Name: Różnicowanie komórek HC11 i EpH4 nabłonka piersi myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj techniki różnicowania komórek nabłonka piersi myszy HC11 i EpH4 w kulturze trójwymiarowej. Ta metoda pozwala badać związki między różnicowaniem a transformacją nowotworową oraz identyfikować cele terapeutyczne w terapii raka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Linia komórkowa HC11 została uprzejmie dostarczona przez Dr. D. Medina (Houston, TX). Autorzy są wdzięczni dr Andrew Craigowi z Queen's University za wiele odczynników i cennych sugestii. Komórki EpH4 były prezentem od dr C. Roskelleya (UBC, Vancouver). Colleen Schick zapewniła doskonałą pomoc techniczną w zakresie badań nad kulturami 3D.
Z wdzięcznością dziękujemy za pomoc finansową Kanadyjskiej Rady ds. Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią (NSERC), Kanadyjskim Instytutom Badań nad Zdrowiem (CIHR), Kanadyjskiej Fundacji Raka Piersi (CBCF, Ontario Chapter), Kanadyjskiemu Sojuszowi Badań nad Rakiem Piersi, Ontario Centres of Excellence, Breast Cancer Action Kingston (BCAK) oraz funduszowi Clare Nelson Bequest poprzez dotacje dla LR. Projekt BE otrzymał wsparcie finansowe od CIHR, CBCF, BCAK i Cancer Research Society Inc. PTG jest wspierane przez Kanadyjską Katedrę Badań, Kanadyjską Fundację Innowacji, CIHR, NSERC i Kanadyjskie Towarzystwo Onkologiczne. MN był wspierany przez stypendium w ramach Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research z NCIC, nagrodę dla absolwentów (QGA) oraz nagrodę dziekana z Queen's University. MG było wspierane przez stypendia podoktorskie z US Army Breast Cancer Program, Ministerstwa Badań i Innowacji Prowincji Ontario oraz Doradczego Komitetu Badawczego Queen's University. VH był wspierany przez stypendium doktoranckie CBCF i stypendium podoktorskie w ramach programu szkoleniowego Fundacji Terry'ego Foxa w zakresie transdyscyplinarnych badań nad rakiem we współpracy z CIHR. Hanad Adan był stypendystą letniego stypendium NSERC. BS został wsparty nagrodą dla absolwentów Queen's University.

