Dwuosiowy ton podstawowy i bierne badanie mysiego układu rozrodczego za pomocą miografu ciśnieniowego
13 sierpnia 2019
Ten protokół wykorzystywał dostępny na rynku system miografu ciśnieniowego do wykonywania testów miografu ciśnieniowego na mysiej pochwie i szyjce macicy. Wykorzystując pożywki z wapniem i bez niego, wyizolowano wkład komórek mięśni gładkich (SMC) w ton podstawowy i pasywną macierz zewnątrzkomórkową (ECM) dla narządów w szacowanych warunkach fizjologicznych.
Protokół ten bada dwuosiowe właściwości mechaniczne narządów rozrodczych, wyjaśniając wkład komórek mięśni gładkich i macierzy biernej. Technika ta utrzymuje geometrię narządu i natywne interakcje między komórkami mięśni gładkich a macierzą, umożliwiając poddanie narządu fizjologicznemu zakresowi nacisków i rozszerzeń osiowych. Badanie funkcji dwuosiowej narządów pod fizjologicznie istotnymi obciążeniami może pomóc w lepszym zrozumieniu etiologii patologii rozrodczości.
Dwuosiowe badanie szyjki macicy i pochwy zapewnia wgląd w dziedziny zdrowia i biomechaniki kobiet. Podobne metody stosuje się do badania naczyń krwionośnych, przełyku i jelita grubego. Podczas pracy z nowym narządem może minąć trochę czasu, aby sfinalizować szczegóły techniczne, takie jak najlepszy sposób zszycia tkanki lub sposób określenia długości bez obciążenia.
Aby pobrać układ rozrodczy od zwierzęcia doświadczalnego, umieść mysz na podkładce chłonnej pod mikroskopem preparacyjnym i użyj kątowej pęsety i nożyczek, aby podnieść skórę wokół brzucha. Wykonaj początkowe nacięcie u podstawy brzucha powyżej kości łonowej na tyle płytkie, aby nie przebić ściany mięśni brzucha i kontynuuj nacięcie wyżej w kierunku klatki piersiowej i głęboko przez mięśnie brzucha. Po usunięciu powierzchownej tkanki tłuszczowej i ostrożnym przecięciu spojenia łonowego, użyj prostej pęsety, aby chwycić pęcherz, aby wytworzyć napięcie i użyj sekcji, aby oddzielić otaczającą tkankę od pochwy.
Następnie przetnij podstawę układu rozrodczego, aby usunąć tkanki z jamy ciała. Po ustaleniu odpowiedniego rozmiaru kaniuli dla pobranego systemu, zamontuj stronę szyjną na części przetwornika siły urządzenia do kaniulacji i zamontuj przeciwległy koniec narządu na części mikrometrycznej urządzenia. Następnie zaciśnij oba końce szwami.
Aby znaleźć nieobciążoną długość zamontowanej tkanki, najpierw rozciągnij narząd tak, aby ściana nie była napięta. W przypadku pochwy obserwuj rowki na ścianie pochwy. W przypadku szyjki macicy wytnij bezpośrednio pod kropkami atramentu znajdującymi się powyżej i poniżej środkowego znaku szyjki macicy.
Użyj suwmiarki, aby zmierzyć długość systemu od szwu do szwu i zwiększ ciśnienie systemu miografu od zera do 10 milimetrów słupa rtęci w przyrostach rtęci o jeden milimetr. Ciśnienie, w którym narząd nie jest już zapadnięty, można określić jako największy skok średnicy zewnętrznej przy danym ciśnieniu. Po zarejestrowaniu ciśnienia i średnicy zewnętrznej zanotuj te dane jako pierwszy punkt, w którym narząd nie jest zapadnięty i wyzeruj siłę.
Aby znaleźć eksperymentalne rozciąganie in vivo, dostosuj narząd do szacowanej długości in vivo przy ciśnieniu bez obciążenia i kliknij start, aby ocenić wartości ciśnienia w stosunku do siły dla wartości ciśnienia w zakresie od ciśnienia nieobciążonego do ciśnienia maksymalnego. Następnie kliknij przycisk Zatrzymaj i zapisz plik. W przypadku wstępnego kondycjonowania średnicy ciśnienia ustaw ciśnienie na zero milimetrów słupa rtęci, długość na długość eksperymentalną in vivo, a gradient na 1,5 milimetra słupa rtęci na sekundę.
