Model fretki uwrażliwionego na stan zapalny późnego wcześniaka niedotlenionego i niedokrwiennego mózgu
19 listopada 2019
Metoda opisuje uwrażliwione na stan zapalne niedotlenieniowo-niedokrwienne i hiperoksyczne uszkodzenie mózgu u fretki P17, aby modelować złożoną interakcję między przedłużającym się stanem zapalnym a oksydacyjnym uszkodzeniem mózgu doświadczanym u wielu późnych wcześniaków.
Protokół ten jest znaczący, ponieważ oferuje pierwszy model uwrażliwionego na stan zapalny przedwczesnego uszkodzenia mózgu u fretek, który skutkuje znacznym i trwałym uszkodzeniem. Technika ta polega na długotrwałym obrażaniu, które obejmuje wiele wyzwalaczy i mechanizmów biochemicznych, które uważa się za przyczyniające się do rodzajów urazów mózgu obserwowanych u wcześniaków. Procedurę pomiaru mózgu zademonstrują Kylie Corry, naukowiec z naszego laboratorium oraz Olivia White, studentka studiów licencjackich.
Trzydzieści minut przed rozpoczęciem operacji należy podać trzy miligramy na kilogram LPS IP zestawom w grupie urazowej i równoważną objętość sterylnego soli fizjologicznej wynoszącą trzy mikrolitry na gram w celu kontrolowania zwierząt. Przed rozpoczęciem zabiegu użyj maszynki do strzyżenia małych zwierząt, aby usunąć wszystkie włosy z brzusznej części szyi fretki w prostokątny wzór, uważając, aby nie naciąć skóry lub nie wywołać potówki. Podać znieczulenie miejscowe na ogolony obszar i zdezynfekować skórę trzema naprzemiennymi wacikami jodu powidonu i siedemdziesięcioprocentowego etanolu.
Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji poprzez uszczypnięcie palca u nogi, przykryj zwierzę sterylnymi, jednorazowymi wyciętymi zasłonami, które odsłaniają okolice szyi. W przypadku obustronnego podwiązania tętnicy szyjnej użyj jednorazowego ostrza skalpela numer dziesięć, aby wykonać 1,5-centymetrowe nacięcie linii środkowej na środku szyi i użyj drobnych hemostatyków i zakrzywionych kleszczy, aby tępo wypreparować lewą tętnicę szyjną. Wyciąć odsłoniętą tętnicę z dala od powiązanego pęczka nerwowo-naczyniowego.
I użyj pary zakrzywionych cienkich kleszczy, aby przeciągnąć zapętloną dziesięciocentymetrową długość sterylnego jedwabnego szwu 5/0 pod tętnicą. Przetnij szew na pół i bezpiecznie zawiąż obie długości szwu, aby podwiązać tętnicę, pozostawiając co najmniej dwa milimetry między węzłami. Przeciąć lewą tętnicę szyjną między szwami, uważając, aby nerw pozostał nienaruszony i powtórzyć rozwarstwienie po prawej stronie.
Odwracalnie podwiązaj prawą tętnicę szyjną za pomocą pojedynczej sterylnej opaski pępowinowej 1/8 cala. I zamknij ranę chirurgicznymi klipsami do skóry. Następnie pozwól zwierzęciu dojść do siebie w łaźni wodnej o kontrolowanej temperaturze przez co najmniej trzydzieści minut z monitorowaniem przed niedotlenieniem.
W celu sekwencyjnego leczenia hipoksji, hiperoksji i niedotlenienia należy umieścić zwierzęta w grupie urazów w hermetycznej komorze w łaźni wodnej. Stale monitoruj stężenie tlenu w komorze, a także temperaturę w odbycie u co najmniej jednego zwierzęcia wskaźnikowego. Przepłucz komorę nawilżonym dziewięcioprocentowym tlenem i 91-procentowym azotem i utrzymuj natężenie przepływu od trzech do pięciu litrów na minutę, w zależności od wielkości komory.
