5 października 2019
Ten protokół opisuje eksperymenty mikrobiologiczne pod podwyższonym ciśnieniem w celu zbadania procesów biogórniczych in situ. W podejściu eksperymentalnym wykorzystuje się kołyszący się reaktor wysokociśnieniowy wyposażony w komórkę reakcyjną złoto-tytanową zawierającą kulturę mikrobiologiczną w kwaśnym, bogatym w żelazo środowisku.
Biogórnictwo opisuje zastosowanie bioługowania do ekstrakcji miedzi i innych metali ciśnieniowych ze skał poprzez rozpuszczanie siarczków metali za pomocą bakterii kwasolubnych. Na przykład miedź jest rudą coopashefa, którą można ekstrahować za pomocą tej bakterii, rozpuszczając siarczki. Następnie wytwarzany jest roztwór bogaty w siarczan miedzi, z którego można łatwo wyekstrahować miedź.
Biogórnictwo in situ to ekstrakcja metali za pomocą bakterii bez konieczności prowadzenia wykopów i prac wydobywczych pod ziemią lub w odkrywce. Zamiast tego bogaty w żelazo kwaśny roztwór jest pompowany w dół formacji skalnej, siarczki metali rozpuszczają się, a bogaty w metal roztwór jest pompowany z powrotem na powierzchnię, z której można następnie wyekstrahować metale. W tym konkretnym eksperymencie użyto wysokociśnieniowej komórki reaktora, która symuluje warunki panujące w głębokiej formacji.
Badane są bakterie, a ich aktywność związana jest z redukcją żelaza sprzężoną z utlenianiem związków siarki, a w szczególności interesuje nas, jak aktywne są komórki pod wysokim ciśnieniem i jak zmienia się ich tempo pod wpływem ciśnienia. Do eksperymentów można użyć reaktora wysokociśnieniowego, takiego jak ten przedstawiony tutaj, który może symulować warunki ciśnienia do 350 barów. Dno reaktora wysokociśnieniowego składa się ze zbiornika reaktora, który może zawierać próbkę płynu z kulturą drobnoustrojów.
Głowica reaktora oferuje różnorodny zestaw połączeń dla środków bezpieczeństwa i czujników monitorujących. Na przykład temperatura lub ciśnienie wewnątrz reaktora. Większość reaktorów wysokociśnieniowych jest wykonana ze stali nierdzewnej.
Materiał ten zapewnia wysoką sprężystość i dobre właściwości obróbcze. Jednak w przypadku niektórych zastosowań, takich jak eksperymenty z kwaśnymi lub wysoce redukującymi roztworami wodnymi, odporność na korozję powierzchni ze stali nierdzewnej może nie być wystarczająca. Jednym ze sposobów, aby tego uniknąć, jest włożenie wkładki do zbiornika reaktora.
Tutaj wkładka wykonana z tefflonu. Tefflon ma wysoką odporność na korozję, ale wiąże się z większym ryzykiem zanieczyszczenia, ponieważ nie można go sterylizować w autoklawie, a na jego powierzchni mogą wytrącać się powierzchnie żelaza. Innym materiałem wkładki, który można zastosować, jest szkło kwarcowe.
Jest łatwy do czyszczenia, może być sterylizowany w autoklawie i jest mniej podatny na działanie kwaśnych lub redukujących roztworów wodnych Mimo że materiał wyściółki może pomóc w zapobieganiu niepożądanym reakcjom próbki ze ścianą reaktora ze stali nierdzewnej, pozostaje kilka problemów. Jeśli powstaje gaz korozyjny, na przykład siarkowodór, gaz ten może reagować z odsłoniętą powierzchnią głowicy reaktora znajdującą się nad wkładką. Kolejną wadą jest to, że nie jest możliwe pobranie próbki z reaktora bez zmiany ciśnienia.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zastosowaliśmy specjalną komórkę reakcyjną, elastyczną złotą torbę z tytanową głowicą. Powierzchnia złota jest odporna na korozję w stosunku do kwaśnych lub redukujących roztworów i gazów. Powierzchnia tytanu jest również wysoce obojętna.
Kiedy utworzyć ciągłą warstwę dwutlenku tytanu, tutaj widoczną w kolorze ciemnoniebieskim. Podczas pobierania próbek worek ze złotem kurczy swoją objętość. Objętość złotej torby nie powinna być zmniejszona o więcej niż 50%aby zapobiec tworzeniu się ostrych załamań i krawędzi.