Uruchom sekwencję, która przyjmuje ciśnienie od zera milimetrów słupa rtęci do ciśnienia maksymalnego plus ciśnienie bez obciążenia, przytrzymaj przez 30 sekund i powróć do zera milimetrów słupa rtęci z dodatkowym 30-sekundowym okresem utrzymywania. Po powtórzeniu tej sekwencji przez łącznie pięć cykli kliknij przycisk stop i zapisz plik. W celu wstępnego kondycjonowania długości siły wprowadź 1/3 maksymalnego ciśnienia plus ciśnienie bez obciążenia zarówno dla ciśnienia wlotowego, jak i wylotowego i wyreguluj narząd na minus 2% długości in vivo.
Kliknij start i dostosuj długość do plus 2% długości in vivo i z powrotem do minus 2% z szybkością 10 mikrometrów na sekundę. Powtórz przedłużenie osiowe przez łącznie pięć cykli przed kliknięciem stop i zapisaniem pliku. Aby przetestować średnicę ciśnienia na długości in vivo, kliknij start i dostosuj narząd do długości in vivo, ustaw ciśnienie na zero milimetrów słupa rtęci i ustaw gradient na 1,5 milimetra słupa rtęci na sekundę.
Zwiększ ciśnienie od zera milimetrów słupa rtęci do maksymalnego ciśnienia, a następnie obniż ciśnienie z powrotem do zera milimetrów słupa rtęci z 20-sekundowym okresem podtrzymania. Następnie powtórz test przez pięć cykli przed zatrzymaniem systemu i zapisaniem danych. W przypadku badania długości siły wynoszącej 1/3 ciśnienia maksymalnego plus ciśnienie nieobciążone, ustaw ciśnienie na 1/3 ciśnienia maksymalnego plus ciśnienie nieobciążone i dostosuj narząd do minus 2% długości in vivo.
Po kliknięciu przycisku start rozciągnij narząd do plus 2% długości in vivo i z powrotem do minus 2% długości in vivo z prędkością 10 mikrometrów na sekundę. Następnie powtórz test w sumie przez trzy cykle przed zatrzymaniem systemu i zapisaniem danych. Po ostatnim badaniu należy wyjąć pożywkę testową KRB i umyć narząd pożywką KRB bez wapnia.
Po przemyciu należy inkubować narząd ze świeżym roztworem KRB bez wapnia uzupełnionym dwumilimolowym EGTA przez 30 minut, a następnie zastąpić roztwór do leczenia świeżym KRB bez wapnia. Po zakończeniu badania tonu podstawowego, w celu wstępnego kondycjonowania średnicy ciśnienia, kliknij start i ustaw ciśnienie na zero milimetrów słupa rtęci, długość jako szacowaną długość in vivo, a gradient na 1,5 milimetra słupa rtęci na sekundę. Rozpocznij sekwencję, która przenosi ciśnienie od zera milimetrów rtęci do ciśnienia maksymalnego i z powrotem do zera milimetrów słupa rtęci.
Powtórz ten proces w pięciu cyklach z 30-sekundowym czasem podtrzymania. W celu wstępnego kondycjonowania długości siły, dostosuj narząd do długości in vivo i ręcznie wprowadź ciśnienie bez obciążenia dla obu ciśnień. Kliknij start i ustaw gradient na 1,5 milimetra słupa rtęci, a ciśnienie na 1/3 maksimum.
Rozciągnij narząd do plus 2% i z powrotem w dół do minus 2%rozciągnij się z prędkością 10 mikrometrów na sekundę i powtórz cykl w sumie pięć razy. W przypadku badania średnicy ciśnienia, gdy narząd znajduje się na poziomie minus 2% eksperymentalnie wyznaczonej długości in vivo, a ciśnienie wynosi zero milimetrów słupa rtęci, kliknij start i zwiększ ciśnienie z zera milimetrów słupa rtęci do maksymalnego ciśnienia i z powrotem do zera milimetrów słupa rtęci. Przytrzymaj krok zero milimetrów słupa rtęci przez 20 sekund i powtórz cykl pięć razy.
W przypadku badania długości siły należy ustawić ciśnienie na ciśnienie nominalne i wyregulować narząd na minus 2% długości in vivo. Rozciągnij narząd do plus 2% długości in vivo i z powrotem do minus 2% długości in vivo z szybkością 10 mikrometrów na sekundę. Po łącznie trzech cyklach zapisz dane i powtórz test długości siły dla 1/3 maksymalnego ciśnienia, 2/3 maksymalnego ciśnienia i przy maksymalnym ciśnieniu.