1. Posiewanie komórek HC11
<ol>
	<li>W okapie z przepływem laminarnym przy użyciu sterylnych technik przygotuj butelkę z 50 ml pożywki komórkowej HC11: RPMI-1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 5 μg/ml insuliny i 10 ng/ml EGF (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Płytka około 400 000 komórek na 3 cm szalka Petriego: Przełóż dwie 10-centymetrowe, 50% zlewające się płytki Petriego na dwadzieścia 3-centymetrowych szalek w pożywce HC11. Komórki muszą być dobrze rozłożone, ale należy unikać wysuszania.
	<ol>
		<li>Zassać pożywkę do kolby za pomocą pompy próżniowej.</li>
		<li>Dodać 250 μl trypsyny (patrz tabela materiałów) na płytkę o średnicy 10 cm. Zakręć i uderz w płytkę z boków, trzymając ją poziomo, aby rozprowadzić trypsynę i usunąć przyczepione komórki</li>
		<li>Obserwuj mikroskopię z kontrastem fazowym z obiektywem 4x, aby upewnić się, że komórki zaczęły odczepiać się od krawędzi przed pipetowaniem.</li>
		<li>Odessać około 1,5 ml pożywki HC11 w sterylnej, 9-calowej pipecie Pasteura i spryskać nią pionowo na komórki. Obróć szalkę Petriego podczas tryskania, aby usunąć wszystkie komórki. Musisz pracować szybko, aby uniknąć wysuszenia komórek.</li>
		<li>Przenieś wszystkie komórki do butelki z pożywką HC11 i zawiruj.</li>
		<li>Odpipetować 2 ml zawiesiny komórek na każdą 3 cm szalkę Petriego. Obróć szalki Petriego w poprzek, aby równomiernie się rozłożyły. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia lub gdy komórki są ~90-100% zlewne, odessaj pożywkę i zastąp ją pożywką z FBS i insuliną, ale bez EGF.</li>
</ol>
2. Indukcja, monitorowanie i oznaczanie ilościowe komórek HC11
<ol>
	<li>Po hodowaniu komórek w pożywce pozbawionej EGF przez 24 godziny, dodaj pożywkę różnicującą (pożywkę HIP) do dziesięciu 3 cm płytek: RPMI-1640 uzupełniony 10% FBS, 1 μg/ml Hydrokortyzonu (patrz Tabela Materiałów), 5 μg/ml Insuliny i 5 μg/ml Prolaktyny (patrz Tabela Materiałów) przez okres do 10 dni.</li>
	<li>Pozostałe dziesięć płytek o średnicy 3 cm należy zachować jako kontrolę: Zmień na pożywkę z 10% FBS i 5 μg/ml insuliny bez EGF i HIP.</li>
	<li>Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni zarówno na komórki traktowane HIP, jak i kontrolne. Ostrożnie odpipetować pożywkę, aby upewnić się, że komórki się nie oderwą.</li>
	<li>Aby monitorować różnicowanie (tj. tworzenie się "kopuł"), obserwuj komórki pod mikroskopią z kontrastem fazowym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A, lewy panel). Jeśli komórki wykazują ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP), obserwuj pod mikroskopią fluorescencyjną (wzbudzenie = 485/20; emisja = 530/25; powiększenie 240x; obiektyw 20x) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A, prawy panel).</li>
	<li>Aby określić ilościowo stopień zróżnicowania, ekstrahuj białka z jednej szalki Petriego z każdej z komórek traktowanych HIP i kontrolnych, raz dziennie przez łącznie 10 dni i sonduj Western blot pod kątem β-kazeiny (patrz Tabela materiałów) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).
	<ol>
		<li>Zeskrob komórki na lodzie za pomocą 1,5 ml lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 1,8 ml.</li>
		<li>Granulować komórki w temperaturze 350 x g, 1 min, 4 °C.</li>
		<li>Szybko umyj pellet 2x lodowatym PBS. Odcedź wszelkie pozostałości.</li>
		<li>Przygotuj bufor do lizy: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 10 μg/ml aprotyniny, 10 μg/ml leupeptin16. Dodać 100 μl na 3 cm szalkę Petriego.</li>
		<li>Klarować lizat przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 10 minut na zimno.</li>
		<li>Oznaczyć stężenie białka (patrz tabela materiałów) i załadować 10–20 μg białka z każdej próbki na 10% żel poliakrylamid-SDS.</li>
		<li>Elektroforeza przez 15 h przy 45 V, lub przy 100 V przez ~2–2,5 h.</li>
		<li>Przenieść na membranę nitrocelulozową lub PVDF za pomocą aparatu do elektroblottingu (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Blok z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w soli fizjologicznej buforowanej tris z 0,1% Tween-20 (TBST).</li>
		<li>Dodać przeciwciało pierwszorzędowe, kozią anty-β-kazeinę rozcieńczoną w stosunku 1:2,000 lub mysią anty-β-aktynę rozcieńczoną w stosunku 1:1,000 (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Umyj 3x łyżką łyżkową po 5 minut za każdym razem.</li>
		<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe, przeciwciało przeciwko kozom sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczone w stosunku 1:2,500 lub przeciwciało przeciwko koniu połączone z HRP rozcieńczone w stosunku 1:10,000.</li>
		<li>Umyj 3x łyżką łyżkową po 5 minut za każdym razem.</li>
		<li>Dodać odczynniki ECL do membrany zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Posiewanie i 3D wzrost komórek EpH4 w matrycy EHS
UWAGA: Matryca jest ciekła w temperaturach <10 °C i stała w temperaturach wyższych. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Rozmrozić w temperaturze 4 °C na noc przed użyciem. Przed użyciem należy wstępnie schłodzić płytki do kultur tkankowych i końcówki pipet w temperaturze -20 °C, a następnie przechowywać matrycę, płytki i końcówki pipet na lodzie, aby zapobiec ich zestaleniu.
<ol>
	<li>Hoduj komórki EpH4 w 2D w pożywce RPMI-1640 z 10% FBS i 5 μg/ml insuliny (EGF nie jest wymagany).</li>
	<li>Przygotować pożywkę wzrostową EpH4 uzupełnioną 10% (v/v, 3,500 μL) lub 20% (v/v 2,000 μL) w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Przechowywać na lodzie, aż będzie gotowy do użycia.</li>
	<li>Pokryj 10 dołków (po 1 cm2 każda) płytki 24-dołkowej 150 μl nierozcieńczonej matrycy. Rozprowadź matrycę za pomocą końcówki do pipet. Unikaj tworzenia bąbelków. Delikatnie postukaj w boki płytki, trzymając ją poziomo, aby upewnić się, że matryca jest równomiernie rozłożona na dnie studzienki.</li>
	<li>Inkubować płytkę 24-dołkową w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić zestalenie się matrycy.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki EpH4 zgodnie z powyższym opisem dla komórek HC11 i policz je za pomocą hemocytometru. Przenieść 5 x 104 komórek na studzienkę do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować z prędkością 250 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie zassać pożywkę i umieścić rurkę na lodzie.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 350 μl pożywki wzrostowej EpH4 uzupełnionej 20% matrycą za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, trzymając stożkową probówkę na lodzie. Unikaj bąbelków. Ważne jest, aby zapewnić zawieszenie pojedynczej komórki.</li>
	<li>Po zestaleniu się matrycy dolnej warstwy (matryca powinna wydawać się półprzezroczysta i jaśniejsza w porównaniu z początkową powłoką studzienek), dodać 350 μl zawiesiny komórek do każdej powlekanej studzienki i umieścić w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C na ~ 1 godzinę, aby umożliwić zestalenie się 20% warstwy matrycy.
	<ol>
		<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem kontrastu fazowego za pomocą obiektywu 4x. Pojedyncze komórki powinny być widoczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 200 μl pożywki EpH4 zawierającej 10% matrycy na wierzch 350 μl komórek zawieszonych w 20% matrycy. Inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
4. Indukcja różnicowania komórek EpH4 hodowanych w 3D (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
UWAGA: Oprócz różnicowania, komórki EpH4 mogą również ulegać tubuogenezie, gdy są stymulowane HGF (czynnikiem wzrostu hepatocytów) w hodowli 3D. Wyrostki rurkowe można zobaczyć po 10 dniach stymulacji HIP i HGF.
<ol>
	<li>Rozpocznij indukcję różnicowania komórek EpH4 1 dzień po posianiu w macierzy. Ostrożnie usunąć 150 μl górnej pożywki zawierającej 10% matrycy z dołków za pomocą plastikowej końcówki do pipety. Dodać 200 μl pożywki EpH4 zawierającej HIP i 10% matrycy.</li>
	<li>Wymieniaj 10% podłoże matrix-HIP co 2 dni przez okres do 10 dni. Hoduj komórki kontrolne w tym samym 10% pożywce matrycowej bez HIP.</li>
	<li>Monitoruj formowanie się mammosfery pod wpływem kontrastu fazowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A, dolny panel).</li>
</ol>
5. Indukcja tubulingenezy komórek EpH4 hodowanych w 3D (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A i 3C)
<ol>
	<li>Przygotuj 24-dołkowe płytki i komórki EpH4 do wzrostu w matrycy, jak opisano w krokach 3.1–3.9. Następnego dnia po posianiu komórek w matrycy usunąć 150 μl pożywki EpH4 zawierającej 10% matrycy z dołków za pomocą plastikowej końcówki do pipety. Dodać 200 μl pożywki EpH4 zawierającej 10% matrycy, HIP i 20 ng/ml HGF (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wymieniaj 10% podłoże matrycowe/HIP/HGF co 2 dni przez okres do 12–14 dni.</li>
	<li>Monitoruj tworzenie się kanalików pod mikroskopem za pomocą obiektywu 20x lub 40x (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A, prawy panel).</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja różnicowania: Western Blot dla β-kazeiny
<ol>
	<li>Ostrożnie odpipetować 10% pożywkę matrix-HIP z dołków. Przepłucz 20% warstwę matrycy 2x 350 μl lodowatego PBS. Sferoidy powinny być nadal obecne w warstwie matrycy.</li>
	<li>Dodać 700–1 000 μl lodowatego PBS z 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) bezpośrednio do studzienek. Delikatnie odłącz dolną warstwę matrycy 100% od studzienki za pomocą końcówki pipety, aby odzyskać sferoidy obecne w tej warstwie. Wstrząsać delikatnie przez 30 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść zawiesinę sferoidalną do stożkowej rurki. Przepłukać studzienki ~500 μl PBS-EDTA, aby odzyskać wszelkie pozostałe sferoidy w studzienkach i dodać do stożkowej probówki.</li>
	<li>Kołysz się na lodzie przez dodatkowe 30 minut. Upewnij się, że matryca całkowicie się rozpuściła. Jeśli widoczne są grudki macierzy, dodaj więcej PBS-EDTA lub potrząsaj dłużej.</li>
	<li>Odwirować roztwór, aby granulować sferoidy o stężeniu 350 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant, zdać lizę sferoid w lodowato zimnym buforze do lizy i sondować pod kątem β-kazeiny, cykliny D1 i p120RasGAP za pomocą Western blot, jak w kroku 2.5 powyżej16. Jako przeciwciała pierwszorzędowe należy użyć koziej anty-β-kazeiny rozcieńczonej 1:2,000, króliczej antycykliny D1 rozcieńczonej 1:2,000 i mysiego anty-p120 rozcieńczonego 1:2,000. W przypadku przeciwciał drugorzędowych należy użyć przeciwciał przeciwko kozom sprzężonym z HRP w stosunku 1:2,500, w stosunku do królików w stosunku 1:2,500 i w stosunku do koni połączonych z HRP w stosunku 1:10,000.</li>
</ol>
<!--Nie usuwaj—>

