Name: Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj metodę mikroaspiracji pojedynczych komórek do izolacji rzadkich wirusów z zakażonych ameb Vermamoeba vermiformis. Technika ta umożliwia separację niskostężonych podpopulacji wirusowych z dużą precyzją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować zarówno Jean-Pierre Baudoin, jak i Olivierowi Mbarekowi za ich rady, a Claire Andréani za pomoc w poprawkach i modyfikacjach języka angielskiego. Prace te były wspierane przez grant państwa francuskiego zarządzany przez Narodową Agencję Badawczą w ramach programu "Investissements d'avenir (Inwestycje dla przyszłości)" o numerze referencyjnym ANR-10-IAHU-03 (zakażenie Méditerranée) oraz przez Région Provence Alpes Côte d'Azur i fundusze europejskie FEDER PRIMI.

1. Kultura ameby
<ol>
	<li>Użyj Vermamoeba vermiformis (szczep CDC19) jako wsparcie komórek.</li>
	<li>Dodać 30 ml pożywki glukozowej (PYG) (Tabela 1) i 3 ml ameb o stężeniu 1 x 106 komórek/ml w kolbie do hodowli komórek o długości 75 cm.</li>
	<li>Utrzymywać kulturę w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Po 48 godzinach oznacz ilościowo ameby za pomocą szkiełek do liczenia.</li>
	<li>Aby wypłukać, zebrać komórki w stężeniu 1 x 106 komórek/ml i zagnieździć ameby przez odwirowanie przy 720 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki głodowej, aby uzyskać 1 x 106 komórek/ml (Tabela 1).</li>
</ol>
2. Rozprzestrzenianie się wirusa w amebach
UWAGA: Przed rozcieńczeniem ważne jest, aby wyhodować próbkę podstawową, aby uzyskać wystarczającą ilość świeżej kultury, a następnie przejść do filtracji.
<ol>
	<li>Użyj 1 x 106 kultury ameby w pożywce głodowej.</li>
	<li>Inokulować mieszaninę wirusów wydzielonych z roztworu podstawowego (Faustowirus/Usurpativirus LCD7 lub Faustowirus/Clandestinovirus ST1) po procesie kohodowli na podporze komórkowej przy wielokrotności infekcji (MOI) 0,01, 
	nuta: MOI jest ważny dla zmniejszenia liczebności głównej populacji wirusa i liczby zakażonych komórek.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 30 °C aż do wywołania efektów cytopatycznych (CPE), takich jak zaokrąglenie lub liza amebalu, około 10 do 14 godzin po zakażeniu.</li>
	<li>Zbierz pożywkę i przefiltruj przez filtr 5 μm, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.</li>
</ol>
3. Rozcieńczenie punktu końcowego
<ol>
	<li>Wykonać seryjne rozcieńczanie (10-1 do 10-11) próbki wirusa w pożywce głodowej (Tabela 1).</li>
	<li>Zaszczepić 2 ml 1 x 106 Vermamoeba vermiformis zawartych na każdej szalce Petriego za pomocą 100 μl inokulum mieszaniny.</li>
	<li>Umieścić szalki Petriego w zamykanej plastikowej torbie w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Rozpocznij obserwację szalek Petriego za pomocą odwróconej mikroskopii optycznej po 6 godzinach od infekcji i sprawdzaj morfologię komórek co 4 do 8 godzin.</li>
	<li>Po pojawieniu się efektu cytopatycznego charakteryzującego się zaokrągleniem komórek, rozpocznij proces mikroaspiracji pojedynczej komórki.</li>
</ol>
4. Mikroaspiracja pojedynczej komórki
<ol>
	<li>Przygotuj hosta. 
	UWAGA: Ten preparat jest przeznaczony do uwalniania zainfekowanych pojedynczych komórek do świeżej podpory komórkowej.
	<ol>
		<li>Potraktuj ameby w hodowli środkiem przeciwdrobnoustrojowym zawierającym 10 μg/ml wankomycyny, 10 μg/ml imipenemu, 20 μg/ml cyprofloksacyny, 20 μg/ml doksycykliny i 20 μg/ml worykonazolu. Mieszanina ta służy do unikania skażenia bakteryjnego i grzybiczego. 
		nuta: Zabieg odbywa się na ławce na zewnątrz stacji bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Dodać 2 ml ameb skoncentrowanych w proporcji 1 x 106 komórek/ml każda do 15 szalek Petriego. W celu przylegania ameby należy inkubować kulturę w temperaturze 30 °C przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybrać szalkę Petriego używaną do mikroaspiracji z rozcieńczenia granicznego zgodnie z następującymi kryteriami: 1) brak widocznego zanieczyszczenia czynnikami grzybowymi i bakteryjnymi, 2) dowody na cytopatyczne działanie ameb wywołane przez wirusy, oraz 3) faza prelizy i zaokrąglenia ameb (w celu uniknięcia aspiracji cząstek wirusa).</li>
	<li>Skonfiguruj stację roboczą z następującymi materiałami (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B): 
	Mikromanipulator, który umożliwia pozycjonowanie mikrokapilarne; 
	Ręczne urządzenie sterujące ciśnieniem, służące do zasysania i uwalniania komórek do mikrokapilary; 
	Mikroskop odwrócony; 
	Moduły silnikowe typu plug and play; 
	Aparat fotograficzny; 
	Moduł komputerowy do wizualizacji manipulacji i robienia zdjęć.</li>
	<li>Wybierz mikrokapilarnę (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
	nuta: Wielkość komórek, deformacja i przyleganie ich błon do powierzchni oraz ruchliwość komórek mogą mieć wpływ na płynny przebieg mikroaspiracji. Średnica mikrokapilary może być precyzyjnie dobrana i dostosowana do konkretnych typów komórek w zależności od ich wielkości i metod aspiracji. Do odessania okrągłej ameby (średnica ~10 μm) użyto mikrokapilary o średnicy wewnętrznej 20 μm. Pozwala to na utrzymanie pozycji wewnętrznej i łatwe zwolnienie ogniwa.</li>
	<li>Zamontuj system.
	<ol>
		<li>Ustawić kąt roboczy systemu chwytania na module z napędem na 45°.</li>
		<li>Wykonaj podwójną instalację, najpierw na systemie chwytakowym, a następnie na mikrokapilarze.</li>
		<li>Skoncentruj się na komórkach po przepuszczeniu kilku kropel olejku przez mikrokapilę. 
		nuta: Olej mineralny o kompatybilności biologicznej jest dostarczany przez urządzenie.</li>
		<li>Kompletny montaż zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Klonuj komórki (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B). 
	UWAGA: Ta procedura jest podobna do tej opisanej przez Fröhlicha i Königa31.
	<ol>
		<li>Umieścić pod mikroskopem szalkę Petriego zawierającą 2 ml zakażonych ameb.</li>
		<li>Skoncentruj się najpierw na komórkach, a następnie na mikrokapilarze zanurzonej w kulturze.</li>
		<li>Wybierz zaokrągloną pojedynczą komórkę i zbliż mikrokapilę do mikromanipulatora.</li>
		<li>Wywieraj miękką aspirację z ręczną kontrolą nacisku na komórkę, wprowadzając ją do wnętrza mikrokapilary. Usunąć pojedynczą komórkę z pierwszej próbki i uwolnić ją w podłożu komórkowym, a następnie inkubować w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Przeprowadzaj codzienne obserwacje za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, aby obserwować wygląd komórek i monitorować pojawienie się efektu cytopatycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Badania przesiewowe PCR
UWAGA: Po kroku 4, systematyczne badanie metodą PCR jest kluczowe dla potwierdzenia separacji. Zarówno w przypadku Usurpativirus/Faustovirus, jak i Clandestinovirus/Faustovirus, projekt i zastosowanie specyficznych systemów starterów i sond wykonano przy użyciu Primer-BLAST online32 (Tabela 2).
<ol>
	<li>Ekstrahować DNA z części dodatnich próbek hodowli (tj. z miejsca, w którym obserwuje się efekt cytopatyczny przy użyciu zautomatyzowanego systemu ekstrakcji zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Używaj odpowiednio zaprojektowanych podkładów. 
	nuta: Tutaj zaprojektowaliśmy startery do amplifikacji genów rdzeniowych oznaczonych jako RpB2 (Faustowirus), główne białko kapsydu LCD7 (Usurpatvirus) i mniejsze białko kapsydu (Clandestinovirus)</li>
	<li>Wykonaj standardowy PCR za pomocą termocyklera.
	<ol>
		<li>Przeprowadź 20 μl reakcji PCR z 50 μM każdego startera (Tabela 2), 1x Master Mix i wodą wolną od RNazy.</li>
		<li>Aktywować polimerazę DNA Taq na 5 minut w temperaturze 95 °C, a następnie wykonać 45 cykli denaturacji trwającej 10 s w temperaturze 95 °C, wyżarzanie starterów przez 30 s w temperaturze 58 °C i przedłużanie przez 30 s w temperaturze 72 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom produkty PCR na 1,5% żelu agarozowym, wybarwij barwnikiem z żelu DNA (tabela materiałów) i zwizualizuj za pomocą UV.</li>
</ol>
6. Produkcja i oczyszczanie wirusów
<ol>
	<li>Resztę kultury z szalki Petriego umieścić z powrotem w małej kolbie.</li>
	<li>Do produkcji wirusa należy przygotować 15 kolb o powierzchni 145cm2, zawierających 40 ml Vermamoeba vermiformis w pożywce głodowej i 5 ml wyizolowanego wirusa już przeniesionego z płytki Petriego do małych kolb.</li>
	<li>Leczyć tą samą mieszaniną antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych, co w kroku 4.1.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 30 °C. Codziennie obserwować za pomocą odwróconej mikroskopii optycznej.</li>
	<li>Po całkowitej infekcji połącz wszystkie kolby. Użyj filtra 0,45 μm, aby wyeliminować zanieczyszczenia.</li>
	<li>Ultraodwirować wszystkie supernatanty przy 50 000 x g przez 45 minut.</li>
	<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant z każdej probówki przez aspirację i ponownie zawiesić osad w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Oczyść wytworzonego wirusa przy użyciu 25% sacharozy (27,5 g sacharozy w 100 ml PBS, sterylizowanej przez filtrację).</li>
	<li>Odwirować 8 ml sacharozy i 2 ml zawiesiny wirusa w temperaturze 80 000 x g przez 30 min. Zawiesić osad wirusa w 1 ml PBS. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
7. Barwienie ujemne i transmisyjna mikroskopia elektronowa
UWAGA: Bou Khalil et al. wcześniej opublikowali ten protokół27.
<ol>
	<li>Umieścić 5 μl supernatantu do lizy na siatce rozrzewniowej. Pozostawić na około 20 minut w temperaturze pokojowej. 
	nuta: Wyładowanie jarzeniowe pozwala nam uzyskać hydrofilową siatkę poprzez aplikację plazmy.</li>
	<li>Ostrożnie wysusz siatkę i nałóż na nią niewielką kroplę 1% molibdenianu amonu na 10 s. Pozostaw siatkę do wyschnięcia na 5 minut.</li>
	<li>Przejdź do obserwacji mikroskopią elektronową przy 200 keV.</li>
</ol>
8. Charakterystyka Clandestinovirus ST1 i Usurpativirus LCD7
<ol>
	<li>Scharakteryzuj czyste populacje Clandestinovirus ST1 i Usurpativirus LCD7 za pomocą sekwencjonowania genomu, składania genomu, analiz bioinformatycznych i badania ich cyklu replikacji, tak jak zrobiliśmy to dla innych wirusów10,20,29.</li>
</ol>

<ol><li>Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+Origin+of+Four+Diverse+Families+of+Large+Eukaryotic+DNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses.</a> Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+74+kb+of+DNA+located+at+the+right+end+of+the+330-kb+chlorella+virus+PBCV-1+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome.</a> Virology. 237 (2), 360-377 (1997).</li>
<li>Scola, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Giant+Virus+in+Amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Giant Virus in Amoebae.</a> Science. 299 (5615), 2033(2003).</li>
<li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoraviruses%3A+amoeba+viruses+with+genomes+up+to+2.5+Mb+reaching+that+of+parasitic+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li>
<li>Antwerpen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+of+a+pandoravirus+isolated+from+keratitis-inducing+acanthamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba.</a> Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+study+of+Mollivirus+sibericum%2C+a+new+30%2C000-y-old+giant+virus+infecting+Acanthamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+the+emerging+Pandoraviridae+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family.</a> Nature Communications. 9 (1), 2285(2018).</li>
<li>Aherfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Large+Open+Pangenome+and+a+Small+Core+Genome+for+Giant+Pandoraviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 166(2018).</li>
<li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cedratvirus%2C+a+Double-Cork+Structured+Giant+Virus%2C+is+a+Distant+Relative+of+Pithoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses.</a> Viruses. 8 (11), 300(2016).</li>
<li>Rodrigues, R. A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+genomic+analyses+of+new+isolates+reveal+a+second+lineage+of+cedratviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses.</a> Journal of Virology. , 00372(2018).</li>
<li>Bertelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cedratvirus+lausannensis-+digging+into+Pithoviridaediversity%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity.</a> Environmental Microbiology. , (2017).</li>
<li>Levasseur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+modern+and+fossil+Pithovirus+reveals+its+genetic+conservation+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution.</a> Genome Biology and Evolution. , (2016).</li>
<li>Dornas, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brazilian+Marseillevirus+Is+the+Founding+Member+of+a+Lineage+in+Family+Marseilleviridae%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae.</a> Viruses. 8 (3), 76(2016).</li>
<li>Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medusavirus%2C+a+novel+large+DNA+virus+discovered+from+hot+spring+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoravirus+Celtis+Illustrates+the+Microevolution+Processes+at+Work+in+the+Giant+Pandoraviridae+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 430(2019).</li>
<li>Abrahão, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailed+giant+Tupanvirus+possesses+the+most+complete+translational+apparatus+of+the+known+virosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere.</a> Nature Communications. 9 (1), 749(2018).</li>
<li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faustovirus%2C+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).</li>
<li>Bajrai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaumoebavirus%2C+a+New+Virus+That+Clusters+with+Faustoviruses+and+Asfarviridae%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae.</a> Viruses. 8 (12), 278(2016).</li>
<li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orpheovirus+IHUMI-LCC2%3A+A+New+Virus+among+the+Giant+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 779(2018).</li>
<li>Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li>
<li>Moniruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+brown+tide+virus+%28AaV%29%2C+the+little+giant+of+the+Megaviridae%2C+elucidates+NCLDV+genome+expansion+and+host-virus+coevolution%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution.</a> Virology. 466-467, 60-70 (2014).</li>
<li>Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+Chrysochromulina+Ericina+Virus+%28CeV%29+and+other+microalgae-infecting+large+DNA+viruses+highlight+their+intricate+evolutionary+relationship+with+the+established+Mimiviridae+family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family.</a> Journal of Virology. , (2017).</li>
<li>Deeg, C. M., Chow, C. -E. T., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetoplastid-infecting+Bodo+saltans+virus+%28BsV%29%2C+a+window+into+the+most+abundant+giant+viruses+in+the+sea%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea.</a> eLife. 7, 235(2018).</li>
<li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).</li>
<li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Isolation+of+Giant+Viruses+in+Liquid+Medium+Using+Automated+Flow+Cytometry+and+Fluorescence+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26(2016).</li>
<li>Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+Strategy+for+the+Isolation+of+New+Faustoviruses+from+Environmental+Samples+Using+Vermamoeba+vermiformis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104(2016).</li>
<li>Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updating+strategies+for+isolating+and+discovering+giant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Updating strategies for isolating and discovering giant viruses.</a> Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).</li>
<li>Andreani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacmanvirus%2C+a+new+giant+icosahedral+virus+at+the+crossroads+between+Asfarviridae+and+Faustoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses.</a> Journal of Virology. , (2017).</li>
<li>Khalil, J. Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+Sorting+to+Separate+Viable+Giant+Viruses+from+Amoeba+Co-culture+Supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722(2017).</li>
<li>Fröhlich, J., König, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques+for+isolation+of+single+prokaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">New techniques for isolation of single prokaryotic cells.</a> FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13 (1), 134(2012).</li>
<li>Kimura, Y., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracytoplasmic+sperm+injection+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Intracytoplasmic sperm injection in the mouse.</a> Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Czas obchodzenia się z pojedynczą komórką mikroaspiracji i jej prawidłowe funkcjonowanie zależy od operatora. Poszczególne etapy eksperymentu wymagają precyzji. Stosowanie komponentów mikromanipulacyjnych stanowiska pracy musi być pod stałą kontrolą poprzez obserwację procesu mikroaspiracji i uwalniania komórki. Kontynuacja poprzez obserwację mikroskopową jest niezbędna do wychwycenia i przeniesienia komórki. Doświadczony operator może potrzebować od 1 do 2 godzin, aby wyizolować 10 komórek i ponownie przenieść je jedna ...

Nukleocytoplazmatyczne wirusy dużego DNA (NCLDV) są niezwykle różnorodne, zdefiniowane przez cztery rodziny, które infekują eukarionty1. Pierwszymi opisanymi wirusami o genomach powyżej 300 kpz były Phydcodnaviridae, w tym Paramecium bursaria Chlorella virus 1 PBCV12. Izolacja i pierwszy opis Mimiwirusa wykazały, że rozmiar wirusów podwoił się zarówno pod względem wielkości cząsteczki (450 nm), jak i długości genomu (1,2 Mb)3. Od tego czasu opisano wiele gigantycznych wirusów, zwykle izolowanych przy użyciu procedury kohodowli ameby. Z komórek Acanthamoeba sp. można wyizolować kilka gigantycznych wirusów o różnej morfologii i zawartości genetycznej, w tym marsylewirusy, Pandorawirusy, Pitowirusy, Molliwirusy, Cedratwirusy, Pacmanwirus, Tupanwirus, a ostatnio Medusavirus4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16,17. Równolegle, izolacja Vermamoeba vermiformis pozwoliła na wyizolowanie i opisanie gigantycznych wirusów Faustovirus, Kaumoebavirus i Orpheovirus18,19,20. Inne gigantyczne wirusy zostały wyizolowane wraz z ich protistami gospodarza, takimi jak Cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23 i Bodo saltans24. Wszystkie te izolacje były wynikiem rosnącej liczby zespołów pracujących nad izolacją i wprowadzeniem aktualizacji strategii o wysokiej przepustowości25,26,27,28, takich jak ulepszenie systemu kohodowli za pomocą cytometrii przepływowej.
W 2016 roku zastosowaliśmy strategię łączącą kokulturę i cytometrię przepływową, aby wyizolować gigantyczne wirusy27. Strategia ta została opracowana w celu zwiększenia liczby zaszczepianych próbek, zróżnicowania protistów wykorzystywanych jako podpory komórek oraz szybkiego wykrycia lizy podpory komórkowej. System został zaktualizowany poprzez dodanie dodatkowego kroku, aby uniknąć wstępnej identyfikacji biologii molekularnej i szybkiego wykrywania nieznanej populacji wirusa, jak w przypadku Pacmanvirus29. Sprzężenie cytometrii przepływowej z sortowaniem komórek pozwoliło na rozdzielenie mieszaniny Mimivirus i Cedratvirus A1130. Jednak później napotkaliśmy ograniczenia związane z separacją i wykrywaniem tych subpopulacji wirusowych za pomocą cytometrii przepływowej. Po sekwencjonowaniu, kiedy zestawiliśmy genomy Faustowirusa ST125 i Faustowirusa LCD7 (dane niepublikowane), zaskakująco znaleźliśmy w każdym zestawie dwa dodatkowe genomy dwóch nowych wirusów, które nie zostały zidentyfikowane w publicznych bazach danych genomów. Jednak ani cytometria przepływowa, ani transmisyjna mikroskopia elektroniczna (TEM) nie wykazały, że ameby były zakażone dwoma różnymi wirusami, Clandestinovirus ST1 i Usurpativirus LCD7. Zaprojektowaliśmy specjalne systemy PCR do amplifikacji markerów odpowiednio faustowirusa, uzurpatiwirusa i tajnego wirusa na podstawie ich genomów; naszym celem było posiadanie systemów opartych na PCR, które umożliwiają weryfikację czystości wydzielanych wirusów. Jednak rozcieńczenie punktu końcowego i cytometria przepływowa nie zdołały ich rozdzielić. Izolacja tej pojedynczej populacji wirusa była trudna, ponieważ nie scharakteryzowano ani morfologii, ani elementów replikacyjnych populacji Clandestinovirus i Usurpativirus. Za pomocą cytometrii przepływowej wykryliśmy tylko jedną populację wirusa ze względu na nakładanie się dwóch populacji (testowane po skutecznej separacji). Próbowaliśmy je rozdzielić za pomocą sortowania pojedynczych cząstek na 96-dołkowych płytkach, ale nie zaobserwowaliśmy żadnych efektów cytopatycznych i nie wykryliśmy ani Clandestinovirusa, ani Usurpatiwirusa przez amplifikację PCR. Wreszcie, dopiero połączenie rozcieńczenia punktu końcowego, a następnie mikroaspiracji pojedynczej ameby, umożliwiło oddzielenie tych dwóch gigantycznych wirusów o niskiej liczebności od faustowirusów. Ta metoda separacji jest przedmiotem tego artykułu.

<table><tbody><tr><td>Agaroza Standard</td><td>Euromedex</td><td>Unkown</td><td>Standard PCR</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold 360 Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4398876</td><td>Standard PCR</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Kontroluj komórki podczas procesu mikroaspiracji</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórek Corning 150 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td></td><td>CLS430825 Kultura</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórek Corning 25 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>CLS430639</td><td>Culture</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych Corning 75 cm2</td><td>Sigma-aldrich</td><td></td><td>CLS430641 Kultura DFC</td></tr><tr><td>425C</td><td>LEICA</td><td>Unkown</td><td>Obserwacja/Monitorowanie</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Eclipse TE2000-S</td><td>Nikon</td><td>Unkown</td><td>Obserwacja/Monitorowanie</td></tr><tr><td>EZ1 zaawansowany XL</td><td>Quiagen</td><td>9001874</td><td>ekstrakcja DNA</td></tr><tr><td>Glasstic Slide 10 z siatkami zliczającymi</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td>Liczba komórek</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus</td><td>Eppendorf</td><td>6331000017</td><td>Standard PCR</td></tr><tr><td>Mikrokapila 20 i mikro; m</td><td>Eppendorf</td><td>5175 107.004</td><td>Mikroaspiracja i uwalnianie komórek</td></tr><tr><td>Mikromanipulator InjectMan NI2</td><td>Eppendorf</td><td>631-0210</td><td>Pozycjonowanie mikrokapilarne</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>ThermoFischer</td><td>AM9920</td><td>Standardowa</td></tr><tr><td>ultrawirówka PCR Optima XPN</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>A94469</td><td>Oczyszczanie wirusów</td></tr><tr><td>szalka Petriego 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>Hodowla/obserwacja</td></tr><tr><td>Sterylne filtry strzykawkowe 5 i mikro; m</td><td>Sigma-aldrich</td><td>SLSV025LS</td><td>Filtracja</td></tr><tr><td>SYBR zielony Typ I</td><td>Invitrogen</td><td>nieznany</td><td>Fluorescencyjne sondy molekularne/cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Standardowy PCR; Barwienie żelem DNA</td></tr><tr><td>Tecnai G20</td><td>FEI</td><td>Unkown</td><td>Mikroskopia elektronowa</td></tr><tr><td>Typ 70 Ti Tytanowy wirnik o stałym kącie</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>337922</td><td>Oczyszczanie wirusów</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>344058</td><td>Oczyszczanie wirusów</td></tr></tbody></table>

mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

Podczas procesu wspólnej hodowli ameby, więcej niż jeden wirus może być wyizolowany w jednej studzience. Wcześniej rozwiązaliśmy ten problem poprzez rozcieńczenie punktu końcowego i/lub sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) zastosowane w populacji wirusów. Jednakże, gdy wirusy w mieszaninie mają podobne właściwości morfologiczne, a jeden z wirusów namnaża się powoli, obecność dwóch wirusów jest wykrywana na etapie składania genomu i wirusów nie można rozdzielić w celu dalszej charakterystyki. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy procedurę mikroaspiracji pojedynczych komórek, która pozwala na separację i klonowanie bardzo podobnych wirusów. W niniejszej pracy przedstawiamy, w jaki sposób ta alternatywna strategia pozwoliła nam oddzielić małe subpopulacje wirusowe Clandestinovirus ST1 i Usurpativirus LCD7, gigantycznych wirusów, które rosną powoli i nie prowadzą do lizy amebalnej w porównaniu z litycznym i szybko rosnącym faustowirusem. Kontrolę czystości oceniano za pomocą specyficznej amplifikacji genów, a następnie wyprodukowano wirusy w celu dalszej charakterystyki.

Mikroaspiracja pojedynczej komórki to proces mikromanipulacji zoptymalizowany w niniejszym opracowaniu (Rysunek 1). Technika ta umożliwia przechwycenie zaokrąglonej, zainfekowanej ameby (Rysunek 2A) i jej przeniesienie do nowej płytki zawierającej niezainfekowane ameby (Rysunek 2). Jest to funkcjonalny prototyp zastosowany w systemie kokultury, który pozwolił na pomyślną izolację nie litycznych wirusów olbrzymich. P...

Tutaj opisujemy metodę mikroaspiracji pojedynczych komórek do separacji zainfekowanych ameb. W celu oddzielenia subpopulacji wirusów w Vermamoeba vermiformis zakażonych faustowirusami i nieznanymi gigantycznymi wirusami, opracowaliśmy protokół opisany poniżej i wykazaliśmy jego zdolność do oddzielania dwóch nowych wirusów gigantycznych o niskiej liczebności.

Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Mikroaspiracja pojedynczych komórek to metoda uzupełniająca różne techniki stosowane w mikrobiologii w ogóle i w wirusologii w szczególności. Może ona odpowiedzieć na kluczowe pytania i rozwiązać problemy napotykane podczas izolacji wirusów olbrzymich poprzez oddzielenie wirusa o niskiej liczebności z mieszaniny wirusowej – co miało miejsce w przypadku wirusów turnover, clandisinal i uzibati – od innego wirusa, jakim jest Faustovirus, występującego w wysokiej liczebności. Główną zaletą tego podejścia jest zastosowanie strategii pośredniej.Polega ona na oddzielaniu i klonowaniu zakażonego gospodarza w celu uzyskania separacji wirusowej. Metoda ta monitoruje poszczególne etapy, od wychwytu po uwalnianie komórek, a proces sortowania jest potwierdzany za pomocą obserwacji mikroskopowej. Na koniec wykorzystuje się biologię molekularną do potwierdzenia sortowania oraz mikroskopię elektronową do obserwacji wyizolowanych cząstek wirusowych.Podejście to rozwiąże główny problem separacji wirusów. Stanowi ono perspektywę dla klonowania ameb lub klonowania protistów w ogóle. Osoba, która po raz pierwszy próbuje zastosować tę technikę, musi być rygorystyczna i precyzyjna podczas kontrolowania ciśnienia.Kontrola wizualna jest niezbędna, aby potwierdzić przechwycenie i uwolnienie tylko jednej komórki. Jako wsparcie komórkowe należy wykorzystać Vermamoeba Vermiformis, szczep CDC 19. Do kolby do hodowli komórkowej o powierzchni 75 cm² należy dodać 30 ml pożywki PYG oraz trzy ml ameb o stężeniu 1 × 10⁶ komórek/ml.Hodowlę należy utrzymywać w temperaturze 28 °C w inkubatorze. Po 48 godzinach przenieś 10 µL kultury komórkowej ameb na szkiełko do liczenia i umieść je pod mikroskopem w celu ilościowego oznaczenia ameb. Aby wypłukać komórki, pobierz 30 mL kultury komórkowej do probówki i odwiruj ameby poprzez centryfugowanie przy 720 ×g przez 10 minut.Usunąć supernatant i resuspender osad w odpowiedniej objętości medium głodzeniowego, aby uzyskać stężenie 1×10⁶ komórek na mililitr. Przygotować podłoże komórkowe z dodatkiem środka przeciwdrobniczego. W komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać 1×10⁶ kultur ameby do 2 ml medium głodzeniowego.Następnie zaszczep 100 mililitrów roztworu stokowego zawierającego mieszaninę wirusów do podłoża hodowli komórek ameb przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 0,01. Inkubuj zaszczepione podłoże hodowli komórek ameb w temperaturze 30°C przez 10 do 14 godzin lub do czasu wystąpienia efektów cytopatycznych, takich jak zaokrąglenie ameb lub lizy.Następnie za pomocą strzykawki zebrać pożywkę i przefiltrować ją przez filtr o wielkości porów 5 µm, aby usunąć szczątki komórkowe. Wykonać rozcieńczenia seryjne próbki wirusa w pożywce głodowej w różnych dołkach. Zaszczepić 2 mL zawiesiny *Vermamoeba vermiformis* o stężeniu 1 × 10⁶ komórek/mL w każdej płytce Petri za pomocą 100 µL inokulum.Następnie umieść szalki Petriego w szczelnej plastikowej torebce w temperaturze 30 °C. Sześć godzin po infekcji obejrzyj szalki Petriego za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego i sprawdzaj morfologię komórek co cztery do ośmiu godzin. Leczenie przeciwdrobnoustrojowe służy do podtrzymania żywotności komórek.Spośród szalek Petri wybierz te, które nie wykazują widocznego zanieczyszczenia czynnikami grzybiczymi i bakteryjnymi oraz w których stwierdzono efekt cytopatyczny ameb wywołany przez wirusy, a także fazę przelisowania i zaokrąglenia ameb, aby uniknąć aspiracji cząsteczek wirusowych. Przygotuj stanowisko pracy z mikromanipulatorem, ręcznym urządzeniem do kontroli ciśnienia, mikroskopem odwróconym, modułami silników Plug and Play, kamerą oraz modułem komputerowym. Wybierz mikrokapilarę o średnicy wewnętrznej 20 micron, aby umożliwić utrzymanie pozycji wewnętrznej i łatwe uwolnienie komórki.Ustaw kąt roboczy systemu chwytającego w module zmotoryzowanym na 45 stopni. Przeprowadź podwójną instalację, najpierw systemu chwytającego, a następnie mikrokapilary. Wyostrz obraz na komórkach.Aby przeprowadzić klonowanie komórek, umieść szalkę Petriego zawierającą 2 mL zainfekowanych ameb pod mikroskopem. Ustaw ostrość najpierw na komórkach, a następnie na mikrokapilarze zanurzonej w hodowli. Wybierz jedną, zaokrągloną komórkę i zbliż mikrokapilarę do mikromanipulatora.Zastosuj delikatną aspirację z ręczną kontrolą ciśnienia, aby wprowadzić komórkę do mikrokapilary. Pobierz pojedynczą komórkę z pierwszej próbki i przenieś ją do podłoża hodowlanego ameb. Następnie inkubuj ją w temperaturze 30 °C. Uważnie kontroluj ciśnienie, aby móc aspirować pojedynczą komórkę, a proces aspiracji monitoruj poprzez obserwację uwolnienia pojedynczej komórki.Przeprowadzaj codzienne obserwacje za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, aby ocenić wygląd komórek i monitorować występowanie efektu cytopatycznego. Następnie uruchom zautomatyzowany system ekstrakcji w celu wyizolowania DNA z części dodatnich próbek hodowli, w których zaobserwowano efekt cytopatyczny. Zaprojektuj primery do amplifikacji genów rdzeniowych adnotowanych jako RBP2 dla Faustovirus, głównego białka kapsydu dla Usurpativirus oraz mniejszego białka kapsydu dla Clandestinovirus.Przeprowadź standardową reakcję PCR przy użyciu termocyklera zgodnie z opisem w manuskrypcie. Przygotuj reakcje PCR w objętości 20 µL, zawierające 50 µM każdego z primerów, 1X Master Mix oraz wodę wolną od RNaz. Produkty PCR poddaj elektroforezie z użyciem barwnika do DNA na żelu agarozowym o stężeniu 1,5% przy napięciu 135 V i wizualizuj w świetle UV.Niniejszy protokół optymalizuje proces micromanipulacji z wykorzystaniem mikroaspiracji pojedynczej komórki. Technika ta umożliwia przechwycenie zaokrąglonej, zainfekowanej ameby oraz jej przeniesienie do nowej płytki zawierającej niezinfekowane ameby. Podejście to pozwoliło na pomyślną izolację nowego, rzadko występującego wirusa olbrzymiego nazwanego Usurpativirus LCD7. Usurpativirus zaobserwowano jedynie w klonie siódmym, w którym stwierdzono obecność DNA Usurpativirus LCD7 przy jednoczesnym braku DNA Faustovirus.Mikroskopia elektronowa ujawniła obecność Clandestinovirus ST1, który posiada typową morfologię ikosaedryczną bez włókien, a także Usurpativirus LCD7 z kapsydem ikosaedrycznym o rozmiarze około 250 nanometrów. Cytometria przepływowa potwierdziła nakładanie się populacji Faustovirus i nowego wirusa. Po opanowaniu ta procedura może być wykonywana z łatwością.Najważniejszą kwestią, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest konieczność wykonania minimalnej liczby zrzutów ekranu z obserwacji dotyczących rozmiaru obiektów, przy jednoczesnym prawidłowym obchodzeniu się z elementami stanowiska pracy oraz sprawdzeniu ewentualnych problemów z kontaminacją. Podejście to może być stosowane jako technika sortowania na podstawie morfologii komórek. Obecnie jest ono wykorzystywane w naszym laboratorium do klonowania specyficznych ameb.Kluczowym punktem tej techniki jest zachowanie integralności komórek. W rzeczywistości mogą wystąpić problemy z brakiem obserwacji uwalniania komórek. Jest to spowodowane głównie rozpadem komórki wewnątrz mikrokapilary.Metoda ta może stanowić wydajną alternatywę w sytuacji, gdy cytometria przepływowa i sortowanie FACS są niedostępne lub gdy osiągnięto ograniczenia specyficzne dla danej techniki. Należy pamiętać, że w niektórych przypadkach komórka nie zostaje uwolniona z mikrokapilary. Wynika to częściowo z charakterystyki ameb oraz ich zdolności do adaptacji i deformacji błony komórkowej.

