Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

Samoorganizujące się nanocząstki białkowe (SAPN) mogą być wykorzystywane do opracowywania szczepionek przeciwko różnym chorobom zakaźnym. Ta metoda, którą tutaj opisujemy, może być stosowana do oczyszczania, ponownego składania i charakteryzowania SAPN zawierających wiązkę sześciu helis. Ta nanocząstka może prezentować antygeny trimeryczne w konformacji podobnej do natywnej.

Z niewielkimi modyfikacjami metoda ta może być stosowana do innych innowacyjnych konstruktów szczepionek SAPN. Co więcej, można go łatwo przenieść do produkcji na dużą skalę w celu przeprowadzenia badań klinicznych. Do lizy zebranych bakterii E. coli wykazujących ekspresję wiązki sześciu helis SAPN, należy użyć sondy o mocy wyjściowej 150 watów z czterema sekundami sonikacji i sześcioma sekundami odpoczynku, aby sonikować zawieszone osady bakteryjne w 40 mililitrach buforu wolnego od imidazolu na lodzie przez pięć minut.

Odwirować lizat komórkowy w celu wytworzenia oczyszczonego supernatantu i przenieść supernatant do sterylnej kolby o pojemności 150 mililitrów. Następnie doprowadzić próbkę do końcowej objętości 100 mililitrów za pomocą świeżego buforu wolnego od imidazolu. Aby wyizolować interesujące Cię białko, otwórz oprogramowanie FPLC i kliknij opcję Nowa metoda.

W menu Ustawienia metody otwórz menu rozwijane Pozycja kolumny i wybierz Port C1 3. Z menu rozwijanego Pokazane przez technikę wybierz opcję Powinowactwo. Z menu rozwijanego Typ kolumny wybierz Inne, HisTrap HP i i pięć mililitrów.

Pojemniki Objętość kolumny i Ciśnienie zostaną automatycznie ustawione na odpowiednie wartości. Kliknij opcję Kontur metody i przeciągnij przyciski Równoważenie i Przykładowa aplikacja, trzy przyciski Mycie kolumn oraz przycisk Elution z menu kontekstowego Biblioteka faz obok strzałki przed zamknięciem menu Biblioteka faz. Kliknij opcję Równoważność i ustaw wartości wymienione w tabeli na Bufor początkowy B, 4%, Bufor końcowy B, 4% i Objętość kolumny, pięć.

Kliknij pozycję Przykładowa aplikacja. W polu Sample Loading (Ładowanie próbki) kliknij przycisk radiowy Inject Sample on Column with Sample Pump (Wstrzykiwanie próbki do kolumny za pomocą pompy do próbki) i upewnij się, że pole obok opcji Use Flow Rate from Method Settings (Użyj natężenia przepływu z ustawień metody) jest zaznaczone w polu Sample Injection with System Pump (Wtryskiwanie próbki za pomocą pompy systemowej). Zmień wartość pola Wolumin na 100 mililitrów, a Schemat zbierania ułamków na Włącz.

Usuń zaznaczenie pola Użyj rozmiaru frakcji w ustawieniach metody i zmień rozmiar frakcji na cztery mililitry. Kliknij pierwszy przycisk Column Wash (Mycie kolumny), ustaw wartości wymienione w tabeli na Początkowy bufor B, 4%, Końcowy bufor B, 4% i Objętość kolumny, 10. Kliknij pole Włącz schemat zbierania ułamków i usuń zaznaczenie opcji Użyj rozmiaru frakcji w ustawieniach metody.

Zmień rozmiar frakcji na cztery mililitry i kliknij drugi przycisk Mycie kolumny. Ustaw wartości w tabeli na Bufor początkowy B, 0%, Bufor końcowy B, 0% i Objętość kolumny, pięć. Kliknij pole Włącz schemat zbierania ułamków i usuń zaznaczenie opcji Użyj rozmiaru frakcji w ustawieniach metody.

Zmień rozmiar frakcji na cztery mililitry i kliknij trzeci przycisk Mycie kolumny. Ustaw wartości w tabeli na Bufor początkowy B, 0%, Bufor końcowy B, 0% i Objętość kolumny, 10. Kliknij przycisk Włącz schemat zbierania frakcji i odznacz pole Użyj rozmiaru frakcji w ustawieniach metody.

Następnie zmień rozmiar frakcji na cztery mililitry. Kliknij przycisk Eliminacja i kliknij prawym przyciskiem myszy informacje w tabeli. W menu podręcznym kliknij przycisk Usuń krok i przeciągnij przycisk Gradient izokratyczny dwa razy na tabelę, tak aby pozostały dwa wpisy.

Ustaw wartość pierwszego wpisu na Bufor początkowy B, 30%, Bufor końcowy B, 30% i Objętość kolumny, 10. Ustaw wartość drugiego wpisu na Bufor początkowy B, 100%, Bufor końcowy B, 100% i Wolumin kolumny, 10. Kliknij przycisk Włącz schemat zbierania frakcji i kliknij pole Użyj rozmiaru frakcji z ustawień metody.

Następnie kliknij Zapisz jako i nazwij oczyszczanie pliku. Umieścić rurkę pompy A FPLC w buforze płuczącym niezawierającym imidazolu, a rurkę pompy B w 500-milimolowym buforze imidazolowym. Umieść rurkę pompy próbki w próbce o pojemności 100 mililitrów i uruchom program oczyszczania.

