Izolacja określonych populacji neuronów od glisty Caenorhabditis elegans
6 sierpnia 2019
Tutaj prezentujemy protokół prostej izolacji określonych grup żywych komórek neuronalnych wyrażających zielone białko fluorescencyjne z transgenicznych linii Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia różnorodne badania ex vivo skoncentrowane na konkretnych neuronach i ma zdolność izolowania komórek do dalszej krótkoterminowej hodowli.
Protokół ten pozwala na bezproblemową izolację, hodowlę i badanie odpowiedzi transkrypcyjnych w określonej linii komórkowej C. elegans. Główną zaletą tego protokołu jest wysoki poziom zdolności przystosowania się do różnych etapów życia robaków lub określonych typów komórek, które mają być izolowane. Procedurę zademonstruję ja i Nataliya Zahayko, technik z naszego laboratorium.
Po zebraniu zwierząt odwiruj je z prędkością 1600 razy g przez pięć minut. Usuń cały sklargent i ponownie zawieś robaki w jednym mililitrze pożywki M9. Przenieść zawiesinę do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.
Wirować pod ciśnieniem 1600 razy g przez pięć minut, aby osadzać robaki. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu SDS-DTT i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Robaki powinny teraz wydawać się pomarszczone wzdłuż ciała, jeśli są oglądane pod mikroskopem świetlnym.
Następnie dodaj 800 mikrolitrów lodowatego buforu izolacyjnego i wymieszaj, delikatnie przesuwając probówkę. Wirować przy 13 000 g i w czterech stopniach Celsjusza przez jedną minutę, aby granulować robaki. Usunąć supernatant i przemyć jednym mililitrem buforu izolacyjnego.
Powtórz proces wirowania i mycia w sumie pięć razy, upewniając się, że za każdym razem ostrożnie usuwasz bufor izolacyjny. Następnie dodać 100 mikrolitrów mieszaniny proteazy ze Streptomyces griseus, rozpuszczonej w buforze izolacyjnym, do osadu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut, upewniając się, że zastosowano mechaniczne zakłócenia, pipetując w górę i w dół od 60 do 70 razy końcówką mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów na dnie probówki.
Aby określić etap trawienia, usuń od jednego do pięciu mikrolitrów mieszanki wytrawiającej, upuść ją na szklane szkiełko i sprawdź za pomocą mikroskopu kultur tkankowych. Po pięciu do siedmiu minutach fragmenty robaka powinny mieć widocznie zredukowany naskórek, a zawiesina komórek będzie łatwo widoczna. Zatrzymaj reakcję, dodając 900 mikrolitrów dostępnej na rynku pożywki L-15 firmy Leibovitz, uzupełnionej 10% FBS i penicyliną-streptomycyną.
Wirować w temperaturze 10 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut, aby osadzać izolowane fragmenty i komórki. Umyj granulowane komórki jeszcze dwukrotnie zimnym podłożem uzupełnionym L-15, używając jednego mililitra pożywki na pranie. Ponownie zawiesić granulowane komórki w jednym mililitrze pożywki z dodatkiem L-15 i pozostawić na lodzie na 30 minut.
Następnie weź wierzchnią warstwę, która ma około 700 do 800 mikrolitrów, i przenieś ją do probówki mikrowirówkowej. Użyj automatycznego licznika komórek lub hemacytometru, aby zmierzyć gęstość komórek od 10 do 25 mikrolitrów izolowanych komórek. Odwirować komórki z wyizolowanej zawiesiny komórkowej w temperaturze 10 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce uzupełnionej L-15 do gęstości komórek nie większej niż sześć milionów komórek na mililitr, aby uniknąć przeciążenia cytometru przepływowego. Następnie sortuj komórki według ekspresji GFP-dodatniej za pomocą cytometru przepływowego zdolnego do sortowania próbek. Komórki GFP-ujemne mogą być używane jako kontrola do analizy niespecyficznej dla typu komórki.
Następnie umieść izolowane komórki w dołkach sterylnej płytki sześciodołkowej, umieść płytkę w plastikowym pojemniku, dodaj wilgotną chusteczkę lub miękką bibułkę, aby dodać wilgoci do komórek i inkubuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Odwiruj komórki z izolowanej zawiesiny komórkowej w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej wolnej od RNaz pod ciśnieniem 10 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Za pomocą mikropipety usunąć supernatant i dodać 100 mikrolitrów pożywki M9 w celu zmycia pożywki uzupełnionej L-15.
Następnie odwirować komórki w temperaturze 10 000 razy g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut i usunąć supernatant. Powtórz ten proces mycia i wirowania łącznie trzy razy, aby upewnić się, że wszystkie media zostały usunięte, upewniając się, że za każdym razem ostrożnie usuwasz supernatant. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny do komórek i ostrożnie pipetuj zawiesinę w górę iw dół.
Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 250 mikrolitrów chloroformu i delikatnie odwróć probówkę 15 do 20 razy. Inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Wirować przy 10 000 g i w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut. Użyj mikropipety, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej górnej warstwy wodnej, uważając, aby nie naruszyć dolnych warstw organicznych. Przenieś dolną warstwę do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej bez RNaz.
Do nowej probówki dodaj 500 mikrolitrów izopropanolu i wymieszaj, odwracając probówkę. Inkubować ten roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie odwirować probówkę z prędkością 14 000 g i w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 20 minut.
Umieść próbki na lodzie i użyj mikropipety, aby usunąć jak najwięcej izopropanolu. Delikatnie dodaj jeden mililitr 70% etanolu w podwójnie destylowanej wodzie bez RNaz do probówki, nakładając go na bok probówki. Wirować przy 10 000 g i w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Usuń większość etanolu i pozostaw rurkę do wyschnięcia na powietrzu na lodzie przez trzy do pięciu minut. Następnie dodaj od 15 do 20 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody bez RNaz. Użyj spektrofotometru o długości 260 nanometrów, aby zmierzyć stężenie i czystość RNA.
W tym badaniu neurony cholinergiczne unc-17:GFP-dodatnie są ekstrahowane i izolowane z glisty C.elegans w kolejnych badaniach ex vivo. Gen unc-17 ulega ekspresji w całym ciele C. elegans i koduje pęcherzykowy transporter transbłonowy acetylocholiny. Ekspresję tego genu można zaobserwować w neuronach głowy, środkowej części ciała i ogona oraz projekcjach neuronów.
Przedstawiono reprezentatywne mikrofotografie fluorescencyjne neuronów unc-17:GFP-dodatnich po izolacji, a także odpowiednią kontrolę negatywną od niezmodyfikowanych zwierząt typu dzikiego N2. Wyizolowane komórki mogą pozostać przy życiu do trzech dni, jeśli zostaną uzupełnione pożywką L-15 Leibovitza i 10% FBS. Reprezentatywne dane qPCR z neuronów cholinergicznych wykazujących ekspresję GFP, a także komórek mięśniowych wykazujących ekspresję GFP, przedstawiono tutaj.
Po pomyślnym posortowaniu komórek RNA jest izolowane metodą izotiocyjanianu fenolu i guanidyny, po czym wytwarza się cDNA przy użyciu zestawu do syntezy. Ekspresja genów specyficznych dla neuronów cholinergicznych, tph-1, hydroksylazy tryptofanu i snb-1, transportera pęcherzyków synaptycznych, jest podwyższona w komórkach izolowanych unc-17:GFP. Jednak ta ekspresja nie jest obecna w komórkach izolowanych myo-3:GFP.
Odwrotność jest prawdziwa w przypadku ekspresji specyficznego dla mięśni transkryptu łańcuchowego mięśnia-2 ciężkiego od miozyny, ponieważ ekspresja tego genu jest ograniczona do izolowanych komórek mięśniowych, ale nie do izolowanych komórek cholinergicznych. Ważne jest, aby w pełni wysiadywać robaki. Jednak przedłużona inkubacja naskórka robaka może spowodować śmierć robaka lub dodatkowy stres u zwierzęcia.
Po izolacji komórki mogą być hodowane przez pewien czas lub wykorzystywane do izolacji RNA i analizy qRT-PCR. Wyhodowane neurony można dalej analizować za pomocą pomiarów elektroforezy z klamrą krosową. Technika ta może ułatwić analizę ex vivo określonych grup komórek, przyczyniając się w ten sposób do lepszego zrozumienia reakcji specyficznych dla komórek w kontekście organizmów wielokomórkowych na różnych etapach ich cyklu życia.
Ponieważ podczas tego eksperymentu używane są chemikalia, takie jak SDS i DTT, podczas wytwarzania i używania należy przestrzegać ogólnych procedur bezpieczeństwa w laboratorium.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół umożliwia sprawne izolowanie, hodowanie i analizowanie odpowiedzi transkrypcyjnych w konkretnej linii komórkowej C.elegans. Metoda ta jest możliwa do dostosowania do różnych etapów cyklu życiowego nicieni lub konkretnych typów komórek przeznaczonych do izolacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Organizmy transgeniczne
Wstęp
- Izolacja specyficznych komórek neuronalnych jest kluczowa dla badania ich funkcji.
- Transgeniczne linie Caenorhabditis elegans wykazujące ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego ułatwiają ten proces.
- Badania ex vivo na izolowanych neuronach mogą dostarczyć informacji na temat ich zachowania i właściwości.
- Niniejszy protokół zwiększa możliwości badania specyficznych populacji neuronalnych.
