających produktów zwierzęcych. Już badanie przeprowadzone na małą skalę wykazało rozsądną wydajność białka w pożywce roślinnej. Przedstawione tutaj prace są łatwo skalowalne w celu uzyskania ostatecznej produkcji GMP, jak wykazano na przykładzie kandydata na szczepionkę przeciwko malarii, FMP01416. Ta produkcja FMP014-SAPN na dużą skalę obejmowała zarówno etap wymiany anionowej, jak i kationowej w celu dalszej redukcji zawartości LPS i Ni2+ w produkcie końcowym. Ten SAPN z ekspresją bakteryjną został już zwiększony na potrzeby zbliżającego się badania klinicznego fazy 1/2a.

Podczas gdy tradycyjne opracowywanie szczepionek skupiało się na inaktywowanych lub atenuowanych patogenach, nacisk nowoczesnych szczepionek przesunął się w kierunku szczepionek podjednostkowych1. Takie podejście może prowadzić do bardziej ukierunkowanej odpowiedzi i potencjalnie skuteczniejszych kandydatów na szczepionki. Jednak jedną z głównych wad jest to, że szczepionki podjednostkowe nie są cząstkami stałymi, jak całe organizmy, co może skutkować zmniejszoną immunogennością2. Nanocząstka jako powtarzalny system wyświetlania antygenu może przynieść korzyści zarówno z ukierunkowanego podejścia opartego na szczepionce podjednostkowej, jak i z charakteru cząstek stałych całego organizmu1,3.
Wśród istniejących typów nanoszczepionek, racjonalnie zaprojektowane zespoły białek pozwalają na projektowanie i rozwój kandydatów na szczepionki, które mogą prezentować wiele kopii antygenu, potencjalnie w natywnej konformacji1,4,5,6. Jednym z przykładów takich zespołów białkowych są samoorganizujące się nanocząstki białkowe (SAPN)7. SAPN są oparte na domenach zwiniętych cewek i są tradycyjnie wyrażane w Escherichia coli8. Kandydaci na szczepionki SAPN zostali opracowani dla różnych chorób, takich jak malaria, SARS, grypa, toksoplazmoza i HIV-19,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Konstrukcja każdego kandydata na SAPN jest specyficzna dla patogenu będącego przedmiotem zainteresowania, jednak techniki produkcji, oczyszczania i ponownego fałdowania mają na ogół szerokie zastosowanie.
Jednym z naszych obecnych zainteresowań jest skuteczna szczepionka przeciwko HIV-1. W RV144 – jedynym badaniu klinicznym III fazy szczepionki przeciwko HIV-1, które wykazało skromną skuteczność – zmniejszone ryzyko infekcji było skorelowane z przeciwciałami IgG przeciwko pętli V1V2 białka otoczki20,21. Uważa się, że natywna prezentacja trimeryczna tego regionu jest ważna dla ochronnej immunogenności22. Aby przedstawić pętlę V1V2 w konformacji jak najbardziej zbliżonej do natywnej, opracowaliśmy kandydata na szczepionkę SAPN typu proof of principle, który zawierał wiązkę sześciu helis (SHB) otoczki HIV-1 po fuzji, aby przedstawić pętlę V1V2 w prawidłowej konformacji9. Kandydat ten został rozpoznany na podstawie znanych przeciwciał monoklonalnych przeciwko białku otoczkowemu HIV-1. Myszy zaszczepione V1V2-SHB-SAPN wytworzyły przeciwciała specyficzne dla V1V2, które, co najważniejsze, wiązały się z gp70 V1V2, prawidłowymi epitopami konformacyjnymi9. Rdzeń SHB-SAPN może pełnić inne funkcje poza rolą nośnika pętli HIV-1 V1V2. Tutaj opisujemy szczegółową metodologię ekspresji, oczyszczania, ponownego składania i walidacji rdzenia SHB-SAPN. Selekcja sekwencji, projektowanie nanocząstek, klonowanie molekularne i transformacja E. coli zostały wcześniej opisane9.

