Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Dzisiaj chcielibyśmy pokazać Wam warianty powszechnego protokołu odzyskiwania antygenu wywołanego ciepłem. Łączy w sobie zalety niższej temperatury antygenu elastazy neutrofilowej i wysokiej wartości pH, która jest wymagana dla histonów. Technika ta pozwala na badanie NET, czyli zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili, w tkankach parafinowych zarówno od myszy, jak i od ludzi.

Rozważa się również badanie materiałów archiwalnych lub badania retrospektywne. Najpierw umieść przygotowane szkiełka w stojakach i zanurz je w podłożu używanym do odwadniania i oczyszczania w odwrotnej kolejności na pięć minut każde. Następnie podgrzej łaźnię wodną z płytą grzejną o kontrolowanej temperaturze do 70 stopni Celsjusza.

Umieść słoik wypełniony buforem do odzyskiwania epitopów wywołanym ciepłem i 10% glicerolem w łaźni wodnej. Gdy bufor osiągnie 70 stopni Celsjusza, umieść stojak ze szkiełkami w słoiku buforowym. Inkubuj szkiełka w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 120 minut.

Następnie wyjmij słoik z łaźni wodnej i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Opłucz schłodzone sekcje trzy razy wodą jonizowaną i jeden raz TBS. Za pomocą zwiniętej bibuły filtracyjnej lub bawełnianego wacika ostrożnie usuń płyn między sekcjami na szkiełkach, upewniając się, że sekcje są nawilżone.

Następnie użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby stworzyć barierę wokół każdej sekcji. Inkubować sekcję w buforze blokującym w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w buforze blokującym w stężeniu jednego mikrograma na mililitr.

Usunąć bufor blokujący ze szkiełek i dodać rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe, upewniając się, że użyto wystarczającej objętości, aby zapobiec wysuszeniu. Zamknij wilgotny pojemnik i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia umyj sekcje trzy razy TBS, przy czym każde mycie trwa pięć minut.

Przygotować roztwór roboczy z przeciwciał drugorzędowych w buforze blokującym. Przykryj skrawki tkanek wtórnym roztworem przeciwciała i przenieś szkiełka do wilgotnego pojemnika. Zamknij wilgotny pojemnik i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę.

Następnie umyj sekcje trzy razy TBS i jeden raz w wodzie, przy czym każde mycie trwa pięć minut. Przykryj umyte sekcje medium montażowym i nałóż szkło nakrywkowe, unikając tworzenia się pęcherzyków. Po zestaleniu się podłoża montażowego do analizy immunofluorescencji należy użyć mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu szerokokątnego z odpowiednimi filtrami pasmowo-przepustowymi.

Aby zdigitalizować całe sekcje za pomocą skanera slajdów, ustaw intensywność fluorescencji za pomocą kontroli ujemnej i dodatniej. Korzystając z barwienia elastazą neutrofilową, znajdź obszary bogate w neutrofile i powiększ te obszary, aby sprawdzić, czy sygnał elastazy neutrofilowej jest ziarnisty czy zewnątrzkomórkowy. Jeśli sygnał jest zewnątrzkomórkowy i nakłada się zarówno na barwienie histonami, jak i DNA, uzyskano zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili

W tym badaniu składniki NET są z powodzeniem wykrywane w tkance zatopionej w parafinie, zarówno pochodzenia ludzkiego, jak i mysiego. Jeśli skrawki tkanek mają grubość od dwóch do trzech mikrometrów, można je analizować za pomocą mikroskopii szerokokątnej przy użyciu obiektywów 10x lub 20x. Aby prawidłowo ocenić barwienie, przetworzono zarówno próbki negatywne, jak i pozytywne.

Reprezentatywny wycinek tkanki ludzkiego zapalenia wyrostka robaczkowego pokazuje tkanki barwione na NE, H2B i Hoechst 33342. Obrazy po lewej pochodzą z obszaru sekcji zawierającej NET, podczas gdy obrazy po prawej pochodzą z innego obszaru tej samej sekcji, który zawiera liczne neutrofile, ale nie zawiera NET. Obszary z masywną formacją NET można łatwo znaleźć nawet przy małych powiększeniach, ponieważ wszystkie trzy składniki NET często kolokalizują się w żylastych strukturach zewnątrzkomórkowych.

Pojawia się to w nakładce trzech kanałów jako białawe włókna zewnątrzkomórkowe, które można określić ilościowo za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w celu utworzenia fioletowej nakładki przy użyciu pikseli z nakładających się sygnałów, które są dodatnie dla zielonego, czerwonego i niebieskiego. Aby uzyskać wyższą rozdzielczość, należy używać mikroskopów konfokalnych lub mikroskopów szerokokątnych z funkcją dekonwolucji, aby zminimalizować rozmycie nieostre. Maksymalna projekcja stosu konfokalnego obszaru bogatego w NET z tej samej próbki ludzkiego zapalenia wyrostka robaczkowego pokazuje, że NE znajduje się w granulkach, ale występuje również obficie zewnątrzkomórkowo, gdzie kolokalizuje się z H2B i DNA.

Kolokalizacja zewnątrzkomórkowa powoduje białawą kombinację kolorów. Piksele dodatnie dla zielonego, czerwonego i niebieskiego mogą być ponownie użyte do stworzenia fioletowej nakładki prezentującej NET. Reprezentatywny szczegół centralnego odcinka płuca myszy zakażonego Mycobacterium tuberculosis dostarcza kolejnego przykładu kolokalizacji wszystkich trzech składników NET, które są wyraźnie widoczne jako białawe obszary między neutrofilami, które można wykorzystać do stworzenia fioletowej warstwy wskazującej na NET.

Podczas procedury barwienia skrawki nie mogą wyschnąć, ponieważ spowoduje to fałszywie dodatnie barwienie lub wysokie tło. Analiza materiałów archiwalnych może pomóc w zrozumieniu wpływu NET na choroby. Ponieważ tkanka parafinowa może mieć ogromne tło, ważne jest, aby mieć pozytywną i negatywną kontrolę, którą można odróżnić od barwienia od tła.

Deparafisja i odwadnianie powinny być wykonywane pod wyciągiem. Upewnij się, że nosisz rękawice i fartuch laboratoryjny.