Name: Opracowanie szczurzego modelu ostrej niewydolności wątroby poprzez połączenie 70% częściowej hepatektomii i paracetamolu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modelu ostrej niewydolności wątroby u szczurów poprzez połączenie 70% hepatektomii z hepatotoksycznością paracetamolu. Ten powtarzalny model umożliwia badanie nowych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant otrzymany od Departamentu Biotechnologii Rządu Indii dla Narodowego Instytutu Immunologii w New Delhi.

Procedura opisana poniżej została zatwierdzona przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt Narodowego Instytutu Immunologii w New Delhi. Numer seryjny zatwierdzenia to IAEC#355/14.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj się do zabiegu chirurgicznego zgodnie z wcześniejszym opisem Das B et al.26.</li>
	<li>Użyj 6–8-tygodniowych wsobnych szczurów Wistar o masie ciała 200–250 g.</li>
	<li>Trzymaj zwierzęta w standardowych warunkach opieki nad zwierzętami i karm je karmą dla szczurów i libitum przed i po zabiegu.</li>
	<li>Podczas wykonywania 70% PHx należy użyć standardowej mieszanki koktajlowej chlorowodorku ketaminy (100 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (10 mg/kg masy ciała), którą wstrzykuje się dootrzewnowo. 
	UWAGA: Rodzaj zastosowanego środka znieczulającego może mieć pooperacyjny wpływ na śmiertelność i zachorowalność.</li>
	<li>Podczas przeszczepu komórek należy zastosować znieczulenie wziewne Isofluran (2-chloro-2-(difluorometoksy)-1,1,1-trifluoro-etan), aby skrócić czas rekonwalescencji zwierzęcia po operacji przeszczepu.</li>
	<li>Indukuj i utrzymuj znieczulenie wziewne za pomocą dostosowanego systemu znieczulenia. Utrzymuj przepływ tlenu na poziomie 4 l/min. Do indukcji należy stosować izofluran w dawce 4%, a do leczenia podtrzymującego 2–3% podczas zabiegu chirurgicznego.</li>
</ol>
2. Procedury przedoperacyjne
<ol>
	<li>Znieczulić szczura, wstrzykując dootrzewnowo mieszaninę ketaminy i ksylazyny opisaną w kroku 3.1. Potwierdź całkowite znieczulenie, szczypiąc palec u nogi zwierzęcia. Dalsze procedury są wykonywane tylko wtedy, gdy nie ma odruchu pedałowania.</li>
	<li>Aby zapobiec wysuszeniu rogówki, nałóż krople do oczu na bazie karboksymetylocelulozy na oba oczy.</li>
	<li>Przymocuj znieczulone zwierzę do deski chirurgicznej za pomocą białej taśmy. Umieść zwierzę stroną brzuszną skierowaną do góry, upewniając się, że pysk znajduje się po dalszej stronie od osoby wykonującej operację.</li>
	<li>Usuń włosy z prawego górnego obszaru chirurgicznego brzucha za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia.</li>
	<li>Zdezynfekuj miejsce operacyjne za pomocą trzech naprzemiennych peelingów jodu powidonu i 70% etanolu za pomocą wysterylizowanych wacików w ruchach okrężnych.</li>
</ol>
3. Częściowa hepatektomia (PHx) w celu usunięcia 70% masy wątroby
UWAGA: Wykonaj całą procedurę chirurgiczną w sterylnym środowisku w kapturze z przepływem laminarnym. Używaj tylko sterylnych narzędzi chirurgicznych, aby zminimalizować ryzyko infekcji pooperacyjnej. Usunięcie 70% masy wątroby, nazwane 70% częściową hepatektomią (70% PHx), przeprowadzono zgodnie z opisem C. Mitchella i H. Willenbringa, 200827.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem operacji należy potwierdzić całkowite znieczulenie zwierzęcia, szczypiąc go w palec u nogi. Dalsze procedury są wykonywane tylko wtedy, gdy nie ma odruchu pedałowania.</li>
	<li>Zaznacz skórę do przecięcia tuż pod mostkiem, prostopadle do mieczykowatej i równolegle do klatki piersiowej.</li>
	<li>Umieść sterylny arkusz serwetki z otworem o wymiarach około 3 cm x 1 cm na zaznaczonej skórze.</li>
	<li>Wykonaj skalpelem poprzeczne nacięcie o długości około 2–3 cm wzdłuż zaznaczonej linii. Użyj ostrza chirurgicznego nr 22. Delikatnie usuń przyczep skóry do leżącej poniżej warstwy mięśniowej w pobliżu naciętego obszaru za pomocą sterylnych, zwilżonych bawełnianych końcówek.</li>
	<li>Następnie wykonaj poprzeczne nacięcie przez warstwę otrzewnej tuż pod wyrostkiem mieczykowatym.</li>
	<li>Za pomocą dwóch zwilżonych solą fizjologiczną bawełnianych końcówek odsłoń lewy płat wątroby, delikatnie uciskając klatkę piersiową. Umieść jedną bawełnianą końcówkę na obszarze przepony naciętej części, a drugą bawełnianą końcówkę poniżej naciętego obszaru, aby podnieść płat wątroby do góry.</li>
	<li>Wsuń sterylną nylonową pętelkę z nici o długości 8–10 cm (rozmiar 4–0, średnica 0,15 mm) wokół odsłoniętego płata wątroby. Weź pętlę do podstawy płata w pobliżu wnęki za pomocą kleszczy do mikropreparowania lub zwilżonych patyczków kosmetycznych.</li>
	<li>Za pomocą uchwytu na igłę do mikrochirurgii i mikrokleszczyków zawiąż dwa końce pętli, umieszczając węzeł jak najbliżej podstawy płata, aby zwęzić naczynie krwionośne i zmniejszyć krwawienie po usunięciu płata wątroby. Zawiąż dwa dodatkowe węzły po drugiej stronie.</li>
	<li>Zachowaj ostrożność, aby nie wiązać węzła zbyt blisko pobliskich naczyń krwionośnych, co w przeciwnym razie może spowodować niedrożność żylną (zwężenie).</li>
	<li>Użyj nożyczek mikrochirurgicznych, aby przeciąć zawiązany płat tuż nad węzłem, który pozostawia przebarwioną masę tkanki zwaną kikutem niedokrwiennym w miejscu płata. 
	UWAGA: Wątroba szczura, podobnie jak wątroba myszy, jest podzielona na cztery odrębne płaty: płat środkowy, prawy płat boczny, lewy płat boczny i płat ogoniasty, które stanowią odpowiednio około 40%, 20%, 30% i 7% całkowitej masy wątroby. Każda kombinacja tych płatów może zostać usunięta, aby wyciąć 70% masy wątroby. W niniejszym badaniu usunięto płat środkowy i lewe płaty boczne.</li>
