Name: Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę izolacji określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans. Protokół umożliwia krótkoterminową hodowlę komórek oraz badania transkrypcyjne in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Jennifer Fox i członkom laboratorium Khalimonchuk za wnikliwe komentarze. Doceniamy wsparcie ze strony National Institutes of Health (R01 GM108975 do O.K. i T32 GM107001-01A1 do E.M.G.).

1. Przygotowanie i zbieranie starych robaków do izolacji komórek
UWAGA: Poniżej wyjaśniono izolację neuronów cholinergicznych z transgenicznego unc-17::GFP szczepu (OH13083) uzyskanego z repozytorium szczepu Caenorhabditis Genetics Center (CGC) na University of Minnesota. Konieczne jest utrzymanie sterylnych warunków, aby zapobiec zanieczyszczeniu grzybami lub bakteriami.
<ol>
	<li>Przygotuj i zsynchronizuj robaki za pomocą metody wybielania, zgodnie z opisem T. Stiernagle16. W eksperymentach ze starzeniem robaki płytkowe umieszcza się na płytkach pożywki wzrostowej nicieni (NGM) zawierających 25 μM wodnego roztworu fluorodeoksyurydyny (FuDR) w celu zmniejszenia produkcji jaj i zatrzymania wylęgu jaj. Regularnie sprawdzaj płytki agarowe, aby zapobiec zanieczyszczeniu lub wykluwaniu się jaj, ponieważ spowoduje to niewiarygodne wyniki. 
	UWAGA: W przypadku komórek unc-17::GFP, zazwyczaj używa się trzech płytek NGM o wymiarach 100 mm x 15 mm do wyizolowania wystarczającej ilości komórek będących przedmiotem zainteresowania16.</li>
	<li>Zbierz robaki i przygotuj do izolacji komórek.
	<ol>
		<li>Zbierz robaki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Robaki należy przepłukać z płytki 1,5 ml buforu M9 (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO, pH 7,0) i wirować przez 5 minut przy 1 600 x g. Odrzucić supernatant i przemyć robaki 1 ml buforu M9. Powtórz wirowanie i umyj w sumie pięć razy, aby usunąć jak najwięcej zanieczyszczeń E. coli. 
		UWAGA: Dodanie antybiotyków (50 μg/ml), takich jak ampicylina, na tym etapie może pomóc w zmniejszeniu zanieczyszczenia bakteryjnego.</li>
		<li>Dla dwóch próbek należy przygotować 2 ml buforu do lizy dodecylosiarczanu sodu i ditiotreitolu (SDS-DTT): 200 mM DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) i 3% (w/v) sacharozy.</li>
		<li>Przygotować 15 ml buforu izolacyjnego (118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM HEPES [pH 7,3]) i przechowywać go na lodzie. 
		UWAGA: Zarówno bufor do lizy SDS-DTT, jak i bufor izolacyjny muszą być świeże przed każdym eksperymentem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przerwanie naskórka i izolacja pojedynczej komórki
	<ol>
		<li>Odwirować zwierzęta zebrane w kroku 1.2.1 przez 5 minut przy 1 600 x g. Usunąć cały supernatant i zawiesić robaki w 1 ml pożywki M9 i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Robaki granulowane z odwirowaniem w ilości 1 600 x g przez 5 min.</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu do lizy SDS-DTT do robaków i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Robaki powinny wydawać się "zmarszczone" wzdłuż ciała, jeśli są oglądane pod mikroskopem świetlnym. 
		UWAGA: Długotrwałe narażenie na bufor do lizy SDS-DTT może spowodować śmierć robaków, co można monitorować, obserwując robaki. Robaki, które są martwe, wydłużają się i nie zwijają się.</li>
		<li>Dodać 800 μl lodowatego buforu izolacyjnego i wymieszać, delikatnie przesuwając probówkę.</li>
		<li>Robaki osadzać przez 1 minutę w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i przemyć 1 ml buforu izolacyjnego.</li>
		<li>Powtórz krok 1.3.5 w sumie pięć razy, za każdym razem ostrożnie usuwając bufor izolacyjny.</li>
		<li>Dodać 100 μl mieszaniny proteazy ze Streptomyces griseus (15 mg/ml) (tabela materiałów) rozpuszczonej w buforze izolacyjnym do osadu i inkubować przez 10−15 min w temperaturze RT. 
		UWAGA: Podobnie jak w przypadku buforu do lizy SDS-DTT, przedłużone trawienie proteazy może powodować nadmierne rozszczepienie białek wzdłuż błony plazmatycznej, uniemożliwiając izolację GFP odsłoniętej powierzchniowo za pomocą kulek magnetycznych.</li>
		<li>Podczas inkubacji z mieszaniną proteazy należy zastosować mechaniczne zakłócenie, pipetując próbki w górę iw dół do dna probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki mikropipety o pojemności 200 μl ~60−70 razy. Przyłóż końcówkę pipety do ścianki probówki mikrowirówki pod stałym ciśnieniem, aby prawidłowo oddzielić komórki.</li>
		<li>Aby określić etap trawienia, należy usunąć niewielką objętość (~1−5 μl) mieszaniny mineralizującej, upuścić ją na szkiełko podstawowe i sprawdzić za pomocą mikroskopu do hodowli tkankowych. Po 5-7 minutach inkubacji fragmenty robaka powinny mieć widocznie zredukowany naskórek, a zawiesina komórek będzie łatwo widoczna.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję z 900 μl dostępnej na rynku zimnej pożywki L-15 firmy Leibovitz uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną-streptomycyną (końcowe stężenie przy 50 μg/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny).</li>
		<li>Izolowane fragmenty i komórki osadów należy odwirowywać przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Umyć granulowane komórki jeszcze dwukrotnie 1 ml zimnej pożywki z dodatkiem L-15, aby upewnić się, że nadmiar zanieczyszczeń i naskórka zostały usunięte.</li>
		<li>Zawiesić granulowane komórki w 1 ml pożywki z dodatkiem L-15 i pozostawić na lodzie na 30 minut. Weź górną warstwę, około 700−800 μl, do probówki mikrowirówkowej. Warstwa ta zawiera komórki bez szczątków komórkowych i zostanie wykorzystana w późniejszej izolacji komórek będących przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, użyj automatycznego licznika komórek lub hemocytometru, aby zmierzyć gęstość komórek 10−25 μl izolowanych komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja komórek GFP-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej lub kulek magnetycznych anty-GFP
UWAGA: Istnieją dwie metody, które można zastosować do izolowania określonych typów komórek. Pierwsza metoda polega na zastosowaniu sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), podczas gdy druga metoda wykorzystuje kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami do łączenia komórek wyrażających wyraźne białka zlokalizowane w błonie plazmatycznej. Ta ostatnia metoda wymaga lokalizacji GFP w błonie plazmatycznej, dzięki czemu jest dostępna do interakcji z kulką magnetyczną sprzężoną z przeciwciałem.