<ol><li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engaged+for+survival%3B+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Jaks-Stat%22%5BJournal%5D)">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li>
<li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin%2FRac+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li>
<li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li>
<li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li>
<li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells%3A+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li>
<li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).</li>
<li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598(2015).</li>
<li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265(2009).</li>
<li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li>
<li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li>
<li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li>
<li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li>
<li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26(2009).</li>
<li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li>
<li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127(2013).</li>
<li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac%2FCdc42+and+Stat3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li>
<li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130%2FStat3+axis%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li>
<li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+R%28h%29oads+to+Stat3%3A+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li>
<li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+structure%2C+to+survival%3A+Stat3+activation+by+cadherin+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li>
<li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li>
<li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Role+of+cell+adhesion+microevironment+and+the+Src%2FStat3+axis+in+autocrine+HGF+signaling+during+breast+tumourigenesis%22">Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis</a>. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).</li>
<li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1%2F2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li>
<li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+gene+products%3B+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li>
<li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li>
<li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+novel+regulatory+role+of+Ezrin+in+promoting+breast+cancer+cell+invasion+and+metastasis%22">A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis</a>. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).</li>
<li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+%28Stat3%29+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+%28NHE3%29+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li>
<li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+tissue+engineering%3A+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li>
<li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novel+Stat3+and+Stat5+pathways+in+epithelial+cell+differentiation%22">Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation</a>. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Komórki HC11 idealnie nadają się do badania różnicowania w połączeniu z transformacją nowotworową. Dodatkową zaletą jest to, że komórki HC11 są łatwo infekowane wektorami retrowirusowymi opartymi na Mo-MLV w celu ekspresji różnych genów. W naszych rękach komórki EpH4 były trudniejsze do zakażenia tymi samymi wektorami retrowirusowymi niż HC112.
Kontakt międzykomórkowy i zatrzymanie wzrostu są kluczowymi warunkami wstępnymi różnicowania komórek HC11. Tak więc, aby osiągn...

