Name: Analiza N-glikanu immunoglobuliny G metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Poznaj metodę analizy N-glikanu IgG za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej. Technika ta oferuje wysoką czułość, powtarzalność i możliwość rozdziału izomerów glikanowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) oraz Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).

Wszystkie przedmioty zawarte w protokole zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Stołecznego Uniwersytetu Medycznego, Pekin, Chiny12. Na początku badania uzyskano pisemną świadomą zgodę od każdego uczestnika.
1. Izolacja IgG
<ol>
	<li>Przygotować substancje chemiczne, w tym bufor wiążący (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), bufor neutralizujący: 10x PBS (pH = 6,6-6,8), eluent: 0,1 M kwas mrówkowy (pH = 2,5), roztwór neutralizujący dla eluentu: 1 M wodorowęglan amonu, bufor magazynowany: 20% etanolu + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), roztwór czyszczący do białka G: 0,1 M NaOH + 30% propan-2-ol. 
UWAGA: Poziom pH ma kluczowe znaczenie w tym protokole. Elucja IgG wymaga bardzo niskiego pH i istnieje ryzyko utraty kwasów sjalowych w wyniku hydrolizy kwasów. Dlatego elucja następuje w ciągu kilku sekund, a pH jest szybko przywracane do neutralności, zachowując integralność IgG i kwasów sjalowych.</li>
	<li>Przygotować próbki: rozmrozić zamrożoną próbkę osocza, następnie odwirować przy 80 x g przez 10 minut i pozostawić monolityczną płytkę białka G i wyżej wymienione substancje chemiczne na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Przenieś próbkę o pojemności 100 μl (którą można użyć do wykrycia 2x, aby zapobiec pierwszemu niepowodzeniu) do płytki zbiorczej o pojemności 2 ml (tutaj w sumie sześć próbek wzorcowych, jedna próbka kontrolna [woda ultraczysta] i 89 próbek osocza zaprojektowano dla płytek 96-dołkowych i losowo przypisano do płytki).</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki 1 PBS w stosunku 1:7 (v/v).</li>
	<li>Wyczyść płytkę filtracyjną z hydrofilowego polipropylenu (GHP) o grubości 0,45 μm 200 μl ultraczystej wody (powtórz 2x).</li>
	<li>Przenieść rozcieńczone próbki na płytkę filtracyjną i przefiltrować próbki do płytki zbiorczej za pomocą pompy próżniowej (kontrolować podciśnienie na poziomie 266,6-399,9 Pa).</li>
	<li>Przygotowanie monolitycznych płytek z białkiem G
	<ol>
		<li>Wyrzuć bufor magazynu.</li>
		<li>Oczyść monolityczne płytki 2 ml ultraczystej wody, 2 ml 1x PBS, 1 ml 0,1 M kwasu mrówkowego, 2 ml 10x PBS, 2 ml 1x PBS (sekwencyjnie) i usuń przepływającą ciecz za pomocą pompy próżniowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltrowane próbki przenieść na monolityczną płytkę białka G w celu związania IgG i oczyszczenia, a następnie oczyścić monolityczne płytki 2 ml 1x PBS (powtórzyć czyszczenie 2x).</li>
	<li>Elutować IgG za pomocą 1 ml 0,1 M kwasu mrówkowego i przefiltrować próbki do płytki zbiorczej za pomocą pompy próżniowej, a następnie dodać 170 μl 1 M wodorowęglanu amonu do płytki zbiorczej.</li>
	<li>Wykryć stężenie IgG za pomocą spektrofotometru absorpcyjnego (optymalna długość fali = 280 nm).
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie i wybierz tryb białka-CY3.</li>
		<li>Pobierz 2 μl ultraczystej wody i załaduj ją na ekran, a następnie kliknij Puste w oprogramowaniu, aby wyczyścić ekran (powtórz 1x).</li>
		<li>Pobierz 2 μl ultraczystej wody i załaduj ją na ekran, a następnie kliknij Próbka w oprogramowaniu, aby wykryć ultraczystą wodę.</li>
		<li>Pobrać 2 μl próbki IgG i załadować ją na ekran, a następnie kliknąć Próbka w oprogramowaniu, aby wykryć próbkę.</li>
		<li>Pobierz 2 μl ultraczystej wody i załaduj ją na ekran, a następnie kliknij Puste w oprogramowaniu, aby wyczyścić ekran.</li>
		<li>Zamknij oprogramowanie. 
		UWAGA: Wzór na obliczenie stężenia IgG jest następujący: 
		 