<ol>
	<li>Izolacja komórek GFP-dodatnich metodą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Z wyizolowanej zawiesiny komórek zebranej w kroku 1.3.12 odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i zawiesić granulowane komórki w pożywce z dodatkiem L-15 do gęstości komórek nie większej niż 6 x 106 komórek/ml, aby uniknąć przeciążenia cytometru przepływowego.</li>
		<li>Sortować komórki według ekspresji GFP-dodatniej przy użyciu cytometru przepływowego zdolnego do sortowania próbek. Komórki GFP-ujemne mogą być używane jako kontrola do analizy niespecyficznej dla typu komórki. 
		UWAGA: Jak wspomniano powyżej, alternatywne podejście do izolacji komórek GFP-dodatnich może być zastosowane, jeśli białko znakowane GFP, będące przedmiotem zainteresowania, jest zlokalizowane w błonie komórkowej komórek. W takim przypadku można zastosować protokół opisany w sekcji 2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja komórek GFP-dodatnich za pomocą kulek magnetycznych anty-GFP
	<ol>
		<li>Z wyizolowanej zawiesiny komórkowej zebranej w kroku 1.3.12 odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i zawiesić komórki w 485 μl pożywki z dodatkiem L-15. Do roztworu dodać 15 μl ddH2O wstępnie umytych kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami α-GFP.</li>
		<li>Inkubować komórki z zawiesiną kulek magnetycznych w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę z bardzo delikatnym obracaniem. Nadmierne obracanie się spowoduje uszkodzenie komórek.</li>
		<li>Po inkubacji odwirować próbkę przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C, a następnie przepłukać granulat 2x 1 ml pożywki z dodatkiem L-15 w celu usunięcia komórek GFP-ujemnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla izolowanych komórek
	<ol>
		<li>Umieść izolowane komórki na sterylnej 6-dołkowej płytce wielodołkowej. 
		UWAGA: Płytki te mogą być pokryte lektyną z orzeszków ziemnych w celu zwiększenia przyczepności komórek; Jeśli jednak komórki mają być użyte natychmiast, ten krok może zostać pominięty.</li>
		<li>Umieścić płytkę w plastikowym pojemniku i inkubować komórki w temperaturze 20 °C za pomocą wilgotnej chusteczki lub miękkiej bibułki (dodać 50 μg/ml ampicyliny do ddH2O, aby upewnić się, że nie rozwijają się bakterie na chusteczce), aby dodać wilgoci do komórek. Nie inkubować w inkubatorze CO2 , ponieważ podwyższony poziom CO2 może uszkodzić komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie fluorescencyjne izolowanych komórek GFP-dodatnich
<ol>
	<li>Włącz żarówkę fluorescencyjną mikroskopu odwróconego z nasadką fluorescencyjną i pozwól jej się rozgrzać przez około 10 minut.</li>
	<li>Wyjmij kulturę komórkową z inkubatora i umieść na stoliku mikroskopu odwróconego z nasadką fluorescencyjną. Wsuń filtr GFP w rowki pod stolikiem mikroskopu.</li>
	<li>Zobacz komórki w powiększeniu 50x. Pomyślnie wyizolowane komórki GFP-dodatnie będą łatwo widoczne. Rób zdjęcia za pomocą nasadki aparatu na mikroskopie.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja RNA z izolowanych komórek
UWAGA: Ekstrakcja RNA powinna być przeprowadzona natychmiast po izolacji komórki, aby zapewnić wysoką jakość materiału. Wyizolowane RNA można wykorzystać do produkcji cDNA, a następnie pomiaru poziomów transkryptów za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Wszystkie probówki, końcówki i odczynniki powinny być wolne od RNaz, a miejsce pracy powinno być umyte etanolem przed ekstrakcją RNA.
<ol>
	<li>Z wyizolowanych komórek pobranych w kroku 2.1.2 odwirować komórki w sterylnej, wolnej od RNaz probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C. Jeśli komórki są izolowane za pomocą kulek magnetycznych, postępuj zgodnie z pobieraniem komórek, jak podano powyżej.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety usunąć supernatant z odwirowanej probówki do mikrowirówek i dodać 100 μl pożywki M9, aby zmyć pożywkę uzupełnioną L-15. Odwirować komórki przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Aby upewnić się, że wszystkie media zostały usunięte, powtórz w sumie trzy prania, za każdym razem ostrożnie usuwając supernatant.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny (tabela materiałów) do komórek i ostrożnie pipetować zawiesinę w górę i w dół. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 250 roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny</li>
	<li>Odwirowywać roztwór przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć jak najwięcej górnej warstwy wodnej za pomocą mikropipety, nie naruszając dolnych warstw organicznych, a następnie przenieść dolną warstwę do nowej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz. Do nowej probówki dodać 500 μl izopropanolu i wymieszać, odwracając probówkę. Inkubować ten roztwór w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Trzymając próbki na lodzie, usuń jak najwięcej izopropanolu za pomocą mikropipety i delikatnie dodaj 1 ml 70% (v/v) etanolu w wolnym od RNaz ddH2O do probówki. Należy pamiętać, aby nie wyrzucać roztworu bezpośrednio na dno probówki; Nałóż mieszaninę etanolu i wody na bok rurki.</li>
	<li>Wirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Usuń większość etanolu i wysusz na powietrzu na lodzie przez 3−5 min. 
	UWAGA: Etanol należy usunąć po tym kroku; Jednak dokładna kontrola dna rurki jest ważna, aby upewnić się, że nie pozostał etanol.</li>
	<li>Po wysuszeniu probówki na powietrzu dodaj 15−20 μl ddH2O bez RNaz i zmierz stężenie i czystość RNA za pomocą spektrofotometru o długości fali 260 nm. Czystość próbki powinna być mierzona w stosunku 260 nm/280 nm. Stosunek ten powinien wynosić około >2, 
	UWAGA: Wyizolowane RNA można zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C. Wysoce korzystne jest jednak użycie zestawu do syntezy cDNA tak szybko, jak to możliwe, aby zapewnić wysoką jakość produkcji cDNA. Ilościowy PCR może być przeprowadzany zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta termocyklera używanego w laboratorium.</li>
</ol>