	<li>Ostrożnie zlokalizuj płat środkowy, nie uszkadzając pozostałego kikuta lewego płata bocznego. Delikatnie wyciągnij go z jamy brzusznej, a u podstawy płata zawiąż węzeł nylonowej nici o długości 8–10 cm (rozmiar 4–0), jak wspomniano wcześniej. Zawiąż dwa dodatkowe węzły po drugiej stronie. Ostrożnie wyciąć i usunąć zawiązany płat środkowy, zachowując wszystkie wymienione środki ostrożności.</li>
	<li>Po usunięciu płatów należy zszyć otrzewną za pomocą wchłanialnego chromowego szwu 4–0 z ciągłymi szwami, a następnie zszyć skórę szwem przerywanym.</li>
	<li>Nałóż jod powidonu na skórę otaczającą szwy, aby zapobiec infekcji.</li>
	<li>Zdejmij arkusz zasłony i usuń zwierzę z deski operacyjnej.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna u zwierząt
<ol>
	<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć zwierzęciu dawkę 12 mg antybiotyku cefotaksymowego w 1 ml 5% roztworu glukozy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, aby chronić je przed ryzykiem zakażenia pooperacyjnego.</li>
	<li>Należy podać podskórne wstrzyknięcie przeciwbólowego meloksykamu (1 mg/kg masy ciała) w celu złagodzenia bólu po zabiegu chirurgicznym, a następnie podać dwie kolejne dawki, utrzymując schemat jako jedną dawkę na dobę.</li>
	<li>Trzymanie operowanych zwierząt w standardowych warunkach 12-godzinnego cyklu światła/ciemności i monitorowanie w regularnych odstępach czasu.</li>
</ol>
5. Wstrzykiwanie leku zwierzętom częściowo poddanym hepatektomii w celu wywołania niewydolności wątroby
<ol>
	<li>Po 24 godzinach od operacji, gdy zwierzęta pomyślnie wyzdrowieją z 70% PHx, należy zmierzyć masę ciała zwierzęcia, a następnie wykonać zastrzyki.</li>
	<li>Wstrzyknąć 750 mg/kg masy ciała APAP dootrzewnowo zwierzętom częściowo poddanym hepatektomii 24 godziny po 70% PHx po pomyślnym wyzdrowieniu zwierząt po zabiegu chirurgicznym. Powtórzyć dawkę ponownie po 24 godz. 
	UWAGA: Zwierzęciu podaje się dwie dawki APAP dootrzewnowo (tj. odpowiednio 24 godziny i 48 godzin po zabiegu 70% PHx).</li>
	<li>W każdym punkcie czasowym po wstrzyknięciu APAP należy zmierzyć masę ciała powracającego do zdrowia zwierzęcia. 
	UWAGA: APAP (biocetamol) jest wstrzykiwany zwierzętom w postaci roztworu o stężeniu 150 mg/ml w 2% alkoholu benzylowym.</li>
</ol>
6. Przeszczepianie zdrowych hepatocytów w modelach zwierzęcych ALF
UWAGA: Aby zbadać odwracalność ALF u szczurów, przeszczep zdrowe syngeniczne hepatocyty szczurów dopełnieniowo zwierzętom z indukcją ALF wraz z 1. dawką APAP. W obecnym badaniu, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu przeszczepionym komórkom na naprowadzanie i wszczepienie, przeszczep wykonano tuż po podaniu 1. dawki APAP. Hepatocyty szczurów są izolowane za pomocą protokołu opublikowanego po raz pierwszy przez Berry and Friends et al.28, a następnie zaadaptowany w różnych innych badaniach29,30,31 z pewnymi modyfikacjami. W przypadku dośledzionowego przeszczepu komórek w modelu zwierzęcym ALF należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.
<ol>
	<li>Umieść szczura w komorze poli (metakrylanu metylu) w celu indukcji znieczulenia 4% izofluranem i przepływem tlenu 4 l/min dla szczura o masie ciała 250-350 g. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak odruchów pedałowania podczas szczypania palca u nogi zwierzęcia.</li>
	<li>Umieść znieczulonego szczura na desce operacyjnej tak, aby jego lewa boczna część była skierowana do góry. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 2-3% inhalacji izofluranu przez odpowiedni ustnik.</li>
	<li>Ogol skórę w lewej bocznej okolicy i wysterylizuj ją roztworem jodu powidonu.</li>
	<li>Wykonaj poprzeczne nacięcie na ogolonym obszarze skóry.</li>
	<li>Wykonaj 1–2 cm nacięcie w warstwie otrzewnej, aby odsłonić śledzionę.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij śledzionę z jamy otrzewnej i unieś ją za pomocą dwóch zwilżonych bawełnianych końcówek.</li>
	<li>Komórki (zwykle 10-7 na zwierzę) przeznaczone do przeszczepu należy przechowywać zawieszone w pożywce IMDM o pojemności 50 μl w strzykawce insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 29 G.</li>
	<li>Delikatnie wkłuć igłę w korę śledziony i w ciągu 2–3 minut uwolnić zawiesinę komórkową do śledziony.</li>
	<li>Po zakończeniu przeszczepu komórek ostrożnie wyjmij igłę i przetrzyj obszar nakłucia igły zwilżoną bawełnianą końcówką, aby uniknąć wycieku zawiesiny komórek z miejsca.</li>
	<li>Zamknij otrzewną i skórę szwem wchłanialnym 4–0 z szyciem ciągłym i nieciągłym.</li>
	<li>Roztwór jodu powidonu nanieść na skórę w miejscu szwów, aby zapobiec infekcji w miejscu operowanym.</li>
	<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć 1 ml objętości 12 mg/ml roztworu antybiotyku (np. cefotaksymu) i podskórnie wstrzyknąć zwierzęciu środek przeciwbólowy (np. meloksykam) 1 mg/kg masy ciała w ramach opieki pooperacyjnej. Przenieś zwierzę do ciepłej klatki do rekonwalescencji.</li>
	<li>Operowane zwierzę należy przechowywać w izolacji w normalnych warunkach 12-godzinnego cyklu światła/ciemności, aż do całkowitego zagojenia się ran pooperacyjnych. Może to potrwać 3-4 dni.</li>
</ol>
7. Charakterystyka rozwoju ALF
<ol>
	<li>Poddać zwierzęta eutanazji przez przedawkowanie roztworu ketaminy i ksylazyny 2 godziny po drugiej dawce leczenia APAP i pobrać próbki krwi i tkanek.</li>
	<li>Zbierz surowicę z krwi do badań biochemicznych32.</li>
	<li>Przetwarzanie próbek tkanki wątroby do badań histologicznych i ekspresji genów33,34,35.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowanie odpowiedniego modelu zwierzęcego dla ALF ma zasadnicze znaczenie dla lepszego zrozumienia patogenezy i progresji ALF. Dobrze scharakteryzowany model zwierzęcy ALF daje również możliwość opracowania i przetestowania nowych podejść terapeutycznych przeciwko ALF. Podjęto wiele prób opracowania klinicznie istotnego modelu ALF 6,12,21,23,46,47,48.<...

