Name: Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów HIV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę izolacji leukocytów z mleka matki do badania fagocytozy zależnej od przeciwciać przeciwko HIV. Technika ta umożliwia ocenę aktywności komórek odpornościowych w kontekście transmisji wirusa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Susan Zolla-Pazner z Wydziału Medycyny i Wydziału Mikrobiologii w Icahn School of Medicine w Mount Sinai za przejrzenie manuskryptu. NIH/NICHD zapewniło finansowanie tego projektu w ramach grantu nr R21 HD095772-01A1. Ponadto R. Powell był wspierany przez fundusze z Wydziału Medycyny Wydziału Chorób Zakaźnych Icahn School of Medicine w Mount Sinai.

Każdy uczestnik tego badania został zrekrutowany i przeprowadzony z nim wywiad zgodnie z aprobatą komisji etycznej i instytucjonalnej (IRB) z wytycznymi i autoryzacją Programu Ochrony Ludzi (PPHS) Mount Sinai, przy użyciu zatwierdzonego przez IRB protokołu pobierania próbek mleka matki.
1. Przygotowanie docelowej mikrosfery
<ol>
	<li>Wybierz odpowiedni antygen docelowy. 
	UWAGA: W tym przykładzie użyto rekombinowanego białka V1V2-2F5K, które zostało zaprojektowane tak, aby naśladować trimeryczny wierzchołek natywnej otoczki HIV 30.</li>
	<li>Wykonaj biotynylację za pomocą komercyjnego zestawu (Tabela Materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
	<ol>
		<li>Obliczyć mmol odczynnika biotyny, który należy dodać do reakcji dla 5-krotnego nadmiaru molowego, korzystając ze wzoru: mmol, biotyna = mL białka x (mg białka/mL białka) x (mmol, biotyna/mg białka) x (5 mmol, biotyna/mmol białko)30,31. Następnie oblicz μl odczynnika biotyny do dodania według wzoru: μL biotyny = mmol biotyny x (1 000 000 μL/L) x (L/10 mmol).</li>
		<li>Przed otwarciem zrównoważyć biotynę do temperatury pokojowej. Rozpuść białko w 0,5−2,0 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zgodnie z powyższymi obliczeniami.</li>
		<li>Przygotować 10 mM roztwór odczynnika biotyny w dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodać odpowiednią objętość 10 mM odczynnika biotyny do roztworu białkowego i inkubować reakcję na lodzie przez 2 godziny lub w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć nadmiar biotyny za pomocą koncentratorów białek (membrany polieterosulfonowe [PES], odcięcie masy cząsteczkowej 3 kDa [MWCO], 0,5 ml; Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Umieścić próbkę w górnej komorze kolumny wirowej i dodać PBS do 400 μl. Nakrętka, a następnie włożyć tę komorę na próbkę do probówki zbiorczej. Wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
		<li>Odrzucić przepływ i dodać PBS do 400 μl. Powtórzyć wirowanie. Odrzucić przepływ i dodać PBS do 100 μl. Zmierzyć stężenie białka za pomocą spektrofotometru. 
		UWAGA: Białko można podzielić na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C do momentu zużycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytki do oznaczania fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP)
<ol>
	<li>Sprzęgnięcie biotynylowanego białka z mikrosferami o wielkości 1 μm ("kulkami"; Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Na płytkę sprzężonych kulek inkubować 6 μg białka z 12 μl kulek podstawowych w 200 μl 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)-PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, delikatnie wirując co 20 minut.</li>
		<li>Wirować przy 13 000 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, delikatnie odwirować i ponownie zawiesić w 1200 μl 0,1% BSA-PBS. Powtórz krok wirowania i prania 2x. Zawiesić w 1200 μl 0,1% BSA-PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwielokrotność 10 μl roztworu kulek na dołek w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem. Przygotować rozcieńczenia przeciwciał lub surowic odpornościowych w 12 μl 2% HSA HBSS, zwykle zaczynając od 50 μg/ml przeciwciała lub rozcieńczenia surowicy 1:100. 
	UWAGA: W próbkach zastosowano przeciwciało monoklonalne (mAb) 830A.</li>
	<li>Dodać 10 μl miareczkowanego przeciwciała/surowicy do płytki perełkowej i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Dodać 200 μl 2% HSA HBSS do każdego dołka i odwirować płytkę przy 2 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usuń supernatant poprzez szybkie przewrócenie i zdekantację cieczy z dołków talerzowych do zlewu, aby uniknąć zakłócenia niewidocznej granulki kulki.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek mleka matki
<ol>