		CIgG = absorbancja x współczynnik ekstynkcji (13,7) x 1 000 μg/ml</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyekstrahowaną IgG umieścić do wyschnięcia w suszarce w temperaturze 60 °C i przechowywać wyekstrahowaną IgG (300 μl wyekstrahowanej IgG przez 4 godziny).
	<ol>
		<li>Usunąć 300 μl wyekstrahowanej IgG, jeśli stężenie jest większe niż 1 000 μg/ml.</li>
		<li>Usunąć 350 μl wyekstrahowanej IgG, jeśli stężenie wynosi od 500 do 1 000 μg/ml.</li>
		<li>Usunąć 400 μl wyekstrahowanej IgG, jeśli stężenie mieści się w przedziale 200-500 μg/ml.</li>
		<li>Usunąć 600 μl wyekstrahowanej IgG, jeśli stężenie jest mniejsze niż 200 μg/ml. 
		UWAGA: Stężenie IgG powinno wynosić korzystnie >200 μg/ml w celu późniejszego wykrycia. Średnia ilość IgG powinna wynosić korzystnie >1 200 μg, którą można przebadać 2x w przypadku, gdy pierwszy test zakończy się niepowodzeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie monolitycznej płytki białkowej G do ponownego użycia
	<ol>
		<li>Umyj płytkę 2 ml ultraczystej wody, 1 ml 0,1 M NaOH (do usuwania wytrąconych białek), 4 ml ultraczystej wody i 4 ml 1x PBS (sekwencyjnie), a następnie usuń płynącą ciecz za pomocą pompy próżniowej.</li>
		<li>Umyj płytkę 2 ml ultraczystej wody, 2 ml 30% propan-2-olu (do usuwania związanych białek hydrofobowych), 2 ml ultraczystej wody i 4 ml 1x PBS (sekwencyjnie), a następnie usuń płynącą ciecz za pomocą pompy próżniowej.</li>
		<li>Przemyć płytkę 1 ml buforu (20% etanolu + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) i dodać 1 ml buforu (20% etanolu + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) do płytki, a następnie pozostawić płytkę w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Uwalnianie glikanów
<ol>
	<li>Przygotuj wysuszoną IgG i przechowuj chemikalia, w tym 1,33% SDS, 4% Igepal (przechowywać z dala od światła) i 5x PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj enzym PNGazy F, rozcieńczając enzym 250 U 250 μl ultraczystej wody.</li>
	<li>Denaturacja IgG
	<ol>
		<li>Dodać 30 μl 1,33% SDS i wymieszać przez wirowanie, przenieść próbkę do pieca o temperaturze 65 °C na 10 minut, następnie wyjąć ją z suszarki i odstawić na 15 minut.</li>
		<li>Dodać 10 μl 4% Igepal i umieścić go w inkubatorze do wytrząsania na 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie i uwalnianie glikanów
	<ol>
		<li>Dodaj 20 μl 5x PBS i 30-35 μl 0,1 mol/L NaOH, aby wyregulować pH 8,0 i wymieszaj przez wirowanie. Dodać 4 μl enzymu PNGazy F i wymieszać przez wirowanie. Następnie inkubować przez 18-20 godzin w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Uwolnione glikany pozostawić do wyschnięcia w piekarniku w temperaturze 60 °C na 2,5-3,0 h.</li>
		<li>Uwolnione glikany należy zachować w temperaturze -80 °C do czasu dalszego pomiaru. 
		UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie. Kluczem do uwalniania glikanów jest poprawa aktywności enzymu PNGazy F w celu maksymalizacji jego wydajności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Etykietowanie i oczyszczanie glikanów
<ol>
	<li>Przygotować odczynnik do znakowania 2-aminobenzamidu (2-AB) z 0,70 mg 2-AB, 10,50 μl kwasu octowego, 6 mg cyjanoborowodorku sodu (NaBH3CN) i 24,50 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) (całkowita objętość = 35 μL). Następnie dodaj kwas octowy, 2-AB i NaBH3CN do DMSO w kolejności.</li>
