Analiza N-glikanu immunoglobuliny G metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej

Ultra-sprawna chromatografia cieczowa jest uznaną technologią dokładnej analizy n-glikanu IgG Ze względu na swoją czułość wydaje się być i ma zdolność do dostarczania określonych informacji o glikanie Ta metoda jest łatwa w użyciu i ma wiele różnych stosunkowo niskich kosztów przyrostów, wysoką odtwarzalność Zdolność do izomerów glikanów. Pomiary białka w osoczu mogą być atrakcyjne. w medycynie.

również związane z IgG w bazie glikozy i takie i biologiczne zawierające populację. Wiesz, że stan zanieczyszczony służy do badania IgG w glikanach. W rzeczywistości może testować n-glikany białka.

Jest to potrzebne w białku związanym krzyżowo w stanie czystym, które można zastosować do białka Proces eksperymentalny OR jest stosunkowo prosty, podczas gdy proces eksperymentalny musi być ustandaryzowany. Kompleksowy proces eksperymentalny trwa trzy dni, a kroki eksperymentalne muszą zostać zapamiętane, aby opanować umiejętności eksperymentalne. Aby przygotować próbki, rozmrozić zamrożoną próbkę osocza.

Następnie odwirować w temperaturze 80 razy G przez 10 minut. Pozostaw monolityczną płytkę z białkiem G w temperaturze pokojowej na 30 minut. Przenieść 100 mikrometrów próbki do każdego dołka dwumililitrowej płytki zbiorczej.

Dodaj ultra czystą wodę jako jedną próbkę kontrolną. Rozcieńczyć próbki jednym X PBS w stosunku objętościowym od jednego do siedmiu. Wyczyść hydrofilową płytę filtracyjną z polipropolu o grubości 0,45 mikrona za pomocą 200 mikrolitrów ultra czystej wody.

Powtórz czyszczenie jeszcze dwa razy. Przenieść rozcieńczone próbki na płytkę filtracyjną i przefiltrować próbki do płytki zbiorczej za pomocą pompy próżniowej o ciśnieniu od 266,6 do 399,9 paskali. Aby przygotować monolityczne płytki z białkiem G, najpierw wyrzuć bufor do przechowywania.

Wyczyść monolityczne płytki kolejno dwoma mililitrami ultra czystej wody, dwoma mililitrami jednego X PBS, jednym mililitrem 0,17 molowego kwasu mrówkowego, dwoma mililitrami 10 X PBS i dwoma mililitrami jednego X PBS. Usuń następujący płyn za pomocą pompy próżniowej. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść przefiltrowane próbki na monolityczną płytkę białka G w celu wiązania IgG i oczyszczenia.

Następnie dodaj dwa mililitry jednego X PBS, aby wyczyścić monolityczne płytki. Usuń PBS za pomocą pompy próżniowej i powtórz czyszczenie jeszcze dwa razy. Zilustrować IgG jednym mililitrem 0,17 molowego kwasu mrówkowego i przefiltrować próbki do płytki zbiorczej za pomocą pompy próżniowej.

Następnie dodaj 170 mikrolitrów jednego molowego wodorowęglanu amonu do płytki zbiorczej. Wykryj stężenie IgG za pomocą spektrofetometru absorpcyjnego o optymalnej długości fali 280 nanometrów. Wyekstrahowaną IgG umieść w piekarniku do wyschnięcia w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Określ ilość, którą należy obserwować, zgodnie z jego stężeniem opisanym w manuskrypcie i zachowaj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zbierz wysuszone IgG i przechowuj chemikalia, w tym 1,33% SDS, cztery procent IgePal i 5% PBS w temperaturze pokojowej. Przygotuj enzym indoglikozydazy F, rozcieńczając 250 jednostek enzymu 250 mikrolitrami ultra czystej wody.

Aby zdenaturować IgG, dodaj 30 mikrolitrów 1,33% SDS i wymieszaj przez wirowanie. Przenieść próbkę do pieca o temperaturze 65 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie wyjmij go z piekarnika i pozwól mu ostygnąć przez 15 minut.

Dodaj 10 mikrolitrów czteroprocentowego IgePal do tej samej próbki i umieść ją w inkubatorze z wytrząsaniem na pięć minut. Dodaj 20 mikrolitrów pięciu X PBS i 30 do 35 mikrolitrów 0,1 molowego wodorotlenku sodu, aby wyregulować pH do 8,0 i wymieszać przez wirowanie. Dodaj cztery mikrolitry enzymu endoglikozydazy F i wymieszaj przez wirowanie.