Ostra niewydolność wątroby (ALF) jest zdefiniowana przez American Association for the Study of Liver Diseases jako szybki rozwój ostrego uszkodzenia wątroby bez żadnych wcześniejszych oznak uszkodzenia i charakteryzuje się poważnym upośledzeniem funkcji syntetycznych, metabolicznych i detoksykacyjnych klasy wątroba<sup="xref">1. ALF różni się od przewlekłej niewydolności wątroby, w której niewydolność występuje w wyniku uszkodzenia wątroby spowodowanego przez długi okres czasu oraz od ostrej przewlekłej niewydolności wątroby (ACLF), gdzie nagłe uszkodzenie wątroby następuje w wyniku przewlekłych chorób wątroby2,3,4. Jedynym dostępnym lekarstwem na ALF jest ortotopowy przeszczep wątroby (OLT), w przeciwnym razie może dojść do śmierci. Ze względu na niedobór dawców wątroby śmiertelność u pacjentów cierpiących na ALF jest bardzo wysoka.
Aby zbadać potencjał alternatywnych podejść terapeutycznych i lepiej zrozumieć patofizjologię ALF, potrzebne są modele zwierzęce, które mogą odzwierciedlać ALF występujący u ludzi. Wiele z dostępnych już modeli zwierzęcych ALF ma kilka wad. Efekty działania paracetamolu (APAP) są trudne do odtworzenia, ale mają najbliższe podobieństwa pod względem parametrów czasowych, klinicznych, biochemicznych i patologicznych. Modele zwierzęce indukowane przez APAP często napotykają problemy z powodu obecności methemoglobinemii spowodowanej utlenianiem hemoglobiny przez APAP i jej produkty pośrednie5,6,7. Innym problemem jest brak odtwarzalności, który znajduje odzwierciedlenie w nieprzewidywalnych reakcjach na dawkę i czasie zgonu. Modele zwierzęce ALF wykonane przy użyciu tetrachlorku węgla (CCl4) mają słabą odtwarzalność8,9,10,11. Modele zwierzęce ALF indukowane koncavaliną A (Con A) i lipoplizacharydem (LPS) nie odzwierciedlają klinicznego wzorca choroby ludzkiej, chociaż mają przewagę w badaniu mechanizmów komórkowych zaangażowanych w autoimmunologiczne choroby wątroby i w badaniu sepsy odpowiednio12,13,14,15. Podobnie, tioacetamid (TAA) również wymaga biotransformacji do aktywnego metabolitu sulfotlenku tioacetamidu i wykazuje zmienność gatunkową16,17,18,19. D-galaktozamina (D-Gal) wywołuje pewne zmiany biochemiczne, metaboliczne i fizjologiczne podobne do ALF, ale nie jest w stanie odzwierciedlić całego stanu patologicznego ALF20,21,22,23. Było bardzo niewiele prób połączenia dwóch lub więcej z tych metod w celu opracowania modelu ALF, który jest w stanie lepiej odzwierciedlić zespół ALF13. W związku z tym konieczne są dalsze badania w celu opracowania modelu, który może odzwierciedlać parametry choroby, ma lepszą odtwarzalność i zapewnia wystarczająco dużo czasu na zbadanie efektów interwencji terapeutycznej.
W obecnym badaniu, alternatywny model ALF u szczurów został stworzony poprzez połączenie efektów częściowej hepatektomii (PHx) i niższych dawek odczynnika hepatotoksycznego. APAP ma ugruntowaną rolę w powodowaniu uszkodzeń wątroby5,24,25. Jest szeroko stosowanym lekiem przeciwbólowym i działa toksycznie na wątrobę w dawkach ponadterapeutycznych poprzez tworzenie toksycznych metabolitów. APAP jest przyczyną wielu zgonów w krajach rozwiniętych. Uraz fizyczny spowodowany częściową hepatektomią inicjuje aktywację różnych procesów związanych ze stanem zapalnym, a także regeneracją wątroby. Wstrzyknięcie środka hepatotoksycznego APAP powoduje nieprzyjazne środowisko w wątrobie, zapobiegając proliferacji hepatocytów. Skraca to okres stresu u zwierzęcia, co w połączeniu z mniejszymi dawkami hepatotoksyny prowadzi do lepszej powtarzalności zabiegu. Dlatego przy użyciu tego modelu zbadano łączny efekt dwóch rodzajów uszkodzeń wątroby. W celu scharakteryzowania opracowanego modelu zwierzęcego ALF zbadano parametry fizjologiczne i biochemiczne. Skuteczna odwracalność ALF została potwierdzona przez przeszczepienie syngenicznych zdrowych hepatocytów szczura.

