Opracowanie szczurzego modelu ostrej niewydolności wątroby poprzez połączenie 70% częściowej hepatektomii i paracetamolu

Ostra niewydolność wątroby lub ALF jest ogólnie definiowana jako szybki rozwój uszkodzenia wątroby w zdrowej wątrobie, któremu towarzyszy poważne upośledzenie jej głównych funkcji. Ortotopowy przeszczep wątroby jest jedynym dostępnym lekarstwem w większości przypadków. Jednak z powodu niedoboru dawców wątroby śmiertelność u pacjentów z ALF jest bardzo wysoka.

Aby zbadać potencjał alternatywnych podejść terapeutycznych i lepiej zrozumieć patofizjologię ALF, wykorzystuje się zwierzęce modele choroby. Wiele modeli ALF opiera się na hepatotoksycznym działaniu paracetamolu, czterochlorku węgla, konkanawaliny A, lipopolisacharydu, D-galaktozaminy i tioacetamidu. Mają one jednak kilka wad, takich jak słaba odtwarzalność i odwracalność, toksyczność dla innych ważnych narządów, słabe odzwierciedlenie patologii chorób u ludzi i zmienności gatunkowej.

W związku z tym istnieje potrzeba stworzenia lepszego systemu modelowego, który jest powtarzalny i pozwala na wystarczający odstęp czasu na badanie efektów interwencji terapeutycznej. W niniejszym badaniu stworzono model ALF u szczurów, łącząc efekty częściowej hepatektomii i hepatotoksyczności paracetamolu. Środkowy i lewy płat boczny wątroby są usuwane w celu wycięcia 70% masy wątroby, a następnie podaje się paracetamol w celu wywołania ALF.

Rozwój ALF w modelu został scharakteryzowany analizą biochemiczną i histologiczną, a odwracalność uszkodzenia wątroby została potwierdzona przez przeszczepienie syngenicznych zdrowych hepatocytów szczura. W obecnym badaniu wykorzystano szczury rasy Wistar o masie ciała w zakresie od 180 do 250 gramów. Poniższe kroki opisują procedurę chirurgiczną indukcji ALF u szczura.

Zwierzę znieczula się poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy i ksylazyny. Całkowite znieczulenie potwierdza się poprzez uszczypnięcie palca u nogi zwierzęcia, a dalsze zabiegi przeprowadza się tylko wtedy, gdy nie ma odruchu pedałowania. Aby zapobiec wysuszeniu rogówki, na obie oczy nakłada się krople do oczu na bazie karboksylometylocelulozy.

Zwierzę jest przytrzymywane do deski chirurgicznej za pomocą białej taśmy. Włosy usuwa się z prawej górnej części brzucha za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia. Zdezynfekuj miejsce operacyjne za pomocą trzech naprzemiennych peelingów z 70% etanolu i jodowidonu za pomocą wysterylizowanych wacików w ruchach okrężnych.

Skóra do przecięcia jest oznaczona tuż pod mostkiem prostopadle do mieczykowatej i równolegle do klatki piersiowej. Na oznaczoną skórę nakłada się sterylny arkusz zasłony o otworze około trzech centymetrów na jeden centymetr. Wzdłuż zaznaczonej linii wykonuje się poprzeczne nacięcie o długości około dwóch do trzech centymetrów za pomocą skalpela.

Przyczep skóry z leżącą pod nią warstwą mięśniową w pobliżu naciętego obszaru jest delikatnie usuwany za pomocą sterylnych, zwilżonych końcówek bawełny. Następnie wykonuje się poprzeczne nacięcie przez warstwę otrzewnej tuż pod wyrostkiem mieczykowatym. Lewy płat wątroby jest odsłaniany poprzez delikatny nacisk na klatkę piersiową za pomocą dwóch zwilżonych solą fizjologiczną bawełnianych końcówek.

Sterylna nylonowa pętla z nici jest nasunięta wokół odsłoniętego płata wątroby. Pętlę ostrożnie przenosi się do podstawy płata za pomocą mikrokleszczy preparacyjnych lub patyczków kosmetycznych. Za pomocą uchwytu na igłę do mikrochirurgii i mikrokleszczyków zawiązuje się dwa końce pętli, umieszczając węzeł jak najbliżej podstawy płata.

Ma to na celu zwężenie naczyń krwionośnych i zmniejszenie krwawienia po usunięciu płata wątroby. Dwa dodatkowe węzły są zawiązane po drugiej stronie. Zawiązany płat jest cięty tuż nad węzłem za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych, co pozostawia niedokrwienny kikut.