<table><tbody><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>BioRad</td><td>1610732</td><td>1 L</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>BioRad</td><td>1610710</td><td>25 ml</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher</td><td>BP26181</td><td>4 L</td></tr><tr><td>2x Laemmli Bufor do próbek</td><td>BioRad</td><td>1610737</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>40ul Kuwet 100 sztuk z korkami</td><td>Malvern Panalytical</td><td>ZEN0040</td><td>opakowanie</td></tr> <tr><td>100 szt.4&ndash; 20% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 10-dołkowe, 30 i mikro; l</td><td>BioRad</td><td>4561093</td><td>10 sztuk</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-6X His tag [HIS. H8]</td> <td>AbCam</td><td>ab18184</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>anty-HIV-1 gp41 Monoklonalny (167-D IV)</td> <td>Repozytorium odczynników AIDS</td><td>11681</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>BCIP/NBT Substrate, roztwór</td><td>Southern Biotech</td><td>0302-01 &nbsp;</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Jednorazowe systemy filtrów próżniowych / przechowywania</td><td>Fisher</td><td>09-761-108</td><td>Różne rozmiary</td></tr><tr><td>Siatka Formvar / Carbon 400, Miedź ok. Rozmiar otworu siatki: 42 i mikro; m</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>01754-F</td><td>25 sztuk</td></tr><tr><td>GE Healthcare&nbsp; 5 ml HisTrap HP Paczkowane kolumny</td><td>GE HealthCare</td><td>45-000-325</td><td>5 sztuk</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Kozia IgG Przeciw Myszom H& L (fosfataza alkaliczna)</td><td>ABCam</td><td>ab97020</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Fisher</td><td>O3196-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Instant beztłuszczowe mleko w proszku</td> wysokiej <td>jakości biologiczne</td><td>A614-1003</td><td>10 sztuk</td></tr><tr><td>Kinetic-QCL Kinetyczny chormogenny test LAL</td><td>Lonza Walkersville</td><td>50650U</td><td>192 Zestaw testowy</td></tr><tr><td>LAL Odczynnik LAL Płytki wielodołkowe</td><td>Lonza Walkersville</td><td>25-340</td><td>1 talerz</td></tr><tr><td>Magic Media E. coli Expression Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>K6803</td><td>1 L</td></tr><tr><td>MilliporeSigma Millex Sterylna strzykawka 0,22 mm Filtry</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td>250 Opakowanie</td></tr><tr><td>Mysz Anti-Human IgG Fc-AP</td><td>Southern Biotech</td><td>9040-04 &nbsp;</td><td>1,0 ml</td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3) Chemicznie kompetentny E. coli</td><td>ThermoFisher</td><td>C601003</td><td>20 fiolek</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, rekombinowany ze znacznikiem Strep,</td> <td>BioRad</td><td>1610363</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer, 10K MWCO, 12 mL</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td>8</td>sztuk</tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td>2,5 kg</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Fisher</td><td>BP329-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris-(2-karboksetylo)fosfiny</td><td>Biosynth International</td><td>C-1818</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Octan uranylu, odczynnik, A.C.S</td><td>Usługi mikokopii elektronowej</td><td>541-09-3</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Fisher</td><td>BP169-500</td><td>2,5 kg</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna jakościowa Whatman</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA10010155</td><td>opakowanie 500</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>&nbsp; Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChromLab Software