	<li>Oznaczyć glikany za pomocą 35 μl odczynnika do znakowania 2-AB, przenieść znakowane glikany do oscylatora na 5 minut, przenieść do pieca na 3 godziny w temperaturze 65 °C, a następnie przenieść do RT na 30 min. 
	UWAGA: Cały etap etykietowania glikanów musi być wykonany w warunkach ochrony przed światłem.</li>
	<li>Na płycie filtracyjnej o GHP 0,2 μm należy wstępnie potraktować 200 μl 70% etanolu, 200 μl ultraczystej wody i 200 μl 96% acetonitrylu (4 °C), a następnie usunąć odpady za pomocą pompy próżniowej.</li>
	<li>Oczyszczanie glikanu znakowanego 2-AB
	<ol>
		<li>Dodać 700 μl 100% acetonitrylu do glikanu znakowanego 2-AB i przenieść do inkubatora z wytrząsaniem na 5 minut.</li>
		<li>Wirować przy 134 x g przez 5 minut (4 °C).</li>
		<li>Przenieść próbkę na płytkę filtracyjną o GHP 0,2 μm na 2 minuty i usunąć filtrat (płynącą ciecz) za pomocą pompy próżniowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć glikan znakowany 2-AB 200 μl 96% acetonitrylu (4 °C) i usunąć filtrat (płynącą ciecz) za pomocą pompy próżniowej 5x-6x.</li>
	<li>Elute glikan znakowany 2-AB 100 μL ultraczystej wody 3x.</li>
	<li>Przenieś glikan oznaczony 2-AB do piekarnika do wyschnięcia w temperaturze 60 °C przez 3,5 godziny.</li>
	<li>Zachowaj oznakowane N-glikany w temperaturze -80 °C do czasu dalszego pomiaru.</li>
</ol>
4. Chromatografia oddziaływań hydrofilowych i analiza glikanów
<ol>
	<li>Kondycjonowanie instrumentów UPLC i przygotowanie faz ruchomych
	<ol>
		<li>Przygotuj fazy ruchome, w tym rozpuszczalnik A: 100 mM mrówczanu amonu (pH = 4,4), rozpuszczalnik B: 100% acetonitryl, rozpuszczalnik C: 90% ultraczysta woda (10% metanol) i rozpuszczalnik D: 50% metanolu (ultraczysta woda).</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie, aby sterować fazami ruchomymi.</li>
		<li>Myć instrumenty UPLC przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min (50% rozpuszczalnika B i 50% rozpuszczalnika C) równoważąc przez 30 minut, następnie przy natężeniu przepływu 0,2 ml/min (25% rozpuszczalnika A i 75% rozpuszczalnika B) równoważąc przez 20 minut, a następnie równoważąc natężenie przepływu 0,4 ml/min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuść znakowane N-glikany w 25 μl mieszaniny 100% acetonitrylu i ultraczystej wody w stosunku 2:1 (v/v). Następnie odwirować przy 134 × g przez 5 minut (4 °C) i załadować 10 μl znakowanych N-glikanów do przyrządów UPLC.</li>
	<li>Oddzielić znakowane N-glikany przy natężeniu przepływu 0,4 ml/min z gradientem liniowym od 75% do 62% acetonitrylu przez 25 minut. Następnie należy przeprowadzić analizę za pomocą drabinki kalibracyjnej dekstranu/kolumny glikopeptydowej na UPLC w temperaturze 60 °C (w tym przypadku próbki przechowywano w temperaturze 4 °C przed wstrzyknięciem).</li>
	<li>Wykrywanie fluorescencji N-glikanów przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 330 nm i 420 nm.</li>
	<li>Zintegruj glikany w oparciu o pozycję piku i czas retencji.</li>
	<li>Oblicz względną wartość każdego piku glikanu (GP) / wszystkich pików glikanu (GP) (procent, %) w następujący sposób: GP1: GP1 / GPs * 100, GP2: GP2 / GPs * 100, GP3: GP3 / GPs * 100 itd.</li>
</ol>