<table><tbody><tr><td>Paracetamol (Biocetamol)</td><td>EG Pharmaceuticals</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne</td></tr><tr><td>)Zestaw fosfatazy alkalicznej (DEA)</td><td>Coral Clinical System, Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Automatyczny analizator</td><td>Tulip, Alto Santracruz, Indie</td><td>Screen Maaster 3000</td><td>Analizator biochemiczny do testu czynnościowego wątroby</td></tr><tr><td>Betadine ( Povidon-Jod Solution)</td><td>Win-Medicare; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego (klasa I)</td><td>Kartos międzynarodowy; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Mikroskop jasnego pola</td><td>Olympus, Japonia</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxime (Taxim&reg;)</td><td>AlKem; Indie</td><td></td><td>cefotaksym do wstrzykiwań sodu, brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe</td><td>Sigma; US</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>17100-017</td><td></td></tr><tr><td>Patyczki kosmetyczne</td><td>Pure Swabs Pvt Ltd; Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Drape Sheet</td><td>JSD Surgicals, Delhi, Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>DPX Mountant</td><td>Sigma; US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór eozyny Y, alkoholowa</td><td>Sigma; Kleszcze HT110132</td><td></td><td></td>amerykańskie</tr><tr><td></td><td>duże chirurgiczne; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>System znieczulenia gazowego</td><td>Ugo Basile; Włochy</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Himedia, Indie</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji (Veet&reg;)</td><td>Reckitt Benckiser, Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny, Mayer's</td><td>Sigma; US</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sól sodowa</td><td>Himedia; Indie</td><td>RM554</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza z jąder owiec</td><td>Sigma; US</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>I.V. Kaniula (plusflon)</td><td>Mediplus, Indie</td><td>Ref 1732411420</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td>BD; </td><td>Nr ref. US 303060</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (foran&reg;)</td><td>Asecia Queenborough</td><td>No B506</td><td>Wziewny środek znieczulający</td></tr><tr><td>Ketamina (Ketamax&reg;)</td><td>Troikaa Pharmaceuticals Sp. z o.o.</td><td></td><td>Chlorowodorek ketaminy IP, Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Meloksykam (Melonex&reg;)</td><td>Intas Pharmaceuticals Sp. z o.o.; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Mikrouchwyty igieł proste i zakrzywiony</td><td>Mercian; Anglia</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikro uchwyty igłowe proste & zakrzywiony</td><td>Mercian; Anglia</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Histo-Line Laboratories, Włochy</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Thread</td><td>Mighty; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Himedia; Indie</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Odświeżanie łez/mgiełki do oczu w żelu</td><td>Allergan India Private Limited/Sun Pharma, Indie</td><td>P3060</td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Himedia; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>Major Surgicals; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Główne chirurgiczne; Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>SGOT (ASAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>SGPT (ALAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation; US</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma; US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne nr 22</td><td>La Medcare, Indie</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Rada chirurgiczna</td><td>wyprodukowana</td><td></td> lokalnie <td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Biała taśma chirurgiczna</td><td>3M Indie; Indie</td><td>1530-1</td><td>Nici chirurgiczne z mikroporami</td></tr><tr><td></td><td>Ethicon, Johnson & Johnson, Indie</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki (1 ml, 26 g)</td> <td>Dispo Van; Indie</td><td></td><td>Brak konkretnego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>Trymer (maszynka do strzyżenia)</td><td>Philips</td><td>NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Braun</td><td></td><td>Brak określonego numeru katalogowego (zamówienia lokalne)</td></tr><tr><td>William's E Media</td><td>Himedia; Indie</td><td>AT125</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna (Xylaxin&reg;)</td><td>Indian Immunologicals Limited</td><td></td><td>Środek uspokajający, przedznieczulający, przeciwbólowy i zwiotczający mięśnie</td></tr></tbody></table>