	<li>Pozyskuj mleko matki od zdrowych kobiet karmiących, odciągane za pomocą podwójnych laktatorów elektronicznych lub ręcznych. Wyizoluj komórki w ciągu ~4 godzin od odciągu, utrzymując mleko w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Używając probówek o pojemności 50 ml, odwiruj 50 ml mleka o stężeniu 800 x g przez 15 minut. Ostrożnie odlej odtłuszczone mleko i tłuszcz, pozostawiając osad komórkowy w spokoju. Wytrzyj wnętrze tubki niestrzępiącą się ściereczką, aby usunąć cały tłuszcz ze ścianki tuby.</li>
	<li>Dodaj 10 ml 2% białka surowicy ludzkiej do zbilansowanego roztworu soli Hanka (2% HSA HBSS [bez Ca2+ lub Mg+]). Zawiesić osad przez delikatne pipetowanie, aby uniknąć aktywacji komórek i apoptozy. Przenieść do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 450 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Odlewać supernatant i powtórzyć krok 1.3. Następnie delikatnie ponownie zawieś komórki w 1-2 ml 2% HSA HBSS w zależności od oczekiwanej liczby komórek i policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, zwracając również uwagę na żywotność komórek.</li>
</ol>
4. Test ADCP
UWAGA: Opisane tutaj metody są zaczerpnięte z Ackerman et al.32.
<ol>
	<li>Dodaj 50 000 świeżo wyizolowanych komórek BM do każdej płytki testowej ADCP w 200 μl 2% HSA-HBSS. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>W przypadku eksperymentów kontrolnych należy wstępnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C z inhibitorem aktyny 10 μg/ml (cytochalazyna-D), środkiem blokującym FcR o stężeniu 50 μg/ml (FcBlock) lub kombinacją obu tych czynników przed ich dodaniem do płytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płytka wirówkowa o masie 930 x g przez 10 min. Dodać 200 μl 2% HSA HBSS i powtórzyć wirowanie. Ostrożnie usunąć supernatant jak w kroku 2.7 i powtórzyć mycie.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć sklarowany sklarat i komórki barwiące pod kątem żywotności za pomocą 0,5 μg/ml (stężenie końcowe) utrwalonej barwie żywotności 450 na studzienkę w 50 μl 2% HSA HBSS. Inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odwirować płytkę o masie 930 x g przez 10 minut i usunąć supernatant jak w kroku 2.7. Dodać 200 μl 2% HSA HBSS i ponownie odwirować płytkę, a następnie usunąć supernatant, jak w kroku 2.7.</li>
	<li>Po barwieniu żywotności wybarwić komórki pod kątem markerów leukocytów będących przedmiotem zainteresowania, minimalnie zawierających barwnik specyficzny dla CD45, taki jak PE-mysz anty-ludzka CD45 (klon HI30) w zoptymalizowanym stężeniu (1 μg/μL w 50 μL 1% BSA HBSS w przykładowych danych). 
	UWAGA: Można dołączyć dowolne markery specyficzne dla danej linii.</li>
	<li>Inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odwirować płytkę o masie 930 x g przez 10 minut i usunąć supernatant jak w kroku 2.7. Dodać 200 μl 1% BSA HBSS i powtórzyć wirowanie. Usunąć supernatant. Utrwalić komórki w 200 μl 0,5% formaldehydu w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przechowywać w lodówce w ciemności do czasu analizy.</li>
</ol>
5. Analiza metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Wykonaj wstępne bramkowanie, aby wyeliminować dublety na wykresie rozrzutu do przodu (FSC) w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SSC) i szczątkami (materiał mniejszy niż FSC = 5000) (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Użyj wykresu SSC w porównaniu z barwieniem żywotności (w tym przypadku V450), aby wyeliminować martwe komórki (te, które są dodatnie pod względem barwienia żywotności).</li>
	<li>Użyj wykresu SSC i CD45, aby rozróżnić główne klasy leukocytów (granulocyty, monocyty, limfocyty) zgodnie z obszernym opisem33,34. 
	UWAGA: Ta klasyfikacja jest tylko sugestywna, a do potwierdzenia typu komórki potrzebne są markery specyficzne dla linii.</li>
	<li>Dla wszystkich komórek CD45 + lub dla każdego podzbioru leukocytów będącego przedmiotem zainteresowania, zmierz aktywność ADCP poprzez bramkowanie markerem na komórkach dodatnich koralików na histogramie kanału izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), w którym wykrywane są kulki fluorescencyjne. 
	UWAGA: Studzienki kontroli ujemnej, w których nie dodano koralików, wskażą, gdzie na histogramie widoczne są komórki dodatnie z koralikami, a zatem gdzie umieścić znacznik bramkowania.</li>
	<li>Obliczyć wyniki ADCP jako (mediana intensywności fluorescencji [MFI] komórek dodatnich pod względem koralików) x (% całkowitych komórek CD45 + w populacji dodatniej). Użyj oprogramowania graficznego, aby wykreślić wyniki dla każdego stężenia Ab/surowicy i przeprowadzić analizę obszaru pod krzywą (AUC). 
	UWAGA: ADCP uważa się za dodatnie, jeśli AUC jest większe niż 3x odchylenie standardowe AUC wyniku ADCP niespecyficznego mAb kontroli ujemnej (w tym przypadku 3865).</li>
</ol>

