Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Hodowla fibroblastów w sferoidach rekapituluje tkankę nowotworową znacznie lepiej niż powszechnie stosowany system 2D na sztywnym plastiku. Pozwala na badanie różnicowania fibroblastów w środowisku przypominającym nowotwór. W tej metodzie sztywność plastycznej pracy z kulturą komórkową nie wpływa sztucznie na różnicowanie fibroblastów.

Zamiast tego wpływ interakcji macierzy komórkowej na indukowane nowotworem różnicowanie fibroblastów można analizować in vitro. Aby rozpocząć tę procedurę, należy uzyskać pożywkę do hodowli komórek, która jest MEM uzupełniona 1% inaktywowanym termicznie FBS i 1% streptomycyną penicyliny. Uzyskaj również sześć miligramów na mililitr roztworu metylocelulozy.

Zmieszać jedną część metylocelulozy z trzema częściami pożywki do hodowli komórkowych w celu przygotowania roztworu do tworzenia sferoidów. Ponownie zawiesić świeżo rozmrożone, unieśmiertelnione normalne fibroblasty lub inne typy komórek, zgodnie z protokołem tekstowym, w roztworze do tworzenia sferoidów. Jeśli w badaniu uwzględniono cytokiny lub inhibitory integryn, należy dodać te związki do zawiesiny komórkowej w celu osadzenia ich w sferoidach podczas ich tworzenia.

W razie potrzeby dodać związki inhibitorowe razem z 10 nanogramami na mililitr TGF beta one, aby wywołać różnicowanie w unieśmiertelnionych normalnych fibroblastach. Rozprowadzić 100 mikrolitrów roztworu tworzącego sferoidy do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem. Kilkakrotnie odpipetować roztwór w każdej studzience w górę iw dół, aby wymieszać.

Następnie inkubuj płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny, aby umożliwić utworzenie jednej sferoidy w każdym dołku. Najpierw odetnij koniec końcówki pipety, aby powiększyć otwór. Po zakończeniu inkubacji użyj tej pociętej pipety, aby zebrać sferoidy do jednej 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej na warunki eksperymentalne lub na białko, które ma być analizowane.

Odwirować sferoidy przy 1000 razy G przez około 30 do 60 sekund. Ostrożnie usunąć sklarowany sklarant zawierający metylocelulozę za pomocą pipetowania, upewniając się, że nie naruszyć granulowanych sferoidów. Należy zachować szczególną ostrożność podczas przenoszenia sferoid do probówek reakcyjnych.

Upewnij się, że nie masz sił dryfu nożyc, przecinając końcówkę. Ważne jest również, aby zebrać wszystkie sferoidy. Na etapie prania upewnij się, że nie zgubiłeś sferoid przez aspirację.

Aby umyć sferoidy, dodaj 50 mikrolitrów jednego X PBS. Wirować przy 1000 razy G przez 30 do 60 sekund. Następnie ostrożnie wyjąć PBS za pomocą pipetowania.

W zależności od białka, które ma być barwione, utrwal sferoidy za pomocą 50 mikrolitrów 4% paraformaldehydu i PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć sferoidy PBS, jak opisano wcześniej. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,1% trytonu X i PBS przez cztery minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie umyj sferoidy w PBS trzy razy, jak opisano wcześniej. Dodać PBS zawierający 5% FBS i 2% BSA do sferoid i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w celu zablokowania niespecyficznych miejsc interakcji białek. Teraz inkubuj sferoidy z 30 mikrolitrami przeciwciał pierwszorzędowych i PBS z 2,5% FBS i 1% BSA w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia umyj sferoidy w PBS trzy razy, jak opisano wcześniej. Następnie inkubować sferoidy z 30 mikrolitrami przeciwciał drugorzędowych i PBS z 2,5% FBS i 1% BSA w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Umyj sferoidy w PBS trzy razy, jak opisano wcześniej.

Następnie inkubuj komórki z 30 mikrolitrami roztworu barwiącego Dappy przez cztery minuty w temperaturze pokojowej. Umyj sferoidy w PBS jeden raz, jak opisano wcześniej. Za pomocą szklanej pipety Pasteura umieść sferoidy na szklanym szkiełku podstawowym i kropli PBS.

Użyj laserowego mikroskopu skaningowego, aby zobrazować sferoidy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w powiększeniu 10 razy. Weź różny przekrój czynny sferoidy na różnych płaszczyznach optycznych stosu Z. Reprezentatywny obraz barwienia immunofluorescencyjnego homosferoidów normalnych fibroblastów trzustki w porównaniu z homosferoidami unieśmiertelnionych fibroblastów związanych z rakiem pokazuje zwiększony sygnał dla podjednostki alfa trzy w zróżnicowanych komórkach.

Sygnał fluorescencyjny komórek w sferoidzie jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą obrazów stosu Z sferoidy 3D, a poziomy transkrypcji genu podjednostki alfa trzy integryny są określane za pomocą qPCR. Wszystkie te wyniki pokazują, że integryna alfa trzy jest regulowana w górę w nieśmiertelnych fibroblastach związanych z rakiem w porównaniu z normalnym odpowiednikiem. Dowodzi to, że integrynę alfa trzy beta one można uznać za marker różnicowania fibroblastów trzustki.

Ta metoda idealnie nadaje się do kapitulacji własnej tkanki zwykle występującej w narządach i masach nowotworowych, gdzie dodatkowa sztywność macierzy komórkowej decyduje o losie komórki. Hodowla sferoidów to wszechstronny model, który można łączyć z innymi testami analitycznymi po dysocjacji sferoidowej, takimi jak ilość, PCR w czasie rzeczywistym i pełna cytometria. Paraformaldehyd używany do wiązania sferoid jest niebezpiecznym środkiem chemicznym.

W celu ochrony należy nosić rękawice i okulary.