W normalnych tkankach lub nowotworach, komórki mają szerokie możliwości przylegania do swoich sąsiadów w trójwymiarowej organizacji, co jest naśladowane w hodowli przez wzrost komórek o dużej gęstości. Adhezja międzykomórkowa odbywa się głównie za pośrednictwem receptorów kadheryny, które definiują architekturę komórek i tkanek. Co ciekawe, niedawno wykazano, że kadheryny również odgrywają potężną rolę w transdukcji sygnału, zwłaszcza w sygnalizacji przeżycia1. Paradoksalnie, niedawno odkryto, że niektóre z tych sygnałów adhezji między komórkami emanujących z kadheryny są wspólne zarówno dla różnicowania, jak i nowotworu2. W tym miejscu opisano metody indukcji i oceny różnicowania w dwóch reprezentatywnych typach linii komórkowych nabłonka piersi myszy, HC11 i EpH4.
Linia komórkowa nabłonka piersi myszy HC11 może stanowić użyteczny model do badania różnicowania komórek nabłonkowych. Komórki HC11 to linia komórkowa pochodząca z COMMA-1D, pochodząca z gruczołu sutkowego kobiety w połowie ciąży Balb/c mouse3. W przeciwieństwie do innych klonów pochodnych COMMA-1D, klon HC11 nie wymaga egzogennie dodanej macierzy zewnątrzkomórkowej lub kouprawy z innymi typami komórek w celu indukcji in vitro endogennego genu β-kazeiny przez hormony laktogenne3. Ta linia komórkowa była szeroko stosowana w badaniach różnicowania, ponieważ zachowała ważne cechy prawidłowego nabłonka sutka: komórki HC11 mogą częściowo odtworzyć nabłonek przewodowy w oczyszczonej poduszeczce tłuszczowej sutka4. Co więcej, mogą różnicować się w dwuwymiarowej (2D) kulturze, gdy rosną do zbiegu przyczepione do plastikowej powierzchni szalki Petriego w obecności steroidu, takiego jak Hydrokortyzon lub deksametazon, oprócz Insuliny i Prolaktyny (pożywka HIP) bez naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), inhibitora różnicowania5,6,7. W tych warunkach komórki HC11 wytwarzają białka mleka, takie jak β-kazeina i WAP, które są wykrywalne przez Western blot w ciągu 4 dni po indukcji. W tym samym czasie część komórek HC11 tworzy szczątkowe struktury przypominające gruczoły sutkowe, zwane w sposób stochastyczny "kopułami". Kopuły są widoczne 4-5 dni po indukcji i stopniowo powiększają się aż do 10 dnia, czemu towarzyszy wzrost produkcji β-kazeiny8. Co ciekawe, komórki HC11 posiadają zmutowany p539, a zatem reprezentują stan przednowotworowy. Z tego powodu model HC11 idealnie nadaje się do badania sieci sygnalizacyjnych różnicowania w połączeniu z nowotworem w tym samym układzie komórkowym.
Komórki EpH4, pochodna komórek IM-2, to nienowotworowa linia komórkowa pierwotnie pochodząca z spontanicznie unieśmiertelnionych komórek nabłonka gruczołu sutkowego myszy wyizolowanych od myszy w połowie ciąży Balb/c mouse10. Komórki EpH4 tworzą ciągłe monowarstwy nabłonkowe w hodowli 2D, ale nie różnicują się w struktury podobne do gruczołów10,11. Jednak po wzroście 3D w materiale składającym się z mieszaniny białek macierzy zewnątrzkomórkowej wytwarzanych przez komórki mięsaka myszy EHS12 (matryca EHS, matryca lub Matrigel, patrz tabela materiałów), oprócz stymulacji HIP, komórki EpH4 mogą podsumować początkowe etapy różnicowania gruczołu sutkowego. W tych warunkach komórki EpH4 tworzą sferoidy (zwane również mammosferami), które wykazują polaryzację wierzchołkowo-podstawową i puste światło oraz są zdolne do wytwarzania białek mleka, β-kazeiny i WAP, podobnie jak komórki nabłonka sutka w okresie laktacji. W przeciwieństwie do komórek HC11, które są niezróżnicowane, a niektóre wyrażają markery mezenchymalne13, komórki EpH4 wykazują czysto luminalną morfologię14. Doniesiono również, że komórki EpH4 wytwarzają białka mleka w hodowli 2D poprzez stymulację deksametazonem, insuliną i prolaktyną15. Jednak takie podejście wyklucza badanie efektów regulacyjnych, które naśladują mikrośrodowisko gruczołu sutkowego w hodowli 3D.

