Hemogenne przeprogramowanie ludzkich fibroblastów poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych

Metoda ta pomaga przezwyciężyć ograniczenia w badaniu rozwoju układu krwiotwórczego u człowieka, zapewniając prostą i wykonalną platformę in vitro opartą na bezpośrednim przeprogramowaniu komórek. Wizualna demonstracja tej metody zapewni idealne wskazówki w podstawowych krokach generowania ludzkich komórek hemogennych, a mianowicie podczas produkcji lentiwirusa, transdukcji fibroblastów i hodowli komórkowej. Przekształcając fibroblasty skóry w prekursory hemogenne, mamy nadzieję wygenerować specyficzne dla pacjenta hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe w liczbie wystarczającej do przeszczepu komórek macierzystych.

Zacznij od wyhodowania HEK293T komórek w 100-milimetrowym naczyniu poddanym kulturze tkankowej z 10 mililitrami kompletnego DMEM w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla aż do zbiegu. W dniu poprzedzającym transfekcję, po zaessaniu pożywki, dokładnie umyj naczynie pięcioma mililitrami PBS i odłącz komórki 1,5 mililitra roztworu dysocjacyjnego. Po inkubacji przez pięć do 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, dezaktywuj roztwór trzema mililitrami kompletnego DMEM i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Umyj naczynie 5 mililitrami kompletnego DMEM, aby usunąć wszelkie pozostałe przyczepione komórki i pociągnij mycie roztworem komórek. Zebrać komórki przez odwirowanie, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w sześciu mililitrach kompletnego DMEM. Następnie podziel zawiesinę równomiernie między sześć 100-milimetrowych naczyń poddanych kulturze tkankowej w końcowej objętości 10 mililitrów kompletnego DMEM na naczynie.

Następnego dnia dodaj 10 mikrogramów całkowitej masy trzech plazmidów transferowych do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie dodaj 10 mikrogramów drugiej generacji wektora pakującego psPAX2 kodującego geny gag, pol, tat i rev, a następnie dodaj pięć mikrogramów pMD2. Wektor obwiedni G kodujący gen VSV-G do probówki.

Na koniec dodaj wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 500 mikrolitrów. W dwóch nowych 15-mililitrowych stożkowych probówkach dodaj 10 mikrogramów plazmidu FUW-M2rtTA, 10 mikrogramów wektora opakowania i pięć mikrogramów wektora kopertowego do każdej probówki. Następnie dodaj wodę do końcowej objętości 500 mikrolitrów do każdej probówki.

Następnie dodaj 62,5 mikrolitra dwóch molowych chlorków wapnia do każdej z trzech probówek i użyj kontrolera pipet wyposażonego w pipetę Pasteura, aby uwolnić pęcherzyki do każdej mieszaniny. Podczas tworzenia się pęcherzyków dodaj kroplami 500 mikrolitrów buforowanej soli fizjologicznej BES do pipety Pasteura i do mieszaniny. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut, aż mieszaniny staną się lekko mętne.

Podczas inkubacji ostrożnie zastąp supernatant HEK293T kultur komórkowych 10 mililitrami kompletnego DMEM bez antybiotyków. Rozprowadź kompleksy DNA kroplami na poszczególnych szalkach do hodowli komórek HEK293T i inkubuj przez 24 godziny. Następnego dnia zastąp supernatanty czterema mililitrami kompletnego DMEM na kulturę i umieść naczynia w inkubatorze hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na noc.

Następnego ranka zbierz supernatanty do jednej 50-mililitrowej probówki na naczynie i dodaj cztery mililitry świeżej pożywki do każdej potrawy. Po kolejnych ośmiu godzinach hodowli połącz supernatant w każdym naczyniu z wcześniej zebranym supernatantem i dodaj cztery mililitry świeżej pożywki. Umieść naczynia z powrotem w inkubatorze kultur komórkowych na noc i zbierz supernatanty po raz ostatni.

Po zebraniu całego wirusa przefiltrować każdy supernatant lentiwirusa przez filtr o niskiej zawartości białka o średnicy 0,45 mikrometra do pojedynczych probówek i dodać maksymalnie 15 mililitrów przefiltrowanego supernatantu do poszczególnych filtrów odśrodkowych w celu odwirowania. Odrzuć przepływ. Lepka ciecz zawierająca lentiwirusa pozostanie w jednostce filtrującej.

Gdy cały supernatant lentiwirusa został przefiltrowany do podwielokrotności 50 do 200 mikrolitrów skoncentrowanego lentiwirusa do przechowywania w chłodni. Przed rozpoczęciem procedury przeprogramowywania należy zakodować płytkę poddaną sześciodołkowej kulturze tkankowej 500 mikrolitrami 0,1% żelatyny na dołek i inkubować płytkę przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji odessać pozostały roztwór żelatyny.