Gdy potrzebne jest mycie 60% izopropanolem, wstrzymaj program, przesuń rurkę pompy A z mycia bez imidazolu do mycia 60% izopropanolu i uruchom ponownie program. Pod koniec prania ponownie wstrzymaj program, włóż rurkę pompy A z powrotem do bufora płuczącego bez imidazolu i uruchom ponownie program oczyszczania. Aby ocenić czystość oczyszczonego białka, najpierw połącz frakcje z przepływu, umyj jedną, umyj dwie i umyj trzy etapy w pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówkach.

Następnie wymieszaj 15 mikrolitrów z każdej probówki z 15 mikrolitrami buforu 2X Laemmli w pojedynczych 0,5-mililitrowych probówkach do mikrowirówek i denaturuj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 10 minut. Pod koniec inkubacji ustawić urządzenie do biegania z żelem z trzema nieplamiącymi prefabrykowanymi żelami poliakrylamidowymi o zawartości od czterech do 20% w buforze do pracy Tris-Glycine SDS-PAGE. Załaduj osiem mikrolitrów markera masy cząsteczkowej do pierwszego dołka każdego żelu i 30 mikrolitrów zdenaturowanej próbki do pozostałych studzienek.

Uruchom żele pod napięciem 200 woltów, aż przód barwnika dotknie dna żelu i krótko spłucz żele wodą dejonizowaną, a następnie natychmiast zobrazuj je za pomocą systemu obrazowania bez plam. Następnie zidentyfikuj frakcje, które zawierają prążki białkowe o odpowiedniej wielkości i połącz te frakcje. W przypadku ponownego składania wiązki sześciu helis SAPN dodaj od 10 do 20 mililitrów połączonego białka do kasety dializacyjnej o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów.

Dializuj kasetę w ośmiomolowym moczniku, 20-milimolowym Tris, 5% glicerolu i pięciomilimolowym TCEP w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego ranka stopniowo zmniejszaj stężenie mocznika w buforze dializacyjnym o dwa mole co dwie godziny, aby powoli dializować mocznik z próbki. Gdy stężenie mocznika osiągnie dwa zęby molowe, przesuń aparat do dializy na cztery stopnie Celsjusza i dializa próbki do 120-milimolowego mocznika, 20-milimolowego Tris i 5% glicerolu przez noc, aby zakończyć ponowne składanie.

Następnego ranka wyjmij ponownie złożone białko z kasety i przefiltruj sześciospiralny pęczek SAPN przez 0,22-mikrometrowy filtr strzykawkowy z polifluorku winylidenu. Aby zmierzyć średnią wielkość cząstek w wiązce sześciu helis SAPN, dodaj 45 mikrolitrów wiązki sześciu helis SAPN do jednorazowej kuwety i umieść kuwetę w maszynie DLS. Następnie utwórz nowy plik pomiarowy i uruchom wstępnie napisaną standardową procedurę operacyjną dla białka w 120-milimolowym moczniku, 20-milimolowym Tris i 5% buforze glicerolowym w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Następnie rozpocznij pomiar. Średni rozmiar Z, PDI i wyniki rozkładu zostaną obliczone dla każdego przebiegu. Maszyna odczyta próbkę pięć razy.

Ta w pełni zmontowana wiązka sześciu helis SAPN jest zbudowana na sekwencjach białek, które zgodnie z przewidywaniami składają się w cząstkę zawierającą 60 kopii monomeru. Całkowity lizat komórkowy użyto do oczyszczenia monomerów SAPN z sześcioma helisami za pomocą FPLC przy użyciu kolumny niklowej, wykazując, że białko eluuje się zarówno przy 150, jak i 500-milimolowym imidazolu. Chromatogram pokazuje również dwa inne piki przy całkowitej objętości 185 i 210 mililitrów, odpowiadające odpowiednio płukaniu izopropanolem i płukaniu bez imidazolu.

Frakcje i czystość rekombinowanego białka można zidentyfikować za pomocą gradientowych żeli SDS-PAGE, w których białko będące przedmiotem zainteresowania znajduje się głównie we frakcji od 68 do 79. Analiza Western blot z przeciwciałami anty-His i anty-167D4 wykazała, że zebrane frakcje były rzeczywiście białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Bloty wykazały również obecność multimerów SAPN z sześcioma helisami wiązkowymi.

Próbki, które zawierały interesujące monomery białkowe, zostały złożone w pełni zmontowaną wiązkę sześciu helis SAPN za pomocą dializy, a rozkład wielkości cząstek określono za pomocą DLS i analizy śledzenia nanocząstek. Wizualizacja za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej ujawniła dobrze uformowane pojedyncze cząstki SAPN z sześcioma helisami o rozkładzie wielkości uzyskanym za pomocą dwóch technik wymiarowania cząstek. Najważniejszym krokiem w tym protokole jest ponowne złożenie wiązki sześciu helis SAPN.

Niezbędne jest prawidłowe pH i siła jonowa buforu do ponownego fałdowania. Stosując mycie izopropanolem podczas oczyszczania, udało nam się zredukować zanieczyszczenie LPS do bardzo niskiego poziomu. Jednak LPS można w razie potrzeby jeszcze bardziej zredukować za pomocą kolumny anionowymiennej.

Technologia ta może być łatwo dostosowana do stosowania przez ludzi. SAPN z ekspresją bakteryjną został już rozszerzony na potrzeby zbliżającego się badania klinicznego fazy 1/2a dotyczącego malarii.