Podobnie środkowy płat wątroby jest podnoszony za pomocą bawełnianych końcówek. Rozpoznaj unikalny kształt środkowego płata wątroby. Umieść nylonową pętlę z nici na płatku, mocno zawiąż jej końce.

Dwa dodatkowe węzły są zawiązane po drugiej stronie i przecinają płat. Po usunięciu płatów otrzewną zszywa się za pomocą wchłanialnego kagutu chromowego 4/0 wchłanialnego szwu z ciągłymi szwami, a następnie szycia skóry prostym szwem przerywanym. Po zamknięciu skóry wokół pola operacyjnego nakłada się roztwór jodu powidonu.

Prześcieradło zasłony jest usuwane, a zwierzę jest zdejmowane z deski operacyjnej. Dawkę antybiotyku 12 miligramów cefotaksymu w jednym ml 5% roztworu glukozy podaje się zwierzęciu dootrzewnowo w celu ochrony przed ryzykiem infekcji pooperacyjnej. W celu złagodzenia bólu po zabiegu chirurgicznym meloksykam, zwykle 1 mg na kg masy ciała, podaje się zwierzęciu podskórnie, a następnie dawkę codziennie przez dwa dni.

Zwierzę przenosi się do ciepłej klatki do rekonwalescencji. Zwierzę traci przytomność w ciągu 30 do 40 minut i zaczyna się poruszać. Operowane zwierzę jest trzymane w izolacji do czasu całkowitego zagojenia się ran chirurgicznych, co może potrwać od trzech do czterech dni.

W celu wywołania ALF 750 miligramów na kg masy ciała paracetamolu i drugiej dawki meloksykamu wstrzykuje się dootrzewnowo 24 godziny po zabiegu częściowej hepatektomii. Ten schemat dawkowania powtarza się po 24 godzinach. Stwierdzono, że po indukcji ALF przeżywalność u zwierząt uległa znacznemu zmniejszeniu.

Aby scharakteryzować rozwój ALF, operowane zwierzęta poddano eutanazji po drugiej dawce paracetamolu i przeprowadzono różne badania biochemiczne i histologiczne. Wyniki są opisane z wyprzedzeniem w filmie. Stwierdzono, że odsetek przeżycia w grupie indukowanej ALF był znacznie zmniejszony i zaobserwowano do 80% śmiertelności w ciągu 24 godzin od drugiej dawki paracetamolu.

Uszkodzenie wątroby było widoczne na poziomie morfologicznym w grupie indukowanej ALF i tylko w grupie częściowej hepatektomii. Natomiast grupa kontrolna i tylko grupa leczona paracetamolem miała zdrowy wygląd. Stwierdzono, że poziomy enzymów aminotransferazy alaniny, aminotransferazy asparaginianowej i fosfatazy alkalicznej były znacznie podwyższone w grupie indukowanej ALF w porównaniu z innymi grupami.

Analiza profilu ekspresji genów metodą qPCR wykazała podwyższoną ekspresję genów zaangażowanych w apoptozę, stan zapalny i progresję uszkodzenia wątroby. Zabarwienie skrawków tkanki wątroby hematoksyliną i eozyną ujawniło w grupie kontrolnej głównie prawidłowe hepatocyty. W grupie ALF obserwowano przeważnie umiarkowane makropęcherzykowe zwyrodnienie tłuszczowe.

Stwierdzono, że czas protrombinowy i międzynarodowy współczynnik znormalizowany były podwyższone w grupie indukowanej ALF, co wskazuje na utrudniony proces krzepnięcia krwi. Stwierdzono, że odsetek przeżycia został przywrócony w grupie indukowanej ALF po przeszczepieniu syngenicznych zdrowych hepatocytów szczura. Stwierdzono, że poziomy enzymów aminotransferazy alaniny, aminotransferazy asparaginianowej i fosfatazy alkalicznej w surowicy zostały przywrócone u zwierząt indukowanych ALF po przeszczepieniu komórek.

Ta metoda indukcji ALF u szczurów jest powtarzalna, wykazuje dobrą odwracalność i zapewnia odpowiednie okno czasowe do testowania nowych terapii. W związku z tym model ten może służyć jako skuteczny model choroby do oceny potencjalnych podejść terapeutycznych w leczeniu ALF.