Pokazane tutaj części to poszczególne elementy wewnętrznej konfiguracji eksperymentu ze złotą torbą. Można zobaczyć, od dołu do góry, elastyczną komórkę reakcyjną ze złotą torbą, tytanowy system uszczelniający, składający się z tytanowej głowicy, podkładki i pogrubionego pierścienia kompresyjnego oraz rurkę do pobierania próbek i zawór umożliwiający dostęp do komórki reakcyjnej w trybie pracy. Teraz przenosimy próbkę do celi reakcyjnej złoto i tytan.
Najpierw otwórz i odblokuj pustą komorę, a następnie załaduj cały przychodzący materiał na ruchomą tacę. Zamknij i zablokuj przednią pokrywę. Po opróżnieniu antykomory należy założyć parę rękawic i zbliżyć się do wewnętrznej osłony.
Odblokuj i otwórz pokrywę wewnętrzną, aby wyjąć materiał przychodzący z ruchomej tacy. Rozpakuj czystą złotą torbę i zabezpiecz jej podstawę. Otwórz butelkę serum, która zawiera 100 ml kultury bakteryjnej i siarki elementarnej.
Delikatnie wstrząśnij butelką serum i przenieś kulturę bakteryjną do złotej torebki. Włóż tytanową głowicę z rurką montażową do tytanowej osłony na złotej torbie. Następnie nasuń podkładkę i pogrubiony pierścień kompresyjny na tytanową rurkę do pobierania próbek.
Dokręć sześć wiązu w tym samym stopniu, aby zapewnić równomierny rozkład nacisku tytanowej czapki na górnej krawędzi złotej torby w tytanowej osłonie. Jest to powierzchnia uszczelniająca ogniwa reakcyjnego złotego tytanu. Ponownie zamontuj zawór do pobierania próbek w górnej części tytanowej rurki.
Dokręć mocno połączenie ręką. Następnie upewnij się, że zamknąłeś zawór. Teraz rdzeń reaktora wysokociśnieniowego jest w pełni zmontowany i może być zainstalowany w kapeluszu reaktora.
Teraz może dojść do instalacji reaktora wysokociśnieniowego. Wiąże się to z bardzo krótkim naświetleniem otwartego końca rurki do pobierania próbek na otaczającą atmosferę, ponieważ zawór do pobierania próbek musi zostać usunięty, aby rurka przeszła przez uszczelkę śrubową w głowicy reaktora. Przestań wyjmować zawór do pobierania próbek i z rurki do pobierania próbek.
Przeprowadź rurkę przez głowicę reaktora, nasuń dużą na rurkę i zamocuj małą pokrywę. Teraz zespół komory reakcyjnej nie może przesunąć się z powrotem przez głowicę reaktora i obie ręce mogą ponownie zainstalować zawór do pobierania próbek. Zdejmij głowicę reaktora z imadła stołowego, aby zainstalować ją na zbiorniku reaktora.
Głowica reaktora, w tym para termiczna, musi być ostrożnie umieszczona na zbiorniku reaktora, aby nie uszkodzić złotego worka ani pary termicznej. Wreszcie, solidna pokrywa, wyposażona w pierścień dzielony i zaciskowe, jest mocowana wokół głowicy reaktora i zbiornika, aby odpowiednio uszczelnić system. Reaktor wysokociśnieniowy jest starannie zamontowany w urządzeniu kołyszącym, aby uniknąć potencjalnych obrażeń, zwłaszcza siniaków na palcach.
Reaktor wysokociśnieniowy jest mocowany za pomocą dwóch zacisków nasuniętych na parę. Podkładki i nakrętki śrubowe utrzymują zaciski na miejscu. Podłączyć jednostki sterujące parą termiczną i czujnikiem ciśnienia.
Ważne jest, aby zapewnić odpowiednią długość drutów do ruchu kołysania, jednocześnie zapobiegając nagrzewaniu się ich powierzchni przez zawartość. Na koniec nasuń element grzejny na zbiornik reaktora i dokręć jego. Woda do zwiększania ciśnienia w systemie jest pobierana ze zbiornika przez pompę wysokociśnieniową.
Jest przenoszony przez kapilary ze stali nierdzewnej do reaktora wysokociśnieniowego. Kołysanie reaktora wysokociśnieniowego gwarantuje dokładne wymieszanie komory reakcyjnej. Na przykład zawartych w nim faz gazowych, płynnych i/lub stałych.