<table><tbody><tr><td>30% Akrylamid/0,8% roztwór Bis Bio</td><td>Rad</td><td>1610154</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Przeciwciało antycyklinowe D1</td><td>królik,</td> mysz z przeciwciałem Santa Cruz <td>sc-717</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>anty-p120</td><td>, Santa Cruz</td><td>sc-373751</td><td>Western Blotting</td></tr><tr>Mysz z<td>przeciwciałem anty-&beta; aktyną</td><td>, technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3700</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anty-&beta; Przeciwciało kazeinowe</td><td>koza, Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17971</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bio Shop</td><td>APR600</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Roztwór kwasu bicynchoninowego</td><td>Sigma</td><td>B9643-1L-KC</td><td>Oznaczanie białka</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Bio Shop</td><td>ALB007.500</td><td>Czystość oznaczania białek</td></tr><tr><td>Western ECL Substrate</td><td>Bio Rad</td><td>170-5061</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II)</td><td>Sigma</td><td>C2284-25ML</td><td>Oznaczanie białka</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>digitoniny</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>14952-500</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Shop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Pożywka dla komórek HC11</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Koza-Anty Królik-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Hepatocyty Czynnik wzrostu rekombinowany</td><td>Gibco</td><td>PHG0321</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Horse Anti-Mouse HRP</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7076</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>HIP Średnia</td></tr><tr><td>insulina</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>HIP Średni</td></tr><tr><td>kaptur o przepływie laminarnym</td><td>BioGard Kaptur</td><td></td><td>Hodowla komórek</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bio Shop</td><td>LEU001.10</td><td>Macierz buforu do lizy</td></tr><tr><td>(matryca Engelbreth-Holm-Swarm, Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CACB 354230</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-Goat HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8360</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 Odczynnik</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>475904-100GM</td><td>Barwienie</td></tr><tr><td>Wielofotonowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica TCS SP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Bio Shop</td><td>SOV850</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Na4P207</td><td>Sigma</td><td>125F-0262</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Shop</td><td>SOD001.1</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher Scientific</td><td>7681-49-4</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy Nikon</td><td>Coolpix 995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>Bio Rad</td><td>1620112</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>30525-89-4</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>kontrastowy z fazą</td> barwienia <td>Olympus IX70</td><td></td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosufonilu</td><td>Sigma</td><td>329-98-6</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>pMX GFP Rac G12V</td><td>Addgene</td><td>14567</td><td></td></tr><tr><td>Prolaktyna</td><td>Sigma</td><td>L6520</td><td>HIP Medium</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Komórka Pożywka</td></tr> hodowlana <tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 35</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowych-24</td><td>dołki Sarstedt</td><td>83.1836.300</td><td>Aparat</td></tr><tr><td>do przenoszenia</td> kultur komórkowych <td>CBS Scientific Co</td><td>EBU-302</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Tris Acetate</td><td>Bio Shop</td><td>TRA222.500</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>9002-07-7.</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Shop</td><td>TWN510.500</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Weryfikalny system elektroforezy żelowej</td><td>CBS Scientific Co</td><td>MGV-202-33</td><td>Western Blotting</td></tr></tbody></table>