<ol><li>Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+human+milk%3A+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Lactation%22%5BJournal%5D)">Cells in human milk: state of the science.</a> Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).</li>
<li>Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+and+physiologic+significance+of+human+milk+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Nutritional and physiologic significance of human milk proteins.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).</li>
<li>Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+maternal+diet+and+body+composition+on+lactational+performance%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effect of maternal diet and body composition on lactational performance.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).</li>
<li>Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+milk+volume+and+composition+during+late+lactation+%287-20+months%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months).</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).</li>
<li>Hassiotou, F., Geddes, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell-mediated+protection+of+the+mammary+gland+and+the+infant+during+breastfeeding%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding.</a> Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).</li>
<li>Hanson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mother-offspring+dyad+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatrica%22%5BJournal%5D)">The mother-offspring dyad and the immune system.</a> Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).</li>
<li>Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+and+memory+T+lymphocytes+in+human+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Activated and memory T lymphocytes in human milk.</a> Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).</li>
<li>Jain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+distribution+of+human+milk+leucocytes+after+ingestion+by+newborn+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons.</a> Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+pathways+of+maternal+cell+transmission+to+offspring%3A+through+placenta+during+pregnancy+and+by+breast-feeding+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth.</a> Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).</li>
<li>Tuboly, S., Bernath, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+absorption+of+colostral+lymphoid+cells+in+newborn+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).</li>
<li>Cabinian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+Maternal+Immune+Cells+by+Breastfeeding%3A+Maternal+Cytotoxic+T+Lymphocytes+Present+in+Breast+Milk+Localize+in+the+Peyer%27s+Patches+of+the+Nursed+Infant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant.</a> PLoS ONE. 11 (6), e0156762(2016).</li>
<li>Filias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+ability+of+neutrophils+and+monocytes+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates.</a> BMC Pediatrics. 11, 29(2011).</li>
<li>Natchu, U. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exclusive+breastfeeding+reduces+risk+of+mortality+in+infants+up+to+6+mo+of+age+born+to+HIV-positive+Tanzanian+women%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).</li>
<li>Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+morbidity+between+breast-fed+and+formula-fed+infants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants.</a> The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+Study+Team+on+the+Role+of+Breastfeeding+on+the+Prevention+of+Infant+Mortality.+Effect+of+breastfeeding+on+infant+and+child+mortality+due+to+infectious+diseases+in+less+developed+countries%3A+a+pooled+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis.</a> Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updates+on+HIV+and+Infant+Feeding%3A+The+Duration+of+Breastfeeding%2C+and+Support+from+Health+Services+to+Improve+Feeding+Practices+Among+Mothers+Living+with+HIVWHO+Guidelines+Approved+by+the+Guidelines+Review+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee.</a> World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).</li>
<li>Nelson, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+HIV-1+Envelope+Systemic+and+Mucosal+Immunization+of+Lactating+Rhesus+Monkeys+Induces+a+Robust+Immunoglobulin+A+Isotype+B+Cell+Response+in+Breast+Milk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).</li>
<li>Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+risk+of+mother-to-child+human+immunodeficiency+virus+transmission%3A+past+successes%2C+current+progress+and+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).</li>
<li>Shen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mother-to-Child+HIV-1+Transmission+Events+Are+Differentially+Impacted+by+Breast+Milk+and+Its+Components+from+HIV-1-Infected+Women%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women.</a> PLoS ONE. 10 (12), e0145150(2015).</li>
<li>Fouda, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-specific+functional+antibody+responses+in+breast+milk+mirror+those+in+plasma+and+are+primarily+mediated+by+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies.</a> Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).</li>
<li>Van de Perre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+reservoirs+in+breast+milk+and+challenges+to+elimination+of+breast-feeding+transmission+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1.</a> Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143(2012).</li>
<li>Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passively+acquired+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+%28ADCC%29+activity+in+HIV-infected+infants+is+associated+with+reduced+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality.</a> Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).</li>
<li>Pollara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+HIV-1+Envelope-Specific+Breast+Milk+IgA+Responses+with+Reduced+Risk+of+Postnatal+Mother-to-Child+Transmission+of+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1.</a> Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).</li>
<li>Ackerman, M., Nimmerjahn, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAckerman%2C+M+%22Antibody+Fc%22">Antibody Fc</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).</li>
<li>Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor-mediated+phagocytosis+makes+a+significant+contribution+to+clearance+of+influenza+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections.</a> Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).</li>
<li>Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+play+an+essential+role+in+cooperation+with+antibody+in+both+protection+against+and+recovery+from+pulmonary+infection+with+influenza+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice.</a> Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).</li>
<li>Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+cell+surface-associated+NS1+triggers+Fc-gamma+receptor-mediated+phagocytosis+and+clearance+of+West+Nile+Virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells.</a> Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).</li>
<li>Yasui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+cells+contribute+to+the+antibody-mediated+elimination+of+pulmonary-infected+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus.</a> Virology. 454-455, 157-168 (2014).</li>
<li>Quattrocchi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophages+in+early+protective+immune+responses+induced+by+two+vaccines+against+foot+and+mouth+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease.</a> Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rationally+Designed+Immunogens+Targeting+HIV-1+gp120+V1V2+Induce+Distinct+Conformation-Specific+Antibody+Responses+in+Rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits.</a> Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).</li>
<li>Sanders, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+next-generation+cleaved%2C+soluble+HIV-1+Env+trimer%2C+BG505+SOSIP.664+gp140%2C+expresses+multiple+epitopes+for+broadly+neutralizing+but+not+non-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618(2013).</li>
<li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Korean+Journal+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li>
<li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580(2015).</li>
<li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum%3A+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li>
<li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana w niniejszym dokumencie technika pomiaru aktywności ADCP oparta na cytometrii przepływowej została po raz pierwszy opisana w 2011 r.30 i od tego czasu została udowodniona i cytowana w ponad 80 badaniach. Opisany tutaj protokół po raz pierwszy dostosowuje tę technikę do użycia z pierwotnymi komórkami BM. Wcześniejsze badania nad funkcjonalnością komórek BM za pośrednictwem Fc były w dużej mierze ograniczone do pomiaru wybuchów oksydacyjnych lub testów fagocytozy opartych na histologii przy ...

