Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów HIV

Opracowaliśmy rygorystyczną metodę izolowania komórek z mleka matki w celu zbadania fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCP) przez fagocyty mleka matki przeciwko celom HIV. Technika ta ułatwia stosunkowo szybką i łatwą izolację komórek mleka kobiecego w celu oceny zdolności populacji leukocytów do wykonywania ADCP. Procedurę zademonstruje Alisa Fox, technik z mojego laboratorium.

Po wybraniu odpowiedniego antygenu docelowego należy użyć komercyjnego zestawu do biotynylacji interesującego nas białka zgodnie z protokołem producenta. I umieścić biotynylowaną próbkę w górnej komorze kolumny wirowej. Dodaj PBS do 400 mikrolitrów i zakryj komorę przed włożeniem kolumny do probówki zbiorczej w celu odwirowania.

Po odrzuceniu przepływu dodaj PBS do 400 mikrolitrów w celu drugiego odwirowania. Odrzuć przepływ, dodaj PBS do 400 mikrolitrów i zmierz stężenie białka za pomocą spektrofotometru, aby sprzęgnąć biotynylowane białko z mikrosferami. Inkubować sześć mikrogramów białka z 12 mikrolitrami kulek wyjściowych w 200 mikrolitrach PBS na płytkę sprzężonych kulek w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, delikatnie wirując co 20 minut.

Pod koniec inkubacji osadzać kulki sprzężone z białkiem przez odwirowanie i odrzucać supernatant. Po delikatnym wirowaniu ponownie zawieś białko w 1200 mikrolitrach 0,1% BSA w PBS i umyj probówkę przez odwirowanie jeszcze dwa razy, jak właśnie pokazano. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić granulat w 1200 mikrolitrach w PBS plus BSA.

Aby ustawić płytki testowe ADCP, najpierw przygotuj 12 mikrolitrowych rozcieńczeń przeciwciała lub interesującej nas surowicy immunologicznej w 2% BSA w PBS na okrągłej płytce 96-dołkowej. Dodaj 10 mikrolitrów kulek sprzężonych z białkiem na studzienkę do płytki na dwugodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać 200 mikrolitrów PBS plus BSA.

Po uzyskaniu mleka matki od zdrowych kobiet karmiących piersią odciągających pokarm za pomocą laktatora, w ciągu czterech godzin od odciągania odciągamy pokarm oddzielić zawartość mleka przez odwirowanie i ostrożnie odlać odtłuszczone mleko i tłuszcz, pozostawiając osad komórkowy w nienaruszonym stanie. Wytrzyj wnętrze probówki niestrzępiącą się ściereczką, aby usunąć cały tłuszcz ze ścianki rurki i dodaj 10 mililitrów PBS plus HSA. Ponownie zawiesić osad za pomocą delikatnego pipetowania, aby uniknąć aktywacji komórek w apoptozie, i przenieść zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki w celu odwirowania.

Po drugim myciu w PBS plus HSA, jak właśnie pokazano, delikatnie ponownie zawieś komórki w jednym do dwóch mililitrów świeżego PBS plus HSA w celu zliczenia. W przypadku testu ADCP należy szybko odwrócić przygotowaną płytkę ADCP, aby zdekantować supernatant po końcowym odwirowaniu i dodać pięć razy 10 w czwartej świeżo wyizolowanej komórki mleka matki w 200 mikrolitrach PBS plus BSA na dwugodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji odwirować komórki i przemyć granulki dwa razy w 200 mikrolitrach świeżego PBS, jak pokazano.

Po ostatnim praniu wybarwić komórki 0,5 mikrograma na mililitr trwałej żywotności barwie 450 na studzienkę w 50 mikrolitrach PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji osadzać komórki przez dwa przemycia w świeżym PBS, jak pokazano, i barwić komórki pod kątem interesujących markerów leukocytów przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji zebrać komórki, odwirować i umyć komórki dwa razy w 200 mikrolitrach 1% BSA plus PBS na pranie.

Po ostatnim praniu utrwal granulki w 200 mikrolitrach 0,5% formaldehydu na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Do analizy cytometrycznej przepływowej próbek komórek należy ustawić cytometr przepływowy wyposażony w czytnik płytek o wysokiej przepustowości, aby pobrać 175 mikrolitrów próbki i zebrać 5000 komórek na studzienkę. Wykonaj początkowe bramkowanie, aby wyeliminować dublety i zanieczyszczenia na wykresie rozproszenia do przodu i z boku.

Użyj wykresu plam rozpraszania bocznego w stosunku do żywotności, aby wyeliminować martwe komórki. I użyj wykresu rozproszenia bocznego w stosunku do CD45, aby rozróżnić główne klasy leukocytów. Dla wszystkich komórek CD45 dodatnich lub dla każdego podzbioru leukocytów będącego przedmiotem zainteresowania, zmierz aktywność fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał poprzez bramkowanie markerem na komórkach dodatnich koralików na histogramie odpowiedniego kanału fluoroforowego dla sprzężonych kulek.

Następnie oblicz wyniki fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał jako medianę intensywności fluorescencji komórek dodatnich przez procent całkowitego CD45 plus komórki w populacji dodatniej. Tutaj pokazano strategię bramkowania w celu wyeliminowania dubletów, gruzu i martwych komórek. Od jednego do 12% wszystkich żywych komórek to zazwyczaj leukocyty CD45-dodatnie, przy czym większość rzekomych monocytów o niskim lub średnim rozrzuceniu bocznym CD45 wydaje się być prekursorami lub niedojrzałymi komórkami, w oparciu o rozproszenie boczne w porównaniu z bramkowaniem CD45.

Rzekome granulocyty definiuje się jako komórki pośrednie CD45 o wysokim rozrzucie bocznym. Pomiar aktywności ADCP świeżo wyizolowanych komórek mleka kobiecego przy użyciu ludzkiego przeciwciała monoklonalnego swoistego dla HIV w ciągu jednego miesiąca po porodzie ujawnia, że leczenie inhibitorem aktyny cytochalazyną D i/lub przeciwciałami blokującymi receptor Fc przed inkubacją kulkami sprzężonymi z antygenem związanym z przeciwciałami powoduje aktywność ADCP równą lub niższą niż obserwowana w obecności przeciwciała kontrolnego. Wynik ADCP określony dla całkowitej liczby komórek CD45 dodatnich jest zwykle od 25 do 35 razy wyższy od poziomów tła, zdefiniowanych za pomocą kontroli negatywnej, przeciwciała monoklonalnego anty-wąglika.

Każda próbka mleka matki jest wyjątkowa, a niektóre granulki mogą być trudne do zauważenia. Ponadto populacje leukocytów, a tym samym wyniki ADCP, mogą się znacznie różnić w zależności od próbki.