Umieść ludzkie fibroblasty skóry w gęstości 1,5 razy dziesięć do piątych komórek na płytkę w dwóch mililitrach kompletnego DMEM na studzienkę i inkubuj przez noc. Następnego ranka zastąp pożywkę w każdej studzience dwoma mililitrami kompletnego DMEM uzupełnionego ośmioma mikrogramami na mililitr polibrenu i dodaj mieszaninę jeden do jednego lentiwirusów czynnika transkrypcyjnego wytwarzanego w puli i M2rtTA do nowej probówki do mikrowirówki. Następnie transdukować fibroblasty optymalną objętością mieszaniny lentiwirusowej, od 10 do 100 mikrolitrów na studzienkę.

Po 16 godzinach inkubacji zastąp supernatanty kompletnym DMEM i włóż komórki z powrotem do inkubatora hodowli komórkowych na sześć do ośmiu godzin. Po odzyskaniu należy zastąpić supernatanty dwoma mililitrami kompletnego DMEM uzupełnionego polibrenem i przeprowadzić drugą transdukcję, jak właśnie pokazano. Pod koniec drugiej inkubacji transdukcji zastąpić supernatanty kompletnym DMEM uzupełnionym jednym mikrogramem na mililitr doksycykliny i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych na 48 godzin.

Pod koniec inkubacji podzielić każdą studzienkę w stosunku jeden do dwóch i ponownie umieścić komórki w dwóch mililitrach na studzienkę pożywki krwiotwórczej uzupełnionej doksycykliną na nowej płytce sześciodołkowej pokrytej żelatyną. Aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny, należy płytkować trzy razy 10 do piątych fibroblastów na pokrytej żelatyną sześciodołkowej płytce i inkubować przez noc. Pod koniec inkubacji należy przeprowadzić transdukcję komórek dwa razy w ciągu dwóch kolejnych dni za pomocą 10 do 20 mikrolitrów lentiwirusa zawierającego poszczególne czynniki będące przedmiotem zainteresowania lub pulę trzech czynników oraz FUW-M2rtTA w stosunku jeden do jednego.

16 godzin po drugiej transdukcji usunąć wirusa zawierającego supernatant i inkubować komórki w pełnym DMEM przez 24 godziny. Pod koniec inkubacji należy ponownie platerować zawartość każdej studzienki na pojedynczych, pokrytych żelatyną 100-milimetrowych naczyniach poddanych kulturze tkankowej z kompletnym DMEM do końcowej objętości 10 mililitrów pożywki na szalkę i wrzucić komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych. Po sześciu dniach zastąpić supernatant kompletnym DMEM uzupełnionym doksycykliną.

Zwróć kultury do inkubatora na dodatkowe dwa dni. Jak pokazują te reprezentatywne wykresy cytometryczne, około 17% przeprogramowanych komórek wykazuje ekspresję zarówno CD49f, jak i CD9 po 25 dniach przeprogramowania. Większość podwójnie dodatnich komórek wyraża CD143, a niewielka populacja wyraża CD34, co sugeruje dynamiczną hemogenną indukcję losu.

Markery te nie są aktywowane w ludzkich fibroblastach skóry przenoszonych przez M2rtTA, hodowanych przez 25 dni. Obrazowanie immunofluorescencyjne potwierdza ekspresję CD9 i CD143 w przylegających i okrągłych komórkach, które są morfologicznie różne od fibroblastów, które są ujemne dla tych markerów. Obrazowanie Brightfeild jest wykonywane w celu wizualizacji zbiegu, morfologii i tworzenia kolonii komórek w całym procesie przeprogramowywania.

Analiza sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki przeprogramowanych komórek ujawnia stopniowy wzrost ekspresji CD49f, CD9 i CD143 od drugiego do 25 dnia. Po sekwencjonowaniu immunoprecypitacji chromatyny, profile Genome Browser pokazują wiązanie GATA2 z genomowymi regionami regulatorowymi ITGA6 i ACE, gdy fibroblasty są kotransdukowane z trzema czynnikami lub GATA2 indywidualnie. Objętość cząsteczek przeciwwirusowych dodawanych do hodowli powinna być zoptymalizowana pod kątem skutecznego przeprogramowania bez uszczerbku dla żywotności komórek.

Platformę tę można połączyć z technologiami hamowania farmakologicznego i badań przesiewowych w skali genomu, takimi jak CRISPR-Cas9, w celu zdefiniowania nowych regulatorów ostatecznej hematopoezy u ludzi. To bezpośrednie podejście do przeprogramowania pozwoli naukowcom zbadać nowe pytania w dziedzinie hematopoezy rozwojowej człowieka i rozszyfrować mechanizmy leżące u podstaw specyfikacji ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych. Ważne jest, aby wykonywać pobieranie i transdukcję leków przeciwwirusowych w okapie z przepływem laminarnym przeznaczonym do pracy lentiwirusowej oraz wyrzucać odpady skażone wirusami do odpowiedniego pojemnika.