Cel badania
- Przedstawienie wiarygodnej metody izolacji żywych komórek neuronalnych.
- Umożliwienie dalszej krótkoterminowej hodowli izolowanych komórek.
- Ułatwienie różnorodnych badań ex vivo skoncentrowanych na konkretnych neuronach.
Zastosowane metody
- Zbieranie transgenicznych C. elegans wykazujących ekspresję GFP.
- Centryfugowanie zebranych zwierząt przy 1600 ×g przez pięć minut.
- Resuspensja nicieni w pożywce M9.
- Przeniesienie zawiesiny do probówek do mikrocentryfugi w celu dalszej obróbki.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja specyficznych populacji neuronów.
- Adaptacyjność protokołu do różnych etapów życia i typów komórek.
- Potencjał do szczegółowej analizy transkrypcyjnej izolowanych komórek.
- Rozszerzona wiedza na temat funkcji neuronów dzięki badaniom ex vivo.
Wnioski
- Protokół zapewnia prostą metodę izolacji komórek neuronalnych.
- Otwiera on możliwości dla dalszych badań nad zachowaniem i właściwościami neuronów.
- Zdolność do adaptacji sprawia, że nadaje się on do szerokiego zakresu badań w dziedzinie neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Izolowanie specyficznych populacji neuronów z organizmów modelowych umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celu poprzez powiązanie perturbacji genetycznych z fenotypami funkcjonalnymi. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania, dostarczając ilościowych, specyficznych dla typu komórek danych transkrypcyjnych, które mogą służyć do selekcji hipotez. Adaptacyjność tej metody w odniesieniu do różnych etapów życia i typów komórek zwiększa ciągłość translacyjną w przedklinicznym modelowaniu procesów neurodegeneracyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie specyficznych dla komórek odpowiedzi transkrypcyjnych w celu oceny zaangażowania celu i modulacji szlaków w określonych populacjach neuronów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny schemat izolacji żywych neuronów cholinergicznych z C. elegans do dalszych analiz funkcjonalnych.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie oczyszczonych lizatów neuronalnych odpowiednich do odczytów metodą qPCR, co umożliwia ilościowe przesiewanie perturbacji genetycznych lub farmakologicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację komórek za pomocą FACS lub separacji kuleczkami magnetycznymi, co zmniejsza zmienność w analizach ex vivo pomiędzy eksperymentami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie systemów istotnych dla chorób poprzez izolację neuronów uwikłanych w dysfunkcje związane ze starzeniem się, co ułatwia odkrywanie biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia krótkoterminową hodowlę wyizolowanych neuronów, co pozwala na prowadzenie badań przebiegu zmian transkrypcyjnych lub elektrofizjologicznych w czasie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po identyfikację wiodących związków – poprzez dostarczanie odczytów mechanistycznych z genetycznie zdefiniowanych populacji neuronów.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez poprzez izolację neuronów znakowanych GFP w celu pomiaru zmian w ekspresji genów po przeprowadzeniu perturbacji.
- Przesiewanie: Pozwala na uzyskanie ustandaryzowanych próbek neuronów odpowiednich do wysokoczułych analiz transkrypcyjnych.
- Analityka: Zapewnia ilościowy pomiar wydajności i czystości RNA za pomocą spektrofotometrii, co wspomaga normalizację i porównywanie danych.
- Badania translacyjne: Stanowią pomost do badań przedklinicznych poprzez izolację neuronów z modeli starzenia w celu badania konserwowanych szlaków degradacji neuronów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Adaptowalne systemy promotor-GFP umożliwiają zastosowanie metody w wielu typach neuronów i na różnych etapach życia, co zwiększa użyteczność platformy.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie zmian transkrypcyjnych z konkretnymi populacjami neuronów, co zwiększa pewność wyboru celu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowaną izolację żywych komórek przy użyciu uznanych technik separacji, co poprawia powtarzalność.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go, dostarczając wczesne, specyficzne dla typu komórek dane funkcjonalne, które zmniejszają ryzyko związane z hipotezami dotyczącymi celów.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie walidacji szlaków neuronalnych w systemie podatnym na modyfikacje genetyczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obsłudze modeli transgenicznych, sortowaniu komórek metodą FACS oraz technikach izolacji RNA.
- Metoda zależy od dostępu do cytometrów przepływowych lub systemów separacji magnetycznej kompatybilnych z neuronowymi próbkami o małej objętości.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów trawienia i przemywania, aby zapewnić spójną wydajność i żywotność komórek w poszczególnych seriach.
- Adaptacja do innych typów neuronów zależy od dostępności specyficznych linii z GFP pod kontrolą odpowiednich promotorów oraz optymalizacji warunków dysocjacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują krótki okres żywotności po izolacji oraz potencjalny stres wynikający z etapów dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej.