opracowanie szczurzego modelu ostrej niewydolności wątroby poprzez połączenie 70% częściowej hepatektomii i paracetamolu

Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen

Ostra niewydolność wątroby (ALF) jest stanem klinicznym spowodowanym różnymi etiologiami, powodującymi utratę funkcji metabolicznych, biochemicznych, syntezy i detoksykacji wątroby. W większości przypadków nieodwracalnego uszkodzenia wątroby jedynym dostępnym sposobem leczenia pozostaje ortotropowy przeszczep wątroby (OLT). Aby zbadać potencjał terapeutyczny leczenia ALF, niezbędne jest jego wcześniejsze przetestowanie na zwierzęcym modelu ALF. W obecnym badaniu model ALF u szczurów został opracowany poprzez połączenie 70% częściowej hepatektomii (PHx) i wstrzyknięć paracetamolu (APAP), co zapewnia okno terapeutyczne 48 godzin. Środkowy i lewy płat boczny wątroby usunięto w celu wycięcia 70% masy wątroby, a APAP podawano 24 godziny po operacji przez 2 dni. Stwierdzono, że przeżywalność u zwierząt z indukcją ALF była znacznie zmniejszona. Rozwój ALF potwierdzono zmienionym stężeniem w surowicy enzymów aminotransferazy alaninowej (ALT), aminotransferazy asparaginianowej (AST), fosfatazy alkalicznej (ALP); zmiany czasu protrombinowego (PT); oraz ocena międzynarodowego współczynnika znormalizowanego (INR). Badanie profilu ekspresji genów metodą qPCR wykazało wzrost poziomu ekspresji genów zaangażowanych w apoptozę, stan zapalny i postęp uszkodzenia wątroby. Na podstawie oceny histologicznej obserwowano rozlane zwyrodnienie hepatocytów i naciek komórek odpornościowych. Odwracalność ALF została potwierdzona przez przywrócenie przeżycia i poziomów ALT, AspAT i ALP w surowicy po dośledziony przeszczepieniu syngenicznych zdrowych hepatocytów szczura. Model ten stanowi wiarygodną alternatywę dla dostępnych modeli zwierzęcych ALF do badania patofizjologii ALF, a także do oceny potencjału nowej terapii ALF. Zastosowanie dwóch różnych podejść umożliwia również zbadanie łącznego wpływu fizycznego i polekowego uszkodzenia wątroby. Powtarzalność i wykonalność obecnej procedury jest dodatkową zaletą modelu.

Procent przeżywalności w modelach zwierzęcych ALF 
Optymalną dawką APAP wywołującą ALF w połączeniu z 70% PHx ustalono na poziomie 750 mg/kg masy ciała. Schemat leczenia rozpoczęto 24 h po 70% PHx, gdy zwierzęta całkowicie powróciły do sprawności po operacji; składał się on z dwóch dawek APAP podawanych w odstępach 24 h. Śmiertelność na poziomie 80% zaobserwowano po podaniu drugiej dawki APAP, 48 h po operacji. Procent przeżywalności przeanalizowano i przedstawiono za pomocą metody Kaplana-Meiera (<st...