<ol><li>Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomics%2C+glycoproteomics+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycomics, glycoproteomics and the immune system.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).</li>
<li>Cummings, R., Pierce, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Challenge+and+Promise+of+Glycomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Biology%22%5BJournal%5D)">The Challenge and Promise of Glycomics.</a> Chemistry Biology. 21 (1), (2014).</li>
<li>Shade, K. T. C., Anthony, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Glycosylation+and+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Antibodies%22%5BJournal%5D)">Antibody Glycosylation and Inflammation.</a> Antibodies. 2, 392(2013).</li>
<li>Gudelj, I., Lauc, G., Pezer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G+glycosylation+in+aging+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G glycosylation in aging and diseases.</a> Cellular Immunology. 333, 65(2018).</li>
<li>Huffman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+performance+of+four+methods+for+high-throughput+glycosylation+analysis+of+immunoglobulin+G+in+genetic+and+epidemiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative performance of four methods for high-throughput glycosylation analysis of immunoglobulin G in genetic and epidemiological research.</a> Molecular Cellular Proteomics. 13, 1598(2014).</li>
<li>Stockmann, H., Adamczyk, B., Hayes, J., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+high-throughput+IgG-antibody+glycoprofiling+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated, high-throughput IgG-antibody glycoprofiling platform.</a> Analytical Chemistry. 85, 8841(2013).</li>
<li>Kristic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycans+are+a+novel+biomarker+of+chronological+and+biological+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glycans are a novel biomarker of chronological and biological ages.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences Medical Sciences. 69, 779(2014).</li>
<li>Nikolac, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+galactosylation+of+immunoglobulin+G+and+body+mass+index%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neuropsychopharmacology+Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The association between galactosylation of immunoglobulin G and body mass index.</a> Progress in Neuropsychopharmacology Biological Psychiatry. 48, 20(2014).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changes+of+immunoglobulin+G+N-glycosylation+in+blood+lipids+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The changes of immunoglobulin G N-glycosylation in blood lipids and dyslipidaemia.</a> Journal of Translational Medicine. 16, 235(2018).</li>
<li>Lemmers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+glycan+patterns+are+associated+with+type+2+diabetes+in+independent+European+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">IgG glycan patterns are associated with type 2 diabetes in independent European populations.</a> Biochimica Biophysica Acta General Subjects. 1861, 2240(2017).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+Between+Glycosylation+of+Immunoglobulin+G+and+Hypertension%3A+A+Multiple+Ethnic+Cross-Sectional+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">The Association Between Glycosylation of Immunoglobulin G and Hypertension: A Multiple Ethnic Cross-Sectional Study.</a> Medicine (Baltimore). 95, e3379(2016).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+is+associated+with+the+pro-inflammatory+potential+of+N-glycosylated+immunoglobulin+G%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke is associated with the pro-inflammatory potential of N-glycosylated immunoglobulin G.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 123(2018).</li>
<li>Russell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-glycosylation+of+immunoglobulin+G+as+a+novel+biomarker+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22GLYCOBIOLOGY%22%5BJournal%5D)">The N-glycosylation of immunoglobulin G as a novel biomarker of Parkinson's disease.</a> GLYCOBIOLOGY. 27, 501(2017).</li>
<li>Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+performance+liquid+chromatographic+profiling+of+serum+N-glycans+for+fast+and+efficient+identification+of+cancer+associated+alterations+in+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation.</a> Analytical Chemistry. 82, 10208(2010).</li>
<li>Pucic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+isolation+and+glycosylation+analysis+of+IgG-variability+and+heritability+of+the+IgG+glycome+in+three+isolated+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High throughput isolation and glycosylation analysis of IgG-variability and heritability of the IgG glycome in three isolated human populations.</a> Molecular Cellular Proteomics. 10, M111(2011).</li>
<li>Berruex, L. G., Freitag, R., Tennikova, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+antibody+binding+to+immobilized+group+specific+affinity+ligands+in+high+performance+monolith+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Comparison of antibody binding to immobilized group specific affinity ligands in high performance monolith affinity chromatography.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24, 95(2000).</li>
<li>Ren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+IgG+galactosylation+as+a+promising+biomarker+for+cancer+screening+in+multiple+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of IgG galactosylation as a promising biomarker for cancer screening in multiple cancer types.</a> Cell Research. 26, 963(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