Następnie inkubuj przez 18 do 20 godzin w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia umieść uwolnione gylany w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza do wyschnięcia przez dwie i pół do trzech godzin. Zachowaj uwalniające się likany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego pomiaru.

Przygotuj odczynnik do znakowania dwóch aminobenzimidów z 24,5 mikrolitrami DMSO, 10,5 mikrolitrami kwasu octowego, 0,7 miligrama dwóch aminobenzimidów i sześcioma miligramami cyjanoborowodorku sodu. Następnie w ciemnym pomieszczeniu oznacz glikany, dodając 35 mikrolitrów dwóch odczynników do znakowania aminobenzimidów. Przenieś oznaczone glcany do oscylatora na pięć minut, a następnie przenieś je do piekarnika na trzy godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Następnie przenieś go do temperatury pokojowej na 30 minut. N-glikaza IgG, oznaczymy ją w celu wykrycia przez fluorescencyjną detekcję stanu zanieczyszczonego. Wstępnie potraktuj płytkę filtracyjną GHP o grubości 0,2 mikrona 200 mikrolitrami 70% etanolu, 200 mikrolitrami ultra czystej wody i 200 mikrolitrami 96% nitrylu acetonowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie usuń odpady za pomocą pompy próżniowej. Aby oczyścić dwa glikany znakowane aminobenzimidem, dodaj 700 mikrolitrów 100% acetonitrylu do próbki i przenieś ją do inkubatora z wytrząsaniem na pięć minut. Wirować w temperaturze 134 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieść supernatent na płytkę filtracyjną GHP o grubości 0,2 mikrona na dwie minuty i usunąć filtrat za pomocą próżni. Przemyć dwa glikany znakowane aminobenzimidem 200 mikrolitrami 96% acetonitrylu w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć filtrat za pomocą pompy próżniowej pięć do sześciu razy. Zilustrowaj dwa glikany znakowane aminobenzimidem trzema razy w 100 mikrolitrach ultra czystej wody.

Przenieś dwa glikany znakowane aminobenzimidem do piekarnika, aby wyschły w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzy i pół godziny. Zachowaj oznaczone n-glikany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego pomiaru. Najpierw otwórz oprogramowanie, aby sterować fazami mobilnymi.

Myć instrumenty UPLC 50% rozpuszczalnikiem B i 50% rozpuszczalnikiem C przy natężeniu przepływu 0,2 mililitra na minutę przez 30 minut. Następnie myć 25% rozpuszczalnikiem A i 75% rozpuszczalnikiem B przy natężeniu przepływu 0,2 mililitra na minutę przez 20 minut. Następnie dodaj natężenie przepływu 0,4 mililitra na minutę.

Rozpuść znakowane n-glikany w 25 mikrolitrach mieszaniny 100% acetonitrylu i ultra czystej wody w stosunku objętościowym dwa do jednego. Następnie odwirować przy 134 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i użyć suchej rury, aby załadować 10 mikrolitrów supernatentu do instrumentów UPLC. Oddziel oznakowane n-glikany przy natężeniu przepływu 0,4 mililitra na minutę z gradientem liniowym od 75% do 62% acetonitrylu przez 25 minut.

Następnie wykonaj przebieg analityczny za pomocą kolumny glikopeptydowej drabinki kalibracyjnej Dexteran na UPLC w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wykrywanie fluorescencji n-glikanów przy długości fal cytowania X i emisji odpowiednio 330 nanometrów i 420 nanometrów. Jak pokazano na tym rysunku, n-glikany IgG analizowano w 24 początkowych pikach glikanów IgG w oparciu o położenie piku i czas retencji.

Struktury n-glikanów są dostępne w 24 typach dzięki detekcji za pomocą spektrometrii mas. Aby ocenić powtarzalność i stabilność metody, próbka wzorcowa została sześciokrotnie przetestowana równolegle. Piki glikanów o stosunkowo niewielkich proporcjach wykazywały wysokie błędy pomiarowe przekraczające 10% współczynnika zmienności.

W kawałku i ważne jest tworzenie do ustalonej struktury n-glikanów IgG, szczególnie dla ustalenia końcowego Dlatego zamiast 3,3 IgG n-glikazy znalezionej w jest krytyczne znaczenie IgG. Wiadomo, że glikany z nich są różne. Dzięki postępom w prototomice glikanowej, połączonej w glikanach w celu zbadania informacji na ten temat, tak aby można go było wykorzystać jako potencjał do dzisiejszej diagnozy.

Po opracowaniu tej techniki zapewnia ona nowy sposób eksploracji