Mleko matki (BM) składa się z komórek matczynych, które są >w 90% żywotne1. Na skład komórek duży wpływ ma etap laktacji, stan zdrowia matki i dziecka oraz zmienność osobnicza, która pozostaje słabo poznana1,2,3,4. Biorąc pod uwagę, że BM zawiera ~103−105 leukocytów/ml, można oszacować, że niemowlęta karmione piersią spożywają ~105−108 leukocytów matczynych dziennie5. Różne badania in vivo wykazały, że leukocyty matki zapewniają krytyczną odporność niemowlęciu i funkcjonują znacznie poza tymi miejscami początkowego spożycia5,6,7,8,9,10,11. Wszystkie komórki pochodzące od matki pobrane przez niemowlę mogą potencjalnie pełnić funkcje immunologiczne równolegle z leukocytami niemowlęcia lub je kompensować12.
Przenoszenie wirusa HIV z matki na dziecko (MTCT) pozostaje kryzysem w krajach o ograniczonych zasobach. Ponieważ biegunka i choroby układu oddechowego są odpowiedzialne za znaczną śmiertelność niemowląt w krajach o ograniczonych zasobach, a choroby te są znacznie zmniejszone przez wyłączne karmienie piersią, korzyści dla matek zakażonych wirusem HIV z karmienia piersią znacznie przewyższają ryzyko13,14,15. O ile dostęp do czystej wody i odpowiedniego mleka modyfikowanego dla niemowląt nie jest niezawodny, WHO nie zaleca zaprzestania karmienia piersią matkom zakażonym wirusem HIV16. Rocznie dochodzi do około 100 000 MTCT za pośrednictwem BM; jednak tylko ~15% niemowląt karmionych piersią przez matki zakażone wirusem HIV ulega zakażeniu, co sugeruje silne działanie ochronne BM17,18,19,20,21. Wiele czynników prawdopodobnie działa w tandemie, aby zapobiec przenoszeniu się wirusa. Co ważne, przeciwciała swoiste dla HIV (Abs) w BM zostały skorelowane ze zmniejszonym MTCT i/lub zmniejszoną śmiertelnością niemowląt z powodu zakażenia wirusem HIV22,23. To, co pozostaje w dużej mierze niejasne, to udział frakcji komórkowej BM w jego właściwościach przeciwwirusowych.
Wiele Abs ułatwia różnorodne działania przeciwwirusowe, w których pośredniczy 'stały' region cząsteczki immunoglobuliny, krystalizowalny fragment (Fc), poprzez interakcję z receptorami Fc (FcR) znajdującymi się na praktycznie wszystkich wrodzonych komórkach odpornościowych, z których praktycznie wszystkie znajdują się w ludzkim BM24. Wykazano, że fagocytoza komórkowa zależna od przeciwciał (ADCP) jest niezbędna do usunięcia infekcji wirusowych i była niedostatecznie zbadana w przypadku zapobiegania MTCT HIV25,26,27,28,29. Biorąc pod uwagę niedostatek wiedzy na temat potencjalnego udziału aktywności ADCP fagocytów BM w zapobieganiu MTCT HIV, naszym celem było opracowanie rygorystycznej metody izolacji komórek od ludzkiego BM w celu podjęcia badania ADCP za pośrednictwem komórek z BM uzyskanych na różnych etapach laktacji.