Model zwierzęcy ostrej niewydolności wątroby, opracowany w obecnym badaniu, stanowi realną alternatywę dla badania potencjalnych terapii. Obecny model wykorzystuje łączny efekt fizycznego i polekowego uszkodzenia wątroby i zapewnia odpowiednie okno czasowe do zbadania potencjału nowych terapii.

Opracowanie szczurzego modelu ostrej niewydolności wątroby poprzez połączenie 70% częściowej hepatektomii i paracetamolu

Acute liver failure (ALF) is a clinical condition caused by various etiologies resulting in the loss of metabolic, biochemical, synthesizing, and ...

Ostra niewydolność wątroby lub ALF jest ogólnie definiowana jako szybki rozwój uszkodzenia wątroby w zdrowej wątrobie, któremu towarzyszy poważne upośledzenie jej głównych funkcji. Ortotopowy przeszczep wątroby jest jedynym dostępnym lekarstwem w większości przypadków. Jednak z powodu niedoboru dawców wątroby śmiertelność u pacjentów z ALF jest bardzo wysoka.Aby zbadać potencjał alternatywnych podejść terapeutycznych i lepiej zrozumieć patofizjologię ALF, wykorzystuje się zwierzęce modele choroby. Wiele modeli ALF opiera się na hepatotoksycznym działaniu paracetamolu, czterochlorku węgla, konkanawaliny A, lipopolisacharydu, D-galaktozaminy i tioacetamidu. Mają one jednak kilka wad, takich jak słaba odtwarzalność i odwracalność, toksyczność dla innych ważnych narządów, słabe odzwierciedlenie patologii chorób u ludzi i zmienności gatunkowej.W związku z tym istnieje potrzeba stworzenia lepszego systemu modelowego, który jest powtarzalny i pozwala na wystarczający odstęp czasu na badanie efektów interwencji terapeutycznej. W niniejszym badaniu stworzono model ALF u szczurów, łącząc efekty częściowej hepatektomii i hepatotoksyczności paracetamolu. Środkowy i lewy płat boczny wątroby są usuwane w celu wycięcia 70% masy wątroby, a następnie podaje się paracetamol w celu wywołania ALF.Rozwój ALF w modelu został scharakteryzowany analizą biochemiczną i histologiczną, a odwracalność uszkodzenia wątroby została potwierdzona przez przeszczepienie syngenicznych zdrowych hepatocytów szczura. W obecnym badaniu wykorzystano szczury rasy Wistar o masie ciała w zakresie od 180 do 250 gramów. Poniższe kroki opisują procedurę chirurgiczną indukcji ALF u szczura.Zwierzę znieczula się poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy i ksylazyny. Całkowite znieczulenie potwierdza się poprzez uszczypnięcie palca u nogi zwierzęcia, a dalsze zabiegi przeprowadza się tylko wtedy, gdy nie ma odruchu pedałowania. Aby zapobiec wysuszeniu rogówki, na obie oczy nakłada się krople do oczu na bazie karboksylometylocelulozy.Zwierzę jest przytrzymywane do deski chirurgicznej za pomocą białej taśmy. Włosy usuwa się z prawej górnej części brzucha za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia. Zdezynfekuj miejsce operacyjne za pomocą trzech naprzemiennych peelingów z 70% etanolu i jodowidonu za pomocą wysterylizowanych wacików w ruchach okrężnych.Skóra do przecięcia jest oznaczona tuż pod mostkiem prostopadle do mieczykowatej i równolegle do klatki piersiowej. Na oznaczoną skórę nakłada się sterylny arkusz zasłony o otworze około trzech centymetrów na jeden centymetr. Wzdłuż zaznaczonej linii wykonuje się poprzeczne nacięcie o długości około dwóch do trzech centymetrów za pomocą skalpela.Przyczep skóry z leżącą pod nią warstwą mięśniową w pobliżu naciętego obszaru jest delikatnie usuwany za pomocą sterylnych, zwilżonych końcówek bawełny. Następnie wykonuje się poprzeczne nacięcie przez warstwę otrzewnej tuż pod wyrostkiem mieczykowatym. Lewy płat wątroby jest odsłaniany poprzez delikatny nacisk na klatkę piersiową za pomocą dwóch zwilżonych solą fizjologiczną bawełnianych końcówek.Sterylna nylonowa pętla z nici jest nasunięta wokół odsłoniętego płata wątroby. Pętlę ostrożnie przenosi się do podstawy płata za pomocą mikrokleszczy preparacyjnych lub patyczków kosmetycznych. Za pomocą uchwytu na igłę do mikrochirurgii i mikrokleszczyków zawiązuje się dwa końce pętli, umieszczając węzeł jak najbliżej podstawy płata.Ma to na celu zwężenie naczyń krwionośnych i zmniejszenie krwawienia