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B. 314, 1-340 (1986).</li>
<li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+classification%3A+challenges%2C+opportunities+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews in Neuroscience. 18, 530-546 (2017).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+protein+misfolding%3A+The+examples+of+Alzheimer%E2%80%99s+and+Parkinson%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of protein misfolding: The examples of Alzheimer’s and Parkinson’s disease.</a> Nature Cell Biology. 6, 1054-1061 (2004).</li>
<li>Choi, M. L., Gandhi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+protein+oligomerization+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer%E2%80%99s+and+Parkinson%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Crucial role of protein oligomerization in the pathogenesis of Alzheimer’s and Parkinson’s disease.</a> FEBS Journal. 285, 3631-3644 (2018).</li>
<li>Burman, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission+facilitates+the+selective+mitophagy+of+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission facilitates the selective mitophagy of protein aggregates.</a> Journal of Cell Biology. 210, 3231-3247 (2017).</li>
<li>Shpilka, T., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+UPR%3A+mechanisms%2C+physiological+functions+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial UPR: mechanisms, physiological functions and implications.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 109-120 (2018).</li>
<li>Haynes, C. M., Petrova, K., Benedetti, C., Yang, Y., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClpP+mediates+activation+of+a+mitochondrial+unfolded+protein+response+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">ClpP mediates activation of a mitochondrial unfolded protein response in C. elegans.</a> Developmental Cell. 13, 467-480 (2007).</li>
<li>Walter, P., Ron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unfolded+protein+response%3A+from+stress+pathway+to+homeostatic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation.</a> Science. 334, 1081-1086 (2011).</li>
<li>Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2005).</li>
<li>Chen, C., Chen, Y., Jiang, H., Chen, C., Pan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron+aging%3A+learning+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Signal%22%5BJournal%5D)">Neuron aging: learning from C. elegans.</a> Journal of Molecular Signal. 8 (14), 1-10 (2013).</li>
<li>Germany, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAA-ATPase+Afg1+preserves+mitochondrial+fidelity+and+cellular+health+by+maintaining+mitochondrial+matrix+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The AAA-ATPase Afg1 preserves mitochondrial fidelity and cellular health by maintaining mitochondrial matrix proteostasis.</a> Journal of Cell Science. 131, jcs219956(2018).</li>
<li>Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+larval+cells+from+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of larval cells from C. elegans.</a> PLOS One. 6 (4), e19505(2011).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2007).</li>
<li>Morley, J. F., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+longevity+in+Caenorhabditis+elegans+by+heat+shock+factor+and+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 657-664 (2004).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">http://www.wormbook.org</a> (2006).</li>
<li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+regulatory+map+of+the+cholinergic+nervous+system+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A cellular regulatory map of the cholinergic nervous system of C. elegans.</a> eLife. 4, e12432(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Glista C. elegans jest dobrze ugruntowanym i potężnym modelem do badania zdrowia i chorób neuronów2. Dzięki licznym narzędziom genetycznym do manipulowania tymi zwierzętami i możliwej do opanowania ilości precyzyjnie zmapowanych różnych typów neuronów, można zebrać wiele danych przy użyciu stosunkowo niewielkiej ilości materiału. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowaną metodę izolowania odrębnych neuronów od całych zwierząt. Poprzez zakłócenie zewnętrznych białek naskórka robaka można...

W ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat, modelowy organizm metazoanowy Caenorhabditis elegans był ogromnym atutem w badaniach nad neuronami, obwodami neuronalnymi i ich rolą w reakcjach fizjologicznych i behawioralnych oraz chorobach neurodegeneracyjnych związanych ze starzeniem się. Unikalną cechą C. elegans jest to, że zwierzęta są przezroczyste, co pozwala na mapowanie linii wszystkich dorosłych komórek somatycznych1. C. elegans posiada również łatwą do opanowania ilość neuronów, co prowadzi do dobrego zrozumienia morfologii i połączeń układu nerwowego2. Niezmienna linia komórkowa, krótka długość życia i obfitość wysokoprzepustowych narzędzi genetycznych dostępnych dla C. elegans sprawiają, że jest to idealny organizm modelowy do badania starzenia się w różnych populacjach neuronów.
Starzenie się neuronów i zaburzenia neurodegeneracyjne są złożone, a każde zaburzenie ma unikalne patologiczne sygnatury z nim związane. Jednak w przypadku wielu z tych zaburzeń, takich jak choroba Parkinsona i choroba Alzheimera, wspólną cechą jest postępujące obciążenie nieprawidłowo sfałdowanych białek3,4,5. W obu tych chorobach białka nieprawidłowo fałdują się i agregują w komórce, powodując toksyczność, co ostatecznie prowadzi do śmierci komórki4,5. Dla prawidłowego starzenia się neuronów ważna jest homeostaza mitochondriów, a dokładniej homeostaza białek, ponieważ zaburzenia i dyshomeostaza mogą prowadzić do neurodegeneracji6,7,8. Komórki są wyposażone w różne mechanizmy utrzymania homeostazy białek, jednym z nich jest odpowiedź na niesfałdowane białko (UPR) - klasyczny szlak, w którym sygnały z retikulum endoplazmatycznego (ER) aktywują wewnątrzkomórkowe kaskady sygnałów, prowadząc do odpowiedzi transkrypcyjnej9. Podobnie jak w przypadkuUPR ER, metazoany wykazują podobną reakcję na utratę homeostazy białek mitochondrialnych, tzw. mitochondrialny UPR (UPRmt)7,8. C. elegans wydaje się być najbardziej podstawowym organizmem, który ma potwierdzoną i dobrze zdefiniowaną ścieżkęUPR mt7.
Funkcja/dysfunkcja określonych populacji neuronów w większej sieci może być trudna do oceny ze względu na ich wewnętrzną łączność i złożoność3. Jednak często istnieje potrzeba zbadania odrębnych populacji neuronów ze względu na choroby specyficzne dla typu komórki ze złożonymi patologiami, takimi jak te związane z upośledzoną homeostazą białek komórkowych. U C. elegans określone populacje neuronów mogą być genetycznie modyfikowane, co pozwala na łatwą obserwację in vivo. Układ nerwowy C. elegans składa się głównie z neuronów, z niewielkim odsetkiem komórek glejowych. U dorosłych robaków hermafrodytycznych znajdują się około 302 neurony, podzielone na ponad 100 różnych klas2,10. Neurony, takie jak neurony cholinergiczne, dominują w połączeniach nerwowo-mięśniowych, podczas gdy neurony dopaminergiczne są przede wszystkim zaangażowane w sensation10,11. Ponieważ zarówno aktywność motoryczna, jak i zdolności sensoryczne zmniejszają się wraz z wiekiem, ważne jest, aby szczegółowo zapoznać się z mechanistycznymi spostrzeżeniami na temat defektów w tych poszczególnych neuronach11,12. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na prostą i solidną metodę izolowania nienaruszonych komórek będących przedmiotem zainteresowania do kolejnych badań ex vivo.
Tutaj opisujemy zoptymalizowaną, skuteczną metodę szybkiej izolacji określonych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne (GFP) od C. elegans. Ta metoda izolacji może być wykonywana na larwach, młodych lub dorosłych robakach. Izolacja komórek od larw robaków została wcześniej opublikowana przez Zhang et al.13 i nie będzie tutaj omawiana. Ważną uwagą jest to, że wszystkie robaki muszą znajdować się na tym samym etapie życia, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu zwierzęcia lub zakażeniu przez zwierzęta na różnych etapach życia. Poprzez zarówno enzymatyczne, jak i mechaniczne rozbicie naskórka nicienia, egzoszkieletu bogatego w kolagen i inne białka strukturalne, można wyizolować szeroką gamę komórek13,14. Komórki można następnie wyizolować za pomocą cytometrii przepływowej lub kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami. Zazwyczaj RNA jest izolowane metodą izotiocyjanianu fenolu i guanidyny, aby zapewnić wzbogacenie pożądanej populacji komórek15. Z dużą ostrożnością te wyizolowane komórki mogą być utrzymywane w kolbie hodowlanej lub naczyniu wielodołkowym. Metoda ta stanowi unikalne i potężne narzędzie w badaniu określonych neuronów i ma zdolność izolowania żywych i funkcjonalnych komórek do dalszej hodowli.