<table><tbody><tr><td>1 &mikro; m FluoSpheres Mikrosfery znakowane neutrAwidyną&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8776</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE Mysz Anti-Human CD45</td><td>BD</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>MP Biomedicals</td><td>8810025</td><td></td></tr><tr><td>Corning Polistyren V-bottom 96-dołkowa płytka&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna D</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-LC-LC-Zestaw biotyny&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>352196</tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 ml Corning</td><td>&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Możliwa do naprawienia plama żywotności 450&nbsp;</td><td>BD</td><td>562247</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu</td><td>Sigma</td><td>252549&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HBSS bez wapnia, magnezu i fenolu Red</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki blok BD Fc BD</td><td></td><td>564219</td><td></td></tr><tr><td>Albumina ludzkiej surowicy</td><td>MP Biomedicals</td><td>2191349</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki do zadań</td><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7,4</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Polistyren 10 ml Pipety serologiczne&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Koncentratory białka PES, 3K MWCO, 0,5 ml</td><td>Pierce</td><td>88512</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów hiv

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Nawet przy braku leków antyretrowirusowych, tylko ~15% niemowląt karmionych piersią przez matki zakażone wirusem HIV ulega zakażeniu, co sugeruje silne działanie ochronne mleka matki (BM). Jeśli dostęp do czystej wody i odpowiedniego mleka modyfikowanego dla niemowląt nie jest niezawodny, WHO nie zaleca zaprzestania karmienia piersią matkom zakażonym wirusem HIV. Wiele czynników prawdopodobnie działa w tandemie w celu zmniejszenia transmisji BM. Niemowlęta karmione piersią spożywają ~105-10 8 leukocytów matki dziennie, chociaż to, co pozostaje w dużej mierze niejasne, to wkład tych komórek w przeciwwirusowe właściwości BM. Obecnie naszym celem było wyizolowanie komórek z ludzkiego BM w celu zmierzenia zależnej od przeciwciał fagocytozy komórkowej (ADCP), jednej z najważniejszych i najbardziej rozpowszechnionych wrodzonych odpowiedzi immunologicznych, przez fagocyty BM przeciwko celom HIV. Komórki wyizolowano z 5 ludzkich próbek BM uzyskanych na różnych etapach laktacji. Izolację przeprowadzono poprzez delikatne odwirowanie, a następnie ostrożne usunięcie tłuszczu mlecznego i wielokrotne mycie osadu komórkowego. Jako cele do analizy ADCP wykorzystano kulki fluorescencyjne pokryte epitopem otoczki HIV (Env). Komórki barwiono markerem powierzchniowym CD45 w celu identyfikacji leukocytów. Stwierdzono, że aktywność ADCP była istotna w porównaniu z eksperymentami kontrolnymi i możliwa do powtarzalnego zmierzenia przy użyciu przeciwciała 830A swoistego dla HIV.

Mleko można przechowywać w temperaturze pokojowej lub niższej (choć nie zamrażać); jednakże, biorąc pod uwagę zaobserwowany przez nas spadek żywotności przy bardzo niskich temperaturach przechowywania mleka (dane nie pokazano) oraz fakt, że pobieranie, krótkotrwałe przechowywanie i transport w temperaturze otoczenia są prostsze, zaleca się, aby próbek nie chłodzić w celu zmniejszenia zmienności między próbkami. W mleku pobranym od 7 do 183 dni po porodzie stężenie komórek określone za pom...

Mleko matki przenosi ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), chociaż tylko ~15% niemowląt karmionych piersią przez matki zakażone wirusem HIV ulega zakażeniu. Niemowlęta karmione piersią spożywają ~105−108 leukocytów matki dziennie, chociaż komórki te są niedostatecznie zbadane. Tutaj opisujemy izolację leukocytów mleka matki i analizę ich zdolności fagocytarnej.

Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów HIV

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Opracowaliśmy rygorystyczną metodę izolowania komórek z mleka matki w celu zbadania fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP) przez fagocyty mleka matki przeciwko celom HIV. Technika ta ułatwia stosunkowo szybką i łatwą izolację komórek mleka kobiecego w celu oceny zdolności populacji leukocytów do wykonywania ADCP. Procedurę zademonstruje Alisa Fox, technik z mojego laboratorium.Po wybraniu odpowiedniego antygenu docelowego należy użyć komercyjnego zestawu do biotynylacji interesującego nas białka zgodnie z protokołem producenta. I umieścić biotynylowaną próbkę w górnej komorze kolumny wirowej. Dodaj PBS do 400 mikrolitrów i zakryj komorę przed włożeniem kolumny do probówki zbiorczej w celu odwirowania.Po odrzuceniu przepływu dodaj PBS do 400 mikrolitrów w celu drugiego odwirowania. Odrzuć przepływ, dodaj PBS do 400 mikrolitrów i zmierz stężenie białka za pomocą spektrofotometru, aby sprzęgnąć biotynylowane białko z mikrosferami. Inkubować sześć mikrogramów białka z 12 mikrolitrami kulek wyjściowych w 200 mikrolitrach PBS na płytkę sprzężonych kulek w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, delikatnie wirując co 20 minut.Pod koniec inkubacji osadzać kulki sprzężone z białkiem przez odwirowanie i odrzucać supernatant. Po delikatnym wirowaniu ponownie zawieś białko w 1200 mikrolitrach 0,1% BSA w PBS i umyj probówkę przez odwirowanie jeszcze dwa razy, jak właśnie pokazano. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić granulat w 1200 mikrolitrach w PBS plus BSA.Aby ustawić płytki testowe ADCP, najpierw przygotuj 12 mikrolitrowych rozcieńczeń przeciwciała lub interesującej nas surowicy immunologicznej w 2% BSA w PBS na okrągłej płytce 96-dołkowej. Dodaj 10 mikrolitrów kulek sprzężonych z białkiem na studzienkę do płytki na dwugodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać 200 mikrolitrów PBS plus BSA.Po uzyskaniu mleka matki od zdrowych kobiet karmiących piersią odciągających pokarm za pomocą laktatora, w ciągu czterech godzin od odciągania odciągamy pokarm oddzielić zawartość mleka przez odwirowanie i ostrożnie odlać odtłuszczone mleko i tłuszcz, pozostawiając osad komórkowy w nienaruszonym stanie. Wytrzyj wnętrze probówki niestrzępiącą się ściereczką, aby usunąć cały tłuszcz ze ścianki rurki i dodaj 10 mililitrów PBS plus HSA. Ponownie zawiesić osad za pomocą delikatnego pipetowania, aby uniknąć aktywacji komórek w apoptozie, i przenieść zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki w celu odwirowania.Po drugim myciu w PBS plus HSA, jak właśnie pokazano, delikatnie ponownie zawieś komórki w jednym do dwóch mililitrów świeżego PBS plus HSA w celu zliczenia. W przypadku testu ADCP należy szybko odwrócić przygotowaną płytkę ADCP, aby zdekantować supernatant po końcowym odwirowaniu i dodać pięć razy 10 w czwartej świeżo wyizolowanej komórki mleka matki w 200 mikrolitrach PBS plus BSA na dwugodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji odwirować komórki i przemyć granulki dwa razy w 200 mikrolitrach świeżego PBS, jak pokazano.Po ostatnim praniu wybarwić komórki 0,5 mikrograma na mililitr trwałej żywotności barwie 450 na studzienkę w 50 mikrolitrach PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez dwa przemycia w świeżym PBS, jak pokazano, i barwić komórki pod kątem interesujących markerów leukocytów przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji zebrać komórki, odwirować i umyć komórki dwa razy w 200 mikrolitrach 1% BSA plus PBS na pranie.Po ostatnim praniu utrwal granulki w 200 mikrolitrach 0,5% formaldehydu na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Do analizy cytometrycznej przepływowej próbek komórek należy ustawić cytometr przepływowy wyposażony w czytnik płytek o wysokiej przepustowości, aby pobrać 175 mikrolitrów próbki i zebrać 5000 komórek na studzienkę. Wykonaj początkowe bramkowanie, aby wyeliminować dublety i zanieczyszczenia na wykresie rozproszenia do przodu i z boku.Użyj wykresu plam rozpraszania bocznego w stosunku do żywotności, aby wyeliminować martwe komórki. I użyj wykresu rozproszenia bocznego w stosunku do CD45, aby rozróżnić główne klasy leukocytów. Dla wszystkich komórek CD45 dodatnich lub dla każdego podzbioru leukocytów będącego przedmiotem zainteresowania, zmierz aktywność fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał poprzez bramkowanie markerem na komórkach dodatnich koralików na histogramie odpowiedniego kanału fluoroforowego dla sprzężonych kulek.Następnie oblicz wyniki fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał jako medianę intensywności fluorescencji komórek dodatnich przez procent całkowitego CD45 plus komórki w populacji dodatniej. Tutaj pokazano strategię bramkowania w celu wyeliminowania dubletów, gruzu i martwych komórek. Od jednego do 12% wszystkich żywych komórek to zazwyczaj leukocyty CD45-dodatnie, przy czym większość rzekomych monocytów o niskim lub średnim rozrzuceniu bocznym CD45 wydaje się być prekursorami lub niedojrzałymi komórkami, w oparciu o rozproszenie boczne w porównaniu z bramkowaniem CD45.Rzekome granulocyty definiuje się jako komórki pośrednie CD45 o wysokim rozrzucie bocznym. Pomiar aktywności ADCP świeżo wyizolowanych komórek mleka kobiecego przy użyciu ludzkiego przeciwciała monoklonalnego swoistego dla HIV w ciągu jednego miesiąca po porodzie ujawnia, że leczenie inhibitorem aktyny cytochalazyną D i/lub przeciwciałami blokującymi receptor Fc przed inkubacją kulkami sprzężonymi z antygenem związanym z przeciwciałami powoduje aktywność ADCP równą lub niższą niż obserwowana w obecności przeciwciała kontrolnego. Wynik ADCP określony dla całkowitej liczby komórek CD45 dodatnich jest zwykle od 25 do 35 razy wyższy od poziomów tła, zdefiniowanych za pomocą kontroli negatywnej, przeciwciała monoklonalnego anty-wąglika.Każda próbka mleka matki jest wyjątkowa, a niektóre granulki mogą być trudne do zauważenia. Ponadto populacje leukocytów, a tym samym wyniki ADCP, mogą się znacznie różnić w zależności od próbki.