po usunięciu płata wątroby. Dwa dodatkowe węzły są zawiązane po drugiej stronie. Zawiązany płat jest cięty tuż nad węzłem za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych, co pozostawia niedokrwienny kikut.Podobnie środkowy płat wątroby jest podnoszony za pomocą bawełnianych końcówek. Rozpoznaj unikalny kształt środkowego płata wątroby. Umieść nylonową pętlę z nici na płatku, mocno zawiąż jej końce.Dwa dodatkowe węzły są zawiązane po drugiej stronie i przecinają płat. Po usunięciu płatów otrzewną zszywa się za pomocą wchłanialnego kagutu chromowego 4/0 wchłanialnego szwu z ciągłymi szwami, a następnie szycia skóry prostym szwem przerywanym. Po zamknięciu skóry wokół pola operacyjnego nakłada się roztwór jodu powidonu.Prześcieradło zasłony jest usuwane, a zwierzę jest zdejmowane z deski operacyjnej. Dawkę antybiotyku 12 miligramów cefotaksymu w jednym ml 5% roztworu glukozy podaje się zwierzęciu dootrzewnowo w celu ochrony przed ryzykiem infekcji pooperacyjnej. W celu złagodzenia bólu po zabiegu chirurgicznym meloksykam, zwykle 1 mg na kg masy ciała, podaje się zwierzęciu podskórnie, a następnie dawkę codziennie przez dwa dni.Zwierzę przenosi się do ciepłej klatki do rekonwalescencji. Zwierzę traci przytomność w ciągu 30 do 40 minut i zaczyna się poruszać. Operowane zwierzę jest trzymane w izolacji do czasu całkowitego zagojenia się ran chirurgicznych, co może potrwać od trzech do czterech dni.W celu wywołania ALF 750 miligramów na kg masy ciała paracetamolu i drugiej dawki meloksykamu wstrzykuje się dootrzewnowo 24 godziny po zabiegu częściowej hepatektomii. Ten schemat dawkowania powtarza się po 24 godzinach. Stwierdzono, że po indukcji ALF przeżywalność u zwierząt uległa znacznemu zmniejszeniu.Aby scharakteryzować rozwój ALF, operowane zwierzęta poddano eutanazji po drugiej dawce paracetamolu i przeprowadzono różne badania biochemiczne i histologiczne. Wyniki są opisane z wyprzedzeniem w filmie. Stwierdzono, że odsetek przeżycia w grupie indukowanej ALF był znacznie zmniejszony i zaobserwowano do 80% śmiertelności w ciągu 24 godzin od drugiej dawki paracetamolu.Uszkodzenie wątroby było widoczne na poziomie morfologicznym w grupie indukowanej ALF i tylko w grupie częściowej hepatektomii. Natomiast grupa kontrolna i tylko grupa leczona paracetamolem miała zdrowy wygląd. Stwierdzono, że poziomy enzymów aminotransferazy alaniny, aminotransferazy asparaginianowej i fosfatazy alkalicznej były znacznie podwyższone w grupie indukowanej ALF w porównaniu z innymi grupami.Analiza profilu ekspresji genów metodą qPCR wykazała podwyższoną ekspresję genów zaangażowanych w apoptozę, stan zapalny i progresję uszkodzenia wątroby. Zabarwienie skrawków tkanki wątroby hematoksyliną i eozyną ujawniło w grupie kontrolnej głównie prawidłowe hepatocyty. W grupie ALF obserwowano przeważnie umiarkowane makropęcherzykowe zwyrodnienie tłuszczowe.Stwierdzono, że czas protrombinowy i międzynarodowy współczynnik znormalizowany były podwyższone w grupie indukowanej ALF, co wskazuje na utrudniony proces krzepnięcia krwi. Stwierdzono, że odsetek przeżycia został przywrócony w grupie indukowanej ALF po przeszczepieniu syngenicznych zdrowych hepatocytów szczura. Stwierdzono, że poziomy enzymów aminotransferazy alaniny, aminotransferazy asparaginianowej i fosfatazy alkalicznej w surowicy zostały przywrócone u zwierząt indukowanych ALF po przeszczepieniu komórek.Ta metoda indukcji ALF u szczurów jest powtarzalna, wykazuje dobrą odwracalność i zapewnia odpowiednie okno czasowe do testowania nowych terapii. W związku z tym model ten może służyć jako skuteczny model choroby do oceny potencjalnych podejść terapeutycznych w leczeniu ALF.

generation-rat-model-acute-liver-failure-combining-70-partial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ortotopowe przeszczepienie wątroby u szczurów jest niezbędnym modelem eksperymentalnym w badaniach biomedycznych. W niniejszym materiale przedstawiamy procedury chirurgiczne ortotopowego przeszczepienia wątroby szczura z rekonstrukcją tętnicy wątrobowej z wykorzystaniem 50% częściowego graftu.

