Name: Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa w tkankach utrwalonych formaliną. Ta metoda umożliwia czułą i swoistą diagnostykę wścieklizny z zachowaniem morfologii tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy laborantom, epidemiologom i współpracownikom departamentów zdrowia publicznego za przesyłanie próbek do Centrów Kontroli i Prewencji Chorób. Ustalenia i wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami i wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują oficjalne stanowisko Centrów Kontroli i Prewencji Chorób. Nazwy handlowe i źródła komercyjne służą wyłącznie do identyfikacji i nie oznaczają poparcia ze strony Centrów Kontroli i Prewencji Chorób.

Chociaż protokół IHC został przeprowadzony na tkankach utrwalonych w formalinie, które dezaktywują RABV, jeśli są obecne, odpowiednie protokoły bezpieczeństwa biologicznego powinny być odpowiednio przestrzegane. Wszystkie procedury bezpieczeństwa biologicznego są opisane w Bezpieczeństwie biologicznym w laboratoriach mikrobiologicznych i biomedycznych (BMBL) wydanie 5 (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), w tym noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) i wymóg szczepień zgodnie z opisem12. Ponadto należy przestrzegać właściwego hermetyzowania i obchodzenia się z niebezpiecznymi chemikaliami (takimi jak formalina, AEC i ksylen) (np. dygestoria).
1. Utrwalanie tkanek w formalinie
<ol>
	<li>Umieść 3-5 mm tkanki mózgowe pobrane po sekcji zwłok13 w 10% buforowanym fosforanem roztworze formaliny (stosunek tkanka do formaliny 1:20 do 1:50) przez 24-72 h. 
	UWAGA: Formalina jest toksycznym utrwalaczem.</li>
	<li>Zapisz przybliżoną masę (rozmiar) tkanki, typ tkanki (obszary mózgu) i objętość formaliny. Ważne jest, aby laboratoria dokumentowały i prowadziły zapisy dotyczące czasów utrwalania.</li>
	<li>W celu dłuższego przechowywania tkanek po utrwaleniu formaliny i przed przetworzeniem należy umieścić tkankę w 70% etanolu.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Po utrwaleniu próbki należy przeciąć tkankę, aby uwzględnić ważne obszary mózgu, np. przekroje pnia mózgu, móżdżku (3 płaty) lub hipokampa (oba hipokampy), z których każdy ma grubość od 3 do 5 mm i umieszcza w kasetach do obróbki.</li>
	<li>Przetwarzać kasety tkankowe do infiltracji wosku parafinowego, osadzone w blokach parafinowych i podzielone (3 do 6 μm) na mikrotomie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie materiałów / Barwienie naczyń
<ol>
	<li>Ustaw naczynie do barwienia14 (Tabela materiałów), jak pokazano w Rysunek 1. Napełnij każde naczynie 250 ml roztworu.</li>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego substratu 3-amino-9-etylokarbiizolu (AEC)
	<ol>
		<li>Rozpuścić jedną tabletkę 20 mg 3-amino9-etylokarbazolu (AEC) w 5 ml N,N, dimetyloformamidu za pomocą szklanej pipety. 
		UWAGA: AEC jest czynnikiem rakotwórczym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego proteazy (np. pronazy) do pobrania antygenu
	<ol>
		<li>Rozpuścić 7 mg proteazy w 200 ml PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu płuczącego PBS-T
	<ol>
		<li>Dodaj 10 ml Tween 80 do 990 ml PBS. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać jednorodny roztwór.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Deparafinizacja i ponowne uwodnienie tkanek
<ol>
	<li>Wykonać skrawek parafiny o wielkości 5 μm za pomocą mikrotomu, umieścić go na łaźni wodnej w temperaturze 38 °C i zebrać na szkiełkach podstawowych. Oznacz szkiełka długopisem/markerem odpornym na odczynniki.</li>