różnicowanie komórek hc11 i eph4 nabłonka piersi myszy

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Kadheryny odgrywają ważną rolę w regulacji różnicowania komórek, jak również nowotworów. W niniejszej pracy opisano pochodzenie i metody indukcji różnicowania dwóch linii komórkowych nabłonka piersi myszy, HC11 i EpH4, oraz ich zastosowanie do badania uzupełniających się etapów rozwoju gruczołu sutkowego i transformacji nowotworowej.
Linia komórkowa nabłonka piersi myszy HC11 wywodzi się z gruczołu sutkowego ciężarnej myszy Balb/c. Różnicuje się, gdy rośnie do zbiegu przyczepiony do plastikowej powierzchni szalki Petriego w pożywce zawierającej płodową surowicę cielęcą i Hydrokortyzon, Insulinę i Prolaktynę (pożywka HIP). W tych warunkach komórki HC11 wytwarzają białka mleka β-kazeinę i kwaśne białko serwatkowe (WAP), podobnie jak komórki nabłonka sutka w okresie laktacji, i tworzą szczątkowe struktury przypominające gruczoły sutkowe zwane "kopułami".
Linia komórkowa EpH4 pochodziła z spontanicznie unieśmiertelnionych komórek nabłonka gruczołu sutkowego myszy wyizolowanych od ciężarnej myszy Balb/c. W przeciwieństwie do HC11, komórki EpH4 mogą w pełni różnicować się w sferoidy (zwane również mammosferami) podczas hodowli w trójwymiarowych (3D) warunkach wzrostu w pożywce HIP. Komórki są trypsynizowane, zawieszone w 20% matrycy składającej się z mieszaniny białek macierzy zewnątrzkomórkowej wytwarzanych przez komórki mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), powlekane na wierzchu warstwy skoncentrowanej matrycy pokrywającej plastikową szalkę Petriego lub płytkę wielodołkową i pokryte warstwą 10% pożywki HIP zawierającej matrycę. W tych warunkach komórki EpH4 tworzą puste sferoidy, które wykazują polaryzację wierzchołkowo-podstawową, puste światło i wytwarzają β-kazeinę i WAP.
Korzystając z tych technik, nasze wyniki pokazały, że intensywność sygnału kadheryny/Rac jest krytyczna dla różnicowania komórek HC11. Podczas gdy Rac1 jest niezbędny do różnicowania, a niskie poziomy aktywowanego RacV12 zwiększają różnicowanie, wysokie poziomy RacV12 blokują różnicowanie, indukując nowotwór. Natomiast komórki EpH4 reprezentują wcześniejszy etap różnicowania nabłonka sutka, który jest hamowany nawet przez niski poziom RacV12.

Od dawna wiadomo, że różnicowanie komórek nabłonkowych i adipocytów wymaga osiągnięcia konfluencji oraz zaangażowania kadheryn2. My i inni badacze wykazaliśmy, że adhezja międzykomórkowa i zaangażowanie E- lub N-kadheryny oraz kadheryny-1, do czego dochodzi podczas konfluencji hodowlanych komórek, wywołuje gwałtowny wzrost aktywności małych GTPaz Rac oraz białka kontroli podziału komórkowego 42 (Cdc42), a proces ten prowadzi do aktywacji cytokin z rodziny interleukiny 6 (IL6) oraz Stat3 (przekaźni...

Opisujemy techniki indukcji różnicowania dwóch linii nabłonka piersi, HC11 i EpH4. Podczas gdy obie wymagają płodowej surowicy cielęcej, insuliny i prolaktyny do produkcji białek mleka, komórki EpH4 mogą w pełni różnicować się w mammosfery w trójwymiarowej hodowli. Te uzupełniające się modele są przydatne do badań transdukcji sygnału różnicowania i nowotworu.

