Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

Tkanki używane do immunohistochemii i histopatologii diagnostycznej są rutynowo utrwalane w 10% buforze fosforanowym formalinie. Wykrywanie antygenu wirusa wścieklizny w tkance mózgowej, który został utrwalony w formalinie, stanowi wyjątkowe wyzwanie, a test IHC okazał się czułą i specyficzną metodą wykrywania antygenu wirusa wścieklizny. Podstawową zaletą biopsji lub innych metod wykrywania jest to, że antygeny można wykryć w odniesieniu do morfologii tkanek i komórek.

W przypadku IHC, lokalizacja antygenu wścieklizny w tkankach mózgu i innych niż mózg, dostarcza dodatkowych informacji, których nie można było uzyskać za pomocą rutynowych odcinków barwienia Hematoksyliną i Eozyną. Badania diagnostyczne w kierunku wścieklizny są ważne dla rozpoczęcia profilaktyki poekspozycyjnej u ludzi narażonych na wirusa wścieklizny. IHC jest jednym z najczęściej wykonywanych testów na tkankach utrwalonych formaliną.

Dzięki specyficznym przeciwciałom może być stosowany do wykrywania odpowiednich patogenów. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść od trzech do pięciu milimetrowych kawałków tkanki mózgowej, pobranych po sekcji zwłok, w 10% buforowanym roztworze formaliny na 24 do 72 godzin. Zapisz przybliżoną masę tkanki, typ tkanki i objętość formaliny.

Umieść tkanki w 70% etanolu w celu dłuższego przechowywania tkanek po utrwaleniu formaliny, a przed przetwarzaniem. Po utrwaleniu próbki należy wyciąć tkankę, aby uwzględnić ważne obszary mózgu, takie jak przekroje pnia mózgu, móżdżku lub hipokampa. Każdy przyciąć na grubość od trzech do pięciu milimetrów.

Umieść tkanki w kasetach do obróbki. Przetwarzaj kasety tkankowe pod kątem infiltracji wosku parafinowego. Umieść je w blokach parafinowych i pokrój na mikrotomiku.

Najpierw ustaw naczynie do barwienia, jak pokazano na rysunku 1 protokołu tekstowego. Napełnij każde naczynie 250 mililitrami przygotowanego roztworu. Aby przygotować roztwór podstawowy substratu AEC, należy użyć szklanej pipety, aby rozpuścić jedną 20 miligramową tabletkę AEC w 5 mililitrach N, N-dimetyloformamidu.

Aby przygotować roztwór podstawowy proteazy, rozpuść 7 miligramów proteazy w 200 mililitrach PBS. Aby przygotować bufor do płukania, dodaj 100 mililitrów Tween od 80 do 990 mililitrów PBS i dobrze wymieszaj, aby uzyskać jednorodny roztwór PBT-T. Za pomocą mikrotomu wykonaj pięciomikrometrowy przekrój parafiny.

Załaduj sekcję na łaźnię wodną o temperaturze 38 stopni Celsjusza i zbierz ją na szkiełka podstawowe. Oznacz szkiełka pisakiem odpornym na odczynniki. Umieść szkiełka na blasze i rozpuść w piekarniku w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza przez godzinę.

Następnie wyjmij szkiełka z piekarnika i natychmiast je odpaśnij, używając 3 kolejnych płukań ksylenu po 5 minut każde. Następnie należy ponownie nawodnić sekcje na szkiełku poprzez sekwencyjne zanurzenie w zmniejszających się rozcieńczeniach etanolu do wody dejonizowanej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Traktować szkiełka proteazą przez 30 minut w celu pobrania antygenu proteolitycznego, a następnie płukać szkiełka w PBS-T przez 10 minut i traktować je 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut.

Następnie ponownie umyj szkiełka PBS-T przez 10 minut. Na początek wyjmij jedno szkiełko z bufora, upewniając się, że dotykasz tylko jednego szkiełka na raz, podczas gdy pozostałe pozostają zanurzone, i użyj ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar buforu z okolic sekcji tkanki. Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej i inkubuj z normalną kozią surowicą w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Następnie inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej z optymalnym, z góry ustalonym rozcieńczeniem, pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko wściekliźnie i ujemnymi przeciwciałami kontrolnymi, w temperaturze pokojowej przez 60 minut, bez płukania pomiędzy nimi. Następnie przemyć szkiełka PBS-T przez 10 minut i inkubować w komorze wilgotnościowej z biotynylowanym przeciwciałem w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Ponownie umyć szkiełka preparatem PBS-T przez 10 minut.

Inkubować szkiełka i komorę wilgotnościową z podziałem paskowym i kompleksem HRB w temperaturze pokojowej przez 15 minut i myć PBS-T przez 10 minut. Następnie inkubować z AEC w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 10 minut i przeciwplamić hematoksyną Gilla, rozcieńczoną od jednego do dwóch wodą dejonizowaną przez dwie minuty.

Następnie spłucz nadmiar hematoksyliny, zanurzając szkiełka w wodzie dejonizowanej. Opłucz szkiełka w Scott's Tap Water przez 30 sekund i myj w wodzie dejonizowanej przez 10 minut. Zdejmuj szkiełka pojedynczo i montuj je za pomocą rozpuszczalnego w wodzie medium montażowego.

Następnie użyj mikroskopu świetlnego, aby odczytać szkiełka. W tym badaniu zademonstrowano test chemii immunocytarnej do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny jako alternatywny test diagnostyczny dla tkanek utrwalonych w formalinie. Przedstawiono reprezentatywny wynik barwienia chemii immunocytarnej pozytywnych i ujemnych próbek kontrolnych w różnych tkankach mózgowych, w tym w pniu mózgu, komórkach móżdżku i purkiniego oraz hipokampie.

Purpurowe czerwone zabarwienie, które wskazuje na rozwój koloru przy użyciu podłoża AEC na niebieskim tle barwionym przeciwstawnie, wynika z reaktywności przeciwciał przeciwko antygenowi wścieklizny. Dodatni wynik w immunohistochemii odpowiada purpurowoczerwonemu zabarwieniu w skrawkach tkanki. Zabarwienie inkluzji cytoplazmatycznych i ziarnistych inkluzji o różnej wielkości wskazuje na to, że próbki są dodatnie pod kątem zakażeń RABB.

Próbki uznaje się za ujemne, jeśli nie zaobserwowano specyficznego czerwonego zabarwienia lub tylko niebieskie tło, spowodowane hematoksyliną. Oprócz pozytywnego barwienia, rozkład inkluzji może zapewnić pośrednie określenie ilościowe poziomów antygenu wścieklizny w próbce, co może odpowiadać mianu wirusa w próbce tkanki. Niezależnie od poziomów dystrybucji, każde specyficzne barwienie sklasyfikuje próbkę jako dodatnią pod kątem wykrycia antygenu RAPV.

Tkanki powinny być odpowiednio utrwalone w formalinie i unikać zamrażania tkanek podczas tego procesu. Antygen wścieklizny jest wykrywany przez IHC, a następnie można wykonać techniki molekularne na skrawkach parafiny w celu określenia wariantu Lyssavirus na podstawie informacji o sekwencji RNA. Z odczynnikami takimi jak ksylen i formalina należy obchodzić się w dygestoriach.

Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z AEC, ponieważ jest to czynnik rakotwórczy.