UPLC służy jako względna metoda analizy ilościowej 5,15. Wyniki wskazują, że UPLC jest stabilną technologią detekcji o dobrej odtwarzalności i względnej dokładności ilościowej. Ilość glikanów w każdym piku jest wyrażona jako procent całkowitej powierzchni zintegrowanej za pomocą UPLC, który jest wartością względną. Względna kwantyfikacja poprawia porównywalność badanych próbek. Ponadto 96-dołkowe płytki białkowe G są używane do oczyszczania IgG za pomocą 96 próbe...

N-glikozylacja ludzkich białek jest powszechną i istotną modyfikacją potranslacyjną1 i może pomóc w stosunkowo dokładnym przewidywaniu występowania i rozwoju chorób. Ze względu na złożoność jego struktury, oczekuje się, że istnieje ponad 5 000 struktur glikanowych, co zapewnia ogromny potencjał jako biomarkery diagnostyczne i predykcyjne chorób2. Wykazano, że N-glikany przyłączone do immunoglobuliny G (IgG) są niezbędne dla funkcji IgG, a N-glikozylacja IgG uczestniczy w równowadze między układami pro- i przeciwzapalnymi3. Różnicowa N-glikozylacja IgG bierze udział w rozwoju i progresji choroby, stanowiąc zarówno predyspozycję, jak i mechanizm funkcjonalny związany z patologią choroby. Zapalna rola N-glikozylacji IgG jest związana ze starzeniem się, chorobami zapalnymi, chorobami autoimmunologicznymi i rakiem4.
Wraz z rozwojem technologii detekcji, następujące metody są najczęściej stosowane w glikomikach o wysokiej przepustowości: chromatografia hydrofilowa (HILIC), ultra-sprawna chromatografia cieczowa z detekcją fluorescencji (UPLC-FLR), multipleksowa kapilarna elektroforeza żelowa z detekcją fluorescencji indukowanej laserem (xCGE-LIF), spektrometria mas czasu przelotu wspomagana matrycą/jonizacją laserową (MALDI-TOF-MS) oraz chromatografia cieczowa elektrorozpylanie masy spektrometria (LC-ESI-MS). Metody te przezwyciężyły wcześniejsze niedociągnięcia związane z niskim strumieniem, niestabilnymi wynikami i słabą swoistością czułości5,6.
UPLC jest powszechnie używany do badania związku między N-glikozylacją IgG a niektórymi chorobami (np. starzeniem się7, otyłość8, dyslipidemia9, cukrzyca typu II10, nadciśnienie11, udar niedokrwienny12, oraz choroba Parkinsona13). W porównaniu z pozostałymi trzema wyżej wymienionymi metodami, UPLC ma następujące zalety5,14. Po pierwsze, zapewnia względną metodę analizy ilościowej, a analiza danych, która obejmuje normalizację całkowitego obszaru, poprawia porównywalność każdej próbki. Po drugie, koszt sprzętu i wymaganej wiedzy specjalistycznej jest stosunkowo niski, co ułatwia wdrażanie i przekształcanie biomarkerów glikozylacji w zastosowania kliniczne. Przedstawiono tutaj wprowadzenie do UPLC, dzięki czemu można go szerzej stosować.

<table><tbody><tr><td>2-aminobenzamid, 2-AB</td><td>Sigma, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka zbiorcza</td><td>AXYGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka filtracyjna</td><td>Pol</td><td>0,45 um GHP</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka monolityczna</td><td>BIA Separacje</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor płytkowy 96-dołkowy</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Niemcy</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mrówczan amonu</td><td>Beijing Minruida Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator / wahacz ze stałym wytrząsaniem</td><td>Zhicheng analytical instrument manufacturing co., Ltd, Chiny</td><td>ZWY-10313</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka kalibracyjna dekstranu / kolumna glikopeptydowa</td><td>Watts technology Co., Ltd, Chiny</td><td>Kolumna</td><td></td>BEH</tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td> <td>Sigma, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforan disodowy</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piekarniki elektryczne</td><td>Przyrządy do testowania Co., Ltd</td><td>202-2AB</td><td></td></tr><tr><td>Empower 3.0</td><td>Waters technology Co., Ltd, Ameryka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoProfile 2-AB Zestaw do etykietowania</td><td>Sigma, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Junrui Biotechnology Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka szybkoobrotowa</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Niemcy</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka niskotemperaturowa</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lodówka niskotemperaturowa</td><td>Qingdao Haier Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolektor 96-dołkowa</td><td>Technologia Watts Co., Ltd, Chiny</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miernik czystej wody Milli-Q</td><td>Millipore Co., Ltd, Ameryka</td><td>Przewaga A10</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tester pH</td><td>Sartorius Co., Ltd, Niemcy</td><td>PB-10</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Niemcy</td><td>4672100, 0,5-10&mu; l & 10-100&mu; l & 20-200&mu; l & 1000&mu; l</td><td></td></tr><tr><td>Enzym PNGazy F</td><td>Sigma, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td><td>sodu Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoborowodorek sodu (NaBH3CN)</td><td>Sigma, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd</td><td>B-500</td><td></td></tr><tr><td>Transfer płynny pistolet</td><td>Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, Chiny</td><td>4672100</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, Ameryka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lodówka niskotemperaturowa</td><td>Thermo Co., Ltd, Ameryka</td><td>MLT-1386-3-V; MDF-382E</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sprawna chromatografia cieczowa</td><td>Watts technology Co., Ltd, Chiny</td><td>Acquity MLtraPerformance LC</td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td><td>próżniowa Watts technology Co., Ltd, Chiny</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do ulatniania/suszarka</td><td>Eppendorf Co., Ltd, Niemcy</td><td>T_1087461900</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, Chiny</td><td>NP-30S</td><td></td></tr><tr>Przyrządy do <td>testowania kąpieli wodnej</td><td>Co., Ltd</td><td>DK-98-IIA</td><td></td></tr><tr><td>Waga ważąca</td><td>Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>Zobacz materiał MP200B</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza n-glikanu immunoglobuliny g metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics to nowa podspecjalizacja w badaniach nad systemami omicznymi, która oferuje znaczny potencjał w odkrywaniu biomarkerów nowej generacji dla podatności na choroby, odkrywania celów leków i medycyny precyzyjnej. Alternatywne N-glikany IgG zostały zgłoszone w kilku powszechnych chorobach przewlekłych i sugeruje się, że mają ogromny potencjał w zastosowaniach klinicznych (tj. biomarkery do diagnozowania i przewidywania chorób). N-glikany IgG są szeroko charakteryzowane przy użyciu metody chromatografii oddziaływań hydrofilowych (HILIC) i ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC). UPLC to stabilna technologia wykrywania o dobrej odtwarzalności i wysokiej względnej dokładności ilościowej. Ponadto struktura N-glikanu IgG jest wyraźnie oddzielona, a także scharakteryzowany jest skład glikanów i względna obfitość w osoczu.