Wolniejsza prędkość kołysania jest ważna, aby zapobiec uszkodzeniu worka ze złotem przez szybko poruszające się ciała stałe lub przez tworzenie się w wyniku wpływu grawitacji na elastyczne złoto w podwyższonych temperaturach. Nasz system jest w stanie obracać się pod kątem oznaczonym na zielono i żółto na wskaźniku, który jest bliski 180 stopni. Parametry eksperymentalne są jednocześnie rejestrowane przez oprogramowanie.
Aby pobrać próbkę, strzykawka o pojemności 5 mililitrów jest przymocowana do małego interfejsu zamka zaworu do pobierania próbek w górnej części reaktora wysokociśnieniowego. Ostrożnie otwórz zawór. Płynna próbka jest automatycznie wpychana do strzykawki przez nadciśnienie wewnątrz komory reakcyjnej.
Zamknij zawór, gdy objętość próbki osiągnie jeden mililitr. Odłączyć strzykawkę. Próbka w strzykawce jest natychmiast przenoszona do dwumililitrowej probówki w celu dalszego przetwarzania.
Określenie mikrobiologicznej redukcji żelaza do żelaza żelazawego w komorze reakcyjnej uzyskuje się za pomocą analizy fotometrycznej. Seria roztworów wzorcowych żelaza żelazowego zawierających fioletowy kompleks i wskaźnik żelaza żelaza zależny od stężenia, żelazo ferrocen, służy jako środek kalibracyjny. Wyniki eksperymentu z reaktorem wysokociśnieniowym ze specjalnym ogniwem reakcyjnym złoto i tytan pokazują, że bakterie utleniają siarkę i żelazo do żelaza żelaznego i że ma to znaczący wpływ na ciśnienie.
Na rysunku pokazano wzrost stężeń żelaza żelaznego w okresie 22 dni dla doświadczenia przeprowadzonego przy ciśnieniach od jednego bara do 100 barów. W przybliżeniu w testach wykryto 31 i 13 milimoli żelaza żelazawego odpowiednio przy jednym barze i 100 barach. To wyraźnie pokazuje, że komórki drobnoustrojów były aktywne nawet przy ciśnieniu 100 barów, ale ich aktywność redukująca żelazo była znacznie niższa przy wysokim ciśnieniu.
Obraz ze skaningowego mikroskopu elektronowego pokazuje komórki w kształcie pręcików rosnące w eksperymencie pod niskim i wysokim ciśnieniem. Elastyczne ogniwo reakcyjne ze złotego tytanu, opracowane przez Seyfrieda i jego współpracowników w 1979 roku, może być wykorzystywane do różnorodnych badań naukowych, w tym do reakcji z gazami i płynami. Jednym z zastosowań może być oznaczanie rozpuszczalności żelaza i gazów pod wysokim ciśnieniem i w wysokich temperaturach.
Innym może być określenie reakcji zachodzących w procesie powstawania ropy naftowej i gazów. A trzeci, podobnie jak w tym badaniu, może dotyczyć badania reakcji mikrobiologicznych pod podwyższonym ciśnieniem i temperaturą.
Niniejszy protokół opisuje eksperymenty mikrobiologiczne prowadzone pod podwyższonym ciśnieniem w celu badania procesów biominingu in situ. Podejście eksperymentalne wykorzystuje kołyszący reaktor wysokociśnieniowy wyposażony w złoto-tytanową celę reakcyjną zawierającą kulturę drobnoustrojów w kwaśnym, bogatym w żelazo medium.
Symulowanie zależnej od ciśnienia aktywności mikroorganizmów z wykorzystaniem chemicznie obojętnych komór reakcyjnych ze złota i tytanu umożliwia prognostyczną ocenę wykonalności biominingu podpowierzchniowego. Podejście to rozwiązuje problem odwzorowania głębokich warunków geologicznych w celu wczesnej walidacji celu oraz ograniczania ryzyka mechanistycznego w rozwoju bioprocesów. Metoda ta wspiera podejmowanie decyzji portfelowych, dostarczając ilościowych danych na temat wydajności drobnoustrojów w warunkach ciśnień i składów chemicznych istotnych operacyjnie.
Metoda ta łączy wczesne etapy odkryć, przesiewanie oraz badania translacyjne, umożliwiając testowanie hipotez i ilościową ocenę aktywności mikrobiologicznej w symulowanych warunkach in situ.