<table><tbody><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-556-004</td><td></td></tr><tr><td>Agar, klasa biologii molekularnej</td><td>VWR</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>496189</td><td></td></tr><tr><td>Contess Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>USBiological</td><td>D8070</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Fluorodeoksyurydyna</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>VWR</td><td>BDH1133</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Amresco</td><td>O395</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>USBiological</td><td>P5110</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professionals</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>USBiological</td><td>M2090</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>USBiological</td><td>S5199</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>X190</td><td></td></tr><tr><td>NaOCl (Bleach)</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Amresco</td><td>O583</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomicen</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepton Y</td><td>USBiological</td><td>P3306</td><td></td></tr><tr><td>Pronase E</td><td>Mieszanina</td> proteaz Sigma <td>7433</td><td>ze Streptomyces griseus</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Amresco</td><td>O227</td><td></td></tr><tr><td>SMT1-FLQC fluorescencyjny stereomikroskop</td><td>Tritech Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>USBiological</td><td>S8010</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV One-Step zestaw do syntezy</td><td>ThermoFisher</td><td>12594025</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>roztwór izotiocyjanianu fenolu i guanidyny</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Invitrogen</td><td>T10Z82</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-GFP kulki magnetyczne</td><td>MBL</td><td>D153-11</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja określonych populacji neuronów od glisty caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Podczas procesu starzenia, wiele komórek akumuluje wysoki poziom uszkodzeń, co prowadzi do dysfunkcji komórek, która leży u podstaw wielu geriatrycznych i patologicznych schorzeń. Neurony postmitotyczne reprezentują główny typ komórek, na który wpływa starzenie się. Chociaż istnieje wiele ssaczych modeli starzenia się neuronów, ich ustalenie jest trudne i kosztowne. Glista Caenorhabditis elegans jest potężnym modelem do badania starzenia się neuronów, ponieważ zwierzęta te mają krótką długość życia, dostępny solidny zestaw narzędzi genetycznych i dobrze skatalogowany układ nerwowy. Przedstawiona w artykule metoda pozwala na bezproblemową izolację określonych komórek w oparciu o ekspresję transgenicznego białka zielonej fluorescencji (GFP). Transgeniczne linie zwierzęce wykazujące ekspresję GFP pod odrębnymi, specyficznymi dla typu komórek promotorami są trawione w celu usunięcia zewnętrznego naskórka i delikatnie mechanicznie przerywane w celu wytworzenia gnojowicy zawierającej różne typy komórek. Interesujące komórki są następnie oddzielane od komórek innych niż docelowe poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z anty-GFP. Wyizolowane komórki mogą być następnie hodowane przez ograniczony czas lub natychmiast wykorzystane do specyficznych dla komórek analiz ex vivo, takich jak analiza transkrypcyjna metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. W związku z tym protokół ten pozwala na szybką i solidną analizę odpowiedzi specyficznych dla komórek w różnych populacjach neuronów u C. elegans.