Różnicowanie komórek HC11 i EpH4 nabłonka piersi myszy

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Komórki HC11 i EpH4 to linie komórkowe nabłonka piersi myszy, które mogą różnicować się w hodowli. W tym samym czasie komórki te mogą być przekształcane przez wiele onkogenów. Komórki te idealnie nadają się do badania wzajemnych powiązań między różnicowaniem a transformacją nowotworową.Techniki te mogą być wykorzystywane w badaniach nad transdukcją sygnału w celu odkrycia celów terapii przeciwnowotworowej. Na przykład mała GTPaza Rac i inne cząsteczki mogą wywoływać transformację komórek nabłonka piersi, gdy ulegną ekspresji do wysokich poziomów, ale zaskakująco przy niskich poziomach mogą indukować różnicowanie. Inne przetworniki sygnału mogą zachowywać się w podobny sposób.Zasady te mogą mieć zastosowanie również do innych rodzajów różnicowania, w których zbieganie się komórek odgrywa ważną rolę, na przykład różnicowanie adipocytów lub miotub. Ktoś, kto wykonuje tę technikę po raz pierwszy, powinien pamiętać, że posiewanie komórek HC11 jest ważne. Dzieje się tak, ponieważ kontakt międzykomórkowy jest ważny dla różnicowania.Inną kwestią, na którą należy zwrócić uwagę, jest to, że prawidłowa ekstrakcja komórek EpH4 z matrycy ma kluczowe znaczenie dla oceny ilościowej białka, ponieważ wszelkie reszty wpłyną na oznaczanie białka. Wizualna demonstracja tej metody jest przydatna, ponieważ niektóre szczegóły protokołu są trudne do opisania na papierze. Zacznij od przygotowania butelki zawierającej 50 mililitrów pożywki komórkowej HC11 zgodnie ze wskazówkami manuskryptu.Aby pokryć komórki, odessaj pożywkę z pięciu sześciocentymetrowych, 50% zlewających się szalek Petriego i umyj komórki około 1,8 mililitra trypsyny za pomocą sterylnej dziewięciocalowej bawełnianej pipety Pasteura. Następnie dodaj 200 mikrolitrów trypsyny na płytkę i zakręć płytką, aby usunąć przyczepione komórki. Obserwuj komórki pod mikroskopią kontrastu fazowego z obiektywem 4X, aby upewnić się, że zaczęły się przemieszczać.Następnie zassaj około 1,5 mililitra pożywki HC11 sterylną dziewięciocalową pipetą Pasteura i spryskaj nią pionowo komórki, obracając naczynie, uważając, aby uniknąć rozpryskiwania. Przenieś wszystkie komórki do butelki z pożywką HC11 i zawiruj, aby równomiernie rozproszyły się w butelce. Następnie podzielić zawiesinę komórek na 20 trzycentymetrowych szalek Petriego, pipetując po dwa mililitry komórek na szalkę.Kołysz szalkami Petriego, aby rozłożyć komórki i inkubować je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego dnia, gdy komórki są w 90 do 100% zlewne, odessaj pożywkę i zastąp ją pożywką z FBS, ale bez EGF. Po hodowaniu komórek w pożywce bez EGF przez 24 godziny, dodaj pożywkę różnicującą do 10 szalek i hoduj komórki przez okres do 10 dni, zachowując pozostałe 10 szalek jako kontrole.Zmieniaj pożywkę co dwa do trzech dni zarówno w przypadku komórek traktowanych HIP, jak i kontrolnych. Aby monitorować różnicowanie, obserwuj komórki za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Użyj mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli komórki wykazują ekspresję białka zielonej fluorescencji.Dodatkowo określ ilościowo stopień zróżnicowania, ekstrahując białka z komórek kontrolnych i poddanych działaniu HIP raz dziennie i wykonując analizę Western Blot. Zbierz i umieść pożywkę wzrostową EpH4, matrycę EHS i dwie stożkowe probówki o pojemności 50 mililitrów na lodzie. Wstępnie schłodzić płytki do hodowli tkankowych końcówkami pipet w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i przygotować pożywkę wzrostową EpH4 uzupełnioną 10 lub 20% matrycą w dwóch 50-mililitrowych stożkowych probówkach i przechowywać je na lodzie do momentu użycia.Po pobraniu wstępnie schłodzonych płytek do hodowli tkankowych w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, pokryj 10 dołków 24-dołkowej płytki 150 mikrolitrami nierozcieńczonej matrycy, rozprowadzając matrycę za pomocą pipety. Unikaj tworzenia bąbelków podczas rozprowadzania matrycy. Następnie delikatnie postukaj w boki płytki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby matryca zastygła.W międzyczasie przygotuj się do różnicowania poprzez trypcynizację komórek EpH4 zgodnie z wcześniejszym opisem i zapewnienie zawiesin pojedynczych komórek po ponownym zawieszeniu komórek trypsynizowanych. Następnie policz komórki w zawiesinie za pomocą hemocytometru. Przenieś pięć razy po 10 do czterech komórek na studzienkę do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i wiruj je 250 razy g przez pięć minut.Ostrożnie zassać pożywkę sklarowaną nad osadem i umieścić probówkę na lodzie. Użyj jednomililitrowej końcówki pipety, aby ponownie zawiesić komórki w 350 mikrolitrach pożywki wzrostowej EpH4 uzupełnionej 20% matrycą, trzymając probówki na lodzie, upewniając się, że nie ma pęcherzyków. Gdy dolna warstwa zestali się, dodaj 350 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej powlekanej studzienki i umieść ją w inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę, aby umożliwić zestalenie się 20% warstwy matrycy.Obserwuj komórki za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby upewnić się, że pojedyncze komórki są widoczne. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki EpH4 z 10% matrycą na wierzchu i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozpocznij indukcję różnicowania jeden dzień po posianiu komórek w macierzy.Ostrożnie usunąć 150 mikrolitrów górnej 10% pożywki matrycowej i dodać 200 mikrolitrów pożywki EpH4 zawierającej HIP i 10% matrycy, a w przypadku kontroli dodać 10% pożywkę matrycową bez HIP. Pożywkę należy wymieniać co dwa dni przez okres do 10 dni, monitorując powstawanie mammosfery za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Aby określić ilościowo różnicowanie, ostrożnie odpipetować 10% pożywkę HIP z dołków i przepłukać 20% warstwę matrycy 350 mikrolitrami lodowatego PBS.Następnie dodaj od 70 do 100 mikrolitrów lodowatego PBS z jednym milimolowym EDTA bezpośrednio do studzienek i delikatnie oderwij dolną warstwę 100% matrycy za pomocą końcówki pipety. Delikatnie potrząsaj płytką w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Ostrożnie przenieść zawiesinę sferoidalną do stożkowej probówki i przepłukać studzienki 500 mikrolitrami PBS EDTA, aby odzyskać pozostałe sferoidy.Kołysz probówką na lodzie przez dodatkowe 30 minut, upewniając się, że matryca całkowicie się rozpuści. Jeśli widoczne są grudki matrycy, dodaj więcej PBS EDTA lub potrząsaj dłużej. Odwirować roztwór o stężeniu 350 razy g, aby otopić sferoidy.Następnie odessać supernatant, poddać lizie sferoidy i zbadać komórki pod kątem beta-kazeiny, cykliny D1 i p120RasGAP za pomocą Western blot. Istnieje uderzająca zależność różnicowania od siły sygnału Rac w komórkach HC11. Podczas gdy endogenny CRAC1 jest wymagany do różnicowania, a niskie poziomy aktywowanego mutacyjnie RacV12 powodują wzrost zdolności różnicowania, wysokie poziomy RacV12 wyzwalają blokadę różnicowania i indukują neoplazję.Kiedy zbadano właściwości różnicujące komórek EpH4 w hodowli matrycowej 3D, stwierdzono, że produkcja beta-kazeiny osiągnęła szczyt po ośmiu do 10 dniach, a ekspresja cykliny D1 była maksymalna po czterech do sześciu dniach po stymulacji HIP. Aby określić położenie poszczególnych komórek, wybarwiono je DAPI i zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. W mammosferach zaobserwowano śmierć komórek wewnętrznych i tworzenie pustych świateł, podczas gdy dodanie HGF spowodowało powstanie struktur rurkowych.Ktoś, kto wykonuje tę technikę po raz pierwszy, powinien pamiętać, że posiewanie komórek HC11 jest ważne. Również prawidłowa ekstrakcja komórek EpH4 z matrycy ma kluczowe znaczenie dla oceny ilościowej białka, ponieważ wszelkie reszty będą miały wpływ na oznaczanie białka. Technika ta może być wykorzystana do zbadania innych przetworników sygnału, które mogą zachowywać się w podobny sposób.Jeśli w nowotworze występują mutacje napędzające, to ich całkowite zahamowanie nie będzie konieczne, ponieważ niski pozostały poziom w rzeczywistości indukowałby różnicowanie.