ver 4</td><td>Oprogramowanie BioRad</td><td>12009390</td><td></td></tr><tr><td>Epoch 2 Spektrofotometr mikropłytek</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2</td><td>Czytnik płytek</td></tr><tr><td>Fiberlite F14-14 x 50cy Rotor o stałym kącie nachylenia</td><td>ThermoFisher</td><td>096-145075</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Gel Documentation System</td><td>BioRad</td><td>1708270</td><td>Gel Imager do Żele bezplamiste</td></tr><tr><td>JEOL TEM</td><td>JEOL</td><td>1400</td><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td></tr><tr><td>Pionowe ogniwo elektroforetyczne Mini-PROTEAN Tetra do mini żeli prefabrykowanych</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td>Do uruchamiania żeli</td></tr><tr><td>NanoDrop One Mikroobjętość Spektrofotometr UV-Vis</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>do stężenia białka</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>Particle Wymiarowanie</td></tr><tr><td>Oprogramowanie NanoSight NTA NTA</td><td>Malvern Panalytical Particle</td><td></td><td>Sizing</td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0000</td><td>Inkubator/wytrząsarka</td></tr><tr><td>System chromatograficzny NGC Quest 10</td><td>BioRad</td><td>7880001</td><td>FPLC wspomagający oczyszczanie białek</td></tr><tr><td>System czyszczenia wyładowań PELCO easiGlow</td><td>Ted Pella, INC</td><td>91000S</td><td>Do czyszczenia kratek</td></tr><tr><td>Zasilacz uniwersalny PowerPac</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>Do uruchamiania żeli</td></tr><tr><td>Rocker Shaker</td><td>Daigger</td><td>EF5536A</td><td>Dla Western</td></tr><tr><td>Sonifer 450</td><td>Branson</td><td>znany również jako 096-145075&nbsp;</td><td>Sonifikacji</td></tr><tr><td>Wirówka Superspeed Thermo Scientific Sorvall LYNX 4000</td><td>Wirówka ThermoFisher</td><td>75-006-580</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Trans-Blot Turbo Mini Zestawy transferowe nitrocelulozy</td><td>BioRad</td><td>1704158</td><td>do systemu</td></tr><tr><td>Western Trans-Blot Turbo Transfer</td><td>BioRad</td><td>1704150</td><td>Dla Western</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Daigger</td><td>EF3030A</td><td>Vortex</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>Particle Sizing</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zetasizer</td><td>Malvern Panalytical Panalytical</td><td></td><td>Particle Sizing</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją e. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Samoorganizujące się nanocząstki białkowe (SAPN) funkcjonują jako powtarzalne wyświetlacze antygenów i mogą być wykorzystane do opracowania szerokiej gamy szczepionek na różne choroby zakaźne. W tym artykule przedstawiono metodę wytwarzania rdzenia SAPN zawierającego wiązkę sześciu helis (SHB), która jest zdolna do prezentowania antygenów w konformacji trimerycznej. Opisujemy ekspresję SHB-SAPN w układzie E. coli, a także niezbędne etapy oczyszczania białek. Uwzględniliśmy etap płukania izopropanolem w celu zmniejszenia pozostałości lipopolisacharydu bakteryjnego. Jako wskaźnik tożsamości i czystości białka, białko reagowało ze znanymi przeciwciałami monoklonalnymi w analizach Western blot. Po ponownym fałdowaniu wielkość cząstek spadła w oczekiwanym zakresie (od 20 do 100 nm), co zostało potwierdzone przez dynamiczne rozpraszanie światła, analizę śledzenia nanocząstek i transmisyjną mikroskopię elektronową. Opisana tutaj metodologia jest zoptymalizowana pod kątem SHB-SAPN, jednak z niewielkimi modyfikacjami może być stosowana do innych konstrukcji SAPN. Metodę tę można również łatwo zastosować w produkcji na dużą skalę w celu wytwarzania GMP dla szczepionek dla ludzi.