Opisany tutaj protokół umożliwia specyficzną izolację neuronów cholinergicznych pozytywnych pod kątem unc-17::GFP z nicieni C. elegans w celu późniejszych badań ex vivo, takich jak profilowanie ekspresji genów specyficznych dla typu komórek oraz ewentualna krótkotrwała hodowla do pomiarów elektrofizjologicznych metodą patch-clamp.
Rysunek 1 przedstawia neurony cholinergiczne wykazu...

Tutaj prezentujemy protokół prostej izolacji określonych grup żywych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne z transgenicznych linii Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia różnorodne badania ex vivo skoncentrowane na konkretnych neuronach i ma zdolność izolowania komórek do dalszej krótkoterminowej hodowli.

Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Protokół ten pozwala na bezproblemową izolację, hodowlę i badanie odpowiedzi transkrypcyjnych w określonej linii komórkowej C. elegans. Główną zaletą tego protokołu jest wysoki poziom zdolności przystosowania się do różnych etapów życia robaków lub określonych typów komórek, które mają być izolowane. Procedurę zademonstruję ja i Nataliya Zahayko, technik z naszego laboratorium.Po zebraniu zwierząt odwiruj je z prędkością 1600 razy g przez pięć minut. Usuń cały sklargent i ponownie zawieś robaki w jednym mililitrze pożywki M9. Przenieść zawiesinę do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.Wirować pod ciśnieniem 1600 razy g przez pięć minut, aby osadzać robaki. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu SDS-DTT i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Robaki powinny teraz wydawać się pomarszczone wzdłuż ciała, jeśli są oglądane pod mikroskopem świetlnym.Następnie dodaj 800 mikrolitrów lodowatego buforu izolacyjnego i wymieszaj, delikatnie przesuwając probówkę. Wirować przy 13 000 g i w czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę, aby granulować robaki. Usunąć supernatant i przemyć jednym mililitrem buforu izolacyjnego.Powtórz proces wirowania i mycia w sumie pięć razy, upewniając się, że za każdym razem ostrożnie usuwasz bufor izolacyjny. Następnie dodać 100 mikrolitrów mieszaniny proteazy ze Streptomyces griseus, rozpuszczonej w buforze izolacyjnym, do osadu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut, upewniając się, że zastosowano mechaniczne zakłócenia, pipetując w górę i w dół od 60 do 70 razy końcówką mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów na dnie probówki.Aby określić etap trawienia, usuń od jednego do pięciu mikrolitrów mieszanki wytrawiającej, upuść ją na szklane szkiełko i sprawdź za pomocą mikroskopu kultur tkankowych. Po pięciu do siedmiu minutach fragmenty robaka powinny mieć widocznie zredukowany naskórek, a zawiesina komórek będzie łatwo widoczna. Zatrzymaj reakcję, dodając 900 mikrolitrów dostępnej na rynku pożywki L-15 firmy Leibovitz, uzupełnionej 10% FBS i penicyliną-streptomycyną.Wirować w temperaturze 10 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby osadzać izolowane fragmenty i komórki. Umyj granulowane komórki jeszcze dwukrotnie zimnym podłożem uzupełnionym L-15, używając jednego mililitra pożywki na pranie. Ponownie zawiesić granulowane komórki w jednym mililitrze pożywki z dodatkiem L-15 i pozostawić na lodzie na 30 minut.Następnie weź wierzchnią warstwę, która ma około 700 do 800 mikrolitrów, i przenieś ją do probówki mikrowirówkowej. Użyj automatycznego licznika komórek lub hemacytometru, aby zmierzyć gęstość komórek od 10 do 25 mikrolitrów izolowanych komórek. Odwirować komórki z wyizolowanej zawiesiny komórkowej w temperaturze 10 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce uzupełnionej L-15 do gęstości komórek nie większej niż sześć milionów komórek na mililitr, aby uniknąć przeciążenia cytometru przepływowego. Następnie sortuj komórki według ekspresji GFP-dodatniej za pomocą cytometru przepływowego zdolnego do sortowania próbek. Komórki GFP-ujemne mogą być używane jako kontrola do analizy niespecyficznej dla typu komórki.Następnie umieść izolowane komórki w dołkach sterylnej płytki sześciodołkowej, umieść płytkę w plastikowym pojemniku, dodaj wilgotną chusteczkę lub miękką bibułkę, aby dodać wilgoci do komórek i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Odwiruj komórki z izolowanej zawiesiny komórkowej w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej wolnej od RNaz pod ciśnieniem 10 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Za pomocą mikropipety usunąć supernatant i dodać 100 mikrolitrów pożywki M9 w celu zmycia pożywki uzupełnionej L-15.Następnie odwirować komórki w temperaturze 10 000 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i usunąć supernatant. Powtórz ten proces mycia i wirowania łącznie trzy razy, aby upewnić się, że wszystkie media zostały usunięte, upewniając się, że za każdym razem ostrożnie usuwasz supernatant. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny do komórek i ostrożnie pipetuj zawiesinę w górę iw dół.Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 250 mikrolitrów chloroformu i delikatnie odwróć probówkę 15 do 20 razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Wirować przy 10 000 g i w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Użyj mikropipety, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej górnej warstwy wodnej, uważając, aby nie naruszyć dolnych warstw organicznych. Przenieś dolną warstwę do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej bez RNaz.Do nowej probówki dodaj 500 mikrolitrów izopropanolu i wymieszaj, odwracając probówkę. Inkubować ten roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie odwirować probówkę z prędkością 14 000 g i w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 20 minut.Umieść próbki na lodzie i użyj mikropipety, aby usunąć jak najwięcej izopropanolu. Delikatnie dodaj jeden mililitr 70% etanolu w podwójnie destylowanej wodzie bez RNaz do probówki, nakładając go na bok probówki. Wirować przy 10 000 g i w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut.Usuń większość etanolu i pozostaw rurkę do wyschnięcia na powietrzu na lodzie przez trzy do pięciu minut. Następnie dodaj od 15 do 20 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody bez RNaz. Użyj spektrofotometru o długości 260 nanometrów, aby zmierzyć stężenie i czystość RNA.W tym badaniu neurony cholinergiczne unc-17:GFP-dodatnie są ekstrahowane i izolowane z glisty C.elegans w kolejnych badaniach ex vivo. Gen unc-17 ulega ekspresji w całym ciele C. elegans i koduje pęcherzykowy transporter transbłonowy acetylocholiny. Ekspresję tego genu można zaobserwować w neuronach głowy, środkowej części ciała i ogona oraz projekcjach neuronów.Przedstawiono reprezentatywne mikrofotografie fluorescencyjne neuronów unc-17:GFP-dodatnich po izolacji, a także odpowiednią kontrolę negatywną od niezmodyfikowanych zwierząt typu dzikiego N2. Wyizolowane komórki mogą pozostać przy życiu do trzech dni, jeśli zostaną uzupełnione pożywką L-15 Leibovitza i 10% FBS. Reprezentatywne dane qPCR z neuronów cholinergicznych wykazujących ekspresję GFP, a także komórek mięśniowych wykazujących ekspresję GFP, przedstawiono tutaj.Po pomyślnym posortowaniu komórek RNA jest izolowane metodą izotiocyjanianu fenolu i guanidyny, po czym wytwarza się cDNA przy użyciu zestawu do syntezy. Ekspresja genów specyficznych dla neuronów cholinergicznych, tph-1, hydroksylazy tryptofanu i snb-1, transportera pęcherzyków synaptycznych, jest podwyższona w komórkach izolowanych unc-17:GFP. Jednak ta ekspresja nie jest obecna w komórkach izolowanych myo-3:GFP.Odwrotność jest prawdziwa w przypadku ekspresji specyficznego dla mięśni transkryptu łańcuchowego mięśnia-2 ciężkiego od miozyny, ponieważ ekspresja tego genu jest ograniczona do izolowanych komórek mięśniowych, ale nie do izolowanych komórek cholinergicznych. Ważne jest, aby w pełni wysiadywać robaki. Jednak przedłużona inkubacja naskórka robaka może spowodować śmierć robaka lub dodatkowy stres u zwierzęcia.Po izolacji komórki mogą być hodowane przez pewien czas lub wykorzystywane do izolacji RNA i analizy qRT-PCR. Wyhodowane neurony można dalej analizować za pomocą pomiarów elektroforezy z klamrą krosową. Technika ta może ułatwić analizę ex vivo określonych grup komórek, przyczyniając się w ten sposób do lepszego zrozumienia reakcji specyficznych dla komórek w kontekście organizmów wielokomórkowych na różnych etapach ich cyklu życia.Ponieważ podczas tego eksperymentu używane są chemikalia, takie jak SDS i DTT, podczas wytwarzania i używania należy przestrzegać ogólnych procedur bezpieczeństwa w laboratorium.