Jak pokazano w Rycina 1, IgG Nglikany przeanalizowano, wyodrębniając 24 początkowe piki glikanów IgG (GP) na podstawie położenia piku i czasu retencji. Nstruktury glikanów są dostępne dzięki detekcji metodą spektrometrii mas zgodnie z poprzednim badaniem (Tabela 1)15Aby zapewnić porównywalność wyników, zastosowano normalizację do całkowitej powierzchni, w której ilość glikanów w każdym piku wyrażono j...

Immunoglobulina G (IgG) N-glikan jest scharakteryzowany za pomocą hydrofilowej chromatografii oddziaływań UPLC. Ponadto struktura N-glikanu IgG jest wyraźnie oddzielona. Przedstawiono tutaj wprowadzenie do tej metody eksperymentalnej, tak aby mogła być szeroko stosowana w warunkach badawczych.

Analiza N-glikanu immunoglobuliny G metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Ultra-sprawna chromatografia cieczowa jest uznaną technologią dokładnej analizy n-glikanu IgG Ze względu na swoją czułość wydaje się być i ma zdolność do dostarczania określonych informacji o glikanie Ta metoda jest łatwa w użyciu i ma wiele różnych stosunkowo niskich kosztów przyrostów, wysoką odtwarzalność Zdolność do izomerów glikanów. Pomiary białka w osoczu mogą być atrakcyjne. w medycynie.również związane z IgG w bazie glikozy i takie i biologiczne zawierające populację. Wiesz, że stan zanieczyszczony służy do badania IgG w glikanach. W rzeczywistości może testować n-glikany białka.Jest to potrzebne w białku związanym krzyżowo w stanie czystym, które można zastosować do białka Proces eksperymentalny OR jest stosunkowo prosty, podczas gdy proces eksperymentalny musi być ustandaryzowany. Kompleksowy proces eksperymentalny trwa trzy dni, a kroki eksperymentalne muszą zostać zapamiętane, aby opanować umiejętności eksperymentalne. Aby przygotować próbki, rozmrozić zamrożoną próbkę osocza.Następnie odwirować w temperaturze 80 razy G przez 10 minut. Pozostaw monolityczną płytkę z białkiem G w temperaturze pokojowej na 30 minut. Przenieść 100 mikrometrów próbki do każdego dołka dwumililitrowej płytki zbiorczej.Dodaj ultra czystą wodę jako jedną próbkę kontrolną. Rozcieńczyć próbki jednym X PBS w stosunku objętościowym od jednego do siedmiu. Wyczyść hydrofilową płytę filtracyjną z polipropolu o grubości 0,45 mikrona za pomocą 200 mikrolitrów ultra czystej wody.Powtórz czyszczenie jeszcze dwa razy. Przenieść rozcieńczone próbki na płytkę filtracyjną i przefiltrować próbki do płytki zbiorczej za pomocą pompy próżniowej o ciśnieniu od 266,6 do 399,9 paskali. Aby przygotować monolityczne płytki z białkiem G, najpierw wyrzuć bufor do przechowywania.Wyczyść monolityczne płytki kolejno dwoma mililitrami ultra czystej wody, dwoma mililitrami jednego X PBS, jednym mililitrem 0,17 molowego kwasu mrówkowego, dwoma mililitrami 10 X PBS i dwoma mililitrami jednego X PBS. Usuń następujący płyn za pomocą pompy próżniowej. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść przefiltrowane próbki na monolityczną płytkę białka G w celu wiązania IgG i oczyszczenia.Następnie dodaj dwa mililitry jednego X PBS, aby wyczyścić monolityczne płytki. Usuń PBS za pomocą pompy próżniowej i powtórz czyszczenie jeszcze dwa razy. Zilustrować IgG jednym mililitrem 0,17 molowego kwasu mrówkowego i przefiltrować próbki do płytki zbiorczej za pomocą pompy próżniowej.Następnie dodaj 170 mikrolitrów jednego molowego wodorowęglanu amonu do płytki zbiorczej. Wykryj stężenie IgG za pomocą spektrofetometru absorpcyjnego o optymalnej długości fali 280 nanometrów. Wyekstrahowaną IgG umieść w piekarniku do wyschnięcia w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzy godziny.Określ ilość, którą należy obserwować, zgodnie z jego stężeniem opisanym w manuskrypcie i zachowaj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zbierz wysuszone IgG i przechowuj chemikalia, w tym 1,33% SDS, cztery procent IgePal i 5% PBS w temperaturze pokojowej. Przygotuj enzym indoglikozydazy F, rozcieńczając 250 jednostek enzymu 250 mikrolitrami ultra czystej wody.Aby zdenaturować IgG, dodaj 30 mikrolitrów 1,33% SDS i wymieszaj przez wirowanie. Przenieść próbkę do pieca o temperaturze 65 stopni Celsjusza na 10 minut. Następnie wyjmij go z piekarnika i pozwól mu ostygnąć przez 15 minut.Dodaj 10 mikrolitrów czteroprocentowego IgePal do tej samej próbki i umieść ją w inkubatorze z wytrząsaniem na pięć minut. Dodaj 20 mikrolitrów pięciu X PBS i 30 do 35 