isolation-leukocytes-from-human-breast-milk-for-use-an-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie pokazujemy izolację limfocytów B z ludzkiej krwi obwodowej za pomocą biotynylowanych przeciwciał specyficznych dla komórek innych niż B oraz mikrokulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną.

Izolacja i oczyszczanie limfocytów B z ludzkiej krwi obwodowej

Ten film demonstruje test do pomiaru fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP) przez fagocyty mleka matki. Znakowane fluorescencyjnie mikrosfery sprzężone z kompleksem antygen-przeciwciało są łączone z zawiesiną komórkową wyizolowaną z mleka matki w celu wywołania zależnej od przeciwciał fagocytozy komórkowej przez leukocyty fagocytarne. Po znakowaniu komórek przeciwciałami przeciwko powszechnemu antygenowi leukocytarnemu (CD45), cytometria przepływowa służy do pomiaru intensywności...

Test in vitro do pomiaru fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał za pomocą fagocytów

Tutaj opisujemy protokół izolacji podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej.  Wystarczająca ilość i jakość kwasów nukleinowych może zostać wyekstrahowana z komórek i wykorzystana w kolejnych testach z wykorzystaniem DNA lub RNA.

Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Opisany tutaj jest protokół do izolacji i dalszego badania naciekających leukocytów decidua basalis i decidua parietalis - ludzkiego interfejsu matczyno-płodowego. Protokół ten utrzymuje integralność markerów powierzchniowych komórek i daje wystarczającą ilość żywotnych komórek do dalszych zastosowań, co udowodniono w analizie cytometrii przepływowej.

Izolacja leukocytów z ludzkiego interfejsu matka-płód

Opisano techniki opisujące gradientową procedurę oddzielania egzosomów od cząsteczek ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Procedura ta została wykorzystana do wyizolowania egzosomów z dala od cząstek HIV w ludzkim osoczu od osób zakażonych wirusem HIV. Wyizolowane egzosomy analizowano pod kątem zawartości cytokin/chemokin.

Izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem HIV-1

Opisujemy metodę pomiaru prędkości fagosomów przemieszczających się w kierunku centrum komórki w żywych komórkach zakażonych lub bez ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) typu 1, używając konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem do identyfikacji fluorescencyjnych zakażonych komórek i mikroskopii jasnego pola do wykrywania fagosomów.

Migracja i prędkość fagosomów mierzona w żywych pierwotnych ludzkich makrofagach zakażonych wirusem HIV-1

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół izolacji, hodowli, transfekcji i różnicowania ludzkich pierwotnych monocytów od osób zakażonych wirusem HIV i zdrowych osób kontrolnych.

Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę kompatybilną z automatyzacją o wysokiej przepustowości, polegającą na izolowaniu ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej do biobankowania i innych celów.

Izolowanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej od kożuchów za pomocą wysokoprzepustowej separacji kulek immunomagnetycznych

Protokół ten został zaprojektowany tak, aby przyspieszyć i umożliwić skuteczną izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od mleka matki o wysokiej czystości.

Szybka izolacja pęcherzyków zewnętrznych pochodzących z ludzkiego mleka matki

Poznaj metodę izolacji leukocytów z mleka matki do badania fagocytozy zależnej od przeciwciać przeciwko HIV. Technika ta umożliwia ocenę aktywności komórek odpornościowych w kontekście transmisji wirusa.

Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów HIV

Przeglądaj więcej filmów