Aby pomyślnie przeprowadzić analizę właściwości mechanicznych żeńskich narządów rozrodczych, konieczne jest usunięcie rogów macicy do pochwy bez żadnych wad. W zależności od typu narządu rozmiar kaniuli będzie się różnił. Kaniulacja musi być wykonana w taki sposób, aby narząd nie mógł się poruszać podczas eksperymentu, ale bez uszkodzenia ściany narządu podczas zabiegu.
System miografu ciśnieniowego może być używany do monitorowania różnych aspektów narządu podczas jego badań mechanicznych, a system ultrasonograficzny może być używany do pomiaru grubości narządów w stanie nieobciążonym z tonem podstawowym i bez niego. Po przeprowadzeniu badań mechanicznych moduły styczne można obliczyć dla kierunku obwodowego i osiowego. Zarówno badanie tonu podstawowego, jak i badanie pasywne pozwalają uzyskać kluczowe właściwości mechaniczne układu rozrodczego z udziałem kurczliwości komórek mięśni gładkich i bez niej.
Skalowanie między narządami wymaga kilku korekt protokołów, ponieważ szyjka macicy i pochwa doświadczają różnych obciążeń in vivo. Kluczowe jest szybkie przeprowadzenie sekcji, aby utrzymać żywotność komórek mięśni gładkich, ale ostrożnie, aby nie nakłuwać pożądanego narządu. Eksperymenty z kątem otwarcia, które mierzą szczątkowe odkształcenie narządu, mogą być przeprowadzane po procedurach badań mechanicznych, jak również po różnych testach histologicznych i biochemicznych.
Po opracowaniu i zbadaniu podstawnego wkładu komórek mięśni gładkich, technika ta pozwala również na ocenę maksymalnej odpowiedzi kurczliwej mięśni gładkich układu rozrodczego pod fizjologicznie istotnymi obciążeniami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół bada dwuosiowe właściwości mechaniczne organów rozrodczych, koncentrując się na udziale komórek mięśni gładkich oraz pasywnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Technika ta zachowuje geometrię organu i natywne oddziaływania, co umożliwia przeprowadzanie testów w warunkach istotnych fizjologicznie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biomechanika
- Zdrowie kobiet
- Fizjologia rozrodu
Wstęp
- Zrozumienie właściwości mechanicznych narządów rozrodczych jest kluczowe dla zdrowia kobiet.
- Badanie roli komórek mięśni gładkich może rzucić światło na patologie układu rozrodczego.
- Metody badań dwuosiowych są powszechnie stosowane w różnych badaniach biologicznych.
- Szczegóły techniczne są niezbędne do uzyskania dokładnych pomiarów w badaniach nad nowymi narządami.
Cel badania
- Wyjaśnienie właściwości mechanicznych szyjki macicy i pochwy.
- Izolacja wpływu komórek mięśni gładkich i macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Pogłębienie zrozumienia funkcji organów rozrodczych w warunkach fizjologicznych.
Zastosowane metody
- Badania z wykorzystaniem miografii ciśnieniowej pochwy i szyjki macicy myszy.
- Zastosowanie pożywek z dodatkiem i bez dodatku wapnia w celu oceny ich udziału.
- Zachowanie geometrii narządu podczas testów.
- Przykładanie ciśnienia fizjologicznego i rozciąganie osiowe.
Główne wyniki
- Wgląd w zachowanie mechaniczne organów rozrodczych.
- Identyfikacja roli komórek mięśni gładkich i macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Potencjalne implikacje dla zrozumienia patologii układu rozrodczego.
- Porównanie z podobnymi metodologiami stosowanymi w badaniach nad innymi organami.
Wnioski
- Badania dwuosiowe dostarczają cennych informacji na temat zdrowia kobiet.
- Zrozumienie mechaniki narządów może pomóc w opracowaniu klinicznych podejść do problemów reprodukcyjnych.
- Dalsze udoskonalenie technik jest niezbędne do badań nad nowymi narządami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena dwuosiowych właściwości mechanicznych organów rozrodczych umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w procesie walidacji celów terapeutycznych w obszarze zdrowia kobiet poprzez wyizolowanie wkładu mięśni gładkich oraz macierzy pozakomórkowej. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych dzięki kwantyfikacji napięcia podstawowego i mechaniki pasywnej pod wpływem obciążeń istotnych fizjologicznie. Metodologia ta wspomaga dostosowanie biomarkerów translacyjnych dla zaburzeń dna miednicy oraz niewydolności szyjki macicy poprzez powtarzalne, ilościowe fenotypowanie biomechaniczne.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar napięcia podstawowego jako częściowego skurczu komórek mięśni gładkich w obliczu braku stymulacji hormonalnej i neuronalnej.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie funkcjonalnej walidacji celu poprzez oddzielenie aktywności komórek kurczliwych od pasywnej mechaniki macierzy z wykorzystaniem mediów wolnych od wapnia i uzupełnionych o EGTA.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie w selekcji projektów badawczych poprzez identyfikację zmian fenotypu mięśni gładkich indukowanych przez ECM, które korelują z utratą siły skurczu w patologiach układu rozrodczego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów pracy poprzez ustalenie długości bez obciążenia oraz parametrów rozciągania in vivo za pomocą montażu w myografie ciśnieniowym.