mikrolitrów 0,1 molowego wodorotlenku sodu, aby wyregulować pH do 8,0 i wymieszać przez wirowanie. Dodaj cztery mikrolitry enzymu endoglikozydazy F i wymieszaj przez wirowanie.Następnie inkubuj przez 18 do 20 godzin w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia umieść uwolnione gylany w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza do wyschnięcia przez dwie i pół do trzech godzin. Zachowaj uwalniające się likany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego pomiaru.Przygotuj odczynnik do znakowania dwóch aminobenzimidów z 24,5 mikrolitrami DMSO, 10,5 mikrolitrami kwasu octowego, 0,7 miligrama dwóch aminobenzimidów i sześcioma miligramami cyjanoborowodorku sodu. Następnie w ciemnym pomieszczeniu oznacz glikany, dodając 35 mikrolitrów dwóch odczynników do znakowania aminobenzimidów. Przenieś oznaczone glcany do oscylatora na pięć minut, a następnie przenieś je do piekarnika na trzy godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza.Następnie przenieś go do temperatury pokojowej na 30 minut. N-glikaza IgG, oznaczymy ją w celu wykrycia przez fluorescencyjną detekcję stanu zanieczyszczonego. Wstępnie potraktuj płytkę filtracyjną GHP o grubości 0,2 mikrona 200 mikrolitrami 70% etanolu, 200 mikrolitrami ultra czystej wody i 200 mikrolitrami 96% nitrylu acetonowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie usuń odpady za pomocą pompy próżniowej. Aby oczyścić dwa glikany znakowane aminobenzimidem, dodaj 700 mikrolitrów 100% acetonitrylu do próbki i przenieś ją do inkubatora z wytrząsaniem na pięć minut. Wirować w temperaturze 134 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieść supernatent na płytkę filtracyjną GHP o grubości 0,2 mikrona na dwie minuty i usunąć filtrat za pomocą próżni. Przemyć dwa glikany znakowane aminobenzimidem 200 mikrolitrami 96% acetonitrylu w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć filtrat za pomocą pompy próżniowej pięć do sześciu razy. Zilustrowaj dwa glikany znakowane aminobenzimidem trzema razy w 100 mikrolitrach ultra czystej wody.Przenieś dwa glikany znakowane aminobenzimidem do piekarnika, aby wyschły w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzy i pół godziny. Zachowaj oznaczone n-glikany w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego pomiaru. Najpierw otwórz oprogramowanie, aby sterować fazami mobilnymi.Myć instrumenty UPLC 50% rozpuszczalnikiem B i 50% rozpuszczalnikiem C przy natężeniu przepływu 0,2 mililitra na minutę przez 30 minut. Następnie myć 25% rozpuszczalnikiem A i 75% rozpuszczalnikiem B przy natężeniu przepływu 0,2 mililitra na minutę przez 20 minut. Następnie dodaj natężenie przepływu 0,4 mililitra na minutę.Rozpuść znakowane n-glikany w 25 mikrolitrach mieszaniny 100% acetonitrylu i ultra czystej wody w stosunku objętościowym dwa do jednego. Następnie odwirować przy 134 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i użyć suchej rury, aby załadować 10 mikrolitrów supernatentu do instrumentów UPLC. Oddziel oznakowane n-glikany przy natężeniu przepływu 0,4 mililitra na minutę z gradientem liniowym od 75% do 62% acetonitrylu przez 25 minut.Następnie wykonaj przebieg analityczny za pomocą kolumny glikopeptydowej drabinki kalibracyjnej Dexteran na UPLC w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Wykrywanie fluorescencji n-glikanów przy długości fal cytowania X i emisji odpowiednio 330 nanometrów i 420 nanometrów. Jak pokazano na tym rysunku, n-glikany IgG analizowano w 24 początkowych pikach glikanów IgG w oparciu o położenie piku i czas retencji.Struktury n-glikanów są dostępne w 24 typach dzięki detekcji za pomocą spektrometrii mas. Aby ocenić powtarzalność i stabilność metody, próbka wzorcowa została sześciokrotnie przetestowana równolegle. Piki glikanów o stosunkowo niewielkich proporcjach wykazywały wysokie błędy pomiarowe przekraczające 10% współczynnika zmienności.W kawałku i ważne jest tworzenie do ustalonej struktury n-glikanów IgG, szczególnie dla ustalenia końcowego Dlatego zamiast 3,3 IgG n-glikazy znalezionej w jest krytyczne znaczenie IgG. Wiadomo, że glikany z nich są różne. Dzięki postępom w prototomice glikanowej, połączonej w glikanach w celu zbadania informacji na ten temat, tak aby można go było wykorzystać jako potencjał do dzisiejszej diagnozy.Po opracowaniu tej techniki zapewnia ona nowy sposób eksploracji