isolation-specific-neuron-populations-from-roundworm-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Neureksyny i neuroliginy są białkami adhezyjnymi błony neuronów, które pełnią kluczowe role w różnicowaniu i transmisji synaptycznej. Mutanty C. elegans z niedoborem neuroliginy wykazują defekt w wykrywaniu siły osmotycznej, jednak gdy posiadają one również mutację w genie kodującym neureksynę, odzyskują fenotyp typu dzikiego.

Unikanie osmotyczne u Caenorhabditis elegans: funkcja synaptyczna dwóch genów, ortologów ludzkich genów NRXN1 i NLGN1, jako kandydatów w badaniach nad autyzmem

Ten film opisuje metodę dysocjacji całych robaków do jednokomórkowej zawiesiny odpowiedniej dla FACS lub immunoprecypitacji nienaruszonych komórek.

Dysocjacja pojedynczych komórek Caenorhabditis elegans: metoda izolowania żywych komórek

Ten film pokazuje izolację fluorescencyjnie znakowanych neuronów od Caenorhabditis elegans. Zawiesinę komórkową uzyskuje się z transgenicznych robaków zaprojektowanych do ekspresji fluorescencyjnych, połączonych z białkiem transbłonowym transporterów pęcherzykowych w neuronach cholinergicznych. Znakowane fluorescencyjnie neurony są następnie izolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i utrzymywane w hodowli.

Izolacja neuronów z Caenorhabditis elegans poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Progenitorzy wyrażający nestynę to nowo zidentyfikowana populacja neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się móżdżku. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mikrodysekcji w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie, ta populacja komórek może zostać oczyszczona bez zanieczyszczenia innymi obszarami móżdżku i może być hodowana do dalszych badań.

Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji

Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest dobrym modelem do badania transportu aksonalnego i wewnątrzkomórkowego. W tym miejscu opisuję protokół rejestracji i analizy in vivo transportu aksonalnego i wewnątrzwiciowego u C. elegans.

Unieruchomienie Caenorhabditis elegans w celu analizy transportu wewnątrzkomórkowego w neuronach

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Opisano protokół, który wykorzystuje laserową mikrodysekcję do izolowania pojedynczych tkanek nicieni do sekwencjonowania RNA. Protokół nie wymaga zestawów narzędzi genetycznych specyficznych dla danego gatunku, co pozwala na porównywanie profili ekspresji genów między różnymi gatunkami na poziomie próbek jednotkankowych.

Mikrodysekcja laserowa do zastosowań jednotkankowych niezależnych od gatunku

Obecny protokół opisuje procedurę ręcznego izolowania jelit od dorosłych nicieni Caenorhabditis elegans w celu wprowadzenia ich do genomiki, proteomiki, mikrobiomu lub innych testów.

Ręczna sekcja jelit Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę izolacji określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans. Protokół umożliwia krótkoterminową hodowlę komórek oraz badania transkrypcyjne in vitro.

Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów