Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

Mikroaspiracja pojedynczych komórek to metoda uzupełniająca różne techniki stosowane w mikrobiologii w ogóle i w wirusologii w szczególności. Może ona odpowiedzieć na kluczowe pytania i rozwiązać problemy napotykane podczas izolacji wirusów olbrzymich poprzez oddzielenie wirusa o niskiej liczebności z mieszaniny wirusowej – co miało miejsce w przypadku wirusów turnover, clandisinal i uzibati – od innego wirusa, jakim jest Faustovirus, występującego w wysokiej liczebności. Główną zaletą tego podejścia jest zastosowanie strategii pośredniej.

Polega ona na oddzielaniu i klonowaniu zakażonego gospodarza w celu uzyskania separacji wirusowej. Metoda ta monitoruje poszczególne etapy, od wychwytu po uwalnianie komórek, a proces sortowania jest potwierdzany za pomocą obserwacji mikroskopowej. Na koniec wykorzystuje się biologię molekularną do potwierdzenia sortowania oraz mikroskopię elektronową do obserwacji wyizolowanych cząstek wirusowych.

Podejście to rozwiąże główny problem separacji wirusów. Stanowi ono perspektywę dla klonowania ameb lub klonowania protistów w ogóle. Osoba, która po raz pierwszy próbuje zastosować tę technikę, musi być rygorystyczna i precyzyjna podczas kontrolowania ciśnienia.

Kontrola wizualna jest niezbędna, aby potwierdzić przechwycenie i uwolnienie tylko jednej komórki. Jako wsparcie komórkowe należy wykorzystać Vermamoeba Vermiformis, szczep CDC 19. Do kolby do hodowli komórkowej o powierzchni 75 cm² należy dodać 30 ml pożywki PYG oraz trzy ml ameb o stężeniu 1 × 10⁶ komórek/ml.

Hodowlę należy utrzymywać w temperaturze 28 °C w inkubatorze. Po 48 godzinach przenieś 10 µL kultury komórkowej ameb na szkiełko do liczenia i umieść je pod mikroskopem w celu ilościowego oznaczenia ameb. Aby wypłukać komórki, pobierz 30 mL kultury komórkowej do probówki i odwiruj ameby poprzez centryfugowanie przy 720 ×g przez 10 minut.

Usunąć supernatant i resuspender osad w odpowiedniej objętości medium głodzeniowego, aby uzyskać stężenie 1×10⁶ komórek na mililitr. Przygotować podłoże komórkowe z dodatkiem środka przeciwdrobniczego. W komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać 1×10⁶ kultur ameby do 2 ml medium głodzeniowego.

Następnie zaszczep 100 mililitrów roztworu stokowego zawierającego mieszaninę wirusów do podłoża hodowli komórek ameb przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 0,01. Inkubuj zaszczepione podłoże hodowli komórek ameb w temperaturze 30°C przez 10 do 14 godzin lub do czasu wystąpienia efektów cytopatycznych, takich jak zaokrąglenie ameb lub lizy.

Następnie za pomocą strzykawki zebrać pożywkę i przefiltrować ją przez filtr o wielkości porów 5 µm, aby usunąć szczątki komórkowe. Wykonać rozcieńczenia seryjne próbki wirusa w pożywce głodowej w różnych dołkach. Zaszczepić 2 mL zawiesiny *Vermamoeba vermiformis* o stężeniu 1 × 10⁶ komórek/mL w każdej płytce Petri za pomocą 100 µL inokulum.

Następnie umieść szalki Petriego w szczelnej plastikowej torebce w temperaturze 30 °C. Sześć godzin po infekcji obejrzyj szalki Petriego za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego i sprawdzaj morfologię komórek co cztery do ośmiu godzin. Leczenie przeciwdrobnoustrojowe służy do podtrzymania żywotności komórek.

Spośród szalek Petri wybierz te, które nie wykazują widocznego zanieczyszczenia czynnikami grzybiczymi i bakteryjnymi oraz w których stwierdzono efekt cytopatyczny ameb wywołany przez wirusy, a także fazę przelisowania i zaokrąglenia ameb, aby uniknąć aspiracji cząsteczek wirusowych. Przygotuj stanowisko pracy z mikromanipulatorem, ręcznym urządzeniem do kontroli ciśnienia, mikroskopem odwróconym, modułami silników Plug and Play, kamerą oraz modułem komputerowym. Wybierz mikrokapilarę o średnicy wewnętrznej 20 micron, aby umożliwić utrzymanie pozycji wewnętrznej i łatwe uwolnienie komórki.