- Wyniki ilościowe: Generuje pomiary zależności ciśnienie-średnica oraz siła-długość, co umożliwia standaryzację i powtarzalność w testach fenotypowania mechanicznego.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Umożliwia skalowalną ocenę wpływu związków na mechanikę tkanek poprzez cykle prekondycjonowania oraz stopniowe zmiany ciśnienia/długości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje patofizjologiczne zmiany ECM związane z obniżeniem narządów miednicy oraz przedwczesnym przebudowywaniem szyjki macicy poprzez analizę składu kolagenu i elastyny.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, wiążąc mikrostrukturalne zmiany sztywności ze zmianami fenotypu mięśni gładkich i dysfunkcją kurczliwą.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza podstaw do decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ilościowe określenie, w jaki sposób zmiany sztywności ECM modulują aktywność mięśni gładkich i integralność mechaniczną na poziomie narządu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z biologią odkrywczą poprzez testowanie hipotez dotyczących oddziaływań między mięśniami gładkimi a macierzą, z badaniami przesiewowymi poprzez standaryzowane fenotypowanie mechaniczne oraz z badaniami translacyjnymi, umożliwiając zachowanie ciągłości przedklinicznej zgodnej z biomarkerami w odniesieniu do wskazań dotyczących zdrowia kobiet.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez pomiar wpływu środowiska biochemicznego i rozciągania mechanicznego na warunki kurczliwości mięśni gładkich w podstawowych stanach fizjologicznych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy poprzez wstępne kondycjonowanie ciśnienie-średnica przy gradiencie 1,5 mmHg/sec oraz cykle siła-długość z prędkością 10 µm/sec w celu stabilizacji odpowiedzi tkanki.
- Analityka: Umożliwia obliczenia modułów stycznych dla kierunków obwodowego i osiowego, co pozwala na ilościowe porównanie mechaniki pasywnej i czynnego wkładu kurczliwości w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy z walidacją przedkliniczną poprzez ocenę wpływu zmian mikrostruktury ECM na fenotyp mięśni gładkich i generowanie siły w modelach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Wykorzystanie przedsiębiorstwa: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do fenotypowania biomechanicznego, możliwą do zastosowania w układach naczyniowych, żołądkowo-jelitowych i rozrodczych pod fizjologicznym obciążeniem dwuosiowym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez odseparowanie podstawowego napięcia mięśni gładkich od pasywnych wkładów ECM przy użyciu mediów modulowanych wapniem.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację poprzez określenie długości bezobciążeniowej za pomocą rowków w ścianie pochwy lub punktów z tuszu na szyjce macicy oraz detekcję punktu zapadania przy zerowym ciśnieniu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w przypadku celów zaangażowanych w biomechanicznie indukowane patologie rozrodcze.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez kwantyfikację wpływu zmian w składzie ECM (kolagen I/III/V, elastyna, GAGs) na sztywność organu i komórkową mechanotransdukcję.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie sekcji tkanek, kaniulacji i technik szycia, aby zachować geometrię i żywotność organu.
- Zależne od instrumentarium do miografii ciśnieniowej, umożliwiającego dwuosiową kontrolę ciśnienia (0-10 mmHg) oraz długości osiowej (±2% in vivo).
- Konieczna jest standaryzacja protokołów długości nieobciążonej oraz cykli wstępnego kondycjonowania (5x ciśnienie-średnica, 5x siła-długość) w ramach zespołów badawczych w celu uzyskania powtarzalnych wartości bazowych.
- Wymaga uwzględnienia adaptacji skalowania specyficznego dla organu ze względu na różnice w obciążeniach in vivo pomiędzy szyjką macicy a pochwą.
- Ograniczone przez wymogi dotyczące żywotności tkanek, co nakłada konieczność szybkiej sekcji w celu zachowania funkcji komórek mięśni gładkich przy jednoczesnym unikaniu uszkodzeń ściany podczas kaniulacji.