W pełni złożony SHB-SAPN pokazany tutaj został zbudowany na podstawie sekwencji białkowych (Rysunek 1A), których przewiduje się, że pofałdują się w cząsteczkę zawierającą 60 kopii monomeru (Rysunek 1B). Rysunek 2 przedstawia schemat metody produkcji, oczyszczania i identyfikacji rdzenia SHB-SAPN. Bakterie E. coli z zapasu w glicerolu, zawierającego wektor ekspresyjny pPep-T z sekwencją genu rdzenia SHB-SAPN, poddano indukcji w szczepie BL21 (DE3) E. coli. Komórki bakteryjne zostały pomyślnie wyhodowane i poddane lizie w warunkach denaturujących i redukujących.
Całkowity lizat komórkowy wykorzystano do oczyszczania monomerów SHB-SAPN za pomocą FPLC przy użyciu kolumny Ni2+ (Rycina 3A). Chromatogram FPLC wykazuje, że białko eluowało zarówno przy 150 mM, jak i 50 mM imidazolu (Rycina 3A). Chromatogram pokazuje również dwa inne piki przy całkowitej objętości 185 mL i 210 mL, odpowiadające odpowiednio płukaniu izopropanolem oraz płukaniu bez imidazolu. Frakcje oraz czystość białka rekombinowanego zidentyfikowano za pomocą żeli SDS-PAGE w gradiencie (Rycina 3B). Białko docelowe znajdowało się głównie w frakcjach 68‒79 (całkowita objętość 278‒30 mL). Frakcje te połączono do dalszych analiz. Western blot z użyciem przeciwciała anty-His (N-koniec) oraz przeciwciała 167-D-IV (C-koniec) wykazał, że połączone frakcje rzeczywiście zawierały białko docelowe (Rycina 4A,B). Analizy te wykazały również obecność multimerów SHB-SAPN. Wcześniejsze frakcje płukania i elucji miały tendencję do zawierania wyższego stężenia zmultimeryzowanego białka, dlatego zostały one odrzucone.
Próbki zawierające interesujące białkowe monomery zostały sfałdowane w całkowicie zmontowane SHB-SAPN poprzez dializę. Rozkład wielkości cząstek określono za pomocą DLS oraz analizy śledzenia nanocząstek (Rysunek 5A,B). Metoda DLS zidentyfikowała cząstki o średnicy hydrodynamicznej Z-average wynoszącej 67 nm, natomiast system NTA zmierzył średnią wielkość 81 nm. Niewielkie różnice w rozmiarach wynikały z zastosowanych technik pomiarowych, jednak wyniki z obu analiz mieściły się w oczekiwanym zakresie 20‒10 nm8,24,25. SHB-SAPNs zostały zwizualizowane za pomocą TEM, a uzyskane obrazy ukazały dobrze uformowane pojedyncze cząstki o rozkładzie wielkości zgodnym z wynikami otrzymanymi z obu technik pomiarowych (Rysunek 5C).
Podczas oczyszczania białka kolumnę przemyto izopropanolu w celu zmniejszenia zanieczyszczenia LPS w końcowym produkcie SHB-SAPN. Aby sprawdzić, czy poziom endotoksyn był dopuszczalny do immunizacji, stężenie LPS w próbkach SHB-SAPN oczyszczonych z i bez etapu płukania izopropanolem określono za pomocą kinetycznego testu LAL. Wyniki wykazały, że płukanie izopropanolem obniżyło poziom endotoksyn z &gt;0,25 EU/µg do 0,010 EU/µg białka SHB-SAPN (Tabela 1).
<img alt="Schemat sekwencji i struktury białka; dopasowanie sekwencji, analiza struktury cząsteczkowej, bioinformatyka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Sekwencja i struktura białka SHB-SAPN. (A) Sekwencja aminokwasowa monomeru SHB-SAPN. (B) Model komputerowy struktury w pełni zmontowanego rdzenia SHB-SAPN składającego się z 60 monomerów białkowych. Schemat kolorystyczny dla sekwencji aminokwasowych: szary = HisTag; zielony = pentamer; ciemnoniebieski = trimer zaprojektowany de novo; jasnoniebieski = wiązka sześciu helis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu oczyszczania białek bakteryjnych z etapami SDS-PAGE, Western blot oraz wizualizacji TEM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat blokowy protokół produkcji SHB-SAPNSchemat kolorystyczki: czarny = ekspresja monomeru białka w E. coli; Ciemnoszary = oczyszczanie monomeru; Średnioszary = identyfikacja monomeru; Jasnoszary = refolding i charakterystyka; Biały = w pełni zmontowany produkt SHB-SAPN. W krokach oznaczonych kolorem ciemnoszarym i średnioszarym białko znajduje się w warunkach denaturujących i redukujących. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Oczyszczanie białek metodą chromatografii: profil elucji i SDS-PAGE, analiza frakcji E150 i E50." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Oczyszczanie białka monomerów SHB-SAPN. (A) Chromatogram z oczyszczania metodą FPLC. Zielona linia nad chromatogramem wskazuje kolejne etapy oczyszczania. Niebieska linia na chromatogramie reprezentuje gęstość optyczną frakcji przy długości fali 280 nm. Czarna linia pokazuje procentową zawartość buforu B (8 M mocznik, 20 mM Tris, 50 mM wodorofosforan sodu, 5 mM TCEP, 50 mM imidazol, pH 8,5) wykorzystanego na każdym etapie oczyszczania. (B) Żele SDS-PAGE z połączonych frakcji lizatu (L), przepływu (FT), pierwszego przemywania (W1), przemywania izopropanolem (W2), trzeciego przemywania (W3) oraz poszczególnych frakcji z etapów elucji 150 mM imidazolem (E150) i 500 mM imidazolem (E50) procesu oczyszczania. Markery cząsteczkowe w pierwszej ścieżce (M) identyfikują prążki w zakresie od 10 do 250 kDa. Białko docelowe wskazano czarną strzałką. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki elektroforezy SDS-PAGE; prążki białkowe z markerami masy cząsteczkowej, wskazujące na rozdzielenie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Identyfikacja białka metodą western blot. Do wszystkich ścieżek naniesiono 10 ng białka.A) Wyniki western blotu z użyciem przeciwciał anty-6x HisTag. (B) Wyniki analizy western blot z użyciem przeciwciała monoklonalnego przeciwko HIV-1 167-D-IV. Oznaczenie ścieżek: M = marker masy cząsteczkowej; 1 = lizat; 2 = przeływ (flow through); 3 = pierwsze przemycie; 4 = przemycie izopropanolem (drugie przemycie); 5 = trzecie przemycie; 6 = połączone frakcje objętościowe 56‒61 (pierwszy piki elucji), 7 = połączone frakcje objętościowe 62‒67 (między dwoma pikami), 8 = połączone frakcje objętościowe 68‒78 (drugi pik elucji). Białko docelowe o oczekiwanej wielkości prążka 18,07 kDa, odpowiadające monomerowi SHB-SAPN, wskazano czarną strzałką. Dodatkowe prążki w ścieżkach 7 i 8 to dimery, trimery i multimery SHB-SAPN (czerwona strzałka). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres rozkładu wielkości nanocząsteczek, wykres intensywności w funkcji średnicy oraz obraz z mikroskopu elektronowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60103/60103fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Charakterystyka refoldowanego SHB-SAPN. (A). Rozkład wielkości cząstek wyznaczony metodą DLS. (B) Wielkość cząstek określona za pomocą (systemu) śledzenia nanocząstek. (C) Wizualizacja cząsteczek SHB-SAPN za pomocą TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60103/60103fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Próbka</td>
			<td>Endotoksyna (EU/ml)</td>
			<td>Endotoksyna (EU/µg białka)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAPN z przemywaniem izopropanolem</td>
			<td>2.02</td>
			<td>0.01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAPN bez przemywania izopropanolem</td>
			<td>&gt;50</td>
			<td>&gt;0.25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kontrola ujemna</td>
			<td>Poniżej poziomu wykrywalności</td>
			<td>N/D</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Poziomy endotoksyn w refoldowanych SHB-SAPN. Poziomy endotoksyn w próbkach SHB-SAPN oczyszczonych z przemywaniem izopropanolem lub bez, przedstawione zarówno jako jednostki endotoksyn/mL, jak i jednostki endotoksyn/µg białka SHB-SAPN.

Szczegółowa metoda jest tutaj opisana jako oczyszczanie, ponowne fałdowanie i charakterystyka samoorganizujących się nanocząstek białkowych (SAPN) do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek.

Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Samoorganizujące się nanocząstki białkowe (SAPN) mogą być wykorzystywane do opracowywania szczepionek przeciwko różnym chorobom zakaźnym. Ta metoda, którą tutaj opisujemy, może być stosowana do oczyszczania, ponownego składania i charakteryzowania SAPN zawierających wiązkę sześciu helis. Ta nanocząstka może prezentować antygeny trimeryczne w konformacji podobnej do natywnej.Z niewielkimi modyfikacjami metoda ta może być stosowana do innych innowacyjnych konstruktów szczepionek SAPN. Co więcej, można go łatwo przenieść do produkcji na dużą skalę w celu przeprowadzenia badań klinicznych. Do lizy zebranych bakterii E. coli wykazujących ekspresję wiązki sześciu helis SAPN, należy użyć sondy o mocy wyjściowej 150 watów z czterema sekundami sonikacji i sześcioma sekundami odpoczynku, aby sonikować zawieszone osady bakteryjne w 40 mililitrach buforu wolnego od imidazolu na lodzie przez pięć minut.Odwirować lizat komórkowy w celu wytworzenia oczyszczonego supernatantu i przenieść supernatant do sterylnej kolby o pojemności 150 mililitrów. Następnie doprowadzić próbkę do końcowej objętości 100 mililitrów za pomocą świeżego buforu wolnego od imidazolu. Aby wyizolować interesujące Cię białko, otwórz oprogramowanie FPLC i kliknij opcję Nowa metoda.W menu Ustawienia metody otwórz menu rozwijane Pozycja kolumny i wybierz Port C1 3. Z menu rozwijanego Pokazane przez technikę wybierz opcję Powinowactwo. Z menu rozwijanego Typ kolumny wybierz Inne, HisTrap HP i i pięć mililitrów.Pojemniki Objętość kolumny i Ciśnienie zostaną automatycznie ustawione na odpowiednie wartości. Kliknij opcję Kontur metody i przeciągnij przyciski Równoważenie i Przykładowa aplikacja, trzy przyciski Mycie kolumn oraz przycisk Elution z menu kontekstowego Biblioteka faz obok strzałki przed zamknięciem menu Biblioteka faz. Kliknij opcję Równoważność i ustaw wartości wymienione w tabeli na Bufor początkowy B, 4%, Bufor końcowy B, 4% i Objętość kolumny, pięć.Kliknij pozycję Przykładowa aplikacja. W polu Sample Loading (Ładowanie próbki) kliknij przycisk radiowy Inject Sample on Column with Sample Pump (Wstrzykiwanie próbki do kolumny za pomocą pompy do próbki) i upewnij się, że pole obok opcji Use Flow Rate from Method Settings (Użyj natężenia przepływu z ustawień metody) jest zaznaczone w polu Sample Injection with System Pump (Wtryskiwanie próbki za pomocą pompy systemowej). Zmień wartość pola Wolumin na 100 mililitrów, a Schemat zbierania ułamków na Włącz.Usuń zaznaczenie pola Użyj rozmiaru frakcji w ustawieniach metody i zmień rozmiar frakcji na cztery mililitry. Kliknij pierwszy przycisk Column Wash (Mycie kolumny), ustaw wartości wymienione w tabeli na Początkowy bufor B, 4%, Końcowy bufor B, 4% i Objętość kolumny, 10. Kliknij pole Włącz schemat zbierania ułamków i usuń zaznaczenie opcji Użyj rozmiaru frakcji w ustawieniach metody.Zmień rozmiar frakcji na cztery mililitry i kliknij drugi przycisk Mycie kolumny. Ustaw wartości w tabeli na Bufor początkowy B, 0%, Bufor końcowy B, 0% i Objętość kolumny, pięć. Kliknij pole Włącz schemat zbierania ułamków i usuń zaznaczenie opcji Użyj rozmiaru frakcji w ustawieniach metody.Zmień rozmiar frakcji na cztery mililitry i kliknij trzeci przycisk Mycie kolumny. Ustaw wartości w tabeli na Bufor początkowy B, 0%, Bufor końcowy B, 0% i Objętość kolumny, 10. Kliknij przycisk Włącz schemat zbierania frakcji i odznacz pole Użyj rozmiaru frakcji w ustawieniach metody.Następnie zmień rozmiar frakcji na cztery mililitry. Kliknij przycisk Eliminacja i kliknij prawym przyciskiem myszy informacje w tabeli. W menu podręcznym kliknij przycisk Usuń krok i przeciągnij przycisk Gradient izokratyczny dwa razy na tabelę, tak aby pozostały dwa wpisy.Ustaw wartość pierwszego wpisu na Bufor początkowy B, 30%, Bufor końcowy B, 30% i Objętość kolumny, 10. Ustaw wartość drugiego wpisu na Bufor początkowy B, 100%, Bufor końcowy B, 100% i Wolumin kolumny, 10. Kliknij przycisk Włącz schemat zbierania frakcji i kliknij pole Użyj rozmiaru frakcji z ustawień metody.Następnie kliknij Zapisz jako i nazwij oczyszczanie pliku. Umieścić rurkę pompy A FPLC w buforze płuczącym niezawierającym imidazolu, a rurkę pompy B w 500-milimolowym buforze imidazolowym. Umieść rurkę pompy próbki w próbce o pojemności 100 mililitrów i uruchom program oczyszczania.Gdy potrzebne jest mycie 60% izopropanolem, wstrzymaj program, przesuń rurkę pompy A z mycia bez imidazolu do mycia 60% izopropanolu i uruchom ponownie program. Pod koniec prania ponownie wstrzymaj program, włóż rurkę pompy A z powrotem do bufora płuczącego bez imidazolu i uruchom ponownie program oczyszczania. Aby ocenić czystość oczyszczonego białka, najpierw połącz frakcje z przepływu, umyj jedną, umyj dwie i umyj trzy etapy w pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówkach.Następnie wymieszaj 15 mikrolitrów z każdej probówki z 15 mikrolitrami buforu 2X Laemmli w pojedynczych 0,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek i denaturuj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Pod koniec inkubacji ustawić urządzenie do biegania z żelem z trzema nieplamiącymi prefabrykowanymi żelami poliakrylamidowymi o zawartości od czterech do 20% w buforze do pracy Tris-Glycine SDS-PAGE. Załaduj osiem mikrolitrów markera masy cząsteczkowej do pierwszego dołka każdego żelu i 30 mikrolitrów zdenaturowanej próbki do pozostałych studzienek.Uruchom żele pod napięciem 200 woltów, aż przód barwnika dotknie dna żelu i krótko spłucz żele wodą dejonizowaną, a następnie natychmiast zobrazuj je za pomocą systemu obrazowania bez plam. Następnie zidentyfikuj frakcje, które zawierają prążki białkowe o odpowiedniej wielkości i połącz te frakcje. W przypadku ponownego składania wiązki sześciu helis SAPN dodaj od 10 do 20 mililitrów połączonego białka do kasety dializacyjnej o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów.Dializuj kasetę w ośmiomolowym moczniku, 20-milimolowym Tris, 5% glicerolu i pięciomilimolowym TCEP w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego ranka stopniowo zmniejszaj stężenie mocznika w buforze dializacyjnym o dwa mole co dwie godziny, aby powoli dializować mocznik z próbki. Gdy stężenie mocznika osiągnie dwa zęby molowe, przesuń aparat do dializy na cztery stopnie Celsjusza i dializa próbki do 120-milimolowego mocznika, 20-milimolowego Tris i 5% glicerolu przez noc, aby zakończyć ponowne składanie.Następnego ranka wyjmij ponownie złożone białko z kasety i przefiltruj sześciospiralny pęczek SAPN przez 0,22-mikrometrowy filtr strzykawkowy z polifluorku winylidenu. Aby zmierzyć średnią wielkość cząstek w wiązce sześciu helis SAPN, dodaj 45 mikrolitrów wiązki sześciu helis SAPN do jednorazowej kuwety i umieść kuwetę w maszynie DLS. Następnie utwórz nowy plik pomiarowy i uruchom wstępnie napisaną standardową procedurę operacyjną dla białka w 120-milimolowym moczniku, 20-milimolowym Tris i 5% buforze glicerolowym w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Następnie rozpocznij pomiar. Średni rozmiar Z, PDI i wyniki rozkładu zostaną obliczone dla każdego przebiegu. Maszyna odczyta próbkę pięć razy.Ta w pełni zmontowana wiązka sześciu helis SAPN jest zbudowana na sekwencjach białek, które zgodnie z przewidywaniami składają się w cząstkę zawierającą 60 kopii monomeru. Całkowity lizat komórkowy użyto do oczyszczenia monomerów SAPN z sześcioma helisami za pomocą FPLC przy użyciu kolumny niklowej, wykazując, że białko eluuje się zarówno przy 150, jak i 500-milimolowym imidazolu. Chromatogram pokazuje również dwa inne piki przy całkowitej objętości 185 i 210 mililitrów, odpowiadające odpowiednio płukaniu izopropanolem i płukaniu bez imidazolu.Frakcje i czystość rekombinowanego białka można zidentyfikować za pomocą gradientowych żeli SDS-PAGE, w których białko będące przedmiotem zainteresowania znajduje się głównie we frakcji od 68 do 79. Analiza Western blot z przeciwciałami anty-His i anty-167D4 wykazała, że zebrane frakcje były rzeczywiście białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Bloty wykazały również obecność multimerów SAPN z sześcioma helisami wiązkowymi.Próbki, które zawierały interesujące monomery białkowe, zostały złożone w pełni zmontowaną wiązkę sześciu helis SAPN za pomocą dializy, a rozkład wielkości cząstek określono za pomocą DLS i analizy śledzenia nanocząstek. Wizualizacja za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej ujawniła dobrze uformowane pojedyncze cząstki SAPN z sześcioma helisami o rozkładzie wielkości uzyskanym za pomocą dwóch technik wymiarowania cząstek. Najważniejszym krokiem w tym protokole jest ponowne złożenie wiązki sześciu helis SAPN.Niezbędne jest prawidłowe pH i siła jonowa buforu do ponownego fałdowania. Stosując mycie izopropanolem podczas oczyszczania, udało nam się zredukować zanieczyszczenie LPS do bardzo niskiego poziomu. Jednak LPS można w razie potrzeby jeszcze bardziej zredukować za pomocą kolumny anionowymiennej.Technologia ta może być łatwo dostosowana do stosowania przez ludzi. SAPN z ekspresją bakteryjną został już rozszerzony na potrzeby zbliżającego się badania klinicznego fazy 1/2a dotyczącego malarii.