Ustaw kąt roboczy systemu chwytającego w module zmotoryzowanym na 45 stopni. Przeprowadź podwójną instalację, najpierw systemu chwytającego, a następnie mikrokapilary. Wyostrz obraz na komórkach.

Aby przeprowadzić klonowanie komórek, umieść szalkę Petriego zawierającą 2 mL zainfekowanych ameb pod mikroskopem. Ustaw ostrość najpierw na komórkach, a następnie na mikrokapilarze zanurzonej w hodowli. Wybierz jedną, zaokrągloną komórkę i zbliż mikrokapilarę do mikromanipulatora.

Zastosuj delikatną aspirację z ręczną kontrolą ciśnienia, aby wprowadzić komórkę do mikrokapilary. Pobierz pojedynczą komórkę z pierwszej próbki i przenieś ją do podłoża hodowlanego ameb. Następnie inkubuj ją w temperaturze 30 °C. Uważnie kontroluj ciśnienie, aby móc aspirować pojedynczą komórkę, a proces aspiracji monitoruj poprzez obserwację uwolnienia pojedynczej komórki.

Przeprowadzaj codzienne obserwacje za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, aby ocenić wygląd komórek i monitorować występowanie efektu cytopatycznego. Następnie uruchom zautomatyzowany system ekstrakcji w celu wyizolowania DNA z części dodatnich próbek hodowli, w których zaobserwowano efekt cytopatyczny. Zaprojektuj primery do amplifikacji genów rdzeniowych adnotowanych jako RBP2 dla Faustovirus, głównego białka kapsydu dla Usurpativirus oraz mniejszego białka kapsydu dla Clandestinovirus.

Przeprowadź standardową reakcję PCR przy użyciu termocyklera zgodnie z opisem w manuskrypcie. Przygotuj reakcje PCR w objętości 20 µL, zawierające 50 µM każdego z primerów, 1X Master Mix oraz wodę wolną od RNaz. Produkty PCR poddaj elektroforezie z użyciem barwnika do DNA na żelu agarozowym o stężeniu 1,5% przy napięciu 135 V i wizualizuj w świetle UV.

Niniejszy protokół optymalizuje proces micromanipulacji z wykorzystaniem mikroaspiracji pojedynczej komórki. Technika ta umożliwia przechwycenie zaokrąglonej, zainfekowanej ameby oraz jej przeniesienie do nowej płytki zawierającej niezinfekowane ameby. Podejście to pozwoliło na pomyślną izolację nowego, rzadko występującego wirusa olbrzymiego nazwanego Usurpativirus LCD7. Usurpativirus zaobserwowano jedynie w klonie siódmym, w którym stwierdzono obecność DNA Usurpativirus LCD7 przy jednoczesnym braku DNA Faustovirus.

Mikroskopia elektronowa ujawniła obecność Clandestinovirus ST1, który posiada typową morfologię ikosaedryczną bez włókien, a także Usurpativirus LCD7 z kapsydem ikosaedrycznym o rozmiarze około 250 nanometrów. Cytometria przepływowa potwierdziła nakładanie się populacji Faustovirus i nowego wirusa. Po opanowaniu ta procedura może być wykonywana z łatwością.

Najważniejszą kwestią, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest konieczność wykonania minimalnej liczby zrzutów ekranu z obserwacji dotyczących rozmiaru obiektów, przy jednoczesnym prawidłowym obchodzeniu się z elementami stanowiska pracy oraz sprawdzeniu ewentualnych problemów z kontaminacją. Podejście to może być stosowane jako technika sortowania na podstawie morfologii komórek. Obecnie jest ono wykorzystywane w naszym laboratorium do klonowania specyficznych ameb.

Kluczowym punktem tej techniki jest zachowanie integralności komórek. W rzeczywistości mogą wystąpić problemy z brakiem obserwacji uwalniania komórek. Jest to spowodowane głównie rozpadem komórki wewnątrz mikrokapilary.

Metoda ta może stanowić wydajną alternatywę w sytuacji, gdy cytometria przepływowa i sortowanie FACS są niedostępne lub gdy osiągnięto ograniczenia specyficzne dla danej techniki. Należy pamiętać, że w niektórych przypadkach komórka nie zostaje uwolniona z mikrokapilary. Wynika to częściowo z charakterystyki ameb oraz ich zdolności do adaptacji i deformacji błony komórkowej.