Gdy stężenie tlenu w komorze osiągnie dziewięć procent, kontynuuj podawanie przez trzydzieści minut. Pod koniec zabiegu hipoksji przełącz dopływ gazu na 80 procent nawilżonego tlenu i 20 procent azotu. Po trzydziestu minutach hiperoksji otwórz komorę, aby umożliwić jej szybsze osiągnięcie normoksji, równoważąc się z powietrzem w pomieszczeniu, a następnie uszczelnij komorę i ponownie przepłucz dziewięcioprocentowym nawilżonym tlenem.
Stale monitoruj wszystkie zwierzęta podczas tej drugiej rundy niedotlenienia, zwracając uwagę na wszystkie zwierzęta, które wykazują bradypneję. Gdy stężenie tlenu w komorze osiągnie dziewięć procent, kontynuuj zabieg hipoksji przez trzydzieści minut. Pod koniec leczenia użyto zakrzywionych kleszczy, aby zidentyfikować i rozwiązać taśmę pępowinową z prawej tętnicy szyjnej.
Ponownie zamknij ranę za pomocą chirurgicznych klipsów do skóry. Następnie umieść wszystkie zestawy z powrotem w skrzelkach na 60 minut w celu pielęgnowania i rekonwalescencji. Pod koniec okresu rekonwalescencji należy umieścić ranne zwierzęta w łaźni wodnej w temperaturze od 37 do 40 stopni Celsjusza na sześć godzin, dostosowując temperaturę wody w razie potrzeby, aby utrzymać temperaturę w odbycie na poziomie od 36 do 37 stopni Celsjusza.
Następnie ponownie przywróć kocięta do ich galarek. Po pobraniu mózgu i utrwaleniu w odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym, umieść końcówki suwmiarki elektronicznej na grzbietowej i brzusznej stronie każdego mózgu, aby zmierzyć wysokość każdego uszkodzonego i nieuszkodzonego mózgu. Umieść końcówki suwmiarki w najbardziej bocznych częściach płatów skroniowych, aby zmierzyć szerokość każdego mózgu i zważyć każdy mózg.
Użyj suwmiarki, aby zmierzyć szczelinę podłużną, wszystkie bruzdy od początku i końca najbardziej wyraźnej części odpowiedniej bruzdy oraz wszystkie zakręty od najszerszego aspektu każdego odpowiadającego im zakrętu. Następnie umieść jedną końcówkę suwmiarki w najbardziej tylnym punkcie szczeliny podłużnej, a drugą końcówkę suwmiarki w najbardziej tylnej części móżdżku, aby zmierzyć ilość odsłoniętego móżdżku. Spośród 34 zwierząt z sześciu miotów narażonych na zniewagę w tym badaniu, pięć zwierząt miało umiarkowane obrażenia, a cztery zwierzęta doznały poważnych obrażeń.
Wraz ze wzrostem uszkodzeń obserwuje się zwężenie zakrętów w płacie skroniowym i/lub potylicznym, z towarzyszącym mu skróceniem i poszerzeniem bruzdy podłużnej oraz większymi obszarami utraty tkanki torbielowatej u najciężej rannych zwierząt. W okresie testowania odruchów ranne zwierzęta wykazują wolniejszy czas rotacji w zadaniu negatywnej geotaksji. Wolniejszy czas na odwrócenie się od krawędzi w zadaniu Awersja do klifu i wolniejszy czas w prawo.
Na wybiegu ranne zwierzęta wykazują podobną średnią prędkość jak grupa kontrolna, ale wykazują znacznie większy stopień zmienności prędkości podczas każdego biegu. Dopasowana do ciężaru odległość między łapami a tylnymi łapami jest znacznie większa u rannych zwierząt, przy mniejszym nacisku wywieranym na jednostkę powierzchni łapy przez cztery łapy. Na otwartym polu ranne zwierzęta pokonują krótszy całkowity dystans, częściej się zatrzymują i spędzają znacznie więcej czasu na środku pola, a mniej na rogach.