production-e-coli-expressed-self-assembling-protein-nanoparticles-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje metodę generowania szczepionek przeciwko pęcherzykom błony zewnętrznej (OMV) wyświetlającym wiele wartości. Komórki ssaków są transfekowane w celu ekspresji i wydzielania antygenów wirusowych połączonych ze znacznikiem SpyTag i znacznikiem polihistydyny. Antygeny te są następnie oczyszczane przy użyciu kolumny powinowactwa do kwasu niklowo-nitrylotryoctowego (Ni-NTA). Oczyszczony antygen miesza się z pęcherzykami błony zewnętrznej wykazującymi ekspresję powierzchniowego...

Wytwarzanie wielowalentnej szczepionki pęcherzykowej z błoną zewnętrzną

Ten film pokazuje produkcję szczepionek przeciwnowotworowych z nanoemulsją. Stabilne zbiorniki ropy naftowej przenoszące syntetyczne peptydy i adiuwanty są wytwarzane z niskoenergetycznej nanoemulsji, co stanowi znaczącą nadzieję w immunoterapii nowotworów.

Przygotowanie szczepionki z adiuwantem w postaci nanoemulsji

Ten film demonstruje metodę generowania kandydata na szczepionkę mRNA przy użyciu nanocząsteczek polimerowych. Polimer kationowy oddziałuje z ujemnie naładowanym mRNA, tworząc polipleksy. Tworzenie polipleksów stabilizuje mRNA, co czyni je potencjalnym kandydatem na przyszłe szczepionki mRNA w zastosowaniach immunoterapeutycznych.

Formułowanie nanocząstek obciążonych mRNA do celów szczepień

Ten film prezentuje oczyszczanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych lub SAPN oznaczonych histydyną za pomocą chromatografii cieczowej o powinowactwie. Uzyskane w ten sposób oczyszczone frakcje SAPN nadają się do opracowania szczepionek, co daje nadzieję na potencjalne zastosowania immunoterapeutyczne.

Oczyszczanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych za pomocą chromatografii powinowactwa

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Rozszerzenie kodu genetycznego jest stosowane do wprowadzenia nienaturalnego aminokwasu posiadającego biorthogonalną grupę funkcyjną na białku nośnikowym w określonym miejscu. Funkcja biortogalna jest dalej wykorzystywana do selektywnego sprzęgania antygenu węglowodanowego w celu uzyskania jednorodnej szczepionki skoniugowanej glikokoniugatem.

Jednorodny glikokoniugat wytwarzany przez połączenie nienaturalnej inkorporacji aminokwasów i chemii kliknięć do celów szczepionkowych

Tutaj przedstawiono prosty protokół produkcji nanocząsteczek mRNA opartych na polimerach poli(beta aminoestrowych), który można łatwo dostosować poprzez zmianę kapsułkowanego mRNA. Opisano również przebieg syntezy polimerów, nanocząstek oraz ich niezbędną charakterystykę in vitro. Dodano również dowód słuszności koncepcji dotyczący szczepień.

Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

Ten protokół opisuje użycie komercyjnych, bezkomórkowych zestawów do ekspresji białek do produkcji białek błonowych opartych na nanodyskach, które mogą być używane jako antygeny w szczepionkach podjednostkowych.

Bezkomórkowa produkcja skalowana i adiuwantowe dodawanie do rekombinowanego głównego białka błony zewnętrznej z Chlamydia muridarum w celu opracowania szczepionki

Obecny protokół opisuje bioinżynierię pęcherzyków błony zewnętrznej jako platformę szczepionki typu "Plug-and-Display", obejmującą produkcję, oczyszczanie, biokoniugację i charakterystykę.

Platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu "plug-and-display" oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2

Tutaj prezentujemy szczegółowe metody przygotowania i oceny nosowej samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsji in vitro i in vivo.

Przygotowanie, charakterystyka, toksyczność i skuteczność oceny samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsją do nosa in vitro i in vivo

Poznaj metodę oczyszczania i refoldingu samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek z epitopami trymerycznymi. Technika FPLC i dializa umożliwiają uzyskanie natywnych konformacji białek.

Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

Przeglądaj więcej filmów