single-cell-micro-aspiration-as-an-alternative-strategy-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroasorpcja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla fluorescencyjnego sortowania komórek w separacji mieszanin dużych wirusów

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Dołączanie wirionów do powierzchni jest wymogiem do obrazowania pojedynczego wirionu za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości lub mikroskopii sił atomowych (AFM). W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania próbki do kontrolowanej adhezji wirionów do powierzchni szklanych, odpowiednią do stosowania w obrazowaniu AFM i fluorescencji o wysokiej rozdzielczości.

Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych pojedynczego wirionu i obrazowania fluorescencyjnego w superrozdzielczości

Opisujemy tutaj najnowsze osiągnięcia w izolacji wirusów w celu scharakteryzowania nowych genotypów wirusa Faustowirusa, nowej linii gigantycznych wirusów związanej z asfarwirusem. Protokół ten może być stosowany do wysokoprzepustowej izolacji wirusów, zwłaszcza gigantycznych wirusów infekujących ameby.

Szybka strategia izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu Vermamoeba vermiformis

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek ujawnia niejednorodność genotypową w systemach biologicznych, ale obecnym technologiom brakuje przepustowości niezbędnej do głębokiego profilowania składu i funkcji społeczności. W tym miejscu opisujemy mikroprzepływowy przepływ pracy do sekwencjonowania &gt;50 000 genomów jednokomórkowych z różnych populacji komórek.

Ultraprzepustowa platforma mikroprzepływowa do sekwencjonowania genomu pojedynczej komórki

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Ten protokół opisuje metodę opartą na sortowaniu komórek do oczyszczania i hodowli fluorescencyjnych neuronów GABA-ergicznych lub glutaminergicznego z kory nowej i hipokampa myszy lub szczurów po urodzeniu.

Pierwotna hodowla komórkowa oczyszczonych neuronów GABA-ergicznych lub glutaminergicznego uzyskanych poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją

Ten protokół zapewnia szybką i dostosowaną do wielkości metodę izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych poprzez optymalizację wielkości dyszy rozpylającej powietrze, ciśnienia płynu w osłonie, ciśnienia przepływu próbki, napięcia, wzmocnienia i parametrów progu wyzwalania.

Optymalizacja parametrów sortowania metodą cytometrii przepływowej w celu wysokoprzepustowej izolacji i oczyszczania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Poznaj metodę mikroaspiracji pojedynczych komórek do izolacji rzadkich wirusów z zakażonych ameb Vermamoeba vermiformis. Technika ta umożliwia separację niskostężonych podpopulacji wirusowych z dużą precyzją.

Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów (Wideo) | JoVE Journal

Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

Przeglądaj więcej filmów