	<li>Umieść szkiełka na blasze i rozpuść w piekarniku o temperaturze 55-60 °C przez 1 godzinę. Nie należy podnosić temperatury powyżej 60 °C, ponieważ może to zniszczyć antygen wirusowy.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka z piekarnika i natychmiast odparafinowaj w 3 kolejnych płukaniach ksylenu po 5 minut każde w naczyniach 1, 2 i 3.</li>
	<li>Ponownie uwodnić sekcje na szkiełku poprzez sekwencyjne zanurzenie w zmniejszającym się rozcieńczeniu etanolu do wody dejonizowanej: (4 do 11 to płukanie zanurzeniowe) danie 4: ksylen/100% etanol (1:1); danie 5: 100% etanolu; danie 6: 100% etanolu; danie 7: 95% etanolu; danie 8: 95% etanolu; danie 9: 80% etanolu; danie 10: 70% etanolu; danie 11: Woda dejonizowana (<silna klasa="xfig">Rysunek 1. Ustawienie talerza). 
	UWAGA: Ksylen jest niebezpieczną substancją chemiczną i praca powinna być wykonywana pod wyciągiem.</li>
</ol>
5. Pobieranie antygenu proteolitycznego
<ol>
	<li>Traktować szkiełka proteazą (2,5 μg/ml PBS) przez 30 minut w celu pobrania antygenu proteolitycznego w naczyniu 12.</li>
	<li>Następnie płucz w PBS-T przez 10 minut (danie 13).</li>
	<li>Traktuj 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut (danie 14).</li>
	<li>Ponownie myj PBS-T przez 10 minut (danie 15).</li>
</ol>
6. Procedura barwienia
<ol>
	<li>Szkiełka należy obsługiwać pojedynczo, trzymając pozostałe prowadnice zanurzone w buforze (nie wyjmuj całego uchwytu prowadnicy - prowadnice powinny być mokre). Usuń jedno szkiełko podstawowe i zetrzyj nadmiar buforu (za pomocą ręcznika papierowego) z okolic sekcji tkanki, uważając, aby nie naruszyć fragmentu tkanki. Inkubuj szkiełka w komorze wilgotnościowej, wykonanej przez umieszczenie zwilżonych ręczników papierowych, na stole laboratoryjnym top14 w temperaturze pokojowej z normalną surowicą kozią (blokowanie) przez 15 minut.</li>
	<li>Inkubować z optymalnym, wstępnie ustalonym rozcieńczeniem, pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko wściekliźnie (rozcieńczenie 1:250 mysiej surowicy przeciwko wściekliźnie, nieopublikowane) (kontrola pozytywna) i ujemnymi przeciwciałami kontrolnymi w temperaturze pokojowej takiej samej jak powyżej (krok 6.1.) przez 60 minut, bez przemywania pomiędzy nimi.</li>
	<li>Po 60 minutach myć PBS-T przez 10 minut (danie 16).</li>
	<li>Inkubować z biotynylowanym przeciwciałem (specyficznym dla gatunku) w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 15 minut (postępowanie takie samo jak w kroku 6.1.).</li>
	<li>Myć PBS-T przez 10 minut (danie 16).</li>
	<li>Inkubować z kompleksem Streptawidyna-HRP w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 15 minut (obchodzenie się z nim jak w pkt 6.1.).</li>
	<li>Myć PBS-T przez 10 minut (danie 16).</li>
	<li>Inkubować z substratem peroksydazy, aminoetylokarbazolem (AEC), w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wykonać AEC tuż przed użyciem. W tym celu dodaj 1 ml roztworu podstawowego AEC do 14 ml 0,1 M buforu octanowego o pH 5,2. Dodać 0,15 ml 3% H2O2. Przefiltrować mieszaninę tuż przed użyciem (filtr 0,45 μm). 
	UWAGA: Roztwór roboczy AEC jest stabilny tylko przez 2-3 godziny. Roztwór podstawowy AEC może być przechowywany w lodówce przez dłuższy czas.</li>
	<li>Myć w wodzie dejonizowanej 10 min (danie 17)</li>
	<li>Barwione przeciwstawnie hematoksyliną Gilla rozcieńczone w stosunku 1:2 wodą dejonizowaną przez 2 minuty (danie 18).</li>
	<li>Nadmiar hematoksyliny spłukać wodą dejonizowaną, spłukać zanurzeniowo (naczynie 19 i 20).</li>
	<li>Opłucz w naczyniu Scott's Tap Water 30 s (roztwór do niebieszczenia) 21.</li>
	<li>Myć w wodzie dejonizowanej 10 min (danie 22)</li>
	<li>Zdejmuj szkiełka pojedynczo - zamontuj za pomocą rozpuszczalnego w wodzie medium montażowego.</li>
	<li>Czytaj slajdy pod mikroskopem świetlnym.</li>
</ol>