differentiation-of-mouse-breast-epithelial-hc11-and-eph4-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Różnicowanie laktogenne komórek HC11 można scharakteryzować poprzez tworzenie się struktur kopułkowatych, określanych jako mammosfery. Struktury te można zliczyć za pomocą mikroskopii fazowej, co ułatwia ilościowe określenie stopnia różnicowania laktogennego.

Mysie komórki nabłonka gruczołu mlekowego tworzą mammosfery podczas różnicowania laktogennego

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Opisano metodę przetwarzania materiału chirurgicznego ludzkiego sutka. Przetworzona tkanka, w postaci organoidów, może być przechowywana w stanie zamrożonym w nieskończoność lub umieszczona w kulturze w celu długotrwałego wzrostu.  Metoda ta umożliwia eksperymentalne badanie prawidłowej biologii komórek nabłonkowych człowieka oraz skutków zaburzeń egzogennych.

Przetwarzanie tkanek ludzkiej mammoplastyki redukcyjnej i mastektomii do hodowli komórkowych

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

W ostatnich latach tworzenie komórek rozrodczych przy użyciu metod hodowli in vitro zostało zademonstrowane przy użyciu kilku różnych typów somatycznych komórek macierzystych. W tym artykule wizualnie przedstawimy różnicowanie nowonarodzonych komórek macierzystych pochodzących od myszy do wczesnych komórek podobnych do oocytów.

Różnicowanie komórek macierzystych pochodzących ze skóry nowonarodzonych myszy w komórki rozrodcze podobne do komórek rozrodczych in vitro

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Idealnym modelem do badania biologii dorosłych komórek macierzystych jest mieszek włosowy myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji różnych populacji mieszków włosowych, komórek macierzystych i keratynocytów naskórka, wykorzystujący trawienie enzymatyczne skóry grzbietowej myszy, a następnie analizę FACS.

Izolowanie komórek macierzystych mieszków włosowych i keratynocytów naskórka z grzbietowej skóry myszy

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Organoidy prostaty myszy stanowią obiecujący kontekst do oceny mechanizmów regulujących różnicowanie. W artykule opisano ulepszone podejście do ustalania organoidów prostaty i przedstawiono metody (1) zbierania lizatu białkowego z organoidów oraz (2) utrwalania i barwienia organoidów do mikroskopii konfokalnej z pełną mocą.

Ocena zdolności różnicowania komórek nabłonka prostaty myszy za pomocą hodowli organoidów

Ten eksperymentalny protokół opisuje izolację BCSC z próbek komórek i tkanek raka piersi, a także testy in vitro i in vivo, które mogą być użyte do oceny fenotypu i funkcji BCSC.

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Obecne badanie przedstawia łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół efektywnego izolowania i hodowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z małych ilości tkanki sutka. Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania pierwotnych HMEC zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka

Poznaj techniki różnicowania komórek nabłonka piersi myszy HC11 i EpH4 w kulturze trójwymiarowej. Ta metoda pozwala badać związki między różnicowaniem a transformacją nowotworową oraz identyfikować cele terapeutyczne w terapii raka.

Różnicowanie komórek HC11 i EpH4 nabłonka piersi myszy

Przeglądaj więcej filmów