Procedury chirurgiczne w szczurzym modelu częściowego ortotopowego przeszczepu wątroby z rekonstrukcją tętnicy wątrobowej

Pomocniczy przeszczep wątroby zapewnia tymczasowe wsparcie w ostrej niewydolności wątroby, aż do regeneracji niewydolnej wątroby. Heterotopowy pomocniczy przeszczep wątroby (HALT) z tętnicą żyły wrotnej (PVA) zapewnia wystarczającą czynność wątroby. Opracowaliśmy analogiczną technikę na szczurach, aby zbadać wpływ tętnicy żyły wrotnej na morfologię i funkcję przeszczepu.

Heterotopowe pomocnicze przeszczepienie wątroby szczura z tętnicą żyły wrotnej o regulowanym przepływie w ostrej niewydolności wątroby

Opisujemy metodę tworzenia zwierzęcego modelu zwłóknienia wątroby u szczura i oceniamy stopień zwłóknienia poprzez badanie histologiczne wątroby. Model może być wykorzystany do badania rozwoju chorób wątroby, a także do testowania skuteczności potencjalnych środków przeciwzwłóknieniowych.

Model zwłóknienia wątroby wywołanego dimetylonitrozoaminą u szczura

Unikalny model zacisku wnękowego wątroby szczura został opracowany do badania wpływu cząsteczek farmakologicznych na łagodzenie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Model ten obejmuje bezpośrednią kaniulację dopływu wrotnego do niedokrwionego segmentu wątroby przez odgałęzienie żyły wrotnej, co pozwala na bezpośrednie dostarczenie wątrobowe.

Metoda bezpośredniego segmentalnego dostarczania dowątrobowego przy użyciu modelu klamry Hilar wątroby szczura

Wywołanie szybkiego przerostu wątroby za pomocą Kojarzenia Partycji Wątroby i Podwiązania Żyły Wrotnej dla etapowej hepatektomii (ALPPS) zostało zaproponowane do resekcji granicznych resekcyjnych guzów wątroby. Model ten może wyjaśnić mechanizmy związane z szybką hipertrofią i umożliwia testowanie leków, które promują lub blokują przyspieszenie regeneracji.

Szczurzy model skojarzenia partycji wątroby i podwiązania żyły wrotnej do etapowej procedury hepatektomii (ALPPS)

Tutaj opisujemy powszechną metodę wywoływania przewlekłego uszkodzenia wątroby u myszy poprzez karmienie dietą ubogą w cholinę i uzupełnioną etyoniną (CDE). Pokazujemy monitorowanie stanu zdrowia, perfuzję wątroby, izolację i konserwację. Sześciotygodniowy przebieg może informować o uszkodzeniu wątroby, patohistologii, zwłóknieniu, zapaleniu i odpowiedziach komórek progenitorowych wątroby.

Model przewlekłego uszkodzenia wątroby z niedoborem choliny i etyoniną (CDE)

Tutaj przedstawiono protokół polegający na ponownym przeszczepieniu wątroby szczurowi. W szczególności 70% wątroby wycięto in vivo przy użyciu zaktualizowanej techniki hepatektomii zorientowanej na naczynia. Tętnicę wątrobową zrekonstruowano w sposób end-to-side. Technika mankietu została zmodyfikowana w celu skrócenia czasu zespolenia żyły podwątrobowej głównej.

Ponownie zarteryalizowany częściowy przeszczep wątroby szczura z 70% hepatektomią in vivo zorientowaną na naczynia

Tutaj prezentujemy nową metodę częściowej resekcji lewego płata wątroby u noworodków (dzień 0) myszy. Ten nowy protokół jest odpowiedni do badania ostrego uszkodzenia wątroby i reakcji na uraz u noworodków.

Hepatektomia zrazikowa częściowa: chirurgiczny model morfologicznej regeneracji wątroby

Ten protokół opisuje powszechną i wykonalną metodę wywoływania ostrego uszkodzenia wątroby (ALI) poprzez ekspozycję na CCl4 przez sondę ustno-żołądkową. Ekspozycja naCCl 4 indukuje ALI poprzez tworzenie reaktywnych form tlenu podczas jego biotransformacji w wątrobie. Metoda ta służy do analizy patofizjologii ALI i badania różnych strategii hepatoprotekcyjnych.

Wywoływanie ostrego uszkodzenia wątroby u szczurów poprzez ekspozycję na czterochlorek węgla (CCl4) przez sondę ustno-żołądkową

Mysi model częściowej 2/3 (66%) hepatektomii jest dobrze opisany w literaturze, ale rzadko stosowano bardziej rozbudowane hepatektomie naśladujące zespół małego dla rozmiaru po przeszczepie wątroby. Opisujemy rozszerzoną 78% procedurę hepatektomii w modelu mysim, która powoduje około 50% śmiertelności pooperacyjnej u zdrowych myszy.

Rozszerzona 78% hepatektomia w mysim modelu chirurgicznym

Poznaj metodę tworzenia modelu ostrej niewydolności wątroby u szczurów poprzez połączenie 70% hepatektomii z hepatotoksycznością paracetamolu. Ten powtarzalny model umożliwia badanie nowych terapii.

Opracowanie szczurzego modelu ostrej niewydolności wątroby poprzez połączenie 70% częściowej hepatektomii i paracetamolu

Przeglądaj więcej filmów