<ol><li>Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+rabies%3A+current+conundrums%2C+concerns%2C+contradictions+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies.</a> F1000Research. 6, 184(2017).</li>
<li>Fooks, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+rabies+and+prospects+for+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Current status of rabies and prospects for elimination.</a> Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).</li>
<li>Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+fluorescence-labeled+rabies+virus%3A+enhanced+green+fluorescent+protein-tagged+phosphoprotein+P+supports+virus+gene+expression+and+formation+of+infectious+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles.</a> Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+Expert+Consulation+on+Rabies%2C+Third+Report%5BTitle%5D)+AND+%22WHO+Technical+Report+Series%22%5BJournal%5D)">WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report.</a> WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).</li>
<li>Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibody+staining+of+street+and+fixed+rabies+virus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).</li>
<li>Lembo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+direct%2C+rapid+immunohistochemical+test+for+rabies+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).</li>
<li>Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+avidin-biotin+peroxidase+system+to+detect+rabies+antigen+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).</li>
<li>Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+five+year+%281985-1989%29+retrospective+study+of+equine+neurological+diseases+with+special+reference+to+rabies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Pathology%22%5BJournal%5D)">A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies.</a> Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).</li>
<li>Inoue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reactive+antigenicity+of+nucleoproteins+of+lyssaviruses+recognized+by+a+monospecific+antirabies+virus+nucleoprotein+antiserum+on+paraffin+sections+of+formalin-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues.</a> Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+diagnostic+immunohistochemistry+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).</li>
<li>Feiden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+staining+of+rabies+virus+antigen+with+monoclonal+and+polyclonal+antibodies+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Zentralblatt+fur+Veterinarmedizin+Reihe+B%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections.</a> Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).</li>
<li>Manning, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+rabies+prevention--United+States%2C+2008%3A+recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Reports+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices.</a> Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Laboratory+techniques+in+rabies%22">Laboratory techniques in rabies</a>. 1, 5th ed, 67-72 (2018).</li>
<li>Patrick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Rabies+Surveillance+Using+a+Direct+Rapid+Immunohistochemical+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).</li>
<li>Whitfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+the+fluorescent+antibody+test+for+rabies+diagnosis+in+fresh+and+formalin-fixed+brain+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens.</a> Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Diagnostic+procedures+for+antigen+detection%22">Diagnostic procedures for antigen detection</a>. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).</li>
<li>Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+direct+fluorescent+antibody+test+does+not+inactivate+rabies+or+eastern+equine+encephalitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Methods%22%5BJournal%5D)">Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses.</a> Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na wysoką śmiertelność wścieklizny po wystąpieniu objawów, diagnoza zwierząt podejrzanych o zakażenie RABV jest niezwykle ważna dla odpowiedniego leczenia profilaktycznego po ekspozycji. Diagnostyka wścieklizny zależy przede wszystkim od technik opartych na DFA, DRIT i PCR przy użyciu świeżych lub mrożonych tkanek. W przypadku badania tkanek utrwalonych w formalinie, test IHC stanowi alternatywną metodę czułego i swoistego wykrywania antygenu RABV. Podczas gdy tkanki utrwalone w formalinie mają białka ustabili...

Wścieklizna to ostre, postępujące zapalenie mózgu wywołane przez wirusy RNA o negatywnym znaczeniu należące do rodzaju lyssavirus1. Prawie 99% wszystkich zgonów ludzi spowodowanych zakażeniem wirusem wścieklizny (RABV), typem należącym do rodzaju, jest przenoszonych przez psy2. Diagnostyka wścieklizny u zwierząt podejrzanych o wściekliznę opiera się na wykryciu antygenu (głównie nukleoproteiny kodowanej przez wirusa, białka N) w kompleksie z genomowym RNA (kompleks rybonukleoproteinowy, RNP) w tkance mózgowej3. Wykrywanie antygenu za pomocą testu na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) jest uważane za złoty standard w diagnostyce wścieklizny4. Metoda wykorzystuje świeży lub świeżo zamrożony materiał mózgu, wycisk dotykowy na szkiełku, utrwalenie w acetonie, barwienie przy użyciu dostępnych na rynku fluorescencyjnych przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych znakowanych izotiocyjanianem (FITC) i odczytane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej5. Test DFA jest szybki, czuły i specyficzny do wykrywania antygenu wścieklizny w świeżej tkance mózgowej. Niedawno wykazano, że bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT), technika zmodyfikowanej immunohistochemii (IHC), wykazuje podobną czułość na DFA, ale oferuje przewagę mikroskopii świetlnej do wizualizacji6. Podczas gdy metoda wykrywania zastosowana w DRIT jest podobna do IHC, początkowy etap wykorzystuje świeże lub zamrożone tkanki do generowania wycisków dotykowych próbki, a następnie utrwalania w formalinie.
IHC jest powszechnie używaną techniką do określania zmian histologicznych i wykrywania białek za pomocą specyficznych przeciwciał w tkankach utrwalonych formaliną osadzonych w blokach parafinowych. IHC jest uznanym alternatywnym testem do wykrywania antygenu wścieklizny w sekcjach tkanek 7. IHC jest szczególnie wykorzystywany do diagnozowania retrospektywnych przypadków, które wykazywały choroby neurologiczne, w celu określenia obciążenia wścieklizną8. Tkanki utrwalone w formalinie zatopione w parafinie zachowują białka do wykrycia nawet po kilku latach, gdy są przechowywane w temperaturze otoczenia9. Leczenie formaliną modyfikuje białka poprzez sieciowanie i zmianę łańcuchów bocznych aminokwasów, co może spowodować, że epitopy przestaną reagować na przeciwciała10. Podczas gdy test IHC do wykrywania antygenu wścieklizny obejmuje mAb lub pAb, ten ostatni jest korzystny, ponieważ można wykryć wiele epitopów i rozbieżnych lyssawirusów11.
Standardowe etapy związane z IHC to utrwalanie tkanek w formalinie, osadzanie w blokach parafinowych, cięcie tkanek, deparafinizacja i hydratacja, odzyskiwanie epitopów, reaktywność przeciwko pierwotnym i wtórnym przeciwciałom oraz rozwój przy użyciu substratów chromogennych. Manuskrypt ten opisuje szczegółowy opis protokołu diagnozy wścieklizny. Do wykrywania antygenu wścieklizny wykorzystuje się surowicę myszy uodpornioną RABV (pAbs) wygenerowaną w amerykańskich Centrach Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) w Atlancie w stanie Georgia w połączeniu z biotynylowanymi przeciwciałami wtórnymi przeciwko myszy. Biotynylowane Abs wykrywa się przez dodanie kompleksu streptawidyny i peroksydazy chrzanowej (HRP), a następnie rozwój koloru za pomocą substratu amino-etylokarbazolu.

<table><tbody><tr><td>3% nadtlenek wodoru</td> Marki <td></td><td>faramakii</td><td>Od ręki 3% H2O2</td></tr><tr><td>3-amino-9-etylokarbazol (AEC)</td><td>Milipore Sigma</td><td>A6926</td><td></td></tr><tr><td>Bufor octanowy pH 5,2</td><td>Poly Scientific R& D Corp.</td><td>s140</td><td></td></tr><tr><td>Buforowana formalina 10% buforowana fosforanem</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td>Certyfikowane</td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-553-471</td><td>24 X 50 mm</td></tr><tr><td>Etanol 190 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 Proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Preparat hematoksyliny Gilla #2</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS401-1D</td><td></td></tr><tr><td>HistoMark Zestaw peroksydazy biotynowo-streptawidynowej</td><td>seracare</td><td>71-00-18</td><td>Pierwotne przeciwciało myszy&nbsp;</td></tr><tr><td>ImmunoHistoMount</td><td>Millipore Sigma</td><td>i1161</td><td>Podłoże montażowe</td></tr><tr><td>N,N, dimetyloformamid GR</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>RR14440.01</td><td>01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)</td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Obiektyw</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-APOCHROMATYCZNY 20X/0.75 Cel</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millipore Sigma</td><td>53702</td><td>Proteaza, Streptomyces griseus</td></tr><tr><td>Scott's Tap Water&nbsp;</td><td>Poly Scientific R& D Corp.</td><td>s1887</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw bejc Tissue-Tek Slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-294-72</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-80&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>Obrazowanie histologiczne</td></tr><tr><td>Zeiss Axioplan 2 - mikroskop</td><td>Wielu dostawców</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