Można tu obserwować reprezentatywne mapy cieplne zwierząt kontrolnych i rannych. Uważaj, aby odciąć tętnicę od towarzyszącego jej nerwu i pozostawić maksymalny możliwy czas niedotlenienia. Kroki te zapewnią, że większość zwierząt przeżyje, a jednocześnie odniesie obrażenia.
Po tej procedurze można ocenić wszelkie wyniki biochemiczne, patologiczne lub behawioralne, w tym oceny, które zwykle ograniczają się do modeli uszkodzenia mózgu u gryzoni.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową metodę modelowania zapalnie uwrażliwionego niedotlenieniowo-niedokrwiennego i hiperoksygenicznego uszkodzenia mózgu u fretkek w 17. dniu po urodzeniu (P17). Celem pracy jest wyjaśnienie złożonych interakcji między przedłużonym stanem zapalnym a oksydacyjnym uszkodzeniem mózgu, które mają istotne znaczenie w przypadku późnych wcześniaków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- neurobiologia
- biologia rozwojowa
Wprowadzenie
- Zrozumienie wpływu stanu zapalnego na uszkodzenia mózgu jest kluczowe, zwłaszcza w przypadku wcześniaków.
- Model fretki pozwala na poznanie mechanizmów biologicznych leżących u podstaw takich urazów.
- Istnieje potrzeba stworzenia wiarygodnego modelu, który oddaje przedłużający się charakter uszkodzeń mózgu.
Cel badania
- Opracowanie kompleksowego modelu uszkodzenia mózgu, który symuluje warunki występujące u wcześniaków.
- Zbadanie mechanizmów biochemicznych uczestniczących w procesach stanu zapalnego i uszkodzeń oksydacyjnych.
- Stworzenie podstaw dla przyszłych badań nad neuroprotekcją i interwencjami terapeutycznymi.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano model fretki do symulacji przedwczesnego uszkodzenia mózgu.
- Kluczowe interwencje obejmują obustronne podwiązanie tętnic szyjnych, a następnie sekwencyjną hipoksję i hiperoksję.
- Procedury zostały starannie zoptymalizowane, aby zapewnić spójne i powtarzalne wyniki w określonych ramach czasowych.
- Pomiar morfometrii mózgu i reakcji behawioralnych w grupach uszkodzonych w porównaniu z grupami kontrolnymi.
Główne wyniki
- Model ten doprowadził do powstania umiarkowanych lub ciężkich urazów mózgu, charakteryzujących się specyficznymi zmianami morfologicznymi.
- Oceny behawioralne wykazały upośledzenie odruchów i sprawności motorycznej u zwierząt z urazami.
- U zwierząt z urazami zaobserwowano znaczące odchylenia w wzorcach ruchu, co pozwoliło uzyskać wgląd w wpływ stopnia ciężkości urazu na zachowanie.
Wnioski
- Niniejsze badanie waliduje nowy model służący do badania uszkodzeń mózgu spowodowanych zapaleniem i hipoksją.
- Wyniki mają istotne znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób przedłużający się stan zapalny wpływa na rozwijający się mózg.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do eksploracji strategii terapeutycznych mających na celu łagodzenie skutków uszkodzeń.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model na fretkach wypełnia krytyczną lukę w neuronauce okołoporodowej, symulując uwrażliwione stanem zapalnym niedotlenieniowo- Niedokrwienne uszkodzenie mózgu, istotne w przypadku późnych wcześniaków. Umożliwia on mechanistyczne zmniejszenie ryzyka w badaniach kandydatów na leki neuroprotekcyjne poprzez odzwierciedlenie złożonej interakcji między przedłużonym stanem zapalnym, niedokrwieniem, hipoksją i stresem oksydacyjnym. Model ten wspiera walidację celów terapeutycznych oraz przesiew fenotypowy w systemie istotnym dla przebiegu choroby, zapewniając ciągłość translacyjną w odniesieniu do ludzkiej encefalopatii noworodkowej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biopharmaceuticals
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na badanie hipotez terapeutycznych w kontekście rozwoju mózgu gyrencefalicznego, który odzwierciedla ludzki rozwój neurologiczny w okresie przedwczesnym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odczyty morfologiczne i behawioralne w celu walidacji celów funkcjonalnych i wyjaśnienia szlaków sygnałowych.