immunoglobulin-g-n-glycan-analysis-ultra-performance-liquid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Ten film demonstruje zasadę rozdzielania hydrofilowych związków polarnych za pomocą hydrofilowej chromatografii cieczowej. Technika ta pomaga w oczyszczaniu różnych analitów polarnych, w tym N-glikanów.

Chromatografia cieczowa oddziaływań hydrofilowych: technika rozdzielania hydrofilowych analitów polarnych za pomocą kulek hydrofilowych

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Ten artykuł przedstawia ulepszoną formę nowatorskiej techniki glikomicznej od dołu do góry, przeznaczonej do analizy zbiorczego profilu składu glikanów w niefrakcjonowanych biopłynach poprzez chemiczny rozkład glikanów na ich składowe specyficzne dla wiązania monosacharydy do wykrycia przez GC-MS. Potencjalne zastosowania obejmują wczesne wykrywanie raka i innych zaburzeń glikanowo-afektywnych.

Analiza węzłów glikanowych: oddolne podejście do glikomiksu

Test mikromacierzy sialoglycan może być używany do oceny przeciwciał anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich, co czyni go potencjalnym wysokoprzepustowym testem diagnostycznym dla raka i innych przewlekłych chorób ludzkich, w których pośredniczy stan zapalny.

Profilowanie IgG anty-Neu5Gc w surowicach ludzkich za pomocą testu mikromacierzy sialoglikanu

Ta praca pokazuje potencjał technologii drukowanych tablic glikanowych (PGA) do analizy krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt.

Drukowana matryca glikanów: czuła technika analizy repertuaru krążących przeciwciał antywęglowodanowych u małych zwierząt

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Przedstawiamy szczegółowy protokół uwalniania O-glikanów z mucyn oraz późniejszego odsolania, permetylacji i analizy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

Poznaj metodę analizy N-glikanu IgG za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej. Technika ta oferuje wysoką czułość, powtarzalność i możliwość rozdziału izomerów glikanowych.

Analiza N-glikanu immunoglobuliny G metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej

Przeglądaj więcej filmów