Jedną z głównych metod diagnostycznych wścieklizny jest wykrywanie kompleksu (antygenu) rybonukleoproteiny wirusa (RNP) w próbkach zakażonych tkanek. Podczas gdy test na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) lub bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) są najczęściej stosowane do wykrywania antygenu, oba testy wymagają świeżych i/lub zamrożonych tkanek do wycisków na szkiełkach przed wykryciem antygenu przy użyciu przeciwciał. Jeśli próbki są pobierane i utrwalane w formalinie, żaden test nie jest optymalny do wykrywania antygenu, jednak badanie można przeprowadzić za pomocą konwencjonalnej immunohistochemii (IHC) po zatopieniu w blokach parafiny i pocięciu. W tej metodzie IHC tkanki są barwione przeciwciałami przeciwko wściekliźnie, skrawki są deparafinizowane, antygen jest pobierany przez częściową proteolizę lub innymi metodami oraz inkubowany z przeciwciałami pierwszorzędowymi i wtórnymi. Antygeny są barwione za pomocą peroksydazy chrzanowej / aminoetylokarbazolu i barwione przeciwwagowo hematoksyliną w celu wizualizacji za pomocą mikroskopu świetlnego. Oprócz specyficznego wykrywania antygenu, utrwalanie formaliny oferuje inne korzyści, takie jak oznaczanie zmian histologicznych, złagodzone warunki przechowywania i transportu próbek (w temperaturach otoczenia), możliwość testowania przypadków retrospektywnych oraz poprawa bezpieczeństwa biologicznego poprzez inaktywację czynników zakaźnych.

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki barwienia IHC próbek kontroli pozytywnej i negatywnej w różnych badanych tkankach mózgu. Rysunek 2A,D,G przedstawia próbki pozytywne przy powiększeniu 200x, natomiast Rysunek 2B,E,H odpowiadają odpowiednio powiększeniu 400x. Rysunek 2A-C odpowiada pniowi mózgu; <strong class="...

Tutaj prezentujemy protokół testu immunohistochemicznego do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny jako alternatywny test diagnostyczny dla tkanek utrwalonych w formalinie.

Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Tkanki używane do immunohistochemii i histopatologii diagnostycznej są rutynowo utrwalane w 10% buforze fosforanowym formalinie. Wykrywanie antygenu wirusa wścieklizny w tkance mózgowej, który został utrwalony w formalinie, stanowi wyjątkowe wyzwanie, a test IHC okazał się czułą i specyficzną metodą wykrywania antygenu wirusa wścieklizny. Podstawową zaletą biopsji lub innych metod wykrywania jest to, że antygeny można wykryć w odniesieniu do morfologii tkanek i komórek.W przypadku IHC, lokalizacja antygenu wścieklizny w tkankach mózgu i innych niż mózg, dostarcza dodatkowych informacji, których nie można było uzyskać za pomocą rutynowych odcinków barwienia Hematoksyliną i Eozyną. Badania diagnostyczne w kierunku wścieklizny są ważne dla rozpoczęcia profilaktyki poekspozycyjnej u ludzi narażonych na wirusa wścieklizny. IHC jest jednym z najczęściej wykonywanych testów na tkankach utrwalonych formaliną.Dzięki specyficznym przeciwciałom może być stosowany do wykrywania odpowiednich patogenów. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść od trzech do pięciu milimetrowych kawałków tkanki mózgowej, pobranych po sekcji zwłok, w 10% buforowanym roztworze formaliny na 24 do 72 godzin. Zapisz przybliżoną masę tkanki, typ tkanki i objętość formaliny.Umieść tkanki w 70% etanolu w celu dłuższego przechowywania tkanek po utrwaleniu formaliny, a przed przetwarzaniem. Po utrwaleniu próbki należy wyciąć tkankę, aby uwzględnić ważne obszary mózgu, takie jak przekroje pnia mózgu, móżdżku lub hipokampa. Każdy przyciąć na grubość od trzech do pięciu milimetrów.Umieść tkanki w kasetach do obróbki. Przetwarzaj kasety tkankowe pod kątem infiltracji wosku parafinowego. Umieść je w blokach parafinowych i pokrój na mikrotomiku.Najpierw ustaw naczynie do barwienia, jak pokazano na rysunku 1 protokołu tekstowego. Napełnij każde naczynie 250 mililitrami przygotowanego roztworu. Aby przygotować roztwór podstawowy substratu AEC, należy użyć szklanej pipety, aby rozpuścić jedną 20 miligramową tabletkę AEC w 5 mililitrach N, N-dimetyloformamidu.Aby przygotować roztwór podstawowy proteazy, rozpuść 7 miligramów proteazy w 200 mililitrach PBS. Aby przygotować bufor do płukania, dodaj 100 mililitrów Tween od 80 do 990 mililitrów PBS i dobrze wymieszaj, aby uzyskać jednorodny roztwór PBT-T. Za pomocą mikrotomu wykonaj pięciomikrometrowy przekrój parafiny.Załaduj sekcję na łaźnię wodną o temperaturze 38 stopni Celsjusza i zbierz ją na szkiełka podstawowe. Oznacz szkiełka pisakiem odpornym na odczynniki. Umieść szkiełka na blasze i rozpuść w piekarniku w temperaturze od 55 do 60 stopni Celsjusza przez godzinę.Następnie wyjmij szkiełka z piekarnika i natychmiast je odpaśnij, używając 3 kolejnych płukań ksylenu po 5 minut każde. Następnie należy ponownie nawodnić sekcje na szkiełku poprzez sekwencyjne zanurzenie w zmniejszających się rozcieńczeniach etanolu do wody dejonizowanej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Traktować szkiełka proteazą przez 30 minut w celu pobrania antygenu proteolitycznego, a następnie płukać szkiełka w PBS-T przez 10 minut i traktować je 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut.Następnie ponownie umyj szkiełka PBS-T przez 10 minut. Na początek wyjmij jedno szkiełko z bufora, upewniając się, że dotykasz tylko jednego szkiełka na raz, podczas gdy pozostałe pozostają zanurzone, i użyj ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar buforu z okolic sekcji tkanki. Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej i inkubuj z normalną kozią surowicą w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Następnie inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej z optymalnym, z góry ustalonym rozcieńczeniem, pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko wściekliźnie i ujemnymi przeciwciałami kontrolnymi, w temperaturze pokojowej przez 60 minut, bez płukania pomiędzy nimi. Następnie przemyć szkiełka PBS-T przez 10 minut i inkubować w komorze wilgotnościowej z biotynylowanym przeciwciałem w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Ponownie umyć szkiełka preparatem PBS-T przez 10 minut.Inkubować szkiełka i komorę wilgotnościową z podziałem paskowym i kompleksem HRB w temperaturze pokojowej przez 15 minut i myć PBS-T przez 10 minut. Następnie inkubować z AEC w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Umyj szkiełka w wodzie dejonizowanej przez 10 minut i przeciwplamić hematoksyną Gilla, rozcieńczoną od jednego do dwóch wodą dejonizowaną przez dwie minuty.Następnie spłucz nadmiar hematoksyliny, zanurzając szkiełka w wodzie dejonizowanej. Opłucz szkiełka w Scott's Tap Water przez 30 sekund i myj w wodzie dejonizowanej przez 10 minut. Zdejmuj szkiełka pojedynczo i montuj je za pomocą rozpuszczalnego w wodzie medium montażowego.Następnie użyj mikroskopu świetlnego, aby odczytać szkiełka. W tym badaniu zademonstrowano test chemii immunocytarnej do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny jako alternatywny test diagnostyczny dla tkanek utrwalonych w formalinie. Przedstawiono reprezentatywny wynik barwienia chemii immunocytarnej pozytywnych i ujemnych próbek kontrolnych w różnych tkankach mózgowych, w tym w pniu mózgu, komórkach móżdżku i purkiniego oraz hipokampie.Purpurowe czerwone zabarwienie, które wskazuje na rozwój koloru przy użyciu podłoża AEC na niebieskim tle barwionym przeciwstawnie, wynika z reaktywności przeciwciał przeciwko antygenowi wścieklizny. Dodatni wynik w immunohistochemii odpowiada purpurowoczerwonemu zabarwieniu w skrawkach tkanki. Zabarwienie inkluzji cytoplazmatycznych i ziarnistych inkluzji o różnej wielkości wskazuje na to, że próbki są dodatnie pod kątem zakażeń RABB.Próbki uznaje się za ujemne, jeśli nie zaobserwowano specyficznego czerwonego zabarwienia lub tylko niebieskie tło, spowodowane hematoksyliną. Oprócz pozytywnego barwienia, rozkład inkluzji może zapewnić pośrednie określenie ilościowe poziomów antygenu wścieklizny w próbce, co może odpowiadać mianu wirusa w próbce tkanki. Niezależnie od poziomów dystrybucji, każde specyficzne barwienie sklasyfikuje próbkę jako dodatnią pod kątem wykrycia antygenu RAPV.Tkanki powinny być odpowiednio utrwalone w formalinie i unikać zamrażania tkanek podczas tego procesu. Antygen wścieklizny jest wykrywany przez IHC, a następnie można wykonać techniki molekularne na skrawkach parafiny w celu określenia wariantu Lyssavirus na podstawie informacji o sekwencji RNA. Z odczynnikami takimi jak ksylen i formalina należy obchodzić się w dygestoriach.Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z AEC, ponieważ jest to czynnik rakotwórczy.

immunohistochemistry-test-for-lyssavirus-antigen-detection-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Technika łącząca barwienie tetramerami in situ i hybrydyzację in situ (ISTH) umożliwia wizualizację, mapowanie i analizę bliskości przestrzennej wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ względem zainfekowanych wirusem komórek docelowych oraz określenie ilościowych zależności między tymi efektorami odpornościowymi a celami w kontekście wyników infekcji.

Technika jednoczesnej wizualizacji wirusowo-specyficznych limfocytów T CD8+ i komórek zainfekowanych wirusem in situ

Ten film demonstruje barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny w zakażonej tkance mózgowej myszy. Proces ten obejmuje deparatynizację i leczenie alkoholem, a następnie leczenie proteolityczne w celu zwiększenia dostępności antygenu. Barwienie immunohistochemiczne ujawnia czerwone osady, potwierdzające obecność antygenów wścieklizny w skrawku tkankowym.

Barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenów wirusa wścieklizny

Prezentujemy tutaj zoptymalizowany, szczegółowy protokół podwójnego barwienia immunologicznego w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie odcinkach tkanek ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i obwodowych węzłów chłonnych (LN).

Analiza immunohistochemiczna w ośrodkowym układzie nerwowym szczura i skrawkach tkanek obwodowych węzłów chłonnych

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Nowatorskie, kompatybilne z barwieniem immunologicznym techniki oczyszczania tkanek, takie jak ostateczne obrazowanie 3D organów oczyszczonych rozpuszczalnikiem, pozwalają na wizualizację 3D infekcji mózgu wirusem wścieklizny i jego złożonego środowiska komórkowego. Grube, znakowane przeciwciałami wycinki tkanki mózgowej są optycznie przezroczyste, aby zwiększyć głębokość obrazowania i umożliwić analizę 3D za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem

Ten protokół wprowadza standardową procedurę laboratoryjną do testowania diagnostycznego antygenów wirusa lyssa u nietoperzy na Tajwanie.

Standardowa procedura operacyjna nadzoru populacji nietoperzy na Tajwanie pod kątem wirusa Lyssa

Ten RT-PCR w czasie rzeczywistym wykorzystujący barwnik interkalacyjny dsDNA jest odpowiedni do diagnozowania infekcji wirusem lyssa. Metoda rozpoczyna się od ekstrakcji RNA z próbek przedubojowych lub pośmiertnych z podejrzeniem wścieklizny, szczegółowo opisując przygotowanie mieszanki wzorcowej, dodanie RNA, ustawienie maszyny w czasie rzeczywistym i prawidłową interpretację wyników.

Pan-lyssavirus RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Protokół ten demonstruje test reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) pan-lizawirusa LN34 w czasie rzeczywistym od pobierania tkanek do interpretacji wyników, w tym aktualizacje sekwencji primerów i formuł poprawiających wydajność testu dla niektórych lizawirusów i zalegowców niezwiązanych z wścieklizną. Demonstrujemy także konfigurację testu dla multipleksowanego formatu LN34 z pojedynczym dołkiem (LN34M).

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa w tkankach utrwalonych formaliną. Ta metoda umożliwia czułą i swoistą diagnostykę wścieklizny z zachowaniem morfologii tkanek.

Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

Przeglądaj więcej filmów