- Wartość prognostyczna: Umożliwia ocenę gradientów nasilenia urazów w celu wsparcia selekcji projektów w portfolio oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe dane dotyczące morfometrii mózgu i zmienności lokomocyjnej w celu standaryzacji testów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne fenotypy urazów w obrębie miotów, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Skalowalność: Wspiera podłużne testy behawioralne w systemach zautomatyzowanych, takich jak analizy catwalk i open field.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystanie frettek P17, których rozwój odpowiada 32–36 tygodniowi ciąży u ludzi, w celu zapewnienia istotności w kontekście przedwczesności.
- Wgląd mechanistyczny: Umożliwia badanie zaburzeń rozwoju kory oraz szlaków odporności u zwierząt nieobjętych zmianami.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Ułatwia ocenę interwencji ukierunkowanych na interakcje między stanem zapalnym a niedotlenieniem i niedokrwieniem (HI) w encefalopatii noworodkowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesów badawczych, od walidacji celu, przez przesiewy fenotypowe, aż po przedkliniczne badania skuteczności, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac w zależności od modulacji urazu.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących mechanizmów uszkodzeń uwrażliwionych przez stan zapalny, wpływających na zakręty i bruzdy kory mózgu.
- Przesiew: Umożliwia standaryzowaną ocenę wpływu związków na morfometrię mózgu i zmienność lokomocyjną.
- Analityka: Dostarcza ilościowych wyników, w tym wskaźników zwężenia zakrętów, skrócenia bruzd, poszerzenia szczeliny podłużnej oraz zmienności prędkości.
- Badania translacyjne: Powiązanie z patofizjologią wcześniaków poprzez ekwiwalencję rozwojową i fenotyp uszkodzenia.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Utworzenie platformy wielokrotnego użytku do testowania środków neuroprotekcyjnych w ramach wielu modalności terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Wiarygodność prognostyczna w walidacji celów terapeutycznych poprzez modelowanie interakcji zapalnych HI istotnych dla danej choroby.
- Wartość operacyjna: Standaryzowana indukcja urazu oraz wielomodalne fenotypowanie zwiększają powtarzalność i spójność w obrębie miotu.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez redukcję ryzyka biologicznego w późnych etapach programów rozwoju neurologicznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o skuteczność w klinicznie istotnym modelu urazu mózgu przedwczesnego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Do przeprowadzenia ligacji tętnicy szyjnej oraz procedur w komorze gazowej wymagana jest biegłość w chirurgii noworodków gryzoni/fretkeków oraz w opiece okołoperacyjnej.
- Instrumentarium obejmuje narzędzia chirurgiczne, łaźnie wodne z kontrolą temperatury, systemy monitorowania gazów oraz zautomatyzowane narzędzia do analizy behawioralnej.
- Standaryzacja pomiędzy miotami i operatorami jest kluczowa dla zapewnienia spójnego stopnia oceny ciężkości urazu oraz ustanowienia linii bazowej zachowań.
- Adaptacja do innych systemów modelowych wymaga uwzględnienia czasu rozwoju oraz analogii w dojrzewaniu mózgu gyrusencjifalicznego.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność w ekspresji urazów oraz konieczność posiadania umiejętności w zakresie perfuzji i pobierania mózgu do analizy morfometrycznej.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Surgical Preparation
1:34
Bilateral Carotid Artery Ligation
2:44
Sequential Hypoxia, Hyperoxia, and Hypoxia
4:02
Right Carotid Artery Ligation Reversal and Recovery and Temperature Management
4:40
Ex Vivo Brain Measurement
5:33
Results: Representative Morphological and Functional Injury Effects
7:00
Conclusion
